Karakterisasi Fag Litik Proteus mirabilis Resisten Antibiotik Asal Feses Penderita Diare

KARAKTERISASI FAG LITIK Proteus mirabilis
RESISTEN ANTIBIOTIK ASAL FESES PENDERITA DIARE

RACHMI AFRIANI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Fag Litik
Proteus mirabilis Resisten Antibiotik Asal Feses Penderita Diare adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014

Rachmi Afriani
NIM G351120301

RINGKASAN
RACHMI AFRIANI. Karakterisasi Fag Litik Proteus mirabilis Resisten
Antibiotik Asal Feses Penderita Diare. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan
IMAN RUSMANA.
Penyakit diare masih menjadi salah satu penyebab utama tingginya angka
kematian di negara berkembang, termasuk Indonesia. Diare dapat disebabkan oleh
berbagai mikroorganisme seperti virus, protozoa dan bakteri enteropatogen.
Proteus mirabilis merupakan salah satu bakteri enteropatogen kelompok Gram
negatif dari famili Enterobacteriacea yang dapat menyebabkan diare. Sebanyak
94 isolat Proteus berhasil diisolasi dari 518 sampel feses anak penderita diare
dengan persentase P. mirabilis sebesar 91.5 % dan P. penneri sebesar 8.5%.
Selain itu, terdapat 8 bakteri enteropatogen termasuk Proteus spp dengan jumlah 6
isolat yang berhasil diisolasi dari 100 sampel feses anak penderita diare berumur
di bawah 5 tahun. Penggunaan antibiotik yang telah lama dipakai sebagai terapi

dalam mengatasi infeksi bakteri patogen saat ini dilaporkan sudah tidak efektif,
karena banyaknya bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik. P. mirabilis
termaksuk bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik ampicillin, amoxicillin
dan trimethoprim-sulfomethoxazole. Fag litik sebagai virus penginfeksi bakteri
dapat digunakan untuk terapi alternatif yang dapat mengendalikan pertumbuhan
bakteri patogen manusia. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan dan mengkarakterisasi fag litik yang dapat melisiskan P. mirabilis
yang telah resisten terhadap antibiotik.
Fag litik P. mirabilis diisolasi dari berbagai sumber fag, yaitu limbah cair
rumah tangga, feses ayam dan kambing, limbah padat peternakan ayam, air sungai
Ciparigi dan air sungai Situ Letik. Isolasi fag litik P. mirabilis berhasil didapatkan
dari limbah peternakan ayam dan air sungai Situ Letik, Dramaga dengan jumlah 3
isolat. Masing-masing isolat menunjukkan morfologi plak yang berbeda dengan
diameter mencapai 2 mm pada setiap plak yang muncul. Isolat fag 1 memiliki
morfologi plak berbentuk bulat, bening dan memiliki cincin disekitar plak. Isolat
fag 2 memiliki morfologi plak berbentuk bulat, samar tanpa ada cincin disekitar
plak, sedangkan isolat fag 3 memiliki morfologi plak berbentuk bulat, bening
tanpa ada cincin disekitar plak. Ketiga isolat fag ini memiliki tingkat stabilitas
yang berbeda walaupun disimpan pada suhu yang sama dan di dalam bufer yang
sama, yaitu bufer Saline Magnesium (SM). Isolat fag 1 dan 3 tidak dapat

ditumbuhkan kembali saat dilakukan tahapan produksi fag. Hasil kisaran inang
isolat fag 2 sebagai fag P. mirabilis yang berhasil dipurifikasi dan diproduksi
menunjukkan bahwa fag litik P. mirabilis bersifat spesifik. Fag litik P. mirabilis
tidak melisiskan bakteri Salmonella sp., Bacillus pumilus, Photobacterium
damselae dan EPEC K.1.1.
Analisis morfologi fag P. mirabilis menggunakan transmission electrom
microscope (TEM) menunjukkan kepala fag berbentuk heksagonal ikosahedral
dan ekor yang panjang berbentuk tabung heliks. Ciri-ciri yang dimiliki oleh fag
litik P. mirabilis tersebut termasuk ke dalam ordo Caudovirales famili
Myoviridae. Diameter kepala fag P. mirabilis adalah sebesar 68.185 nm, panjang
ekor sebesar 109.091 nm dan diameter ekor fag sebesar 18.182 nm. Hasil analisis

SDS-PAGE menunjukkan adanya delapan pita protein dengan bobot molekul
yang bervariasi sebesar 90.50, 82.03, 74.35, 43.31, 37.37, 30.70, 27.83 dan 20.72
kDa. Molekul protein dengan berat tertentu menunjukkan penyusun komponen
fag seperti kepala, ekor dan serabut ekor. Hasil perhitungan terhadap konsentrasi
protein fag P. mirabilis menunjukkan bahwa konsentrasi proteinnya sebesar
316.198 µg/mL.
Kata kunci : diare, fag litik, Proteus mirabilis

SUMMARY
RACHMI AFRIANI. Characterization Lytic Phage of Proteus mirabilis
Antibiotics Resistant from Feces of Diarrheal Patient. Supervised by SRI
BUDIARTI and IMAN RUSMANA.
Diarrheal disease remains one of the main causes of death in developing
countries, including Indonesia. Diarrhea can be caused by a variety of
microorganisms such as viruses, protozoa and bacterial enteropathogens. Proteus
mirabilis is a Gram-negative bacteria enteropathogens group of families
Enterobacteriacea which can cause diarrhea. A total of 94 isolates of Proteus
were isolated from faecal samples of 518 children with diarrhea by percentage of
P. mirabilis 91.5% and P. penneri 8.5%. In addition, there are 8 bacterial
enteropathogens including Proteus spp with 6 isolates that were isolated from
stool samples of 100 children with diarrhea aged under 5 years. Antibiotics has
been long used as a therapy to overcome the current pathogenic bacterial
infection. Antibiotic treatment has been reported to be ineffective due to the
emergence of antibiotic resistant bacteria, including P. mirabilis. P. mirabilis was
resistant to ampicillin, amoxicillin and trimethoprim-sulfomethoxazole. Infection
of lytic phages can be used as alternative therapies to control pathogenic bacteria.
Therefore, this study aimed to obtain and characterize the lytic phage that can lyse
P. mirabilis that were resistant to antibiotics.

Lytic phages P. mirabilis were isolated from various sources, namely
domestic wastewater, feces of chicken and goat, chicken farm sewage, Ciparigi
and Situ Letik river. Three isolates of lytic P. mirabilis phages were obtained from
sewage of chicken farms and Situ Letik river, Dramaga. The isolates had different
plaque morphology with a diameter up to 2 mm. Phage isolate 1 has plaque
morphology round, translucent and has a ring around the plaque. Phage isolate 2
has plaque morphology round, with no ring around the cryptic plaques, whereas
phage isolate 3 has a round-shaped plaque morphology, without any clear ring
around the plaque. All three isolates of this phage have a different level of
stability even it kept at the same temperature and buffer, the buffer is Saline
Magnesium (SM). Phage isolate 1 and 3 could not be grown back when phage
production stages done. Results of host range phage isolate 2 as P. mirabilis
phage purified and produced successful show that P. mirabilis lytic phages was
specific. P. mirabilis lytic phages did not lyse Salmonella sp., Bacillus pumilus,
Photobacterium damselae and EPEC K.1.1.
Morphological analysis of P. mirabilis phage using electrom transmission
microscope (TEM) showed the hexagonal-shaped phage, icosahedral head and a
long tail tubular helix. The characteristics possessed by P. mirabilis phage was
included in order Caudovirales and Myoviridae family. P. mirabilis phage head
diameter was equal 68.185 nm, tail length of 109.091 nm and phage tail diameter

of 18.182 nm. The results of Sodium Dodecyl Sulphate-Poly Acrilamide Gel
Electrophoresis (SDS-PAGE) analysis showed the presence of eight protein bands
with molecular weights varying by 90.50, 82.03, 74.35, 43.31, 37.37, 30.70, 27.83
and 20.72 kDa. Protein molecule with a certain weight indicated constituent

components such as phage heads, tails and tail fibers. The proteins concentration
of P. mirabilis phage is 316.1λ8 g/mL.

Keywords: diarrhea, lytic phage, Proteus mirabilis

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI FAG LITIK Proteus mirabilis
RESISTEN ANTIBIOTIK ASAL FESES PENDERITA DIARE

RACHMI AFRIANI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr drh Sri Murtini, MSi

Judul Tesis
Nama

NIM

: Karakterisasi Fag Litik Proteus mirabilis Resisten Antibiotik
Asal Feses Penderita Diare
: Rachmi Afriani
: G351120301

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr dr Sri Budiarti
Ketua

Dr Ir Iman Rusmana
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Anja Meryandini, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 29 Agustus 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas berkat rahmat,
hidayah dan karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2013
sampai Mei 2014 ini ialah Karakterisasi Fag Litik Proteus mirabilis Resisten
Antibiotik Asal Feses Penderita Diare.
Terima kasih, penghargaan dan apresiasi penulis ucapkan kepada ibu Dr dr
Sri Budiarti selaku ketua komisi pembimbing, yang telah memberikan bimbingan,
perhatian, keteladanan, arahan, nasihat dan motivasi, membagikan ilmu,

memberikan dorongan semangat yang tiada henti kepada penulis sejak awal
pemilihan tema penelitian hingga penulisan tesis ini. Penulis banyak tergugah
dengan kata “SEMANGAT” yang sering beliau ucapkan sehingga penulis tetap
bersemangat dalam menjalankan penelitian hingga menyelesaikan penulisan tesis
ini. Selain itu, terima kasih dan apresiasi setinggi-tingginya penulis ucapkan
kepada bapak Dr Ir Iman Rusmana selaku anggota komisi pembimbing yang
telah memberikan ide-ide cemerlang beliau kepada penulis, bimbingan, masukan,
serta logika ilmiah beliau yang sangat banyak membantu penulis selama
menjalankan penelitian dan menyelesaikan tesis. Penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada ibu Prof Dr Anja Meryandini, MS selaku ketua Program
Studi Mikrobiologi dan ibu Dr drh Sri Murtini, MSi selaku penguji luar komisi
pada ujian tesis yang telah memberikan masukan untuk kesempurnaan tesis ini.
Ungkapan terima kasih tak lupa penulis ucapkan untuk ibu Ita selaku
asisten peneliti di Laboratorium TEM dan Histologi Lembaga Eijkman Jakarta
Pusat, serta ibu Dewi selaku teknisi di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan
Biomedis PPSHB IPB yang telah banyak membagikan ilmu dan pengalamannya
kepada penulis. Beliau dengan hati ikhlasnya meluangkan waktu dan tenaga demi
kelancaran proses penelitian ini. Ungkapan sayang dan terima kasih yang tak
terhingga penulis ucapkan untuk ayahanda Syech Idham Choled dan ibunda
Nining Mariani Azwar atas semua dukungan, motivasi, nasehat dan doa-doa

mereka yang senantiasa mengiringi setiap langkah penulis. Terima kasih abah dan
ibu atas segala perjuangan dan pengorbanan ikhlas tanpa pamrih yang penulis
rasakan dari kecil hingga sampai pada titik ini. Semoga Allah SWT memberikan
kesempatan kepada penulis agar dapat menjadi anak yang berbakti bagi abah, ibu
dan keluarga yang sangat penulis sayangi. Kepada seluruh keluarga di Pontianak
dan Sintang, adik Syech Indah Rahmawati, Syech M. Reza Fahlevi dan Syech
Dinda Hanriani, bu Upik, tek Atik, ayah Daus, tek buyung, om Hen, uni Vety dan
Agung yang tak pernah putus memberikan doa, semangat dan dukungan kepada
penulis agar terus semangat menyelesaikan penelitian ini.
Terima kasih untuk sahabat-sahabat terhebat, Hamtini Yamin, Vita, Wulan,
Henny, Yeni, Anik, Novy, Aar, Nezharia, Anja, Lia, Ika, Leny, Kapli, Ira, teteh
Ipit, ibu Nurdin yang telah banyak membantu dan menyemangati penulis serta
kepada teman-teman Mikrobiologi 2012 dan rekan-rekan lain yang tidak dapat
penulis sebutkan satu persatu. Terima kasih untuk pelajaran berharga tentang arti
sahabat yang telah penulis dapatkan dari orang-orang yang juga berjuang untuk
membahagiakan keluarga dan menjadi mutiara di dalam keluarga.

Semoga bantuan, dukungan, perhatian dan doa yang telah diberikan kepada
penulis mendapat berkah dan balasan pahala yang banyak dari Allah SWT. Akhir
kata semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan
khususnya ilmu mikrobiologi.

Bogor, September 2014

Rachmi Afriani

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xiv

DAFTAR GAMBAR

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

viv

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Perumusan Masalah

2

Tujuan Penelitian

2

Manfaat Penelitian

2

Ruang Lingkup Penelitian

2

TINJAUAN PUSTAKA

3

Karakteristik Proteus mirabilis

3

Patogenisitas Proteus mirabilis

3

Karakteristik Fag

4

Penelitian dan Aplikasi Fag

5

METODE PENELITIAN

6

Kerangka Penelitian

6

Waktu dan Tempat Penelitian

6

Peremajaan Proteus mirabilis

7

Reidentifikasi dan Uji Patogenisitas Proteus mirabilis

7

Sensitifitas Proteus mirabilis terhadap Antibiotik

7

Isolasi Fag

7

Produksi Fag

8

Titrasi Fag

9

Penentuan Kisaran Inang Fag

9

Pengamatan Morfologi Fag dengan Transmision Electron Microscope (TEM) 9
Karakterisasi Protein
HASIL DAN PEMBAHASAN

9
11

Hasil

11

Pembahasan

15

SIMPULAN DAN SARAN

19

Simpulan

19

Saran

19

DAFTAR PUSTAKA

20

LAMPIRAN

24

RIWAYAT HIDUP

27

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5

Hasil identifikasi KIT API 20E bakteri P. mirabilis
Resistensi P. mirabilis terhadap beberapa antibiotik
Hasil isolasi fag dari berbagai sumber fag
Karakteristik isolat-isolat fag litik P. mirabilis
Kisaran inang fag P. mirabilis

11
12
12
13
13

DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alur penelitian
2 Morfologi fag P. mirabilis menggunakan TEM model JEOL JEM-1010
dengan pewarnaan 2% uranil asetat
3 Kisaran berat molekul protein fag P. mirabilis pada SDS-PAGE

6
14
14

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Pembuatan pereaksi Bradford untuk pengukuran konsentrasi protein
Kurva standar protein
Komposisi bahan dalam pembuatan gel pengumpul dan pemisah
Prosedur pewarnaan silver staining dan komposisi larutannya
Hasil pewarnaan Gram, morfologi dan hemolisin P. mirabilis
Morfologi plak dari tiga isolat fag litik P. mirabilis

24
24
25
25
26
26

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit diare masih menjadi salah satu penyebab utama tingginya angka
kematian di negara berkembang, termasuk Indonesia. Diare dapat disebabkan oleh
berbagai mikroorganisme seperti virus, protozoa dan bakteri enteropatogen.
Proteus mirabilis merupakan salah satu bakteri enteropatogen kelompok Gram
negatif dari famili Enterobacteriacea yang dapat menyebabkan diare. Silham
(2012) melaporkan dari 518 sampel feses anak penderita diare terdapat sekitar 94
isolat Proteus dengan persentase Proteus mirabilis sebesar 91.5 % dan Proteus
penneri sebesar 8.5%. Hasil penelitian Kilic et al. (2007) menunjukkan bahwa
terdapat 8 bakteri enteropatogen termaksuk Proteus spp. dengan jumlah 6 isolat
yang berhasil diisolasi dari 100 sampel feses anak penderita diare berumur di
bawah 5 tahun.
Langkah pengobatan yang paling sering digunakan untuk mengendalikan
penyakit diare akibat P. mirabilis adalah dengan pemberian antibiotik yang dapat
menghambat pertumbuhan dan atau membunuh bakteri patogen tersebut. Namun,
beberapa penelitian melaporkan bahwa saat ini penggunaan antibiotik untuk
mengendalikan bakteri patogen ini menjadi tidak efektif digunakan karena
timbulnya resistensi P. mirabilis terhadap antibiotik. Kim et al. (2004)
menyatakan bahwa beberapa isolat P. mirabilis multiresisten terhadap sepuluh
jenis antibiotik, yaitu: ampicillin, gentamicin, ceftazidime, cefotaxime,
cefuroxime, cefalothin, cefepime, piperacillin, trimethoprim/sulfamethoxazole dan
ciprofloxacin. Hasil penelitian Noriyuki et al. (2003) menunjukkan bahwa
beberapa isolat P. mirabilis memiliki gen ESBL (extended-spectrum βlactamases) yang berperan dalam peningkatan resistensi P. mirabilis terhadap
antibotik golongan β- lactam.
Bakteri P. mirabilis yang resisten antibiotik dapat mencemari air dan
makanan. Seiring dengan pesatnya perkembangan ilmu pengetahuan dan
teknologi maka banyak penelitian dilakukan untuk mencari dan mengetahui agen
biokontrol yang bersifat ramah lingkungan untuk mengatasi pencemaran air dan
makanan oleh P. mirabilis, salah satunya dengan penggunaan fag litik.
Penggunaan fag litik dalam mengontrol pertumbuhan bakteri patogen
manusia merupakan suatu metode alternatif alami yang bersifat ramah
lingkungan. Sumber fag yang paling umum digunakan untuk mereduksi bakteri
patogen pencemar air dan makanan dapat diisolasi dari tinja, berbagai macam
bahan pangan, air, limbah, tanah, dan jaringan tubuh yang terinfeksi. Beberapa fag
telah diaplikasikan sebagai biokontrol pencemaran makanan, diantaranya fag litik
Enterobacter sakazaki yang diaplikasikan pada susu formula bayi (Kim 2007), fag
litik Salmonella dan Campylobacter pada karkas ayam (Goode et al. 2003), fag
litik FR38 yang diaplikasikan pada sosis, susu dan air mampu menurunkan
cemaran Salmonella P38 indigenous secara signifikan (Sartika 2012).
Aplikasi fag litik sebagai biokontrol bakteri patogen diantaranya adalah fag
litik Listeria monocytogenes yang diaplikasikan pada keju untuk mencegah
penyakit listeriosis (Carlton et al. 2005). Budiarti et al. (2011) melaporkan adanya
infektivitas fag litik terhadap enteropatogenik Escherichia coli (EPEC K.1.1)

2

resisten antibiotik yang diisolasi dari pasien penderita diare di Indonesia.
Penelitian efektivitas fag litik terhadap bakteri patogen P. mirabilis resisten
antibiotik yang dapat mencemari air, makanan serta penyebab diare belum pernah
dilakukan, oleh karena itu penelitian ini penting dilakukan untuk mengetahui
efektivitas fag litik agar dapat digunakan sebagai biokontrol pencemaran air dan
makanan yang disebabkan oleh P. mirabilis.
Perumusan Masalah
Bakteri P. mirabilis merupakan salah satu bakteri enteropatogen penyebab
diare. Banyak penelitian melaporkan P. mirabilis multiresisten terhadap beberapa
antibiotik, diantaranya antibiotik ampicillin, gentamicin, ciprofloxacin dan
sulfamethoxazole. Oleh karena itu, diperlukan terapi alternatif yang dapat
mengendalikan pertumbuhan bakteri patogen. Terapi alternatif yang dapat
dilakukan adalah dengan menggunakan fag litik. Fag litik merupakan virus
penginfeksi bakteri yang dapat melisiskan dinding sel bakteri sehingga fag litik
dapat digunkaan sebagai agen biokontrol terhadap P. mirabilis. Fag litik bersifat
non toksik dan aman digunakan sebagai metode alternatif alami untuk mereduksi
dan mengontrol pertumbuhan bakteri P. mirabilis yang sering mengontaminasi air
dan makanan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan dan mengkarakterisasi fag litik
yang efektif melisiskan P. mirabilis resisten antibiotik .
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan sebagai biokontrol
terhadap pencemaran air dan makanan yang disebabkan oleh bakteri P. mirabilis
sehingga dapat mencegah penyakit diare.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi peremajaan P. mirabilis,
verifikasi P. mirabilis, uji resistensi P. mirabilis terhadap beberapa antibiotik,
isolasi fag, titrasi fag, penentuan kisaran inang fag, pengamatan morfologi fag
dengan transmision electron microscope (TEM) dan karakterisasi protein fag
dengan sodium dodecyl sulphate-poly acrilamide gel electrophoresis (SDSPAGE).

3

TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Proteus mirabilis
Proteus mirabilis adalah bakteri Gram negatif anggota famili
Enterobacteriaceae yang terdapat dalam saluran pencernaan manusia dan hewan.
Bakteri ini berbentuk batang (1.5 x 2.0 m), tidak membentuk spora, bergerak
sangat aktif dengan flagella peritrik (Jacobsen et al. 2008). Bakteri P. mirabilis
tumbuh optimum pada suhu 35-37 °C, berbentuk batang pendek dengan 6-10
flagella peritrik jika ditumbuhkan di dalam media cair (Manos dan Belas 2006).
Karakteristik biokimia bakteri ini umumnya memfermentasi xilosa, namun
tidak memfermentasi laktosa, manitol, dulsitol, adonitol, sorbitol, arabinosa dan
rhamnosa. Uji oksidase negatif, uji urease positif dan uji lisin dekarboksilase
negatif. P. mirabilis memberi reaksi positif terhadap uji sitrat dan ornithin
dekarboksilase serta menghasilkan hidrogen sulfida (O’hara et al. 2000).
Bakteri P. mirabilis sebagai salah satu flora normal ditemukan hidup pada
saluran pencernaan mamalia dalam jumlah yang kecil, namun tetap memiliki
peranan untuk mencegah kolonisasi bakteri lain melalui kompetisi bakteri dan
mencegah melekatnya mikroorganisme patogen pada mukosa usus (Collins dan
Gibson 1999). Pada tahun 1979 dilaporkan adanya wabah P. mirabilis yang
multiresisten terhadap antibiotik ampisilin, tetrasiklin, carbenicillin,
klorampenikol, cephalothin, colistin dan aminoglikosida. Bakteri P. mirabilis
yang resisten terhadap 7 antibiotik dilaporkan menjadi agen utama penyebab
infeksi pada 90 pasien di Inggris pada tahun 1λ87 (O’hara et al. 2000). Hasil
penelitian Tibbetts et al. (2008) menunjukkan adanya isolat P. mirabilis yang
multiresisten terhadap imipenem, meropenem dan ertapenem.
Patogenisitas Proteus mirabilis
Faktor virulensi yang terlibat dalam patogenisitas P. mirabilis dapat dibagi
menjadi dua kelompok: 1) protein, enzim serta produk yang disekresikan lainnya,
dan 2) struktur permukaan seperti flagella. Faktor virulensi yang paling signifikan
adalah: urease, Zapa (protease yang secara khusus menurunkan imunoglobulin
IgA dan IgG), lipopolisakarida, protein pada membran luar, hemolisin, dan enzim
metaloprotease (Burall et al. 2004). Gendlina et al. (2002) menyatakan
kemampuan P. mirabilis dan P. penneri dalam memproduksi enzim urease lebih
tinggi daripada spesies bakteri lainnya. Enzim urease memecah urea menjadi
amonia dan karbondioksida yang dapat menyebabkan peningkatan pH sehingga
dapat meningkatkan kolonisasi spesies bakteri lain seperti Helicobacter pylori
(Kuwahara et al. 2000).
Infeksi P. mirabilis dapat ditransmisikan melalui sumber nosokomial
seperti dari makanan rumah sakit dan peralatannya, melalui cairan intravena dan
kontak dengan permukaan kulit yang terkontaminasi. Kateter yang dipasang
dalam waktu yang lama merupakan salah satu sumber utama dari kolonisasi dan

4

infeksi P. mirabilis (Stickler dan Hughes 1999). Bakteri P. mirabilis memiliki
flagella peritrik yang memungkinkannya bergerak dan pindah ke sel lain lalu
membentuk koloni (Jansen et al. 2003).
Karakteristik Fag
Fag adalah virus yang menginfeksi sel bakteri, mengganggu kegiatan
metabolisme dan mengakibatkan lisis pada sel bakteri (Sulakvelidze et al. 2001).
Fag ditemukan oleh Frederick W. Twort pada tahun 1λ15 dan Felix d’Herelle
pada tahun 1917. Saat itu, Twort mengamati adanya koloni bakteri yang lisis.
Fenomena lisis pada koloni bakteri terjadi dari satu koloni bakteri ke koloni
bakteri lainnya. Koloni bakteri lisis yang difiltrasi menggunakan membran filter
masih dapat melisiskan koloni, namun jika filtrat dipanaskan maka sifat litiknya
hilang dan tidak terdapat koloni bakteri yang menjadi lisis. Twort menyimpulkan
bahwa fenomena lisis tersebut disebabkan oleh virus. Felix d’Herelle menemukan
fenomena yang sama pada tahun 1917, oleh karena itu disebut fenomena Twortd’Herelle (Pelczar dan Chan 2007).
Fag memiliki kemampuan menginfeksi bakteri, namun tidak dapat
menginfeksi tumbuhan, hewan dan manusia. Fag bersifat parasit obligat
intraselular yang dapat menggandakan diri di dalam sel bakteri, mengandung
asam nukleat berupa ss-DNA, ds-DNA, ss-RNA atau ds-RNA yang dilindungi
oleh suatu selubung protein yang disebut kapsid. Kapsid ini terdiri atas subunitsubunit kapsomer, sedangkan kapsomer terdiri atas subunit- subunit protein yang
disebut protomer (Snyder dan Champness 2003).
Siklus hidup fag terdiri atas litik dan lisogenik. Mekanisme replikasi fag
litik terdiri atas beberapa tahap, yaitu: adsorpsi, penetrasi, sintesis, pematangan,
dan lisis sel. Fag litik yang menginfeksi sel bakteri sebagai sel inang akan
bereplikasi di dalam sel inang, membentuk fag baru, lalu melisiskan sel inang.
Pada tahap adsorpsi, ujung ekor fag melekat pada dinding sel melalui reseptor
pada permukaan sel. Reseptor dapat berupa lipopolisakarida, flagella, pili,
karbohidrat atau protein pada membran dinding sel (Madigan et al. 2011).
Pelekatan fag pada sel bakteri atau sel inang diikuti dengan proses
penetrasi asam nukleat fag ke dalam sel bakteri. Penetrasi fag ke dalam sel inang
bersifat mekanis dan dibantu dengan proses enzimatis. Tahap transkrispi fage
disandi oleh gen awal, gen tengah dan gen akhir. Produk gen awal dan gen tengah
berupa enzim nuklease yang akan menguraikan DNA bakteri. Produk gen tengah
akan mengakibatkan enzim restriksi bakteri tidak dapat menguraikan DNA fag
karena adanya penggantian nukleotida menjadi 5-hidroksimetilsitosin. Produk gen
tengah juga berperan sebagai enzim polimerase dan ligase yang terlibat dalam
replikasi fag. Gen akhir menyandikan protein penyusun kepala, serabut ekor dan
enzim lisozim (Kutter dan Sulakvelidze 2005). Fag memasuki tahap pematangan
setelah proses replikasi dan transkripsi selesai. Tahap pematangan diawali dengan
pengemasan asam nukleat yang baru disintesis ke dalam selubung protein yang
disebut kapsid. Fag yang telah matang akan keluar dengan jumlah yang sangat
banyak dari sel inang yang telah lisis. Fag-fag tersebut akan menginfeksi sel
bakteri yang lain dan siklus litik akan diulang kembali (Madigan et al. 2011).
Fag terdistribusi luas dan dan dapat ditemukan pada habitat yang dihuni
oleh bakteri. Fag dapat diisolasi dari berbagai macam bahan pangan seperti fag

5

Propionibacterium freudenreichii pada keju swiss (Gautier et al. 1999) dan fag
Escherichia coli pada wortel (Endley et al. 2003). Sumber fag lainnya adalah
limbah cair rumah tangga. Sunarti (2012) menyatakan bahwa jumlah fag sebanyak
3,36 x 104 PFU/mL ditemukan pada limbah cair rumah tangga. Fag ini dapat
menginfeksi isolat bakteri Salmonella P38. Hasil penelitian Iswadi (2012)
menunjukkan bahwa fag juga umum ditemukan di lingkungan, terutama pada
sampel limbah cair. Limbah merupakan habitat bagi banyak bakteri sehingga di
dalam limbah mengandung banyak fag bagi bakteri-bakteri tertentu, terutama
bakteri fekal (coliform).
Penelitian dan Aplikasi Fag
Aplikasi aktivitas fag semakin banyak diteliti. Penelitian-penelitian fag
semakin banyak dikembangkan sejak Ernest Hanbury Hankin melakukan
pengamatan fag yang menginfeksi Vibrio cholerae pada tahun 1896 di India
(Skurnik dan Strauch 2006). Pada tahun 1λ1λ, Felix d’Herelle mengaplikasikan
fag sebagai terapi terhadap penyakit disentri hemorrhagic pada ayam yang
disebabkan oleh Bacillus gallinarum (Kutter dan Sulakvelidze 2005). Doyle et al.
(2007) melaporkan pada perang dunia kedua, Soviet dan Jerman mengaplikasikan
fag untuk digunakan pada terapi penyakit disentri. Saat senyawa antibiotik
ditemukan pada tahun 1940-an, peneltian dan aplikasi fag sebagai agen terapi
mengalami penurunan. Namun, seiring dengan adanya peningkatan jumlah bakteri
yang resisten terhadap antibiotik, saat ini penelitian tentang fag mengalami
peningkatan (Doyle et al. 2007).
Beberapa penelitian melaporkan bahwa aplikasi fag terbukti efektif dalam
mereduksi kontaminasi bakteri patogen pada bahan pangan. Park et al. (2000)
melaporkan bahwa fag memiliki potensi untuk mengontrol kontaminasi
Lactococcus garviae dan Pseudomonas plecoglossicida pada ikan. Leverentz et
al. (2001) menggunakan fag untuk mengurangi kontaminasi Salmonella pada
buah melon. Hasil penelitian Modi et al. (2001) menunjukkan bahwa fag yang
digunakan dalam starter keju cheddar mampu menekan kontaminasi S. enteritidis.
Fag juga dapat mengurangi kontaminasi S. typhimurium pada sosis ayam
(Whichard et al. 2003). Pao et al. (2004) menyatakan fag mampu mereduksi
pertumbuhan S. typhimurium dan S. enteritidis pada biji brokoli dan biji sawi.
Fag telah diaplikasikan sebagai antibakteri bagi bakteri-bakteri patogen
manusia yang telah resisten terhadap antibiotik. Sulakvelidze et al. (2001)
menyatakan fag menginfeksi beberapa bakteri patogen penyebab infeksi seperti
Staphylococcus, Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella dan Salmonella yang telah
resisten terhadap antibiotik. Fag dilaporkan telah digunakan untuk mengontrol
pertumbuhan Enterococcus resisten vancomisin (VRE) dan Staphylococcus
aureus resisten methicillin (MRSA) (Projan 2004).

6

METODE PENELITIAN
Kerangka Penelitian
Penelitian ini terdiri dari 6 tahapan kerja. Tahapan kerja penelitian
disajikan pada Gambar 1.
Peremajaan Proteus mirabilis

Reidentifikasi dan Uji Patogenisitas Proteus mirabilis

Isolasi Fage
a.
b.
c.
d.
e.

Pengambilan Sampel
Filtrasi Sampel
Pencawanan Fag
Purifikasi Fag
Kuantifikasi Fag (PFU/mL)

Penentuan Kisaran Inang Fag

Pengamatan Morfologi Fag dengan Transmission
Electron Microscope (TEM)

Karakterisasi Protein Fag dengan SDS-PAGE

Gambar 1 Diagram alur penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan mulai bulan September 2013 sampai Mei 2014 di
Laboratorium Bioteknologi Hewan, Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi (PPSHB) IPB Darmaga dan Laboratorium TEM dan Histologi
Lembaga Eijkman Biologi Molekular Jakarta.

7

Peremajaan Proteus mirabilis
Bakteri P. mirabilis resisten antibiotik hasil isolasi dari feses penderita
diare ditumbuhkan pada media cair Tryptone Soy Bean (TSB) (Difco), kemudian
ditumbuhkan dengan cara digores menggunakan metode kuadran pada media
Salmonella shigella agar (SSA) (Himedia) dan diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 24 jam. Koloni tunggal yang terbentuk diambil dan ditumbuhkan pada
media agar miring SS kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
Bakteri uji P. mirabilis kemudian disimpan pada suhu 4 oC untuk digunakan
sebagai stok bakteri uji.
Reidentifikasi dan Uji Patogenisitas Proteus mirabilis
Tahapan reidentifikasi P. mirabilis dilakukan menggunakan uji pewarnaan
gram dan API KIT 20E. Uji patogenisitas dilakukan pada media Blood Agar.
Bakteri digores pada media Blood Agar secara aseptis. Pengamatan terhadap
perubahan warna media Blood Agar dilakukan pada 3 jam dan 5 jam pertama,
kemudian inkubasi dilanjutkan hingga 24 jam untuk menentukan faktor virulen
yang berperan dalam patogenisitas bakteri P. mirabilis.
Sensitifitas Proteus mirabilis terhadap Antibiotik
Proteus mirabilis diuji sensitifitasnya terhadap 4 jenis antibiotik, yaitu
ampicillin, amoxicillin, ciprofloxacin, dan trimethoprim-sulfomethoxazole dengan
konsentrasi 1 mg/mL. Metode yang digunakan adalah difusi agar menggunakan
kertas cakram berdiameter 6 mm. Kertas saring mengandung 10 µg antibiotik
ampicillin, 20 µg amoxicillin, 5 µg ciprofloxacin dan 5 µg trimethoprimsulfomethoxazole (CLSI 2012).
Sebanyak 150 L kultur bakteri P. mirabilis (OD600nm=1) dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang berisi 15-17 mL media NA bersuhu 50 oC, lalu
dihomogenkan menggunakan vortex, dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan
hingga media menjadi padat. Kertas cakram yang mengandung antibiotik
diletakkan pada permukaan media yang telah memadat dan diinkubasi pada suhu
37 oC selama 24 jam (Madigan et al. 2011). Diameter zona hambat yang terbentuk
di ukur dan dibandingkan dengan diameter zona hambat menurut CLSI 2012
untuk menentukan tingkat sensitifitas P. mirabilis terhadap antibiotik ampicillin,
amoxicillin, ciprofloxacin dan trimethoprim-sulfomethoxazole.
Isolasi Fag
Sampel fag diambil dari beberapa sumber yakni dari limbah cair rumah
tangga, air sungai Desa Situ Letik, air sungai Ciparigi, feses ayam, feses kambing
dan limbah padat peternakan ayam. Sampel limbah padat peternakan ayam dan
feses ayam masing-masing ditambahkan dengan 10 mL akuades steril, sedangkan
sampel berupa feses kambing digerus menggunakan mortar terlebih dahulu lalu
ditambahkan dengan 10 mL akuades steril. Masing-masing sampel disimpan

8

dalam botol steril kemudian dihomogenkan menggunakan vorteks di
laboratorium.
Filtrasi Sampel. Sebanyak 4.5 mL sampel fag dimasukkan ke dalam
tabung sentrifus yang telah berisi 0.5 mL kultur P. mirabilis OD600nm=1 dengan
jumlah bakteri P. mirabilis sebanyak 108 CFU/mL lalu ditambahkan 5 mL Nutrien
Broth (NB) (Difco) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24-48 jam. Sampel
tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 20 menit
sebanyak 2 kali ulangan. Sebanyak 3 mL supernatan diambil dengan syringe dan
difiltrasi menggunakan membran filter milipore 0.22 µm. Supernatan yang telah
difiltrasi disimpan di dalam tabung steril pada suhu 4 oC (Pitt dan Gaston (1995).
Pencawanan fag. Kultur P. mirabilis diinokulasikan sebanyak 2-3 ose ke
dalam media NB lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam sampai diperoleh
kultur P. mirabilis OD600nm=1. Sebanyak 100 µL kultur P. mirabilis dicampurkan
dengan 100 µL supernatan yang telah difiltrasi lalu diinkubasi selama 30 menit
pada suhu 37 oC. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam 6 mL soft
agar yang bersuhu 47 oC, lalu di homogenkan menggunakan vorteks, dituang
pada media Nutrient Agar (NA) di dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam (Atterbury et al. 2007).
Purifikasi fag. Purifikasi fag dilakukan berdasarkan metode Goodridge et
al. (2001). Plak (zona bening) yang terbentuk dipindahkan menggunakan pipet
Pasteur ke dalam tabung sentrifus yang telah diisi dengan 5-7 mL bufer Saline
Magnesium (SM). Suspensi fag dihomogenkan dengan vorteks dan dibiarkan
selama 5-10 menit pada suhu ruang. Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi
pada kecepatan 6000 rpm selama 20 menit sebanyak 2 kali ulangan. Supernatan
diambil menggunakan syringe lalu difiltrasi menggunkaan membran filter
milipore 0.22 µm. Supernatan yang telah difiltrasi disimpan sebagai stok fag pada
suhu 4 oC di dalam tabung steril.
Produksi Fag
Sebanyak 1 ose bakteri dimasukkan ke dalam tabung berisi media NB, lalu
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Sebanyak 5 mL kultur dimasukkan
kembali ke dalam 50 mL media NB, di shaker selama 24 jam pada suhu 37 oC
hingga kepadatan bakteri pada OD600 nm = 1. Kultur kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 6000 rpm selama 20 menit sebanyak 2 kali ulangan. Pelet yang
terbentuk diambil, ditambahkan dengan 1 mL cairan fag, lalu dihomogenkan
menggunakan vorteks, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit lalu
dimasukkan ke dalam 50 mL media NB dan di shaker kembali selama 24 jam
pada suhu 37 oC. Kultur yang telah diinkubasi selanjutnya disentrifugasi pada
kecepatan 6000 rpm selama 20 menit sebanyak 2 kali ulangan. Supernatan yang
telah diperoleh disaring menggunakan membran filter milipore 0.22 µm dan
disimpan ke dalam tabung steril sebagai hasil perbanyakan fag (Atterbury et al.
2007).

9

Titrasi Fag
Kuantifikasi fag dilakukan berdasarkan metode Foschino et al. (1995).
Jumlah fag ditentukan dengan cara menghitung jumlah plak yang terbentuk
(Plaque forming unit (PFU/mL)). Stok fag diencerkan sampai 108, kemudian
sebanyak 100 µL dari masing-masing pengenceran tersebut diambil dan
ditambahkan dengan 100 µL kultur P. mirabilis yang telah ditumbuhkan pada
media NB (OD600nm=1). Suspensi tersebut diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30
menit lalu dimasukkan ke dalam 6 mL soft agar yang bersuhu 47 oC, dituang pada
media NA dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Jumlah plak atau zona
bening yang terbentuk (PFU/mL) dihitung setelah diinkubasi selama 24 jam.

Penentuan Kisaran Inang Fag
Uji penentuan kisaran inang fag dilakukan berdasarkan metode Carey et
al. (2006). Sebanyak 100 µ L kultur P. mirabilis yang telah ditumbuhkan pada
media NB (OD600nm=1) dan 100 µl kultur EPEC K.1.1, Salmonella sp., Bacillus
pumilus, dan Photobacterium damselae yang ditumbuhkan di media NB
(OD600nm=1) masing-masing dicampurkan dengan 100 µL stok fag dan diinkubasi
pada suhu 37 oC selama 15-30 menit. Masing-masing campuran tersebut lalu
dimasukkan ke dalam 5 mL soft agar yang bersuhu 47 oC dan diinkubasi pada
suhu 37 oC selama 24 jam.

Pengamatan Morfologi Fag dengan Transmision Electron Microscope (TEM)
Stok fag diteteskan sebanyak 10 µ L pada grid (400 mesh) lalu dibiarkan
selama 1 menit. Sebanyak 5 µL larutan uranil asetat 2% diteteskan ke atas grid.
Grid kemudian dikeringkan menggunakan kertas saring dan dibiarkan hingga
kering. Grid yang telah kering diletakkan pada holder dan diamati menggunakan
mikroskop elektron transmisi model JEOL JEM-1010 pada perbesaran 6000080000x (Carey et al. 2006).
Karakterisasi Protein
Kadar protein stok fage diukur berdasarkan metode Bradford (1976).
Konsentrasi standar protein yang digunakan pada penelitian ini dibuat secara
serial dengan konsentrasi standar protein Bovine Serum Albumin (BSA) dari 0.1
hingga 1.0 mg/mL. Masing-masing protein BSA dan sampel diambil sebanyak
400 µL lalu dimasukkan pada tabung-tabung reaksi. Masing-masing tabung
reaksi ditambahkan dengan 4 mL pereaksi Bradford (Lampiran 1). Larutan
tersebut lalu dihomogenkan dengan vortex, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 15
menit kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang ( ) 5λ5 nm.
Kurva standar untuk menentukan konsentrasi protein sampel dibuat menggunakan
program Excell dengan konsentrasi protein sebagai sumbu x (absis) dan nilai

10

absorbansi sebagai sumbu y (ordinat), kemudian ditentukan persamaan garis
regresinya (Lampiran 2).
Analisis berat molekul protein fag ditentukan menggunakan metode
Laemmli (1970). Marker yang digunakan adalah Presstained Protein Molecular
Weight Marker dengan berat molekul berturut-turut adalah 20, 25, 35, 50, 85, 120
kDa. Konsentrasi gel pemisah yang digunakan pada penelitian ini adalah sebesar
12,5% poliakrilamida sedangkan konsentrasi gel pengumpul sebesar 4%
(Lampiran 3). Gel pengumpul diletakkan di atas gel pemisah setelah gel pemisah
tersebut padat. Masing-masing stok fag dan marker ditambahkan dengan bufer
sampel dengan perbandingan 4:1 (4 bagian sampel atau marker dan 1 bagian bufer
sampel), lalu disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu ruang selama 20
menit sebanyak 2 kali dan dipanaskan dalam air mendidih selama 5-10 menit.
Sebanyak 50-60 µL campuran kemudian dimasukkan ke dalam sumur dan
dielektroforesis pada tegangan 60 volt selama 4 jam. Gel diangkat dari lempengan
kaca kemudian dilakukan pewarnaan perak (Silver Staining) (Lampiran 4).

11

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Reidentifikasi dan Patogenisitas Proteus mirabilis
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa P. mirabilis adalah bakteri
Gram negatif berbentuk batang. Koloni P. mirabilis berwarna hitam saat
ditumbuhkan pada media SSA dengan warna hitam pada bagian tengah koloni dan
tampak bening pada tepi koloni. Hasil uji patogenisitas P. mirabilis yang
dilakukan pada media agar darah menunjukkan bahwa P. mirabilis mampu
melisiskan sel darah dan menghasilkan alfa hemolisin (Lampiran 5).
Berdasarkan hasil identifikasi dengan KIT API 20E menunjukkan bahwa
isolat A31 adalah Proteus mirabilis (99.9%). Bakteri P. mirabilis tampak tidak
memfermentasikan manosa, sorbitol, glukosa, arabinosa, rhamnosa. Uji ornithin
dekarboksilase, produksi H2S, urease dan gelatin menunjukkan hasil yang positif,
sedangkan uji indol dan lisin dekarboksilase menunjukkan hasil yang negatif
(Tabel 1).
Tabel 1 Hasil identifikasi KIT API 20E bakteri P. mirabilis
Uji Fsiologis
ONPG (Ortho Nitrofenil-βGalaktopiranosidase)
ODC (Ornitin
dekarboksilase)
LDC (Lisin dekarboksilase)
ADH (Arginin Dihidrolase)
TDA (Triptopan
Deaminase)
H2S
Urease
Indol
VP (Voges Proskauer)
Gelatin

Reaksi
+
+
+
+
+

Uji Fisiologis
Sitrat

Reaksi

Glukosa
Manosa
Inositol
Melibiose
Sorbitol
Rhamnosa
Sukrosa
Arabinosa
Oksidase

+
-

+ : reaksi positif; - : reaksi negatif

Resistensi Proteus mirabilis terhadap Antibiotik
Hasil uji resistensi antibiotik menunjukkan bahwa P. mirabilis telah
resisten terhadap antibiotik ampicillin, amoxicillin dan trimethoprimsulfametahoxazole (Tabel 2). Hal ini terlihat dari tidak adanya zona
penghambatan yang terbentuk saat P. mirabilis diujikan dengan ketiga antibiotik

12

tersebut, sedangkan terhadap antibiotik ciprofloxacin masih dalam kriteria
sensitif. Zona penghambatan yang dihasilkan ciprofloxacin cukup besar, yaitu
mencapai 26 mm.
Tabel 2 Resistensi P. mirabilis terhadap beberapa antibiotik

Jenis Antibiotik

Konsentrasi
antibiotik
(µg/mL)

Ampicillin
Amoxicillin
Trimethoprimsulfomethaxazole
Ciprofloxacin

10
10

Pengelompokan
ukuran
zona hambat menurut
CLSI (mm)
S
I
R
≥17
14-16 ≤13
≥18
14-17 ≤13

Ukuran
zona
Keterangan
hambat
(mm)
0
0

Resisten
Resisten

5

≥16

11-15

≤10

0

Resisten

5

≥21

16-20

≤15

26

Sensitif

S: sensitif, I: intermediet, R: resisten

Isolasi Fag
Fag berhasil diisolasi dari limbah peternakan ayam dan air sungai di Desa
Situ Letik Kecamatan Darmaga, Bogor (Tabel 3). Fag yang didapatkan berjumlah
3 isolat, yaitu 1 isolat dari limbah peternakan ayam dan 2 isolat dari air sungai
Desa Situ Letik. Hal ini mengindikasikan adanya bakteri P. mirabilis yang
terdapat di limbah peternakan ayam dan air sungai di Desa Situ Letik.

Tabel 3 Hasil isolasi fag dari berbagai sumber fag

Sumber fag
Limbah cair rumah tangga
Feses ayam
Feses kambing
Limbah peternakan ayam
Air sungai Ciparigi
Air sungai Situ Letik
Total sampel

Jumlah
Jumlah Jumlah sampel yang
sampel ulangan mengandung
fag
2
4
2
3
2
3
2
4
1
2
2
2
4
1
12
20
2

Jumlah
isolat
fag
1
2
3

Keterangan
Fag 1
Fag 2, Fag 3

Hasil pencawanan fag menunjukkan bahwa masing-masing isolat fag
menghasilkan morfologi plak yang berbeda, namun memiliki ukuran yang sama
(Lampiran 6). Plak yang dibentuk oleh 3 isolat fag berdiameter 2 mm. Isolat fag 2
yang berhasil diisolasi berjumlah lebih banyak daripada isolat fag 1 dan 3, yakni
sebanyak 1.3 x 108 PFU/mL (Tabel 4).

13

Tabel 4 Karakteristik isolat-isolat fag litik P. mirabilis
Isolat fag
Fag 1

Jumlah plak (PFU/mL)
1 x 104*

Fag 2

1.3 x 108

Fag 3

2 x 107*

Morfologi plak
Plak bulat, bening, diameter 2 mm,
memiliki cincin di sekitar plak
Plak bulat, samar, diameter 2 mm, tidak
ada cincin di sekitar plak
Plak bulat, bening, diameter 2 mm, tidak
ada cincin di sekitar plak

*Isolat fag tidak dapat ditumbuhkan kembali

Hasil purifikasi dan produksi terhadap ketiga isolat fag menunjukkan
bahwa isolat fag yang dapat dimurnikan dan ditumbuhkan kembali adalah isolat
fag 2. Isolat fag 1 dan 3 tidak dapat diproduksi karena kedua isolat tersebut tidak
dapat ditumbuhkan kembali saat proses pencawanan fag. Oleh karena itu, isolat
fag 2 dipilih sebagai isolat fag P. mirabilis yang dapat dikarakterisasi morfologi
dan proteinnya. Hasil produksi isolat fag 2 sebagai fag P. mirabilis yang berhasil
diproduksi kembali adalah sebesar 1.61 x 109 PFU/mL.
Kisaran Inang Fag
Hasi uji kisaran inang menunjukkan bahwa fag P. mirabilis bersifat
spesifik. Fag P. mirabilis hanya dapat menginfeksi P. mirabilis dan tidak dapat
menginfeksi bakteri lain seperti B. pumilus, P. damselae, Salmonellla sp. dan
EPEC K.1.1 (Tabel 5).
Tabel 5 Kisaran inang fag P. mirabilis
Bakteri inang
Proteus mirabilis
Salmonella sp
EPEC K.1.1
Bacillus pumilus
Photobacterium damselae

Keterangan
Terbentuk plak
Tidak terbentuk plak
Tidak terbentuk plak
Tidak terbentuk plak
Tidak terbentuk plak

Morfologi Fag
Berdasarkan hasil pengamatan dengan Transmission electron microscope,
diketahui bahwa fag P. mirabilis memiliki kepala berbentuk heksagonal
ikosahedral dan ekor yang panjang berbentuk tabung heliks (Gambar 2). Diameter

14

kepala fag P. mirabilis adalah 68.185.nm, panjang ekor mencapai 109.091 nm dan
ekor berdiameter 18.182 nm.

a
e
b
e

Gambar 2 Morfologi fag P. mirabilis menggunakan TEM model JEOL JEM1010 dengan pewarnaan 2% uranil asetat, perbesaran 60.000x, Bar
100 nm. Ket: a. Kepala fag dan b. ekor fag,

Karakteristik Protein Fag Proteus mirabilis
Berdasarkan hasil analisis menggunakan SDS-PAGE diketahui terdapat
pita-pita protein yang diantaranya berukuran 90.50, 82.03, 74.35, 43.31, 37.37,
30.70, 27.83 dan 20.72 kDa (Gambar 3). Hasil perhitungan terhadap konsentrasi
protein fag P. mirabilis menunjukkan bahwa konsentrasi proteinnya sebesar
316.198 µg/mL.

Gambar 3 Kisaran berat molekul protein fag P. mirabilis pada SDS-PAGE.
1) Marker, 2), 3), 4) Protein fag P. mirabilis

15

Pembahasan

Hasil analisis terhadap patogenitas P. mirabilis menunjukkan bahwa
bakteri tersebut memiliki toksin berupa alfa hemolisin sebagai salah satu faktor
virulensinya. Alfa hemolisin adalah prototipe dari racun RTX (repeat toxin), yaitu
sebuah kelompok protein yang memiliki banyak struktur genetik dan struktural.
Sanchez et al. (2011) mengatakan alfa hemolisin merupakan faktor virulensi
penting pada bakteri patogen yang dapat mengakibatkan berbagai kasus infeksi.
Alfa hemolisin sebagai salah satu faktor virulen bakteri patogen mampu
membentuk pori sehingga memicu respon seluler dan efek jangka panjang bagi
organisme inang seperti mamalia. Konsentrasi tinggi alfa toksin dapat
menyebabkan lisis beberapa sel-sel seperti eritrosit, granulosit dan monosit.
Tahapan isolasi fag yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan
metode enrichment. Prinsip metode ini adalah memperkaya nutrisi media
pertumbuhan bakteri agar pertumbuhan bakteri meningkat sehingga replikasi fag
juga semakin banyak. Fag yang bersifat parasit intraseluler obligat akan
bereplikasi dengan baik, cepat dan dalam jumlah yang banyak apabila kondisi
pertumbuhan bakteri inangnya berada pada kondisi optimum. Bakteri P. mirabilis
yang digunakan sebagai bakteri inang untuk mengisolasi fag ditumbuhkan di
dalam media cair NB dengan suhu optimum 37 oC pada fase logaritma yakni saat
kultur bakteri P. mirabilis pada OD600nm=1 dengan jumlah bakteri mencapai 108
CFU/mL.
Verifikasi keberhasilan isolasi fag dilakukan dengan melakukan
pencawanan fag bersama dengan bakteri inang P. mirabilis. Proses pencawanan
ini menggunakan teknik media double layer. Bagian atas media double layer
terdiri atas media agar dengan konsentrasi 0.8 %. Pada konsentrasi ini, fag dapat
bergerak lebih cepat mencari dan menemukan bakteri inang disekitarnya. Bagian
bawah media double layer adalah media nutrient agar yang menyediakan nutrisi
untuk pertumbuhan bakteri inang, sehingga bakteri inang dapat membelah lebih
banyak dan lebih cepat karena nutrisi yang banyak akibatnya fag juga semakin
banyak menginfeksi dan melisiskan bakteri inang.
Hasil pencawanan fag menunjukkan bahwa terdapat zona kerusakan sel
berupa zona berwarna bening. Fag yang melisiskan sel bakteri inang akan
membentuk zona bening pada media yang disebut plak. Plak merupakan suatu
indikator bahwa fag yang diisolasi bersifat litik dan mampu melisiskan bakteri
inangnya. Plak atau zona bening yang terbentuk merupakan parameter adanya
kerusakan sel bakteri akibat infeksi fag. Plak yang diperoleh dari ketiga isolat fag
pada penelitian ini memiliki morfologi yang berbeda, yaitu plak bening atau
samar, berbentuk bulat dengan atau tanpa cincin disekitar plak dan berukuran 2
mm. Menurut Abedon et al. (2000), ukuran plak berbanding lurus dengan tingkat
efisiensi adsorpsi fag, panjang periode laten, yakni waktu yang dibutuhkan fag
untuk melisiskan bakteri inangnya dan ukuran ledakan progeni yakni banyaknya
progeni yang dilepaskan saat sel inang lisis, sedangkan morfologi plak tergantung
dari beberapa faktor diantaranya sifat fag, bakteri yang menjadi inangnya dan
kondisi pertumbuhan bakteri. Hasil produksi fag terhadap isolat fag 1 dan 3

16

menunjukkan bahwa kedua isolat fag tersebut tidak dapat diproduksi untuk
dilakukan perbanyakan karena tidak dapat ditumbuhkan kembali saat proses
pencawanan fag. Hal ini diduga disebabkan oleh perbedaan tingkat stabilitas pada
masing-masing isolat fag. Faktor stabilitas pada fag sangat erat kaitannya dengan
protein-protein penyusun fag (Evilevitch et al. 2010).
Berdasarkan hasil penelitian, diketahui pembentukan plak pada isolat fag 2
sebagai fag P. mirabilis yang berhasil dipurifikasi dan diproduksi terjadi antara
30-35 menit waktu inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa fag P. mirabilis sangat
efektif dan bersifat infektif kuat terhadap Proteus mirabilis yang telah resisten
terhadap antibiotik ampicillin, amoxicillin, dan trimetoprin-sulfomethoxazole,
sehingga penelitian ini menjadi bukti nyata kemampuan fag yang bersifat ramah
lingkungan dan aman dalam mengontrol serta mengendalikan bakteri P. mirabilis
yang dapat menyebabkan diare dan sering mengkontaminasi air dan makanan.
Hasil penelitian Shao dan Wang (2008) menunjukkan bahwa waktu lisis optimal
fag berkisar diantara 29,3-68 menit. Waktu lisis ini dipengaruhi oleh laju adsorpsi
fag pada bakteri inangnya. Fag yang memiliki laju adsorpsi tinggi akan
menghasilkan waktu lisis yang relatif lebih cepat. Oleh karena itu, fag P. mirabilis
dapat disimpulkan memiliki laju adsorpsi yang tinggi dengan waktu lisis yang
pendek. Berdasarkan hasil pengamatan terhadap ukuran plak diketahui bahwa
ukuran plak yang dihasilkan oleh fag P. mirabilis akan semakin membesar seiring
dengan bertambahnya waktu inkubasi hingga 24 jam. Jika kepadatan bakteri
meningkat, maka jumlah plak yang terbentuk semakin banyak dan jarak setiap
plak semakin rapat. Toro et al. (2005) menyatakan bahwa setelah menginfeksi
bakteri inangnya, fag dengan siklus litik akan bereplikasi di dalam sel inang untuk
membentuk fag-fag baru lalu keluar sel dengan melisiskan sel inang hingga pada
akhirnya masing-masing fag baru akan mencari dan menginfeksi bakteri inang
lain disekitarnya. Proses lisis ini menggunakan enzim lisozim yang disandikan
oleh gen pada fag namun disintesis di dalam sel bakteri inang (Tortora et al.
2006). Madigan et al. (2011) menyatakan lisozim dapat memutuskan ikatan β-1,4glikosida antara N-asetil glukosamin dan N-asetil muramat, akibatnya bakteri
menjadi lisis karena adanya kerusakan pada struktur peptidoglikan.
Saat dilakukan pencawanan fag, maka fag yang tumbuh memiliki siklus
hidup yang terdiri dari fas