Isolation and Characterization of Protease Keratinolytic Enzyme in Water Monitor Lizard Intestine.
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
ARINI MEGIANDARI. Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari
Usus Biawak Air. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI dan IRMA H SUPARTO.
Enzim protease yang diisolasi dari lapisan atas (mukosa) usus biawak air
(Varanus salvator) memiliki aktivitas proteolitik. Penelitian ini bertujuan
mengisolasi dan mencirikan protease dari lapisan mukosa usus biawak air.
Lapisan mukosa usus biawak air (2%) dilarutkan dalam 50mM bufer fosfat
pH 7,0, kemudian disentrifus pada kecepatan 6000 G dan suhu 4 ºC selama 10
menit. Dari hasil sentrifus didapatkan ekstrak kasar enzim, kemudian dilakukan
analisis aktivitas enzim maksinum dengan memanaskan ekstrak pada selang suhu
45–65 ºC dan selang waktu 5–20 menit. Dari hasil analisis aktivitas enzim
maksimum didapatkan pada suhu 55 ºC waktu inkubasi 5 menit untuk sampel
duodenum, jejenum, ileum, dan kolon masing-masing sebesar 4,3482 U/ml,
3,9247, 3,9176 U/ml, dan 3,0353 U/ml. Protease dari ekstrak kasar enzim terdiri
atas tujuh pita dengan ukuran bobot molekul 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa,
48,47 kDa, 36,80 kDa, 24,28 kDa, 12,80 kDa. Enzim ini bekerja pada suhu
optimum 55 ºC dan pH optimum 9, serta dihambat oleh ion Ca2+ dan Mg2+. Uji
in vitro menggunakan substrat tepung bulu ayam tidak ditemukan adanya suatu
aktivitas keratinolitik.
ABSTRACT
ARINI MEGIANDARI. Isolation and Characterization of Protease Keratinolytic
Enzyme in Water Monitor Lizard Intestine. Supervised by DONDIN SAJUTHI
and IRMA H SUPARTO.
Protease enzyme isolated from mucosa layer in intestine water monitor
lizard (Varanus salvator) showed proteolytic activity. Therefore, the purpose of
this research was to isolate and characterize of protease produced by water
monitor lizard intestine.
The intestine mucous layer of water monitor lizard (2%) was dissolved in
50mM buffer phosphate pH 7,0, then centrifuged at 6000 G in 4 ºC temperature
for 10 minute. The centrifuged extract was used to analyze the maximum enzyme
activity by heating the extract at 45–65 ºC range temperature and 5–20 minute
range time. Maximum enzyme activity analysis obtained at 55 ºC for 5 minute for
the sample duodenum, jejunum, ileum, colon respectively were 4, 3482 U/ml,
3,9247 U/ml, 3,9176 U/ml, and 3,0353 U/ml. Protease from extract enzyme has
seven bands with molecular weight 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa, 48,47 kDa,
36,80 kDa, 24,28 kDa, and 12,80 kDa. The enzyme has optimum temperature at
55 ºC and optimum at pH 9, and also inhibited by ion Ca2+ and Mg2+. The in vitro
analysis used chicken powder showed no keratinase activity.
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul : Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak
Air
Nama : Arini Megiandari
NIM : G44204018
Disetujui
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD
NIP 130 536 684
Dr. dr. Irma H. Suparto, MS
NIP 131 606 776
Diketahui
Dekan Falkultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131 578 806
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini.
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan November 2008 dengan judul
Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak Air. Penelitian di
lakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Lembaga Penelitian dan
Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Penyusunan karya ilmiah ini tidak akan terwujud tanpa bantuan, bimbingan, dan saran
dari berbagai pihak. Oleh karena itu dengan selesaainya laporan ini, penulis mengucapkan
terima kasih kepada Prof. Drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD dan Dr. dr Irma H. Suparto,
MS selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan, saran, dan pengarahan
kepada penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan untuk keluargaku tercinta Bapak, Mama, Kakak, Suami, dan Anakku
Annindya Luviana Iriani yang telah memberikan dukungan moral maupun material,
Bapak mertua, iparku, dan adik sepupuku yang selalu memberikan doa, serta seluruh
keluarga besarku di Bogor, Sukabumi, Purworejo, dan Cilacap. Penelitian ini juga tidak
lepas dari bantuan beberapa pihak, oleh karena itu penghargaan penulis sampaikan
kepada Kak Willy, Bu Eni, Bu Nani, dan semua pegawai PSSP lainnya atas bantuan
yang diberikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dhesti, Tri, Anti, Asnel, Rima,
teman-teman Kimia Angkatan 41 lainnya dan angkatan 40 atas diskusi dan masukanmasukan yang sangat berharga. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kak Eko
dan Mas Hery atas bantuannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2008
Arini Megiandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 8 Mei 1986 dari ayah Sugiardi dan
ibu Wagiyem. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2006
penulis menikah dan dikaruniai saeorang anak bernama Annindya Luviana Iriani
pada 26 Februari 2007.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMU PGRI 4 Bogor dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan
di Laboratorium PT Haeng Nam Sejahtera Indonesia, Bogor pada tahun 2007.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... ix
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator) .............................................................
Enzim Keratinase .................................................................................
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis .............
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .....................................................................................
Metode Penelitian ................................................................................
3
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein .......................................................................................
Ciri Enzim Protease...............................................................................
Bobot Molekul (SDS-PAGE) ................................................................
Uji In Vitro Aktivitas Keratinase ...........................................................
5
5
8
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan...............................................................................................
Saran ...................................................................................................
8
9
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
9
LAMPIRAN .................................................................................................
11
1
2
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
Biawak air .................................................................................................
Pengaruh waktu inkubasi pada aktivitas protease........................................
Pengaruh suhu pada aktivitas enzim protease .............................................
Pengaruh pH pada aktivitas enzim protease................................................
Pengaruh ion logam pada aktivitas enzim protease .....................................
Analisis SDS-PAGE ..................................................................................
Uji in vitro .................................................................................................
1
5
6
6
7
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Bagan alir penelitian ..................................................................................
Prosedur pembuatan pereaksi kimia ...........................................................
Pembuatan kurva standar Bradford.............................................................
Data penentuan aktivitas enzim maksimum ................................................
Penentuan aktivitas maksimum ..................................................................
Contoh perhitungan aktivitas enzim ................................................................
Data pengaruh suhu, pH, dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum ..
Pembuatan kurva standar SDS-PAGE ........................................................
12
13
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
dalam saluran cerna biawak sehingga dapat
meningkatkan nilai ekonomi dari hewan
tersebut.
Latar Belakang
Biawak merupakan kelas reptil yang
kulitnya banyak dimanfaatkan sebagai bahan
perhiasan juga dagingnya sebagai bahan
makanan dan dipercaya dapat digunakan
untuk obat kulit. Jenis biawak yang paling
banyak dimanfaatkan dan dikonsumsi adalah
biawak air (Varanus salvator). Hasil limbah
dari pemanfaatan biawak tersebut belum
banyak digunakan seperti bagian organ
dalamnya, antara lain saluran cernanya.
Biawak merupakan hewan karnivora yang
memangsa berbagai jenis burung, ayam, ikan,
serta mamalia kecil seperti tikus dan cecurut.
Reptil ini memangsa korbannya hidup-hidup
termasuk dengan bulunya kemudian hasil
pencernaannya dikeluarkan dalam bentuk
feses tanpa ada sisa bulu ayam ataupun
burung. Hal ini diduga di dalam saluran
pencernaannya terdapat suatu zat atau enzim
yang dapat menghancurkan bulu tersebut.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin yang kaya akan sistein dan sistin. Oleh
karena itu diduga terdapat suatu enzim
keratinase di dalam saluran cerna biawak.
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim ini
dihasilkan di dalam sel tetapi dikeluarkan ke
dalam media untuk menghidrolisis dan
mendegradasi komponen kompleks menjadi
senyawa sederhana yang mudah larut. Enzim
keratinase banyak digunakan pada kosmetik
dan teknologi kulit. Secara komersial enzim
tersebut dapat diekstraksi dari Streptomyces
frandiae dan Streptomyces mikrolavus. Enzim
ini baik sekali untuk memecah ikatan disulfida
keratin pada bulu (Winarno 1983). Selain
untuk kosmetik, penggunaan enzim banyak
digunakan untuk pengolahan limbah dan juga
pakan hewan. Contohnya, enzim keratinase
ini dapat diaplikasikan pada limbah bulu ayam
yang dijadikan tepung bulu ayam sebagai
bahan pakan alternatif yang mempunyai
kandungan protein tinggi. Enzim keratinase
ini ditambahkan agar dapat mendegradasi bulu
ayam tersebut. Hal ini karena bulu ayam
mengandung keratin yang merupakan protein
serat khusus, tidak larut dalam air dan sulit
dicerna (Rawn 1989).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengetahui pencirian enzim protease yang
mempunyai aktivitas keratinase dari ekstrak
kasar lapisan atas (mukosa) usus biawak air.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi
informasi adanya suatu enzim keratinase
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator)
Biawak merupakan hewan yang masuk
dalam golongan kadal besar, suku biawakbiawakan (varanidae). Biawak dalam bahasa
lain disebut sebagai bayawak (Sunda),
menyawak atau nyambik (Jawa), berekai
(Madura), dan monitor lizard atau goanna
(Inggris). Biawak banyak macamnya, yang
terbesar dan terkenal ialah biawak komodo (V.
komodoensis), yang panjangnya dapat
melebihi 3 m.
Hewan berdarah dingin ini kerap ditemui
di desa-desa dan perkotaan di Indonesia barat.
Jenis biawak yang paling banyak adalah
biawak air dari jenis Varanus salvator.
Habitatnya di sekitar sungai dan rawa karena
merupakan hewan yang semi-akuatik, oleh
karena itu disebut sebagai biawak air.
Umumnya biawak dewasa mempunyai
panjang tubuh (moncong hingga ujung ekor)
sekitar 1 m, meskipun ada pula yang dapat
mencapai 2.5 m. Bobot badan biawak jantan
biasanya lebih besar sampai dua kali lipat
dibandingkan betina. Biawak bereproduksi
dengan bertelur dan paling tinggi pada bulan
April sampai dengan Oktober (Bennet 1998).
Ciri-ciri lainnya adalah adanya garis hitam
dengan tepian kuning sepanjang tubuhnya dari
kepala sampai ekor. Hewan ini biasanya
beRwarna kecoklatan (Byers 2000). Gambar 1
memperlihatkan gambar dari biawak air.
Gambar 1 Biawak air (Tan 2001).
Enzim Keratinase
Keratin merupakan protein serat yang
membentuk rambut, bulu, dan kuku, serta
kaya akan sistein dan sistin. Protein ini 14%
terdiri dari sistin dan disulfida sebagai
jembatan antar molekul (Moran et al. 1966).
Menurut Lehninger (1995), -keratin kaya
akan residu sistin yang dapat memberikan
jembatan disulfida di antara rantai polipeptida
yang berdekatan. Sistin terdiri atas dua
molekul sistein.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin. Adanya ikatan silang yang terbelit
dalam bentuk heliks dan saling berhubungan
melalui ikatan disulfida, ikatan hidrogen dan
interaksi hidrofobik, menyebabkan keratin
sangat stabil, tidak larut dalam air, tahan
terhadap asam atau basa kuat dan tahan
terhadap enzim proteolitik yang disekresikan
oleh kelenjar pencernaan (Lin et al. 1992).
Keratin dapat dipecah menjadi molekul
sederhana melalui reaksi kimia dan enzim.
Kemudian molekul ini dapat dicerna oleh
tripsin dan pepsin.
Tiap molekul protein dalam keratin
mempunyai bentuk spiral, yang disebut spiral- kanan. Kanan menunjukkan arah putaran
dalam spiral itu. Tiap putaran spiral
mengandung 3,6 residu asam amino. Jarak
dari satu kumparan ke kumparan berikutnya
adalah 5,4Å. Bentuk spiral ini tidak berubah
terutama berkat ikatan hidrogen antara satu
gugus amida-karbonil dan suatu gugus NH
yang jaraknya 3,6 satuan asam amino. Bentuk
spiral ini menghasilkan produk yang kuat,
lunak, dan bersifat serat (Girindra 1986).
Ikatan hidrogen antara suatu gugus asam
amino dengan suatu gugus karboksil
merupakan suatu penyumbang pada bentuk
suatu molekul protein. Interaksi inter dan
antar molekul juga menentukan struktur
(Wijaya 2001).
Enzim adalah biokatalis yang diproduksi
oleh sel hidup. Enzim mengkatalis reaksi
biokimia spesifik pada substrat dan sering kali
banyak enzim yang berbeda dibutuhkan
sehingga terbentuk kerja sama dan
keberhasilan reaksi metabolik yang dilakukan
sel (Wijaya 2001).
Faktor yang mempengaruhi aktivitas
enzim adalah pH, suhu, konsentrasi substrat,
konsentrasi enzim, dan waktu inkubasi. Suhu
meningkatkan aktivitas enzim sampai suhu
optimum, setelah itu protein enzim akan
terdenaturasi dan terjadi inaktivasi. Begitu
pula halnya dengan pH, pada pH optimum
aktivitasnya akan maksimum, sedangkan
diluar pH optimum aktivitasnya akan turun.
Konsentrasi substrat dan enzim, juga waktu
inkubasi yang bertambah akan meningkatkan
aktivitas enzim sampai tingkat tertentu,
setelah itu aktivitasnya tetap (Sears & Walsh
1993).
Klasifikasi enzim berdasarkan jenis reaksi
yang dikatalisis terdiri atas enam kelompok,
yaitu oksidoreduktase, transferase, hidrolase,
liase, isomerase, dan ligase (Suhartono 1989).
Protease merupakan enzim yang berperan
dalam reaksi yang melibatkan pemecahan
protein.
Enzim ini
dalam
kerjanya
membutuhkan air dan termasuk kelas
hidrolase. Enzim protease dihasilkan secara
ekstraseluler oleh tanaman, hewan, maupun
mikrob, dan mempunyai peranan yang sangat
penting dalam metabolisme sel dan
keteraturan proses dalam sel (Ward 1983).
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim
ekstraseluler adalah enzim dihasilkan di dalam
sel tetapi dikeluarkan ke dalam media untuk
menghidrolisis dan mendegradasi komponen
kompleks menjadi senyawa sederhana yang
mudah larut dan diserap oleh mikroorganisme.
Enzim intraseluler dihasilkan di dalam sel dan
melakukan aktivitasnya juga didalam sel.
Enzim protease berdasarkan cara kerjanya
dapat digolongkan dalam dua kelompok besar
yaitu endopeptidase dan eksopeptidase
(Winarno 1983).
Menurut Kim et al. (1992) aktivitas
keratinase dapat dideteksi dengan memakai
kultur supernatan yang mengandung endapan
amonium sulfat. Enzim ini melakukan
aktivitas hidrolitik terhadap bulu secara
optimal pada suhu 45°C dengan pH 8,5.
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen-komponen dengan pengaruh arus
listrik (dalam medan listrik) sehingga terjadi
laju perpindahan. Jika suatu zat bermuatan
diberi potensial, maka zat tersebut akan
berpindah sepanjang medium yang kontinu ke
arah katode atau anode sesuai dengan muatan
yang dibawanya. Menurut Khopkar (1990),
elektroforesis diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok utama, yaitu elektroforesis Free
Boundary, elektroforesis zona/wilayah dan
elektroforesis kontinu.
Elektroforesis SDS-PAGE termasuk ke
dalam kelompok elektroforesis zona/wilayah,
yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan
berdasarkan
medium
penyangganya.
Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan gel
buatan sebagai medium penyangga. Gel yang
digunakan terbentuk dari polimerisasi
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
ARINI MEGIANDARI. Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari
Usus Biawak Air. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI dan IRMA H SUPARTO.
Enzim protease yang diisolasi dari lapisan atas (mukosa) usus biawak air
(Varanus salvator) memiliki aktivitas proteolitik. Penelitian ini bertujuan
mengisolasi dan mencirikan protease dari lapisan mukosa usus biawak air.
Lapisan mukosa usus biawak air (2%) dilarutkan dalam 50mM bufer fosfat
pH 7,0, kemudian disentrifus pada kecepatan 6000 G dan suhu 4 ºC selama 10
menit. Dari hasil sentrifus didapatkan ekstrak kasar enzim, kemudian dilakukan
analisis aktivitas enzim maksinum dengan memanaskan ekstrak pada selang suhu
45–65 ºC dan selang waktu 5–20 menit. Dari hasil analisis aktivitas enzim
maksimum didapatkan pada suhu 55 ºC waktu inkubasi 5 menit untuk sampel
duodenum, jejenum, ileum, dan kolon masing-masing sebesar 4,3482 U/ml,
3,9247, 3,9176 U/ml, dan 3,0353 U/ml. Protease dari ekstrak kasar enzim terdiri
atas tujuh pita dengan ukuran bobot molekul 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa,
48,47 kDa, 36,80 kDa, 24,28 kDa, 12,80 kDa. Enzim ini bekerja pada suhu
optimum 55 ºC dan pH optimum 9, serta dihambat oleh ion Ca2+ dan Mg2+. Uji
in vitro menggunakan substrat tepung bulu ayam tidak ditemukan adanya suatu
aktivitas keratinolitik.
ABSTRACT
ARINI MEGIANDARI. Isolation and Characterization of Protease Keratinolytic
Enzyme in Water Monitor Lizard Intestine. Supervised by DONDIN SAJUTHI
and IRMA H SUPARTO.
Protease enzyme isolated from mucosa layer in intestine water monitor
lizard (Varanus salvator) showed proteolytic activity. Therefore, the purpose of
this research was to isolate and characterize of protease produced by water
monitor lizard intestine.
The intestine mucous layer of water monitor lizard (2%) was dissolved in
50mM buffer phosphate pH 7,0, then centrifuged at 6000 G in 4 ºC temperature
for 10 minute. The centrifuged extract was used to analyze the maximum enzyme
activity by heating the extract at 45–65 ºC range temperature and 5–20 minute
range time. Maximum enzyme activity analysis obtained at 55 ºC for 5 minute for
the sample duodenum, jejunum, ileum, colon respectively were 4, 3482 U/ml,
3,9247 U/ml, 3,9176 U/ml, and 3,0353 U/ml. Protease from extract enzyme has
seven bands with molecular weight 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa, 48,47 kDa,
36,80 kDa, 24,28 kDa, and 12,80 kDa. The enzyme has optimum temperature at
55 ºC and optimum at pH 9, and also inhibited by ion Ca2+ and Mg2+. The in vitro
analysis used chicken powder showed no keratinase activity.
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul : Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak
Air
Nama : Arini Megiandari
NIM : G44204018
Disetujui
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD
NIP 130 536 684
Dr. dr. Irma H. Suparto, MS
NIP 131 606 776
Diketahui
Dekan Falkultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131 578 806
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini.
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan November 2008 dengan judul
Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak Air. Penelitian di
lakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Lembaga Penelitian dan
Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Penyusunan karya ilmiah ini tidak akan terwujud tanpa bantuan, bimbingan, dan saran
dari berbagai pihak. Oleh karena itu dengan selesaainya laporan ini, penulis mengucapkan
terima kasih kepada Prof. Drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD dan Dr. dr Irma H. Suparto,
MS selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan, saran, dan pengarahan
kepada penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan untuk keluargaku tercinta Bapak, Mama, Kakak, Suami, dan Anakku
Annindya Luviana Iriani yang telah memberikan dukungan moral maupun material,
Bapak mertua, iparku, dan adik sepupuku yang selalu memberikan doa, serta seluruh
keluarga besarku di Bogor, Sukabumi, Purworejo, dan Cilacap. Penelitian ini juga tidak
lepas dari bantuan beberapa pihak, oleh karena itu penghargaan penulis sampaikan
kepada Kak Willy, Bu Eni, Bu Nani, dan semua pegawai PSSP lainnya atas bantuan
yang diberikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dhesti, Tri, Anti, Asnel, Rima,
teman-teman Kimia Angkatan 41 lainnya dan angkatan 40 atas diskusi dan masukanmasukan yang sangat berharga. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kak Eko
dan Mas Hery atas bantuannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2008
Arini Megiandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 8 Mei 1986 dari ayah Sugiardi dan
ibu Wagiyem. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2006
penulis menikah dan dikaruniai saeorang anak bernama Annindya Luviana Iriani
pada 26 Februari 2007.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMU PGRI 4 Bogor dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan
di Laboratorium PT Haeng Nam Sejahtera Indonesia, Bogor pada tahun 2007.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... ix
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator) .............................................................
Enzim Keratinase .................................................................................
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis .............
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .....................................................................................
Metode Penelitian ................................................................................
3
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein .......................................................................................
Ciri Enzim Protease...............................................................................
Bobot Molekul (SDS-PAGE) ................................................................
Uji In Vitro Aktivitas Keratinase ...........................................................
5
5
8
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan...............................................................................................
Saran ...................................................................................................
8
9
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
9
LAMPIRAN .................................................................................................
11
1
2
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
Biawak air .................................................................................................
Pengaruh waktu inkubasi pada aktivitas protease........................................
Pengaruh suhu pada aktivitas enzim protease .............................................
Pengaruh pH pada aktivitas enzim protease................................................
Pengaruh ion logam pada aktivitas enzim protease .....................................
Analisis SDS-PAGE ..................................................................................
Uji in vitro .................................................................................................
1
5
6
6
7
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Bagan alir penelitian ..................................................................................
Prosedur pembuatan pereaksi kimia ...........................................................
Pembuatan kurva standar Bradford.............................................................
Data penentuan aktivitas enzim maksimum ................................................
Penentuan aktivitas maksimum ..................................................................
Contoh perhitungan aktivitas enzim ................................................................
Data pengaruh suhu, pH, dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum ..
Pembuatan kurva standar SDS-PAGE ........................................................
12
13
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
dalam saluran cerna biawak sehingga dapat
meningkatkan nilai ekonomi dari hewan
tersebut.
Latar Belakang
Biawak merupakan kelas reptil yang
kulitnya banyak dimanfaatkan sebagai bahan
perhiasan juga dagingnya sebagai bahan
makanan dan dipercaya dapat digunakan
untuk obat kulit. Jenis biawak yang paling
banyak dimanfaatkan dan dikonsumsi adalah
biawak air (Varanus salvator). Hasil limbah
dari pemanfaatan biawak tersebut belum
banyak digunakan seperti bagian organ
dalamnya, antara lain saluran cernanya.
Biawak merupakan hewan karnivora yang
memangsa berbagai jenis burung, ayam, ikan,
serta mamalia kecil seperti tikus dan cecurut.
Reptil ini memangsa korbannya hidup-hidup
termasuk dengan bulunya kemudian hasil
pencernaannya dikeluarkan dalam bentuk
feses tanpa ada sisa bulu ayam ataupun
burung. Hal ini diduga di dalam saluran
pencernaannya terdapat suatu zat atau enzim
yang dapat menghancurkan bulu tersebut.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin yang kaya akan sistein dan sistin. Oleh
karena itu diduga terdapat suatu enzim
keratinase di dalam saluran cerna biawak.
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim ini
dihasilkan di dalam sel tetapi dikeluarkan ke
dalam media untuk menghidrolisis dan
mendegradasi komponen kompleks menjadi
senyawa sederhana yang mudah larut. Enzim
keratinase banyak digunakan pada kosmetik
dan teknologi kulit. Secara komersial enzim
tersebut dapat diekstraksi dari Streptomyces
frandiae dan Streptomyces mikrolavus. Enzim
ini baik sekali untuk memecah ikatan disulfida
keratin pada bulu (Winarno 1983). Selain
untuk kosmetik, penggunaan enzim banyak
digunakan untuk pengolahan limbah dan juga
pakan hewan. Contohnya, enzim keratinase
ini dapat diaplikasikan pada limbah bulu ayam
yang dijadikan tepung bulu ayam sebagai
bahan pakan alternatif yang mempunyai
kandungan protein tinggi. Enzim keratinase
ini ditambahkan agar dapat mendegradasi bulu
ayam tersebut. Hal ini karena bulu ayam
mengandung keratin yang merupakan protein
serat khusus, tidak larut dalam air dan sulit
dicerna (Rawn 1989).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengetahui pencirian enzim protease yang
mempunyai aktivitas keratinase dari ekstrak
kasar lapisan atas (mukosa) usus biawak air.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi
informasi adanya suatu enzim keratinase
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator)
Biawak merupakan hewan yang masuk
dalam golongan kadal besar, suku biawakbiawakan (varanidae). Biawak dalam bahasa
lain disebut sebagai bayawak (Sunda),
menyawak atau nyambik (Jawa), berekai
(Madura), dan monitor lizard atau goanna
(Inggris). Biawak banyak macamnya, yang
terbesar dan terkenal ialah biawak komodo (V.
komodoensis), yang panjangnya dapat
melebihi 3 m.
Hewan berdarah dingin ini kerap ditemui
di desa-desa dan perkotaan di Indonesia barat.
Jenis biawak yang paling banyak adalah
biawak air dari jenis Varanus salvator.
Habitatnya di sekitar sungai dan rawa karena
merupakan hewan yang semi-akuatik, oleh
karena itu disebut sebagai biawak air.
Umumnya biawak dewasa mempunyai
panjang tubuh (moncong hingga ujung ekor)
sekitar 1 m, meskipun ada pula yang dapat
mencapai 2.5 m. Bobot badan biawak jantan
biasanya lebih besar sampai dua kali lipat
dibandingkan betina. Biawak bereproduksi
dengan bertelur dan paling tinggi pada bulan
April sampai dengan Oktober (Bennet 1998).
Ciri-ciri lainnya adalah adanya garis hitam
dengan tepian kuning sepanjang tubuhnya dari
kepala sampai ekor. Hewan ini biasanya
beRwarna kecoklatan (Byers 2000). Gambar 1
memperlihatkan gambar dari biawak air.
Gambar 1 Biawak air (Tan 2001).
Enzim Keratinase
Keratin merupakan protein serat yang
membentuk rambut, bulu, dan kuku, serta
kaya akan sistein dan sistin. Protein ini 14%
terdiri dari sistin dan disulfida sebagai
jembatan antar molekul (Moran et al. 1966).
Menurut Lehninger (1995), -keratin kaya
akan residu sistin yang dapat memberikan
jembatan disulfida di antara rantai polipeptida
yang berdekatan. Sistin terdiri atas dua
molekul sistein.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin. Adanya ikatan silang yang terbelit
dalam bentuk heliks dan saling berhubungan
melalui ikatan disulfida, ikatan hidrogen dan
interaksi hidrofobik, menyebabkan keratin
sangat stabil, tidak larut dalam air, tahan
terhadap asam atau basa kuat dan tahan
terhadap enzim proteolitik yang disekresikan
oleh kelenjar pencernaan (Lin et al. 1992).
Keratin dapat dipecah menjadi molekul
sederhana melalui reaksi kimia dan enzim.
Kemudian molekul ini dapat dicerna oleh
tripsin dan pepsin.
Tiap molekul protein dalam keratin
mempunyai bentuk spiral, yang disebut spiral- kanan. Kanan menunjukkan arah putaran
dalam spiral itu. Tiap putaran spiral
mengandung 3,6 residu asam amino. Jarak
dari satu kumparan ke kumparan berikutnya
adalah 5,4Å. Bentuk spiral ini tidak berubah
terutama berkat ikatan hidrogen antara satu
gugus amida-karbonil dan suatu gugus NH
yang jaraknya 3,6 satuan asam amino. Bentuk
spiral ini menghasilkan produk yang kuat,
lunak, dan bersifat serat (Girindra 1986).
Ikatan hidrogen antara suatu gugus asam
amino dengan suatu gugus karboksil
merupakan suatu penyumbang pada bentuk
suatu molekul protein. Interaksi inter dan
antar molekul juga menentukan struktur
(Wijaya 2001).
Enzim adalah biokatalis yang diproduksi
oleh sel hidup. Enzim mengkatalis reaksi
biokimia spesifik pada substrat dan sering kali
banyak enzim yang berbeda dibutuhkan
sehingga terbentuk kerja sama dan
keberhasilan reaksi metabolik yang dilakukan
sel (Wijaya 2001).
Faktor yang mempengaruhi aktivitas
enzim adalah pH, suhu, konsentrasi substrat,
konsentrasi enzim, dan waktu inkubasi. Suhu
meningkatkan aktivitas enzim sampai suhu
optimum, setelah itu protein enzim akan
terdenaturasi dan terjadi inaktivasi. Begitu
pula halnya dengan pH, pada pH optimum
aktivitasnya akan maksimum, sedangkan
diluar pH optimum aktivitasnya akan turun.
Konsentrasi substrat dan enzim, juga waktu
inkubasi yang bertambah akan meningkatkan
aktivitas enzim sampai tingkat tertentu,
setelah itu aktivitasnya tetap (Sears & Walsh
1993).
Klasifikasi enzim berdasarkan jenis reaksi
yang dikatalisis terdiri atas enam kelompok,
yaitu oksidoreduktase, transferase, hidrolase,
liase, isomerase, dan ligase (Suhartono 1989).
Protease merupakan enzim yang berperan
dalam reaksi yang melibatkan pemecahan
protein.
Enzim ini
dalam
kerjanya
membutuhkan air dan termasuk kelas
hidrolase. Enzim protease dihasilkan secara
ekstraseluler oleh tanaman, hewan, maupun
mikrob, dan mempunyai peranan yang sangat
penting dalam metabolisme sel dan
keteraturan proses dalam sel (Ward 1983).
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim
ekstraseluler adalah enzim dihasilkan di dalam
sel tetapi dikeluarkan ke dalam media untuk
menghidrolisis dan mendegradasi komponen
kompleks menjadi senyawa sederhana yang
mudah larut dan diserap oleh mikroorganisme.
Enzim intraseluler dihasilkan di dalam sel dan
melakukan aktivitasnya juga didalam sel.
Enzim protease berdasarkan cara kerjanya
dapat digolongkan dalam dua kelompok besar
yaitu endopeptidase dan eksopeptidase
(Winarno 1983).
Menurut Kim et al. (1992) aktivitas
keratinase dapat dideteksi dengan memakai
kultur supernatan yang mengandung endapan
amonium sulfat. Enzim ini melakukan
aktivitas hidrolitik terhadap bulu secara
optimal pada suhu 45°C dengan pH 8,5.
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen-komponen dengan pengaruh arus
listrik (dalam medan listrik) sehingga terjadi
laju perpindahan. Jika suatu zat bermuatan
diberi potensial, maka zat tersebut akan
berpindah sepanjang medium yang kontinu ke
arah katode atau anode sesuai dengan muatan
yang dibawanya. Menurut Khopkar (1990),
elektroforesis diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok utama, yaitu elektroforesis Free
Boundary, elektroforesis zona/wilayah dan
elektroforesis kontinu.
Elektroforesis SDS-PAGE termasuk ke
dalam kelompok elektroforesis zona/wilayah,
yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan
berdasarkan
medium
penyangganya.
Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan gel
buatan sebagai medium penyangga. Gel yang
digunakan terbentuk dari polimerisasi
akrilamida
dengan
N’N’-metilen
bisakrilamida sehingga terbentuk ikatan silang
karena polimerisasi akrilamida sendiri hanya
menghasilkan ikatan linear yang tidak
membentuk gel kaku (Girindra 1993).
Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat
pada suhu kamar dengan adanya katalis dan
inisiator. Katalis dan inisiator yang umum
digunakan
adalah
N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin
(TEMED)
dan
ammonium persulfat (APS) yang berperan
sebagai sumber radikal bebas yang akan
menginisiasi pembentukan polimer (Girindra
1993). Pada metode ini, digunakan sodium
dodesil sulfat (SDS) dan 2-merkaptoetanol.
Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan
detergen anionik yang bersama dengan 2merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan
rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi
konfigurasi acak. Hal ini disebabkan karena
pecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya
tereduksi menjadi gugus-gugus sulfhidrin
(Girindra 1993).
Bufer tris digunakan dalam proses
elektroforesis SDS-PAGE ini. Bufer tris
berfungsi sebagai medium penyangga untuk
mengarahkan dan mengatur arus, juga
digunakan sebagai pelarut materi sampel. Jadi,
arus antara elektrode diatur oleh ion sampel
dan bufer dalam larutan, sedangkan arus
lainnya diatur oleh elektron (Girindra 1993).
Pergerakan partikel di dalam media
tergantung pada ukuran partikel dan ukuran
media penunjang. Ukuran pori dari gel akan
ditentukan
oleh
konsentrasi
gel
poliakrilamida.
Protein
yang
besar
mempunyai mobilitas yang lebih lambat
dibandingkan dengan kompleks protein yang
lebih kecil. Bobot molekul protein dapat
ditentukan dengan kalibrasi menggunakan
standar protein yang sudah diketahui bobot
molekulnya. Teknik elektroforesis gel banyak
digunakan baik di bidang kimia maupun
biokimia karena memiliki banyak keuntungan,
diantaranya memiliki daya resolusi tinggi,
sederhana, dan mudah dibawa (Girindra
1993).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah usus
biawak air dewasa ukuran 1 m, akrilamida,
bis-akrilamida, buffer Tris-HCl pH 8.8 dan
6.8, buffer fosfat 50 mM pH 7, larutan buffer
universal pH 3-12, tirosin 5 mM, TCA
(trichloro acetic acid) 0.1 M, Na2CO3 0.4 M,
kasein
Hammarsten,
pereaksi
FolinCiocalteau, bovine serum albumin (BSA)
fraksi v, pereaksi Bradford, bulu ayam,
TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina),
larutan SDS 10% (b/v), glisin, gliserol 50%
(v/v), larutan 2-merkaptoetanol, ammonium
persulfat, marker
low molecular weight
(LMW) (Bio-Rad), bromfenol biru 1% (b/v),
coomassie brilliant blue R-250, metanol, asam
asetat glasial, dan NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2.
Alat-alat yang digunakan Spektronik
(Hexios), perangkat sel SDS-PAGE (BioRad),
sentrifus
mikro
berpendingin
(Beckman), tabung eppendorf, mikroskop
fotostereo (Labophot-2 Nikon).
Metode Penelitian
Ekstraksi dan preparasi sampel usus
Usus biawak air dicuci dengan akuades
dan diidentifikasi bagian-bagian ususnya.
Kemudian dibelah dan dipotong sesuai
bagiannya, yaitu duodenum, jejenum, ileum,
dan kolon sehingga terlihat bagian dalamnya.
Bagian dalam usus dikerok dengan hati-hati
untuk memperoleh lapisan atas usus (mukosa)
Lapisan atas usus (mukosa) (2% v/v)
dilarutkan dalam 50 mM bufer fosfat pH 7,0
dan diaduk dengan vorteks selama satu menit.
Kemudian larutan tersebut dipisahkan dengan
sentrifus pada kecepatan 6000 G dan suhu 4
°C selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh berupa ekstrak enzim. Ekstrak
enzim ini merupakan ekstrak kasar dari usus
yang kemudian digunakan untuk pencirian
enzim keratinase.
Kadar protein
Kadar protein ditentukan dengan metode
Bradford (1976), menggunakan bovine serum
albumin (BSA) sebagai standar protein.
Sebanyak 100 µl enzim ditambahkan ke
dalam tabung yang berisi 1ml akuades dan 1
ml pereaksi Bradfofd. Perlakuan pada blanko,
larutan enzim diganti dengan akuades.
Selanjutnya larutan tersebut diaduk dengan
vorteks dan didiamkan selama 20 menit pada
suhu ruang. Absorbans larutan diukur pada
panjang gelombang 595 nm.
Kurva standar protein menggunakan BSA
Fraksi V dengan kisaran konsentrasi 0,1–1,0
mg/ml. Konsentrasi protein enzim ditentukan
berdasarkan persamaan garis linier hubungan
antara konsentrasi standar protein dan
absorbansi.
Ciri enzim protease
Pencirian enzim protease diuji secara
kuantitatif dengan metode spektrofotometri
(Bregmeyer 1983) meliputi: pengaruh suhu,
pengaruh pH, dan pengaruh ion logam serta
SDS-PAGE untuk menentukan bobot molekul
pita protein
Analisis aktivitas protease
Aktivitas protease diukur secara kuantitatif
dengan metode Bergmeyer (1983) dengan
menggunakan substrat kasein Hammarsten
(2% b/v). Ada tiga perlakuan analisis yang
dilakukan, yaitu blanko, standar, dan sampel.
Sebanyak 50 µl larutan enzim ditambahkan ke
dalam tabung eppendorf yang berisi 250 µl
kasein 2% b/v dan 250 µl bufer fosfat 50 mM,
pH 7. Perlakuan pada blanko dan standar,
larutan enzim digantikan dengan akuades dan
tirosin 5 mM.
Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 55
°C selama 5 menit (suhu dan waktu inkubasi
optimum enzim). Reaksi hidrolisis dihentikan
dengan cara penambahan 500 µl TCA 0,1 M.
Pada blanko dan standar ditambahkan 50 µl
larutan enzim, sedangkan pada sampel
ditambahkan 50 µl akuades. Selanjutnya,
larutan diinkubasi kembali pada suhu 37 °C
selama 10 menit, dilanjutkan dengan sentrifus
pada kecepatan 6000 G dan suhu 4 °C selama
10 menit.
Sebanyak 375 µl supernatan ditambahkan
ke dalam tabung berisi 1,25 ml Na2CO3 0,4 M
dan 250 µl pereaksi Folin-Ciocalteau, lalu
diinkubasi kembali pada suhu 37 °C selama
20 menit. Absorbans larutan diukur pada
panjang gelombang 578 nm. Satu unit
aktivitas protease didefinisikan sebagai
jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1
µmol produk tirosin per menit pada kondisi
pengukuran.
Aktivitas
enzim
diukur
berdasarkan persamaan berikut:
Aktivitas
protease
(U/ml)
=
Asampel − Ablanko
faktorpengenceran
Χ
As tan dar − Ablanko
waktuinkub asi
Pengaruh suhu terhadap enzim
Penentuan suhu optimum dilakukan
dengan uji aktivitas enzim pada berbagai suhu
(45 65 °C) dalam 50mM bufer fosfat pH 7,0
selama 0–20 menit, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 6000 G dan suhu 4 °C selama 10
menit. Supernatan berupa filtrat enzim diuji
aktivitasnya secara kuantitatif.
Pengaruh pH terhadap enzim
Optimasi pH enzim dilakukan pada suhu
optimum dengan cara analisis aktivitas enzim
dengan menggunakan bufer universal pH
12.
Pengaruh ion logam terhadap enzim
Pengaruh aktivitas protease terhadap ion
logam ditentukan dengan cara inkubasi 100 µl
enzim dan 100 l larutan ion logam dengan
konsentrasi akhir 5 mM selama 1 jam pada
suhu ruang, lalu dianalisis aktivitas proteinnya
secara kuantitatif. Ion logam yang digunakan
yaitu NaCl, MgCl2, CaCl2, KCl.
SDS-PAGE
Analisis SDS-PAGE bertujuan mengetahui
berapa banyak pita yang muncul pada gel
(kualitatif) dan untuk menentukan nilai bobot
molekul dari pita yang terbentuk (kuantitatif).
Tahapan kerja yang dilakukan dalam
analisis SDS-PAGE meliputi: preparasi gel
pemisah dan penahan, preparasi sampel dan
loading, kondisi running, pewarnaan gel, dan
pelunturan warna
Preparasi gel pemisah dan gel penahan
Pembuatan gel pemisah 12% dan gel
penahan 4% untuk SDS-PAGE dilakukan
dengan komposisi yang tertera pada Tabel 1.
Tabel 1
Komposisi gel pemisah dan gel
penahan untuk SDS-PAGE.
Gel
Gel
penahan
pemisah
12%
4%
Pereaksi
Larutan A (ml)
6,78
0,74
Larutan B (ml)
3,90
Larutan C (ml)
1,31
Akuades (ml)
4,24
2,92
APS (ml)
75,00
25,00
TEMED (µl)
7,50
5,00
Total (ml)
15,00
5,00
Keterangan:
Larutan A-C (Lampiran 2),
APS=ammonium
persulfat,
TEMED=
N,N,N’,N’tetraetilendiamin.
Preparasi sampel dan loading
Khusus SDS-PAGE, sebanyak 20 µl
sampel ditambahkan dengan 10 µl bufer
sampel yang mengandung 2-merkaptoetanol,
lalu dipanaskan pada suhu 100 °C selama 2-5
menit, volume marker LMW yang digunakan
adalah 10 µl.
Uji In Vitro Aktivitas Keratinase
Uji
in
vitro
dilakukan
dengan
menggunakkan substrat bulu ayam yang
dibuat tepung dan dilakukan pengenceran
pada substrat tersebut untuk uji aktivitas dari
enzim keratinase.
Persiapan substrat tepung bulu ayam
Bulu ayam dicuci bersih dan dijemur
dengan menggunakan sinar matahari sampai
kering. Setelah kering bulu ayam digiling
sampai halus sehingga didapatkan tepung bulu
ayam yang dapat digunakan sebagai substrat
Uji aktivitas keratinase secara in vitro
Uji ini dilakukan penganceran sustrat
tepung bulu ayam dengan konsentrasi akhir
1%, 0,5%, 0,25%,0,125% yang ditambahkan
0,5 ml ekstrak kasar enzim dari lapisan
mukosa usus biawak air kemudian diinkubasi
selama 1 jam dan 3 jam yang kemudian dilihat
menggunakan mikroskop.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein Ekstrak Kasar Usus V.
salvator
Penentuan kadar protein berdasarkan
metode
Bradford
(1976),
dengan
menggunakan BSA sebagai standar protein.
Hasil analisis kadar protein untuk masingmasing bagian usus, yaitu duodenum,
jejenum, ileum, kolon didapatkan kadar
protein masing-masing sebesar 1,6956 mg/ml,
1,4615 mg/ml, 1,3946 mg/ml, dan 0,5585
mg/ml. Hasil ini menunjukkan adanya suatu
protein di dalam ekstrak kasar lapisan mukosa
usus biawak air. Kandungan protein yang
tertinggi pada bagian duodenum.
Ciri Enzim Protease
Pencirian enzim protease diuji secara
kuantitatif dengan metode Bergmeyer (1983)
yang meliputi pengaruh suhu, pengaruh pH,
pengaruh ion logam serta SDS-PAGE untuk
menentukan bobot molekul dari pita protein
enzim.
Analisis aktivitas enzim protease
Penentuan aktivitas enzim protease
maksimum dilakukan pada suhu optimum dan
waktu optimum. Pengaruh waktu inkubasi
pada suhu 55 °C dapat dilihat pada Gambar 2.
5,00
Aktivitas protease (U/ml)
Kondisi
running,
pewarnaan,
dan
pelunturan warna
Gel dijalankan (running) pada tegangan
150 V selama 1 jam dalam bufer
elektroforesis. Pada SDS-PAGE, setelah
elektroforesis, gel langsung diwarnai dengan
larutan pewarna (coomassie brilliant blue R250) selama 15 menit. Pelunturan warna pada
gel dilakukan dengan larutan peluntur
(metanol, asam asetat glasial, akuades)
berulang kali hingga didapatkan pita protein
biru dengan latar belakang gel tidak bewarna.
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
5
10
15
20
waktu inkubasi (menit)
Gambar 2 Pengaruh waktu inkubasi terhadap
aktivitas protease pada suhu
= duodenum,
optimum dengan
=
jejenum,
= ileum, x =
kolon.
Aktivitas enzim protease tertinggi pada
waktu inkubasi 5 menit dengan suhu 55 ºC
(Gambar 2). Aktivitas enzim protease
maksimum
didapatkan
untuk
sampel
duodenum, jejenum, ileum, dan kolon masingmasing sebesar 4, 3482 U/ml, 3,9247 U/ml,
3,9176 U/ml, dan 3,0353U/ml. Sedangkan
aktivitas enzim spesifik duodenum, jejenum,
ileum, dan kolon adalah 2,5643 U/mg,
2,68532 U/mg, 2,6090 U/mg, dan 5,4344
U/mg. Semakin
bertambahnya waktu
inkubasi terlihat bahwa aktivitas dari enzim
menurun hingga pada waktu inkubasi 20
menit aktivitas enzim mendekati nol atau
hampir tidak adanya aktivitas dari enzim
tersebut. Menurut Rahayu et al. (1989) prinsip
kerja metode ini, yaitu substrat kasein akan
terhidrolisis
oleh
protease
dengan
menggunakan bantuan air menjadi peptida dan
asam amino.
Laju pembentukan peptida dan asam
amino tersebut dapat dijadikan tolok ukur
aktivitas katalisis protease. Asam amino yang
terbentuk harus dipisahkan dari substrat yang
tidak terhidrolisis. Umumnya pemisahan ini
dilakukan
dengan
penambahan
TCA
(trichloro acetic acid) menyebabkan produk
yang mengandung peptida dan asam amino
akan larut, sedangkan protein yang tidak
terhidrolisis akan mengendap. Penambahan
TCA ini sekaligus akan menginaktifkan enzim
Pengaruh suhu terhadap enzim
Umumnya setiap enzim memiliki aktivitas
maksimum pada suhu tertentu, aktivitas enzim
akan
semakin
meningkat
dengan
bertambahnya suhu hingga suhu optimum
tercapai. Setelah itu kenaikan suhu lebih lanjut
akan menyebabkan aktivitas enzim menurun.
Pengaruh suhu terthadap enzim protease
ekstrak kasar lapisan atas (mukosa) usus
biawak air dapat dilihat pada Gambar 3.
aktivitas protease (U/ml)
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
45
55
65
suhu (C)
Gambar 3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas
=
enzim protease, dengan
jejenum,
duodenum, =
= ileum, x = kolon.
Aktivitas enzim protease kasar dari lapisan
mukosa usus biawak air yang tertinggi
terdapat pada suhu 55 °C. Suhu optimum
enzim dari bakteri Microbacterium sp adalah
50 °C(Thys & Brandelli 2006), 55 °C dari
bakteri Chryseobacterium sp. (Riffel et al.
2003) dan 60 °C dari bakteri Bacillus
licheniformis (Suntornsuk et al. 2004).
Untuk kebanyakan enzim, suhu optimum
adalah suhu sel atau di atas sel tempat enzimenzim berada. Kenaikan kecepatan aktivitas
enzim di bawah suhu optimum disebabkan
oleh kenaikan energi kinetik molekul-molekul
yang bereaksi. Akan tetapi bila suhu tetap
dinaikkan terus, energi kinetik molekulmolekul enzim menjadi demikian besar
sehingga melampaui penghalang energi untuk
memecahkan ikatan-ikatan sekunder yang
mempertahankan enzim dalam keadaan
aslinya atau keadaan katalitik enzim aktif.
Akibatnya struktur sekunder dan tersier hilang
disertai hilangnya aktivitas biologi (Harper
1979).
Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis
enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan
suhu akan meningkatkan energi molekul
substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju
reaksi enzim. Peningkatan suhu juga
berpengaruh terhadap perubahan konformasi
substrat sehingga sisi reaktif substrat
mengalami hambatan untuk memasuki sisi
aktif enzim dan menyebabkan turunnya
aktivitas enzim.
Kedua, peningkatan energi termal molekul
yang membentuk struktur protein enzim itu
sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksiinteraksi non kovalen (ikatan hidrogen,
interaksi van der Waals, interaksi hidrofobik,
dan interaksi elektrostatik) yang menjaga
struktur 3 dimensi enzim secara bersama-sama
sehingga enzim mengalami denaturasi.
Denaturasi menyebabkan struktur lipatan
enzim membuka pada bagian permukaannya
sehingga sisi aktif enzim berubah dan terjadi
penurunan aktivitas enzim (Hames & Hooper
2000).
Pengaruh pH terhadap enzim
Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH
medium tempat reaksi terjadi. Sebab itulah,
pada setiap percobaan dengan enzim
diperlukan bufer untuk mengontrol pH reaksi.
Pengaruh enzim protease terhadap pH dapat
dilihat pada Gambar 4.
1,200
aktivitas protease (U/ml)
protease. Asam-asam amino tirosin dan
triptofan yang larut dalam TCA akan bereaksi
dengan reagen folin menghasilkan warna biru.
Penambahan Na2CO3 bertujuan untuk
mendapatkan pH sekitar 11,5 yang merupakan
pH optimum untuk intensitas dan stabilitas
warna (Novo 1981). Warna yang terbentuk
diukur absorbansinya pada daerah sinar
tampak 578 nm. Besarnya serapan berbanding
lurus dengan konsentrasi protein yang
terhidrolisis.
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
Gambar 4
Pengaruh pH terhadap aktivitas
enzim protease, dengan
=
duodenum, =
jejenum,
= ileum, x = kolon.
Aktivitas enzim protease kasar maksimum
(pH optimum) pada ekstrak lapisan mukosa
usus biawak air terdapat pada pH 9,0 (50 mM
bufer fosfat) dengan nilai untuk duodenum,
jejenum, ileum, dan kolon masing-masing
Enzim keratinase memiliki pH optimum dari
bakteri Microbacterium sp adalah 7,5 (Thys &
Brandelli
2006),
8,0
dari
bakteri
Streptomyces. (Tapia &Contiero 2008) dan
8,5 dari bakteri Bacillus licheniformis
(Suntornsuk et al. 2004).
Pengaruh ion logam terhadap enzim
Beberapa enzim membutuhkan ion logam
sebagai kofaktor untuk mendukung efisiensi
katalitik enzim. Logam tersebut membantu
reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat
pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam
pengikatan antara enzim dengan s
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
ARINI MEGIANDARI. Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari
Usus Biawak Air. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI dan IRMA H SUPARTO.
Enzim protease yang diisolasi dari lapisan atas (mukosa) usus biawak air
(Varanus salvator) memiliki aktivitas proteolitik. Penelitian ini bertujuan
mengisolasi dan mencirikan protease dari lapisan mukosa usus biawak air.
Lapisan mukosa usus biawak air (2%) dilarutkan dalam 50mM bufer fosfat
pH 7,0, kemudian disentrifus pada kecepatan 6000 G dan suhu 4 ºC selama 10
menit. Dari hasil sentrifus didapatkan ekstrak kasar enzim, kemudian dilakukan
analisis aktivitas enzim maksinum dengan memanaskan ekstrak pada selang suhu
45–65 ºC dan selang waktu 5–20 menit. Dari hasil analisis aktivitas enzim
maksimum didapatkan pada suhu 55 ºC waktu inkubasi 5 menit untuk sampel
duodenum, jejenum, ileum, dan kolon masing-masing sebesar 4,3482 U/ml,
3,9247, 3,9176 U/ml, dan 3,0353 U/ml. Protease dari ekstrak kasar enzim terdiri
atas tujuh pita dengan ukuran bobot molekul 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa,
48,47 kDa, 36,80 kDa, 24,28 kDa, 12,80 kDa. Enzim ini bekerja pada suhu
optimum 55 ºC dan pH optimum 9, serta dihambat oleh ion Ca2+ dan Mg2+. Uji
in vitro menggunakan substrat tepung bulu ayam tidak ditemukan adanya suatu
aktivitas keratinolitik.
ABSTRACT
ARINI MEGIANDARI. Isolation and Characterization of Protease Keratinolytic
Enzyme in Water Monitor Lizard Intestine. Supervised by DONDIN SAJUTHI
and IRMA H SUPARTO.
Protease enzyme isolated from mucosa layer in intestine water monitor
lizard (Varanus salvator) showed proteolytic activity. Therefore, the purpose of
this research was to isolate and characterize of protease produced by water
monitor lizard intestine.
The intestine mucous layer of water monitor lizard (2%) was dissolved in
50mM buffer phosphate pH 7,0, then centrifuged at 6000 G in 4 ºC temperature
for 10 minute. The centrifuged extract was used to analyze the maximum enzyme
activity by heating the extract at 45–65 ºC range temperature and 5–20 minute
range time. Maximum enzyme activity analysis obtained at 55 ºC for 5 minute for
the sample duodenum, jejunum, ileum, colon respectively were 4, 3482 U/ml,
3,9247 U/ml, 3,9176 U/ml, and 3,0353 U/ml. Protease from extract enzyme has
seven bands with molecular weight 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa, 48,47 kDa,
36,80 kDa, 24,28 kDa, and 12,80 kDa. The enzyme has optimum temperature at
55 ºC and optimum at pH 9, and also inhibited by ion Ca2+ and Mg2+. The in vitro
analysis used chicken powder showed no keratinase activity.
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul : Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak
Air
Nama : Arini Megiandari
NIM : G44204018
Disetujui
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD
NIP 130 536 684
Dr. dr. Irma H. Suparto, MS
NIP 131 606 776
Diketahui
Dekan Falkultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131 578 806
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini.
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan November 2008 dengan judul
Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak Air. Penelitian di
lakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Lembaga Penelitian dan
Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Penyusunan karya ilmiah ini tidak akan terwujud tanpa bantuan, bimbingan, dan saran
dari berbagai pihak. Oleh karena itu dengan selesaainya laporan ini, penulis mengucapkan
terima kasih kepada Prof. Drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD dan Dr. dr Irma H. Suparto,
MS selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan, saran, dan pengarahan
kepada penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan untuk keluargaku tercinta Bapak, Mama, Kakak, Suami, dan Anakku
Annindya Luviana Iriani yang telah memberikan dukungan moral maupun material,
Bapak mertua, iparku, dan adik sepupuku yang selalu memberikan doa, serta seluruh
keluarga besarku di Bogor, Sukabumi, Purworejo, dan Cilacap. Penelitian ini juga tidak
lepas dari bantuan beberapa pihak, oleh karena itu penghargaan penulis sampaikan
kepada Kak Willy, Bu Eni, Bu Nani, dan semua pegawai PSSP lainnya atas bantuan
yang diberikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dhesti, Tri, Anti, Asnel, Rima,
teman-teman Kimia Angkatan 41 lainnya dan angkatan 40 atas diskusi dan masukanmasukan yang sangat berharga. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kak Eko
dan Mas Hery atas bantuannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2008
Arini Megiandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 8 Mei 1986 dari ayah Sugiardi dan
ibu Wagiyem. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2006
penulis menikah dan dikaruniai saeorang anak bernama Annindya Luviana Iriani
pada 26 Februari 2007.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMU PGRI 4 Bogor dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan
di Laboratorium PT Haeng Nam Sejahtera Indonesia, Bogor pada tahun 2007.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... ix
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator) .............................................................
Enzim Keratinase .................................................................................
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis .............
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .....................................................................................
Metode Penelitian ................................................................................
3
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein .......................................................................................
Ciri Enzim Protease...............................................................................
Bobot Molekul (SDS-PAGE) ................................................................
Uji In Vitro Aktivitas Keratinase ...........................................................
5
5
8
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan...............................................................................................
Saran ...................................................................................................
8
9
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
9
LAMPIRAN .................................................................................................
11
1
2
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
Biawak air .................................................................................................
Pengaruh waktu inkubasi pada aktivitas protease........................................
Pengaruh suhu pada aktivitas enzim protease .............................................
Pengaruh pH pada aktivitas enzim protease................................................
Pengaruh ion logam pada aktivitas enzim protease .....................................
Analisis SDS-PAGE ..................................................................................
Uji in vitro .................................................................................................
1
5
6
6
7
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Bagan alir penelitian ..................................................................................
Prosedur pembuatan pereaksi kimia ...........................................................
Pembuatan kurva standar Bradford.............................................................
Data penentuan aktivitas enzim maksimum ................................................
Penentuan aktivitas maksimum ..................................................................
Contoh perhitungan aktivitas enzim ................................................................
Data pengaruh suhu, pH, dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum ..
Pembuatan kurva standar SDS-PAGE ........................................................
12
13
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
dalam saluran cerna biawak sehingga dapat
meningkatkan nilai ekonomi dari hewan
tersebut.
Latar Belakang
Biawak merupakan kelas reptil yang
kulitnya banyak dimanfaatkan sebagai bahan
perhiasan juga dagingnya sebagai bahan
makanan dan dipercaya dapat digunakan
untuk obat kulit. Jenis biawak yang paling
banyak dimanfaatkan dan dikonsumsi adalah
biawak air (Varanus salvator). Hasil limbah
dari pemanfaatan biawak tersebut belum
banyak digunakan seperti bagian organ
dalamnya, antara lain saluran cernanya.
Biawak merupakan hewan karnivora yang
memangsa berbagai jenis burung, ayam, ikan,
serta mamalia kecil seperti tikus dan cecurut.
Reptil ini memangsa korbannya hidup-hidup
termasuk dengan bulunya kemudian hasil
pencernaannya dikeluarkan dalam bentuk
feses tanpa ada sisa bulu ayam ataupun
burung. Hal ini diduga di dalam saluran
pencernaannya terdapat suatu zat atau enzim
yang dapat menghancurkan bulu tersebut.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin yang kaya akan sistein dan sistin. Oleh
karena itu diduga terdapat suatu enzim
keratinase di dalam saluran cerna biawak.
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim ini
dihasilkan di dalam sel tetapi dikeluarkan ke
dalam media untuk menghidrolisis dan
mendegradasi komponen kompleks menjadi
senyawa sederhana yang mudah larut. Enzim
keratinase banyak digunakan pada kosmetik
dan teknologi kulit. Secara komersial enzim
tersebut dapat diekstraksi dari Streptomyces
frandiae dan Streptomyces mikrolavus. Enzim
ini baik sekali untuk memecah ikatan disulfida
keratin pada bulu (Winarno 1983). Selain
untuk kosmetik, penggunaan enzim banyak
digunakan untuk pengolahan limbah dan juga
pakan hewan. Contohnya, enzim keratinase
ini dapat diaplikasikan pada limbah bulu ayam
yang dijadikan tepung bulu ayam sebagai
bahan pakan alternatif yang mempunyai
kandungan protein tinggi. Enzim keratinase
ini ditambahkan agar dapat mendegradasi bulu
ayam tersebut. Hal ini karena bulu ayam
mengandung keratin yang merupakan protein
serat khusus, tidak larut dalam air dan sulit
dicerna (Rawn 1989).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengetahui pencirian enzim protease yang
mempunyai aktivitas keratinase dari ekstrak
kasar lapisan atas (mukosa) usus biawak air.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi
informasi adanya suatu enzim keratinase
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator)
Biawak merupakan hewan yang masuk
dalam golongan kadal besar, suku biawakbiawakan (varanidae). Biawak dalam bahasa
lain disebut sebagai bayawak (Sunda),
menyawak atau nyambik (Jawa), berekai
(Madura), dan monitor lizard atau goanna
(Inggris). Biawak banyak macamnya, yang
terbesar dan terkenal ialah biawak komodo (V.
komodoensis), yang panjangnya dapat
melebihi 3 m.
Hewan berdarah dingin ini kerap ditemui
di desa-desa dan perkotaan di Indonesia barat.
Jenis biawak yang paling banyak adalah
biawak air dari jenis Varanus salvator.
Habitatnya di sekitar sungai dan rawa karena
merupakan hewan yang semi-akuatik, oleh
karena itu disebut sebagai biawak air.
Umumnya biawak dewasa mempunyai
panjang tubuh (moncong hingga ujung ekor)
sekitar 1 m, meskipun ada pula yang dapat
mencapai 2.5 m. Bobot badan biawak jantan
biasanya lebih besar sampai dua kali lipat
dibandingkan betina. Biawak bereproduksi
dengan bertelur dan paling tinggi pada bulan
April sampai dengan Oktober (Bennet 1998).
Ciri-ciri lainnya adalah adanya garis hitam
dengan tepian kuning sepanjang tubuhnya dari
kepala sampai ekor. Hewan ini biasanya
beRwarna kecoklatan (Byers 2000). Gambar 1
memperlihatkan gambar dari biawak air.
Gambar 1 Biawak air (Tan 2001).
Enzim Keratinase
Keratin merupakan protein serat yang
membentuk rambut, bulu, dan kuku, serta
kaya akan sistein dan sistin. Protein ini 14%
terdiri dari sistin dan disulfida sebagai
jembatan antar molekul (Moran et al. 1966).
Menurut Lehninger (1995), -keratin kaya
akan residu sistin yang dapat memberikan
jembatan disulfida di antara rantai polipeptida
yang berdekatan. Sistin terdiri atas dua
molekul sistein.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin. Adanya ikatan silang yang terbelit
dalam bentuk heliks dan saling berhubungan
melalui ikatan disulfida, ikatan hidrogen dan
interaksi hidrofobik, menyebabkan keratin
sangat stabil, tidak larut dalam air, tahan
terhadap asam atau basa kuat dan tahan
terhadap enzim proteolitik yang disekresikan
oleh kelenjar pencernaan (Lin et al. 1992).
Keratin dapat dipecah menjadi molekul
sederhana melalui reaksi kimia dan enzim.
Kemudian molekul ini dapat dicerna oleh
tripsin dan pepsin.
Tiap molekul protein dalam keratin
mempunyai bentuk spiral, yang disebut spiral- kanan. Kanan menunjukkan arah putaran
dalam spiral itu. Tiap putaran spiral
mengandung 3,6 residu asam amino. Jarak
dari satu kumparan ke kumparan berikutnya
adalah 5,4Å. Bentuk spiral ini tidak berubah
terutama berkat ikatan hidrogen antara satu
gugus amida-karbonil dan suatu gugus NH
yang jaraknya 3,6 satuan asam amino. Bentuk
spiral ini menghasilkan produk yang kuat,
lunak, dan bersifat serat (Girindra 1986).
Ikatan hidrogen antara suatu gugus asam
amino dengan suatu gugus karboksil
merupakan suatu penyumbang pada bentuk
suatu molekul protein. Interaksi inter dan
antar molekul juga menentukan struktur
(Wijaya 2001).
Enzim adalah biokatalis yang diproduksi
oleh sel hidup. Enzim mengkatalis reaksi
biokimia spesifik pada substrat dan sering kali
banyak enzim yang berbeda dibutuhkan
sehingga terbentuk kerja sama dan
keberhasilan reaksi metabolik yang dilakukan
sel (Wijaya 2001).
Faktor yang mempengaruhi aktivitas
enzim adalah pH, suhu, konsentrasi substrat,
konsentrasi enzim, dan waktu inkubasi. Suhu
meningkatkan aktivitas enzim sampai suhu
optimum, setelah itu protein enzim akan
terdenaturasi dan terjadi inaktivasi. Begitu
pula halnya dengan pH, pada pH optimum
aktivitasnya akan maksimum, sedangkan
diluar pH optimum aktivitasnya akan turun.
Konsentrasi substrat dan enzim, juga waktu
inkubasi yang bertambah akan meningkatkan
aktivitas enzim sampai tingkat tertentu,
setelah itu aktivitasnya tetap (Sears & Walsh
1993).
Klasifikasi enzim berdasarkan jenis reaksi
yang dikatalisis terdiri atas enam kelompok,
yaitu oksidoreduktase, transferase, hidrolase,
liase, isomerase, dan ligase (Suhartono 1989).
Protease merupakan enzim yang berperan
dalam reaksi yang melibatkan pemecahan
protein.
Enzim ini
dalam
kerjanya
membutuhkan air dan termasuk kelas
hidrolase. Enzim protease dihasilkan secara
ekstraseluler oleh tanaman, hewan, maupun
mikrob, dan mempunyai peranan yang sangat
penting dalam metabolisme sel dan
keteraturan proses dalam sel (Ward 1983).
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim
ekstraseluler adalah enzim dihasilkan di dalam
sel tetapi dikeluarkan ke dalam media untuk
menghidrolisis dan mendegradasi komponen
kompleks menjadi senyawa sederhana yang
mudah larut dan diserap oleh mikroorganisme.
Enzim intraseluler dihasilkan di dalam sel dan
melakukan aktivitasnya juga didalam sel.
Enzim protease berdasarkan cara kerjanya
dapat digolongkan dalam dua kelompok besar
yaitu endopeptidase dan eksopeptidase
(Winarno 1983).
Menurut Kim et al. (1992) aktivitas
keratinase dapat dideteksi dengan memakai
kultur supernatan yang mengandung endapan
amonium sulfat. Enzim ini melakukan
aktivitas hidrolitik terhadap bulu secara
optimal pada suhu 45°C dengan pH 8,5.
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen-komponen dengan pengaruh arus
listrik (dalam medan listrik) sehingga terjadi
laju perpindahan. Jika suatu zat bermuatan
diberi potensial, maka zat tersebut akan
berpindah sepanjang medium yang kontinu ke
arah katode atau anode sesuai dengan muatan
yang dibawanya. Menurut Khopkar (1990),
elektroforesis diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok utama, yaitu elektroforesis Free
Boundary, elektroforesis zona/wilayah dan
elektroforesis kontinu.
Elektroforesis SDS-PAGE termasuk ke
dalam kelompok elektroforesis zona/wilayah,
yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan
berdasarkan
medium
penyangganya.
Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan gel
buatan sebagai medium penyangga. Gel yang
digunakan terbentuk dari polimerisasi
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
ARINI MEGIANDARI. Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari
Usus Biawak Air. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI dan IRMA H SUPARTO.
Enzim protease yang diisolasi dari lapisan atas (mukosa) usus biawak air
(Varanus salvator) memiliki aktivitas proteolitik. Penelitian ini bertujuan
mengisolasi dan mencirikan protease dari lapisan mukosa usus biawak air.
Lapisan mukosa usus biawak air (2%) dilarutkan dalam 50mM bufer fosfat
pH 7,0, kemudian disentrifus pada kecepatan 6000 G dan suhu 4 ºC selama 10
menit. Dari hasil sentrifus didapatkan ekstrak kasar enzim, kemudian dilakukan
analisis aktivitas enzim maksinum dengan memanaskan ekstrak pada selang suhu
45–65 ºC dan selang waktu 5–20 menit. Dari hasil analisis aktivitas enzim
maksimum didapatkan pada suhu 55 ºC waktu inkubasi 5 menit untuk sampel
duodenum, jejenum, ileum, dan kolon masing-masing sebesar 4,3482 U/ml,
3,9247, 3,9176 U/ml, dan 3,0353 U/ml. Protease dari ekstrak kasar enzim terdiri
atas tujuh pita dengan ukuran bobot molekul 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa,
48,47 kDa, 36,80 kDa, 24,28 kDa, 12,80 kDa. Enzim ini bekerja pada suhu
optimum 55 ºC dan pH optimum 9, serta dihambat oleh ion Ca2+ dan Mg2+. Uji
in vitro menggunakan substrat tepung bulu ayam tidak ditemukan adanya suatu
aktivitas keratinolitik.
ABSTRACT
ARINI MEGIANDARI. Isolation and Characterization of Protease Keratinolytic
Enzyme in Water Monitor Lizard Intestine. Supervised by DONDIN SAJUTHI
and IRMA H SUPARTO.
Protease enzyme isolated from mucosa layer in intestine water monitor
lizard (Varanus salvator) showed proteolytic activity. Therefore, the purpose of
this research was to isolate and characterize of protease produced by water
monitor lizard intestine.
The intestine mucous layer of water monitor lizard (2%) was dissolved in
50mM buffer phosphate pH 7,0, then centrifuged at 6000 G in 4 ºC temperature
for 10 minute. The centrifuged extract was used to analyze the maximum enzyme
activity by heating the extract at 45–65 ºC range temperature and 5–20 minute
range time. Maximum enzyme activity analysis obtained at 55 ºC for 5 minute for
the sample duodenum, jejunum, ileum, colon respectively were 4, 3482 U/ml,
3,9247 U/ml, 3,9176 U/ml, and 3,0353 U/ml. Protease from extract enzyme has
seven bands with molecular weight 66,54 kDa, 57,61 kDa, 48,94 kDa, 48,47 kDa,
36,80 kDa, 24,28 kDa, and 12,80 kDa. The enzyme has optimum temperature at
55 ºC and optimum at pH 9, and also inhibited by ion Ca2+ and Mg2+. The in vitro
analysis used chicken powder showed no keratinase activity.
ISOLASI DAN PENCIRIAN ENZIM PROTEASE
KERATINOLITIK DARI USUS BIAWAK AIR
ARINI MEGIANDARI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul : Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak
Air
Nama : Arini Megiandari
NIM : G44204018
Disetujui
Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD
NIP 130 536 684
Dr. dr. Irma H. Suparto, MS
NIP 131 606 776
Diketahui
Dekan Falkultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131 578 806
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan karya ilmiah ini.
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan November 2008 dengan judul
Isolasi dan Pencirian Enzim Protease Keratinolitik dari Usus Biawak Air. Penelitian di
lakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), Lembaga Penelitian dan
Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Penyusunan karya ilmiah ini tidak akan terwujud tanpa bantuan, bimbingan, dan saran
dari berbagai pihak. Oleh karena itu dengan selesaainya laporan ini, penulis mengucapkan
terima kasih kepada Prof. Drh. Dondin Sajuthi, MST, PhD dan Dr. dr Irma H. Suparto,
MS selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan, saran, dan pengarahan
kepada penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini.. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan untuk keluargaku tercinta Bapak, Mama, Kakak, Suami, dan Anakku
Annindya Luviana Iriani yang telah memberikan dukungan moral maupun material,
Bapak mertua, iparku, dan adik sepupuku yang selalu memberikan doa, serta seluruh
keluarga besarku di Bogor, Sukabumi, Purworejo, dan Cilacap. Penelitian ini juga tidak
lepas dari bantuan beberapa pihak, oleh karena itu penghargaan penulis sampaikan
kepada Kak Willy, Bu Eni, Bu Nani, dan semua pegawai PSSP lainnya atas bantuan
yang diberikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dhesti, Tri, Anti, Asnel, Rima,
teman-teman Kimia Angkatan 41 lainnya dan angkatan 40 atas diskusi dan masukanmasukan yang sangat berharga. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kak Eko
dan Mas Hery atas bantuannya selama ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2008
Arini Megiandari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 8 Mei 1986 dari ayah Sugiardi dan
ibu Wagiyem. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2006
penulis menikah dan dikaruniai saeorang anak bernama Annindya Luviana Iriani
pada 26 Februari 2007.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMU PGRI 4 Bogor dan pada tahun yang sama
penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan
di Laboratorium PT Haeng Nam Sejahtera Indonesia, Bogor pada tahun 2007.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... ix
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator) .............................................................
Enzim Keratinase .................................................................................
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis .............
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat .....................................................................................
Metode Penelitian ................................................................................
3
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein .......................................................................................
Ciri Enzim Protease...............................................................................
Bobot Molekul (SDS-PAGE) ................................................................
Uji In Vitro Aktivitas Keratinase ...........................................................
5
5
8
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan...............................................................................................
Saran ...................................................................................................
8
9
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
9
LAMPIRAN .................................................................................................
11
1
2
3
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
Biawak air .................................................................................................
Pengaruh waktu inkubasi pada aktivitas protease........................................
Pengaruh suhu pada aktivitas enzim protease .............................................
Pengaruh pH pada aktivitas enzim protease................................................
Pengaruh ion logam pada aktivitas enzim protease .....................................
Analisis SDS-PAGE ..................................................................................
Uji in vitro .................................................................................................
1
5
6
6
7
8
8
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Bagan alir penelitian ..................................................................................
Prosedur pembuatan pereaksi kimia ...........................................................
Pembuatan kurva standar Bradford.............................................................
Data penentuan aktivitas enzim maksimum ................................................
Penentuan aktivitas maksimum ..................................................................
Contoh perhitungan aktivitas enzim ................................................................
Data pengaruh suhu, pH, dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum ..
Pembuatan kurva standar SDS-PAGE ........................................................
12
13
15
16
17
18
19
20
PENDAHULUAN
dalam saluran cerna biawak sehingga dapat
meningkatkan nilai ekonomi dari hewan
tersebut.
Latar Belakang
Biawak merupakan kelas reptil yang
kulitnya banyak dimanfaatkan sebagai bahan
perhiasan juga dagingnya sebagai bahan
makanan dan dipercaya dapat digunakan
untuk obat kulit. Jenis biawak yang paling
banyak dimanfaatkan dan dikonsumsi adalah
biawak air (Varanus salvator). Hasil limbah
dari pemanfaatan biawak tersebut belum
banyak digunakan seperti bagian organ
dalamnya, antara lain saluran cernanya.
Biawak merupakan hewan karnivora yang
memangsa berbagai jenis burung, ayam, ikan,
serta mamalia kecil seperti tikus dan cecurut.
Reptil ini memangsa korbannya hidup-hidup
termasuk dengan bulunya kemudian hasil
pencernaannya dikeluarkan dalam bentuk
feses tanpa ada sisa bulu ayam ataupun
burung. Hal ini diduga di dalam saluran
pencernaannya terdapat suatu zat atau enzim
yang dapat menghancurkan bulu tersebut.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin yang kaya akan sistein dan sistin. Oleh
karena itu diduga terdapat suatu enzim
keratinase di dalam saluran cerna biawak.
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim ini
dihasilkan di dalam sel tetapi dikeluarkan ke
dalam media untuk menghidrolisis dan
mendegradasi komponen kompleks menjadi
senyawa sederhana yang mudah larut. Enzim
keratinase banyak digunakan pada kosmetik
dan teknologi kulit. Secara komersial enzim
tersebut dapat diekstraksi dari Streptomyces
frandiae dan Streptomyces mikrolavus. Enzim
ini baik sekali untuk memecah ikatan disulfida
keratin pada bulu (Winarno 1983). Selain
untuk kosmetik, penggunaan enzim banyak
digunakan untuk pengolahan limbah dan juga
pakan hewan. Contohnya, enzim keratinase
ini dapat diaplikasikan pada limbah bulu ayam
yang dijadikan tepung bulu ayam sebagai
bahan pakan alternatif yang mempunyai
kandungan protein tinggi. Enzim keratinase
ini ditambahkan agar dapat mendegradasi bulu
ayam tersebut. Hal ini karena bulu ayam
mengandung keratin yang merupakan protein
serat khusus, tidak larut dalam air dan sulit
dicerna (Rawn 1989).
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengetahui pencirian enzim protease yang
mempunyai aktivitas keratinase dari ekstrak
kasar lapisan atas (mukosa) usus biawak air.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi
informasi adanya suatu enzim keratinase
TINJAUAN PUSTAKA
Biawak Air (Varanus salvator)
Biawak merupakan hewan yang masuk
dalam golongan kadal besar, suku biawakbiawakan (varanidae). Biawak dalam bahasa
lain disebut sebagai bayawak (Sunda),
menyawak atau nyambik (Jawa), berekai
(Madura), dan monitor lizard atau goanna
(Inggris). Biawak banyak macamnya, yang
terbesar dan terkenal ialah biawak komodo (V.
komodoensis), yang panjangnya dapat
melebihi 3 m.
Hewan berdarah dingin ini kerap ditemui
di desa-desa dan perkotaan di Indonesia barat.
Jenis biawak yang paling banyak adalah
biawak air dari jenis Varanus salvator.
Habitatnya di sekitar sungai dan rawa karena
merupakan hewan yang semi-akuatik, oleh
karena itu disebut sebagai biawak air.
Umumnya biawak dewasa mempunyai
panjang tubuh (moncong hingga ujung ekor)
sekitar 1 m, meskipun ada pula yang dapat
mencapai 2.5 m. Bobot badan biawak jantan
biasanya lebih besar sampai dua kali lipat
dibandingkan betina. Biawak bereproduksi
dengan bertelur dan paling tinggi pada bulan
April sampai dengan Oktober (Bennet 1998).
Ciri-ciri lainnya adalah adanya garis hitam
dengan tepian kuning sepanjang tubuhnya dari
kepala sampai ekor. Hewan ini biasanya
beRwarna kecoklatan (Byers 2000). Gambar 1
memperlihatkan gambar dari biawak air.
Gambar 1 Biawak air (Tan 2001).
Enzim Keratinase
Keratin merupakan protein serat yang
membentuk rambut, bulu, dan kuku, serta
kaya akan sistein dan sistin. Protein ini 14%
terdiri dari sistin dan disulfida sebagai
jembatan antar molekul (Moran et al. 1966).
Menurut Lehninger (1995), -keratin kaya
akan residu sistin yang dapat memberikan
jembatan disulfida di antara rantai polipeptida
yang berdekatan. Sistin terdiri atas dua
molekul sistein.
Komponen utama pada bulu adalah protein
keratin. Adanya ikatan silang yang terbelit
dalam bentuk heliks dan saling berhubungan
melalui ikatan disulfida, ikatan hidrogen dan
interaksi hidrofobik, menyebabkan keratin
sangat stabil, tidak larut dalam air, tahan
terhadap asam atau basa kuat dan tahan
terhadap enzim proteolitik yang disekresikan
oleh kelenjar pencernaan (Lin et al. 1992).
Keratin dapat dipecah menjadi molekul
sederhana melalui reaksi kimia dan enzim.
Kemudian molekul ini dapat dicerna oleh
tripsin dan pepsin.
Tiap molekul protein dalam keratin
mempunyai bentuk spiral, yang disebut spiral- kanan. Kanan menunjukkan arah putaran
dalam spiral itu. Tiap putaran spiral
mengandung 3,6 residu asam amino. Jarak
dari satu kumparan ke kumparan berikutnya
adalah 5,4Å. Bentuk spiral ini tidak berubah
terutama berkat ikatan hidrogen antara satu
gugus amida-karbonil dan suatu gugus NH
yang jaraknya 3,6 satuan asam amino. Bentuk
spiral ini menghasilkan produk yang kuat,
lunak, dan bersifat serat (Girindra 1986).
Ikatan hidrogen antara suatu gugus asam
amino dengan suatu gugus karboksil
merupakan suatu penyumbang pada bentuk
suatu molekul protein. Interaksi inter dan
antar molekul juga menentukan struktur
(Wijaya 2001).
Enzim adalah biokatalis yang diproduksi
oleh sel hidup. Enzim mengkatalis reaksi
biokimia spesifik pada substrat dan sering kali
banyak enzim yang berbeda dibutuhkan
sehingga terbentuk kerja sama dan
keberhasilan reaksi metabolik yang dilakukan
sel (Wijaya 2001).
Faktor yang mempengaruhi aktivitas
enzim adalah pH, suhu, konsentrasi substrat,
konsentrasi enzim, dan waktu inkubasi. Suhu
meningkatkan aktivitas enzim sampai suhu
optimum, setelah itu protein enzim akan
terdenaturasi dan terjadi inaktivasi. Begitu
pula halnya dengan pH, pada pH optimum
aktivitasnya akan maksimum, sedangkan
diluar pH optimum aktivitasnya akan turun.
Konsentrasi substrat dan enzim, juga waktu
inkubasi yang bertambah akan meningkatkan
aktivitas enzim sampai tingkat tertentu,
setelah itu aktivitasnya tetap (Sears & Walsh
1993).
Klasifikasi enzim berdasarkan jenis reaksi
yang dikatalisis terdiri atas enam kelompok,
yaitu oksidoreduktase, transferase, hidrolase,
liase, isomerase, dan ligase (Suhartono 1989).
Protease merupakan enzim yang berperan
dalam reaksi yang melibatkan pemecahan
protein.
Enzim ini
dalam
kerjanya
membutuhkan air dan termasuk kelas
hidrolase. Enzim protease dihasilkan secara
ekstraseluler oleh tanaman, hewan, maupun
mikrob, dan mempunyai peranan yang sangat
penting dalam metabolisme sel dan
keteraturan proses dalam sel (Ward 1983).
Keratinase termasuk enzim protease yang
merupakan enzim ekstraseluler. Enzim
ekstraseluler adalah enzim dihasilkan di dalam
sel tetapi dikeluarkan ke dalam media untuk
menghidrolisis dan mendegradasi komponen
kompleks menjadi senyawa sederhana yang
mudah larut dan diserap oleh mikroorganisme.
Enzim intraseluler dihasilkan di dalam sel dan
melakukan aktivitasnya juga didalam sel.
Enzim protease berdasarkan cara kerjanya
dapat digolongkan dalam dua kelompok besar
yaitu endopeptidase dan eksopeptidase
(Winarno 1983).
Menurut Kim et al. (1992) aktivitas
keratinase dapat dideteksi dengan memakai
kultur supernatan yang mengandung endapan
amonium sulfat. Enzim ini melakukan
aktivitas hidrolitik terhadap bulu secara
optimal pada suhu 45°C dengan pH 8,5.
Sodium Dodecyl sulphate Polyacrilamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen-komponen dengan pengaruh arus
listrik (dalam medan listrik) sehingga terjadi
laju perpindahan. Jika suatu zat bermuatan
diberi potensial, maka zat tersebut akan
berpindah sepanjang medium yang kontinu ke
arah katode atau anode sesuai dengan muatan
yang dibawanya. Menurut Khopkar (1990),
elektroforesis diklasifikasikan menjadi tiga
kelompok utama, yaitu elektroforesis Free
Boundary, elektroforesis zona/wilayah dan
elektroforesis kontinu.
Elektroforesis SDS-PAGE termasuk ke
dalam kelompok elektroforesis zona/wilayah,
yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan
berdasarkan
medium
penyangganya.
Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan gel
buatan sebagai medium penyangga. Gel yang
digunakan terbentuk dari polimerisasi
akrilamida
dengan
N’N’-metilen
bisakrilamida sehingga terbentuk ikatan silang
karena polimerisasi akrilamida sendiri hanya
menghasilkan ikatan linear yang tidak
membentuk gel kaku (Girindra 1993).
Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat
pada suhu kamar dengan adanya katalis dan
inisiator. Katalis dan inisiator yang umum
digunakan
adalah
N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin
(TEMED)
dan
ammonium persulfat (APS) yang berperan
sebagai sumber radikal bebas yang akan
menginisiasi pembentukan polimer (Girindra
1993). Pada metode ini, digunakan sodium
dodesil sulfat (SDS) dan 2-merkaptoetanol.
Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan
detergen anionik yang bersama dengan 2merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan
rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi
konfigurasi acak. Hal ini disebabkan karena
pecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya
tereduksi menjadi gugus-gugus sulfhidrin
(Girindra 1993).
Bufer tris digunakan dalam proses
elektroforesis SDS-PAGE ini. Bufer tris
berfungsi sebagai medium penyangga untuk
mengarahkan dan mengatur arus, juga
digunakan sebagai pelarut materi sampel. Jadi,
arus antara elektrode diatur oleh ion sampel
dan bufer dalam larutan, sedangkan arus
lainnya diatur oleh elektron (Girindra 1993).
Pergerakan partikel di dalam media
tergantung pada ukuran partikel dan ukuran
media penunjang. Ukuran pori dari gel akan
ditentukan
oleh
konsentrasi
gel
poliakrilamida.
Protein
yang
besar
mempunyai mobilitas yang lebih lambat
dibandingkan dengan kompleks protein yang
lebih kecil. Bobot molekul protein dapat
ditentukan dengan kalibrasi menggunakan
standar protein yang sudah diketahui bobot
molekulnya. Teknik elektroforesis gel banyak
digunakan baik di bidang kimia maupun
biokimia karena memiliki banyak keuntungan,
diantaranya memiliki daya resolusi tinggi,
sederhana, dan mudah dibawa (Girindra
1993).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah usus
biawak air dewasa ukuran 1 m, akrilamida,
bis-akrilamida, buffer Tris-HCl pH 8.8 dan
6.8, buffer fosfat 50 mM pH 7, larutan buffer
universal pH 3-12, tirosin 5 mM, TCA
(trichloro acetic acid) 0.1 M, Na2CO3 0.4 M,
kasein
Hammarsten,
pereaksi
FolinCiocalteau, bovine serum albumin (BSA)
fraksi v, pereaksi Bradford, bulu ayam,
TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina),
larutan SDS 10% (b/v), glisin, gliserol 50%
(v/v), larutan 2-merkaptoetanol, ammonium
persulfat, marker
low molecular weight
(LMW) (Bio-Rad), bromfenol biru 1% (b/v),
coomassie brilliant blue R-250, metanol, asam
asetat glasial, dan NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2.
Alat-alat yang digunakan Spektronik
(Hexios), perangkat sel SDS-PAGE (BioRad),
sentrifus
mikro
berpendingin
(Beckman), tabung eppendorf, mikroskop
fotostereo (Labophot-2 Nikon).
Metode Penelitian
Ekstraksi dan preparasi sampel usus
Usus biawak air dicuci dengan akuades
dan diidentifikasi bagian-bagian ususnya.
Kemudian dibelah dan dipotong sesuai
bagiannya, yaitu duodenum, jejenum, ileum,
dan kolon sehingga terlihat bagian dalamnya.
Bagian dalam usus dikerok dengan hati-hati
untuk memperoleh lapisan atas usus (mukosa)
Lapisan atas usus (mukosa) (2% v/v)
dilarutkan dalam 50 mM bufer fosfat pH 7,0
dan diaduk dengan vorteks selama satu menit.
Kemudian larutan tersebut dipisahkan dengan
sentrifus pada kecepatan 6000 G dan suhu 4
°C selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh berupa ekstrak enzim. Ekstrak
enzim ini merupakan ekstrak kasar dari usus
yang kemudian digunakan untuk pencirian
enzim keratinase.
Kadar protein
Kadar protein ditentukan dengan metode
Bradford (1976), menggunakan bovine serum
albumin (BSA) sebagai standar protein.
Sebanyak 100 µl enzim ditambahkan ke
dalam tabung yang berisi 1ml akuades dan 1
ml pereaksi Bradfofd. Perlakuan pada blanko,
larutan enzim diganti dengan akuades.
Selanjutnya larutan tersebut diaduk dengan
vorteks dan didiamkan selama 20 menit pada
suhu ruang. Absorbans larutan diukur pada
panjang gelombang 595 nm.
Kurva standar protein menggunakan BSA
Fraksi V dengan kisaran konsentrasi 0,1–1,0
mg/ml. Konsentrasi protein enzim ditentukan
berdasarkan persamaan garis linier hubungan
antara konsentrasi standar protein dan
absorbansi.
Ciri enzim protease
Pencirian enzim protease diuji secara
kuantitatif dengan metode spektrofotometri
(Bregmeyer 1983) meliputi: pengaruh suhu,
pengaruh pH, dan pengaruh ion logam serta
SDS-PAGE untuk menentukan bobot molekul
pita protein
Analisis aktivitas protease
Aktivitas protease diukur secara kuantitatif
dengan metode Bergmeyer (1983) dengan
menggunakan substrat kasein Hammarsten
(2% b/v). Ada tiga perlakuan analisis yang
dilakukan, yaitu blanko, standar, dan sampel.
Sebanyak 50 µl larutan enzim ditambahkan ke
dalam tabung eppendorf yang berisi 250 µl
kasein 2% b/v dan 250 µl bufer fosfat 50 mM,
pH 7. Perlakuan pada blanko dan standar,
larutan enzim digantikan dengan akuades dan
tirosin 5 mM.
Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 55
°C selama 5 menit (suhu dan waktu inkubasi
optimum enzim). Reaksi hidrolisis dihentikan
dengan cara penambahan 500 µl TCA 0,1 M.
Pada blanko dan standar ditambahkan 50 µl
larutan enzim, sedangkan pada sampel
ditambahkan 50 µl akuades. Selanjutnya,
larutan diinkubasi kembali pada suhu 37 °C
selama 10 menit, dilanjutkan dengan sentrifus
pada kecepatan 6000 G dan suhu 4 °C selama
10 menit.
Sebanyak 375 µl supernatan ditambahkan
ke dalam tabung berisi 1,25 ml Na2CO3 0,4 M
dan 250 µl pereaksi Folin-Ciocalteau, lalu
diinkubasi kembali pada suhu 37 °C selama
20 menit. Absorbans larutan diukur pada
panjang gelombang 578 nm. Satu unit
aktivitas protease didefinisikan sebagai
jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1
µmol produk tirosin per menit pada kondisi
pengukuran.
Aktivitas
enzim
diukur
berdasarkan persamaan berikut:
Aktivitas
protease
(U/ml)
=
Asampel − Ablanko
faktorpengenceran
Χ
As tan dar − Ablanko
waktuinkub asi
Pengaruh suhu terhadap enzim
Penentuan suhu optimum dilakukan
dengan uji aktivitas enzim pada berbagai suhu
(45 65 °C) dalam 50mM bufer fosfat pH 7,0
selama 0–20 menit, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 6000 G dan suhu 4 °C selama 10
menit. Supernatan berupa filtrat enzim diuji
aktivitasnya secara kuantitatif.
Pengaruh pH terhadap enzim
Optimasi pH enzim dilakukan pada suhu
optimum dengan cara analisis aktivitas enzim
dengan menggunakan bufer universal pH
12.
Pengaruh ion logam terhadap enzim
Pengaruh aktivitas protease terhadap ion
logam ditentukan dengan cara inkubasi 100 µl
enzim dan 100 l larutan ion logam dengan
konsentrasi akhir 5 mM selama 1 jam pada
suhu ruang, lalu dianalisis aktivitas proteinnya
secara kuantitatif. Ion logam yang digunakan
yaitu NaCl, MgCl2, CaCl2, KCl.
SDS-PAGE
Analisis SDS-PAGE bertujuan mengetahui
berapa banyak pita yang muncul pada gel
(kualitatif) dan untuk menentukan nilai bobot
molekul dari pita yang terbentuk (kuantitatif).
Tahapan kerja yang dilakukan dalam
analisis SDS-PAGE meliputi: preparasi gel
pemisah dan penahan, preparasi sampel dan
loading, kondisi running, pewarnaan gel, dan
pelunturan warna
Preparasi gel pemisah dan gel penahan
Pembuatan gel pemisah 12% dan gel
penahan 4% untuk SDS-PAGE dilakukan
dengan komposisi yang tertera pada Tabel 1.
Tabel 1
Komposisi gel pemisah dan gel
penahan untuk SDS-PAGE.
Gel
Gel
penahan
pemisah
12%
4%
Pereaksi
Larutan A (ml)
6,78
0,74
Larutan B (ml)
3,90
Larutan C (ml)
1,31
Akuades (ml)
4,24
2,92
APS (ml)
75,00
25,00
TEMED (µl)
7,50
5,00
Total (ml)
15,00
5,00
Keterangan:
Larutan A-C (Lampiran 2),
APS=ammonium
persulfat,
TEMED=
N,N,N’,N’tetraetilendiamin.
Preparasi sampel dan loading
Khusus SDS-PAGE, sebanyak 20 µl
sampel ditambahkan dengan 10 µl bufer
sampel yang mengandung 2-merkaptoetanol,
lalu dipanaskan pada suhu 100 °C selama 2-5
menit, volume marker LMW yang digunakan
adalah 10 µl.
Uji In Vitro Aktivitas Keratinase
Uji
in
vitro
dilakukan
dengan
menggunakkan substrat bulu ayam yang
dibuat tepung dan dilakukan pengenceran
pada substrat tersebut untuk uji aktivitas dari
enzim keratinase.
Persiapan substrat tepung bulu ayam
Bulu ayam dicuci bersih dan dijemur
dengan menggunakan sinar matahari sampai
kering. Setelah kering bulu ayam digiling
sampai halus sehingga didapatkan tepung bulu
ayam yang dapat digunakan sebagai substrat
Uji aktivitas keratinase secara in vitro
Uji ini dilakukan penganceran sustrat
tepung bulu ayam dengan konsentrasi akhir
1%, 0,5%, 0,25%,0,125% yang ditambahkan
0,5 ml ekstrak kasar enzim dari lapisan
mukosa usus biawak air kemudian diinkubasi
selama 1 jam dan 3 jam yang kemudian dilihat
menggunakan mikroskop.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein Ekstrak Kasar Usus V.
salvator
Penentuan kadar protein berdasarkan
metode
Bradford
(1976),
dengan
menggunakan BSA sebagai standar protein.
Hasil analisis kadar protein untuk masingmasing bagian usus, yaitu duodenum,
jejenum, ileum, kolon didapatkan kadar
protein masing-masing sebesar 1,6956 mg/ml,
1,4615 mg/ml, 1,3946 mg/ml, dan 0,5585
mg/ml. Hasil ini menunjukkan adanya suatu
protein di dalam ekstrak kasar lapisan mukosa
usus biawak air. Kandungan protein yang
tertinggi pada bagian duodenum.
Ciri Enzim Protease
Pencirian enzim protease diuji secara
kuantitatif dengan metode Bergmeyer (1983)
yang meliputi pengaruh suhu, pengaruh pH,
pengaruh ion logam serta SDS-PAGE untuk
menentukan bobot molekul dari pita protein
enzim.
Analisis aktivitas enzim protease
Penentuan aktivitas enzim protease
maksimum dilakukan pada suhu optimum dan
waktu optimum. Pengaruh waktu inkubasi
pada suhu 55 °C dapat dilihat pada Gambar 2.
5,00
Aktivitas protease (U/ml)
Kondisi
running,
pewarnaan,
dan
pelunturan warna
Gel dijalankan (running) pada tegangan
150 V selama 1 jam dalam bufer
elektroforesis. Pada SDS-PAGE, setelah
elektroforesis, gel langsung diwarnai dengan
larutan pewarna (coomassie brilliant blue R250) selama 15 menit. Pelunturan warna pada
gel dilakukan dengan larutan peluntur
(metanol, asam asetat glasial, akuades)
berulang kali hingga didapatkan pita protein
biru dengan latar belakang gel tidak bewarna.
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
5
10
15
20
waktu inkubasi (menit)
Gambar 2 Pengaruh waktu inkubasi terhadap
aktivitas protease pada suhu
= duodenum,
optimum dengan
=
jejenum,
= ileum, x =
kolon.
Aktivitas enzim protease tertinggi pada
waktu inkubasi 5 menit dengan suhu 55 ºC
(Gambar 2). Aktivitas enzim protease
maksimum
didapatkan
untuk
sampel
duodenum, jejenum, ileum, dan kolon masingmasing sebesar 4, 3482 U/ml, 3,9247 U/ml,
3,9176 U/ml, dan 3,0353U/ml. Sedangkan
aktivitas enzim spesifik duodenum, jejenum,
ileum, dan kolon adalah 2,5643 U/mg,
2,68532 U/mg, 2,6090 U/mg, dan 5,4344
U/mg. Semakin
bertambahnya waktu
inkubasi terlihat bahwa aktivitas dari enzim
menurun hingga pada waktu inkubasi 20
menit aktivitas enzim mendekati nol atau
hampir tidak adanya aktivitas dari enzim
tersebut. Menurut Rahayu et al. (1989) prinsip
kerja metode ini, yaitu substrat kasein akan
terhidrolisis
oleh
protease
dengan
menggunakan bantuan air menjadi peptida dan
asam amino.
Laju pembentukan peptida dan asam
amino tersebut dapat dijadikan tolok ukur
aktivitas katalisis protease. Asam amino yang
terbentuk harus dipisahkan dari substrat yang
tidak terhidrolisis. Umumnya pemisahan ini
dilakukan
dengan
penambahan
TCA
(trichloro acetic acid) menyebabkan produk
yang mengandung peptida dan asam amino
akan larut, sedangkan protein yang tidak
terhidrolisis akan mengendap. Penambahan
TCA ini sekaligus akan menginaktifkan enzim
Pengaruh suhu terhadap enzim
Umumnya setiap enzim memiliki aktivitas
maksimum pada suhu tertentu, aktivitas enzim
akan
semakin
meningkat
dengan
bertambahnya suhu hingga suhu optimum
tercapai. Setelah itu kenaikan suhu lebih lanjut
akan menyebabkan aktivitas enzim menurun.
Pengaruh suhu terthadap enzim protease
ekstrak kasar lapisan atas (mukosa) usus
biawak air dapat dilihat pada Gambar 3.
aktivitas protease (U/ml)
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
45
55
65
suhu (C)
Gambar 3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas
=
enzim protease, dengan
jejenum,
duodenum, =
= ileum, x = kolon.
Aktivitas enzim protease kasar dari lapisan
mukosa usus biawak air yang tertinggi
terdapat pada suhu 55 °C. Suhu optimum
enzim dari bakteri Microbacterium sp adalah
50 °C(Thys & Brandelli 2006), 55 °C dari
bakteri Chryseobacterium sp. (Riffel et al.
2003) dan 60 °C dari bakteri Bacillus
licheniformis (Suntornsuk et al. 2004).
Untuk kebanyakan enzim, suhu optimum
adalah suhu sel atau di atas sel tempat enzimenzim berada. Kenaikan kecepatan aktivitas
enzim di bawah suhu optimum disebabkan
oleh kenaikan energi kinetik molekul-molekul
yang bereaksi. Akan tetapi bila suhu tetap
dinaikkan terus, energi kinetik molekulmolekul enzim menjadi demikian besar
sehingga melampaui penghalang energi untuk
memecahkan ikatan-ikatan sekunder yang
mempertahankan enzim dalam keadaan
aslinya atau keadaan katalitik enzim aktif.
Akibatnya struktur sekunder dan tersier hilang
disertai hilangnya aktivitas biologi (Harper
1979).
Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis
enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan
suhu akan meningkatkan energi molekul
substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju
reaksi enzim. Peningkatan suhu juga
berpengaruh terhadap perubahan konformasi
substrat sehingga sisi reaktif substrat
mengalami hambatan untuk memasuki sisi
aktif enzim dan menyebabkan turunnya
aktivitas enzim.
Kedua, peningkatan energi termal molekul
yang membentuk struktur protein enzim itu
sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksiinteraksi non kovalen (ikatan hidrogen,
interaksi van der Waals, interaksi hidrofobik,
dan interaksi elektrostatik) yang menjaga
struktur 3 dimensi enzim secara bersama-sama
sehingga enzim mengalami denaturasi.
Denaturasi menyebabkan struktur lipatan
enzim membuka pada bagian permukaannya
sehingga sisi aktif enzim berubah dan terjadi
penurunan aktivitas enzim (Hames & Hooper
2000).
Pengaruh pH terhadap enzim
Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH
medium tempat reaksi terjadi. Sebab itulah,
pada setiap percobaan dengan enzim
diperlukan bufer untuk mengontrol pH reaksi.
Pengaruh enzim protease terhadap pH dapat
dilihat pada Gambar 4.
1,200
aktivitas protease (U/ml)
protease. Asam-asam amino tirosin dan
triptofan yang larut dalam TCA akan bereaksi
dengan reagen folin menghasilkan warna biru.
Penambahan Na2CO3 bertujuan untuk
mendapatkan pH sekitar 11,5 yang merupakan
pH optimum untuk intensitas dan stabilitas
warna (Novo 1981). Warna yang terbentuk
diukur absorbansinya pada daerah sinar
tampak 578 nm. Besarnya serapan berbanding
lurus dengan konsentrasi protein yang
terhidrolisis.
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
Gambar 4
Pengaruh pH terhadap aktivitas
enzim protease, dengan
=
duodenum, =
jejenum,
= ileum, x = kolon.
Aktivitas enzim protease kasar maksimum
(pH optimum) pada ekstrak lapisan mukosa
usus biawak air terdapat pada pH 9,0 (50 mM
bufer fosfat) dengan nilai untuk duodenum,
jejenum, ileum, dan kolon masing-masing
Enzim keratinase memiliki pH optimum dari
bakteri Microbacterium sp adalah 7,5 (Thys &
Brandelli
2006),
8,0
dari
bakteri
Streptomyces. (Tapia &Contiero 2008) dan
8,5 dari bakteri Bacillus licheniformis
(Suntornsuk et al. 2004).
Pengaruh ion logam terhadap enzim
Beberapa enzim membutuhkan ion logam
sebagai kofaktor untuk mendukung efisiensi
katalitik enzim. Logam tersebut membantu
reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat
pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam
pengikatan antara enzim dengan s