Karakterisasi Fag Litik Photobacterium Damselae Asal Lingkungan Perairan

KARAKTERISASI FAG LITIK Photobacterium damselae
ASAL LINGKUNGAN PERAIRAN

NOVIANTY

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi Fag litik
Photobacterium damselae Asal Lingkungan Perairan adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip
dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014
Novianty
NIM G351120221

RINGKASAN
NOVIANTY. Karakterisasi Fag Litik Photobacterium damselae Asal Lingkungan
Perairan. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan IMAN RUSMANA.
Photobacterium damselae salah satu bakteri patogen yang menginfeksi
hewan (khususnya ikan) dan manusia. Patogenisitas bakteri tersebut dikontrol
melalui terapi antibiotik, tetapi aplikasi antibiotik yang berkelanjutan
menimbulkan resistensi bakteri. Hasil beberapa penelitian melaporkan
Photobacterium damselae sudah resisten terhadap antibiotik. Fag litik adalah
terapi alternatif yang dapat digunakan untuk mengatasi bakteri-bakteri patogen.
Fag litik dapat melisiskan sel bakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah
mendapatkan fag litik Photobacterium damselae serta mengkarakterisasi fag
litiknya. Fag litik Photobacterium damselae diisolasi dari berbagai sumber
perairan yaitu Danau IPB, sungai Cidepit, dan sungai Ciparigi Bogor.
Bakteri inang untuk fag litik terlebih dahulu direidentifikasi secara
morfologi dan karakterisasi fisiologis dengan menggunakan KIT API 20E, uji
patogenisitas dengan menggunakan agar darah, dan uji resistensi antibiotik. Isolasi

dan pemurnian fag litik dilakukan berdasarkan metode agar dua lapis. Keberadaan
fag litik ditandai dengan adanya plak. Fag litik hanya ditemukan pada sungai
Cidepit dan Ciparigi Bogor. Pada titik ketiga pengambilan sampel di sungai
Cidepit didapatkan isolat pertama fag F A91 yang menunjukkan morfologi cloudy
plaque, berdiameter 0.3 mm dengan konsentrasi 3 x 104 PFU mL-1. Pada titik
pertama pada sungai Ciparigi didapatkan dua isolat fag. Fag F A92 memiliki
morfologi clear plaque berdiameter 3 mm dengan konsentrasi 11 x 105 PFU mL-1.
Berbeda dengan morfologi F A93 yaitu turbid plaque berdiameter 1 mm dan
konsentrasinya 62 x 106 PFU mL-1. F A91 dengan ciri cloudy plaque merupakan
fag lisogenik sehingga tidak digunakan. Clear plaque (F A92) dan turbid plaque
(F A93) merupakan fag litik. Hasil pasase menunjukkan bahwa F A92 dan F A93
merupakan fag yang identik (F A9). Berdasarkan uji kisaran inang fag F A9
spesifik terhadap Photobacterium damselae.
Pengamatan morfologi fag pada Transmission Electron Microscope (TEM)
F A9 termasuk famili Myoviridae. Morfologi kepala ikosahedral berdiameter
30 nm dan ekor kontraktril dengan panjang 60 nm. Analisis SDS-PAGE protein
fag F A9 pada gel poliakrilamida menunjukkan 4 pita protein. Berat molekul
protein secara berurutan adalah 109.06, 30.58, 17.08, dan 14.96 kDa.
Kata kunci: Photobacterium damselae, fag litik, Myoviridae, SDS-PAGE.

SUMMARY
NOVIANTY. Characterization Lytic Phage of Photobacterium damselae from
Water Environment. Supervised by SRI BUDIARTI and IMAN RUSMANA.
Photobacterium damselae is one of pathogenic bacteria infecting animal
(particulary fish) and human. Its pathogenity was controled by antibiotic therapy,
but continous application of antibiotics can induce bacterial resistant. Some
researches reported that Photobacterium damselae was resistant to antibiotics.
Lytic bacteriophage could be an alternative therapy to reduce bacterial patogens
by lyse mechanisms of the bacterial cells. The aims of this study were to obtaine
lytic phage of Photobacterium damselae and to characterize the phage. Lytic
phages of Photobacterium damselae were isolated from water of IPB lake, Cidepit
river, and Ciparigi river.
Host bacterium for lytic phage was identified based on morphological and
physiological characterization, pathogenity test using blood agar, and antibotic
resistant test. Isolation and purification of lytic phage were done using double
layer method. Presence of lytic phage was indicated by a plaque formation on
double layer agar. Lytic phage were obtained from Cidepit and Ciparigi river
Bogor. Lytic phage isolated from Cidepit river (F A91) had cloudy plaque
morphology with 0.3 mm in diameter and phage concentration 3 x 104 PFU mL-1.
However in Ciparigi river was obtained two isolates of lytic phage i.e F A92 and

F A93 phages. F A92 phage had clear plaque morphology with 3 mm in diameter
and phage concentration 11 x 105 PFU mL-1. While F A93 phage had turbid
plaque with 1 mm in diameter and phage concentration 62 x 106 PFU mL-1.
Based on formation of plaque, phage F A91 was espected as a lysogenic phage
while phage F A92 and F A93 were lytic phages. F A92 and F A93 were identic
phages (F A9). Host determination showed phage F A9 was spesific to
Photobacterium damselae.
Based on viral morphology of phage on Transmission Electron Microscope
(TEM) phage F A9 (F A92 dan F A93) was grouped into Myoviridae family. The
phage had icosahedral head (30 nm in diameter) and contractile tail (60 nm in
lenght). SDS-PAGE analysis of phage F A9 proteins, showed four bands of
proteins with molecule weight of 109.06 kDa, 30.58 kDa, 17.08 kDa, and 14.96
kDa respectively.
Keywords : Photobacterium damselae, lytic phage, Myoviridae, SDS-PAGE.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI FAG LITIK Photobacterium damselae
ASAL LINGKUNGAN PERAIRAN

NOVIANTY

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Drh Sri Murtini, MSi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah S.W.T atas segala
karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih
dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 hingga Mei 2014
ini ialah Karakterisasi Fag Litik Photobacterium damselae Asal Lingkungan
Perairan.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr dr Sri Budiarti selaku
ketua komisi pembimbing dan bapak Dr Ir Iman Rusmana, MSi selaku anggota
komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan bantuan,
saran, nasihat, waktu konsultasi, solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi
penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah, serta
bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini. Selain itu penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada ibu Dr Drh Sri Murtini MSi selaku penguji luar
komisi pada ujian tesis dan ibu Prof Dr Anja Meryandini, MS selaku Ketua
Program Studi Mikrobiologi IPB atas motivasi selama studi dan masukan pada
saat ujian sidang tesis. Kepada Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan
Indonesia melalui program Beasiswa Unggulan DIKTI 2012 atas kepercayaanya

telah memberikan beasiswa selama menempuh pendidikan di pascasarjana IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada bapak Prof Dr Suharsono, MSi
selaku Kepala Pusat Penelitian Sumber daya hayati dan Bioteknologi (PPSHB)
IPB yang telah memberikan izin untuk menggunakan fasilitas laboratorium
PPSHB IPB. Terima kasih kepada ibu Dewi Asnita, teteh Fitri, dan bapak Fras
selaku teknisi di laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis dan
laboratorium Biologi Tumbuhan PPSHB IPB, ibu Heni dan bapak Jaka selaku
teknisi di laboratorium Mikrobiologi, IPB. Terima kasih juga kepada mbak Ita
selaku peneliti di laboratorium TEM dan Histologi, Lembaga Eijkman Jakarta.
Ucapan terima kasih tak terhingga juga penulis ucapkan kepada kedua orang tua
tercinta, bapak Imron (alm) dan ibu Yusro, serta adik Darmawan atas doa, kasih
sayang, dukungan, serta semangat yang diberikan. Kepada ibu Prof Dr Badia
Perizade, MBA selaku Rektor Universitas Sriwijaya, ibu Dr Hary Widjajanti,
MSi, bapak Dr Munawar, MSi, ibu Dra Muharni, MSi, bapak Prof Dr Zulkifli
Dahlan, DEA, dan bapak Dr Indra Yustian, MSi penulis ucapkan terima kasih atas
rekomendasi dan motivasi yang telah diberikan sehingga penulis dapat
melanjutkan pendidikan di Pascasarjana IPB.
Terima kasih kepada teman-teman seperjuangan tim fag (Anik dan Rachmi),
teman-teman satu laboratorium (Tini, Ika, Lia, Fathin, Yeni, Leni, mbak Ira, mbak
Debby, kak Dedy, Bob, Dewi, dan Kurratayun) atas bantuan, dukungan, dan

semangat. Terima kasih untuk kebersamaan, pengalaman teruntuk Vita dan
teman-teman Pascasarjana Mikrobiologi 2012, teman-teman satu daerah (kak
Erwin, mbak Ike, Lina, Wulan, dan Hari) dan teman-teman Wisma Melati
Babakan, serta seluruh pihak yang telah memberikan doa dan dukungannya,
penulis ucapkan terima kasih.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Novianty

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xi

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xi

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Perumusan Masalah

2

Tujuan Penelitian

2

Manfaat Penelitian

2

Ruang Lingkup penelitian

2

TINJAUAN PUSTAKA

2

Karakterisasi Photobacterium damselae

2

Patogenisitas Photobacterium damselae

3

Fag Litik

3

Aplikasi Fag Litik

5

METODE

5

Kerangka Penelitian

5

Waktu dan tempat penelitian

6

Prosedur penelitian

6

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN

9
9
14
17

Simpulan

17

Saran

17

DAFTAR PUSTAKA

17

LAMPIRAN

23

RIWAYAT HIDUP

24

DAFTAR TABEL
Karakterisasi Fisologis Isolat Photobacterium damselae
Uji Resistensi Photobacterium damselae terhadap Antibiotik
Isolasi Fag Litik Photobacterium damselae
Karakteristik Plak dan Konsentrasi (PFU.mL-1) Fag Litik
Photobacterium damselae (F A9)
5 Kisaran Inang Fag Litik F A9

1
2
3
4

9
10
11
12
12

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5

Diagram Alur Penelitian
Photobacterium damselae pada Agar Darah
Morfologi Plak
Morfologi Fag Litik F A9
Profil Protein F A9 melalui SDS-PAGE

6
10
11
13
13

DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi Bufer Saline Magnesium (SM)
2 Prosedur Pewarnaan Perak dan Komposisi Larutan yang Digunakan

23
23

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Photobacterium damselae merupakan salah satu bakteri patogen. Bakteri ini
berhabitat di lingkungan perairan, terutama laut. Umumnya Photobacterium
damselae menginfeksi ikan. Keberadaan bakteri ini sangat merugikan bagi petani
ikan hias maupun ikan konsumsi. Dilaporkan Hawke (1996) bakteri ini
menyebabkan kerugian yang besar mencapai 1 juta US Dollar pada petani ikan di
Lousiana.
Beberapa penelitian melaporkan Photobacterium damselae juga patogen
terhadap udang, mamalia air, dan manusia. Kasus infeksi Photobacterium
damselae pada manusia dapat melalui air, memegang hewan yang telah terinfeksi
bakteri ini, dan makanan laut yang dikonsumsi (Tang dan Wong 1999; Goodell
et al. 2004; Alvarez et al. 2006; Aigbivhalu dan Maraqa 2009). Gejala klinis yang
timbul akibat Photobacterium damselae adalah infeksi jaringan melalui luka,
namun dapat juga gangguan pencernaan (Shin et al. 1996).
Faktor virulen Photobacterium damselae berupa produk seluler yaitu
eksotoksin damselin. Eksotoksin ini disebarkan pada lingkungan perairan (Fouz
et al. 2000). Eksotoksin yang dihasilkan Photobacterium damselae menyebabkan
septikimia hemoragik dan nekrosis. Beberapa kasus pada manusia yang terinfeksi
Photobacterium damselae akan mengalami kegagalan fungsi organ dan
menyebabkan kematian akibat komplikasi organ (Rivas et al. 2013).
Penanggulangan Photobacterium damselae diatasi dengan pemberian
antibiotik, seperti tetrasiklin, kloromfenikol, gentamisin, amikasin, cepalotin,
ciprofloksasin, kolistin, ceftriakson, penisilin, dan ampisilin (Shin et al. 1996;
Fraser et al. 1997; Asato dan Kanaya 2004). Pemberian antibiotik untuk
mereduksi Photobacterium damselae tidak efektif lagi karena bakteri tersebut
telah resisten. Fag litik memiliki aktivitas bakterisida sehingga bisa dijadikan
alternatif dalam upaya mengatasi bakteri-bakteri patogen yang telah resisten
terhadap antibiotik (Merril et al. 1996).
Hasil beberapa penelitian fag litik menunjukkan efektivitas lisisnya,
contohnya fag litik Shigella FY51-X (Iswadi 2012), fag litik EPEC K 1.1
(Budiarti et al. 2011), AB1 Acinetobacter baumanni (Yang et al. 2010), CEV2
dan CBA65 E.coli O157:H7 (Viazis et al. 2010), serta WHR8 dan WHR10
Salmonella enteretidis (Bieke et al. 2007). Histopatologis dari organ ginjal dan
hati pada pemberian fag litik FR38 secara oral terhadap tikus galur Sprague
dawley tidak menyebabkan kerusakan pada kedua organ tersebut. Ini
mengindikasikan fag tidak menimbulkan efek samping (Sartika 2012). Fag litik
memiliki spesifitas inang yang tinggi dan aman untuk diaplikasikan pada manusia,
hewan, dan makanan (Carrillo et al. 2005). Di Indonesia, penelitian mengenai fag
litik Photobacterium damselae belum pernah. Hasil penelitian ini dapat menjadi
informasi awal untuk pengembangan fag litik Photobacterium damselae sebagai
agen biokontrol dan terapi fag.

2
Perumusan Masalah
Photobacterium damselae merupakan bakteri patogen yang menginfeksi
ikan (termasuk ikan konsumsi), mamalia air, dan manusia. Infeksi bakteri ini
menyebabkan septikmia hemoragik dan necrocis fasciitis berakibat pada
kematian. Penanggulangan yang biasa dilakukan adalah menggunakan antibiotik.
Penggunaan antibiotik yang berkelanjutan menimbulkan resistensi bakteri, oleh
karena itu diperlukan metode alternatif. Metode alternatif yang dapat diterapkan
adalah menggunakan fag litik. Fag litik memiliki aktivitas bakterisida karena
kemampuan untuk melisiskan sel bakteri, spesifitas inang tinggi, dan non toksik.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan fag litik Photobacterium
damselae serta mengkarakterisasinya.

Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan memberikan informasi awal mengenai
karakter fag litik Photobacterium damselae yang berpotensi untuk dikembangkan
sebagai agen biokontrol dan terapi fag.

Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi reidentifikasi bakteri inang fag,
isolasi, pemurnian dan titrasi fag, pengamatan morfologi fag dengan
menggunakan Transmission Electrone Microscope (TEM), dan analisis berat
molekul protein fag.

TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Photobacterium damselae
Photobacterium damselae merupakan bakteri Gram negatif dan dapat hidup
pada kadar garam yang tinggi (halofilik). Bakteri ini termasuk bakteri patogen
dari famili Vibrioceae. Pertama kali diisolasi dari damselfish (Chromis
punctipinnis) (Austin dan Austin 1993). Ada dua subsepesies Photobacterium
damselae yaitu subspesies piscidia (lebih dikenal Pasteurella piscicida) dan
subspesies damselae (lebih dikenal Vibrio damselae). Kedua subspesies ini
memiliki virulensi berupa aktivitas hemolitik (eksotoksin damselin). Subspesies
piscidia hanya patogen terhadap ikan, namun subspesies damselae selain patogen
terhadap hewan laut juga mammalia air, dan manusia (Love et al. 1981).
Subspesies piscidia tidak bisa tumbuh pada suhu 37 °C dan tidak memiliki
aktivitas hemolitik pada agar darah. Berbeda dengan subspesies piscidia,

3
subspesies damselae bisa tumbuh pada suhu 25 °C sampai 37 °C dan memiliki
aktivitas hemolitik pada agar darah (Osorio et al. 2000). Kedua subspesies ini
memiliki motilitas rendah dan menggunakan glukosa sebagai sumber karbon.
Karakterisasi fisiologisnya akan menunjukkan hasil positif pada uji oksidase,
katalase, sitrat, dan gelatin.

Patogenisitas Photobacterium damselae
Produk ekstraseluler yang dihasilkan bakteri patogen berperan untuk
pengambilan nutrisi dari lingkungan sekitar dan penetrasi serta bertahan di dalam
sel inang (Bakopoulos et al. 2003). Produk ekstraseluler tersebut merupakan salah
satu faktor virulensi, seperti protease, hemolisin, dan siderofor. Faktor virulensi
Photobacterium damselae terdapat pada lapisan kapsular polisakarida, berupa
produk ekstraseluler (eksotoksin) yang memiliki kemampuan mengikat besi (Fe)
(Magarinos et al. 1992). Photobacterium damselae dapat menghindari mekanisme
pertahanan bakteri inang melalui pertahanan intraseluler dalam sel non fagosit
(Magarinos et al 1996).
Faktor virulensi utama Photobacterium damselae adalah eksotoksin
damselin. Damselin memiliki aktivitas hemolitik dan menyebabkan sitolisis
terhadap beberapa tipe eritrosit, termasuk ikan. Kreger (1984) melaporkan
aktivitas sitolitik ekstraseluler yang diproduksi subspesies damselae menyebabkan
penyakit pada uji in vivo terhadap tikus. Clarridge dan Zighelboim-Daum (1985)
melaporkan dua fenotip hemolitik yang menunjukkan aktivitas hemolisis yang
berbeda. Fenotip LZ menyebabkan zona hemolisis yang lebih besar dibanding
fenotip SZ pada agar darah. Penelitian Rivas et al. (2011) melaporkan terdapat
plasmid baru (pPHDD1) yang mengkodekan hemolisin damselin (Hly A-dly)
pada subspesies damselae dan menunjukkan aktivitas hemolitik lebih tinggi.
Pemberian antibiotik tidak dapat mengontrol efek fatal akibat infeksi
Photobacterium damselae (Clarridge dan Zighelboim-Daum 1985; Fraser et al.
1997; Yamane et al.2004). Pembedahan dan amputasi merupakan langkah terakhir
yang dilakukan untuk menyelamatkan pasien yang terinfeksi Photobacterium
damselae (Goodell et al. 2004). Beberapa pasien yang diinfeksi Photobacterium
damselae akan mengalami kegagalan fungsi organ beberapa jam dari gejala awal
yang ditunjukkan. Pada tahun 1984 dilaporkan seorang tangan pasien terluka
akibat memegang ikan lele, beberapa jam kemudian area sekitar luka tampak
mengeluarkan nanah. Penyebaran toksin yang cepat menyebabkan pasien tersebut
meninggal setelah mengalami komplikasi. Necrosis fasciitis yang disebabkan
subspesies damselae memiliki efek mortalitas yang lebih tinggi (Perez-Tirse et al.
1993; Yuen et al. 1993).
Fag Litik
Pemberian antibiotik untuk mengatasi patogenitas Photobacterium
damselae beberapa tahun terakhir dilaporkan tidak efektif lagi. Bakteri ini telah
resisten pada sebagian antibotik seperti, ampisilin, kloromfenikol, tetrasiklin,
kanamisin, tobramisin, amoksisilin, karbenisilin, neomisin, cefotaksime,
norfolaksin, amoksisilin-asam klavulanat, ofloksasin (Jee et al. 2009).
Kemampuan melisiskan sel bakteri patogen menjadikan fag litik dapat digunakan

4
sebagai terapi alternatif untuk mengatasi resistensi bakteri terhadap antibiotik. Fag
adalah virus yang menginfeksi bakteri. Fag dapat ditemukan pada semua habitat
bakteri dan arkea, termasuk semua ekosistem yang terdapat di bumi (Ashelford
et al. 2003; Breitbart dan Rohwer 2005).
Struktur fag secara lengkap dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
elektron. Semua fag terdiri dari asam inti yang dilindungi oleh kapsid. Kapsid
memiliki banyak bentuk, yaitu ikosahedral heksagonal, bentuk filamen dengan
struktur komplek kepala dan ekor (Carter dan Sauders 2007). Fag dikelompokkan
ke dalam ordo Caudovirales yang memiliki DNA utas ganda dan merupakan fag
berekor. Caudovirales memiliki kapsid berbentuk ikosahedral dan serabut ekor
untuk berinteraksi dengan inang. Terdapat tiga famili fag dalam ordo
Caudovirales yaitu Myoviridae, Siphoviridae, dan Podoviridae. Fag juga
diklasifikasikan ke dalam kelompok fag polihedral, filamentous, dan pleomorfik
(PFP) (Ackermann 2003).
Berdasarkan siklus hidupnya, fag dikelompokkan menjadi fag litik dan
lisogenik. Fag litik memiliki keunggulan dibandingkan fag lisogenik. Fag litik
memiliki aktivitas bakterisida yaitu dapat melisiskan sel bakteri. Menurut
Tortora et al. (2006) reproduksi fag litik terdiri atas 5 tahap, yaitu tahap adsorpsi,
tahap penetrasi, tahap sintesis, tahap pematangan, dan tahap lisis. Fag litik akan
bereplikasi di dalam sel inang membentuk sejumlah fag baru kemudian melisiskan
sel inang dan progeni fag akan menginfeksi sel inang lainnya.
Tahap adsorpsi diawali dengan pelekatan fag pada sel inang melalui reseptor
khusus pada permukaan sel. Proses pelekatan ini bersifat spesifik yang berarti
bahwa reseptor dan fag bersifat seperti pasangan, setelah pelekatan fag pada sel
inang terjadinya penetrasi. Enzim lisozim yang terdapat pada bagian ekor fag
berperan dalam proses penetrasi ke dalam sel inang. Pada tahap penetrasi asam
inti fag masuk ke dalam sel inang kemudian dimulai tahapan sintesis asam inti
fag. Diawali proses transkripsi yang melibatkan tiga gen yaitu gen awal, gen
tengah, dan gen akhir. Gen awal dan gen tengah menyandikan protein yang
terlibat dalam replikasi asam inti fag dan transkripsi, sedangkan gen akhir
merupakan gen yang menyandikan protein kepala dan ekor serta protein yang
berperan dalam pelepasan partikel fag matang (Snyder et al. 2003).
Tahapan pematangan dimulai dengan pengemasan asam inti yang baru
disintesis di dalam selubung protein. Saat tahapan ini titer fag yang aktif di dalam
sel meningkat secara drastis meskipun virion belum terlihat berada di luar sel.
Pada akhir proses pematangan virion matang keluar dengan mengakibatkan lisis
sel inang. Jumlah virion yang dilepaskan disebut ukuran ledakan (burn size).
Siklus replikasi fag berlangsung selama 20-60 menit (Madigan et al. 2000).
Proses lisis terjadi dimulai dari gen fag akan mengkodekan suatu protein untuk
membuat lubang pada membran sel inang yaitu protein holin. Holin akan
menyebabkan gangguan pada membran kemudian gen fag juga akan
mengkodekan protein endolisin (enzim muralitik) yang mampu merusak dinding
sel inang dan akhrinya mengakibatkan lisisnya sel inang (Grundling et al. 2001).
Fag memiliki spesifitas inang yang tinggi sehingga dapat dijadikan dasar
untuk fag digunakan dalam mengatasi infeksi atau untuk pemulihan lingkungan
terkontaminasi bakteri pathogen (Sulakvelidze dan Burrow 2005). Kelebihan fag
yang lain ialah kemampuannya untuk bertahan pada inang (Sulakvelidze dan
Kutter 2005; Lu dan Koeris 2011). Dibandingkan antibiotik, fag tidak memiliki

5
efek samping, terutama jika diaplikasikan pada hewan dan manusia. Ini
disebabkan karena tidak adanya reseptor fag pada sel eukariotik (Proctor dan
Fuhrman 1990; Lederberg 1996).

Aplikasi Fag Litik
Aplikasi fag litik sebagai agen antibakteri pertama kali digunakan pada awal
tahun 1920, diikuti dengan penemuan bakteriologis Inggris Fredrick Twort tahun
1915 dan juga ilmuwan Kanada Prancis Felix D’Herelle tahun 1917. Penemuan
D’Herelle adalah adanya mikroba yang antagonis terhadap bakteri dan
mengakibatkan lisis serta kematian sel bakteri. Dua tahun sebelumnya, Fredrick
Twort menemukan hal yang sama, tetapi dia tidak pernah mempertimbangkan
terapi fag (Travis 2010; Ryan et al 2011).
Terapi fag merupakan metode alternatif untuk mengatasi penyakit infeksi
sebagai solusi mengatasi patogen yang telah resisten terhadap antibiotik. Terapi
fag diaplikasikan pada manusia untuk pertama kalinya oleh Bruynoghe dan
Maisin pada tahun 1921. Fag diinjeksikan pada pasien yang diinfeksi
Staphylococcus. Selama 48 jam berhasil menurunkan panas (Abedon et al. 2011).
Beberapa penelitian juga menunjukkan fag diaplikasikan sebagai biokontrol
pencemaran air dan makanan. Di Bangladesh fag spesifik E.coli patogen telah
digunakan untuk sanitasi air dalam bentuk tablet pada air minum (Ochman dan
Selander 1984). Fag litik spesifik E. coli O157 (O’Flynn et al. 2004), fag spesifik
Salmonella dan Campylobacter Goode et al. 2003), fag spesifik Yersinia
enterocolitica (Strauch et al. 2001), fag spesifik Lactococcus garviae dan
Pseudomonas plecoglossicida (Park dan Nakai 2000) telah diaplikasikan dalam
mengatasi pencemaran makanan oleh bakteri patogen. Aplikasi fag juga
diterapkan pada hewan yang diinfeksi bakteri, misalnya; fag PlyG yang
melindungi mencit terhadap infeksi Bacillus antrachis (Schuch et al. 2002). Fag
spesifik Streptococcus pneumoniae yang menginfeksi tikus (Jado et al. 2003).
Beberapa lembaga seperti EPA (Environmental Protection Agency), USDA
(United State Depaprtment of Agriculture), dan FDA (Food and Drug
Administration) telah mengizinkan aplikasi fag sebagai biokontrol pada makanan
dan lingkungan. Produk fag yang diaplikasikan merupakan koktail fag dan fag
tunggal. Bakteri target dari produk koktail fag seperti Listeria monocytogenes.
Produk ini digunakan sebagai agen sterilisasi untuk makanan (ListShieldTM dan
LISTEXTM P100). Produk lain adalah untuk mengatasi patogen pasca panen
seperti Xanthomonas campestris pv. vesicatoria dan Pseudomonas syringae pv.
tomato (Omnilytics’ AgriphageTM) (Lu dan Koeris 2011).

METODE
Kerangka Penelitian
Penelitian ini terdiri atas 5 tahapan (Gambar 1). Tahapan-tahapan tersebut
yaitu reidentifikasi bakteri inang, isolasi fag, penentuan kisaran inang, morfologi
fag litik dengan TEM dan analisis berat molekul protein fag litik.

6

Reidentifikasi bakteri
inang
Isolasi Fag :
a. Pengambilan Sampel Fag Litik
b. Pemurnian dan Titrasi Fag litik
Penentuan Kisaran Inang Fag
Litik
Pengamatan Morfologi Fag litik
melalui TEM

Analisis Berat Molekul Protein Fag
Litik melalui SDS-PAGE
Gambar 1 Diagram alir penelitian

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2013 sampai dengan Mei
2014. Penelitian bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hewan, Pusat Antar
Studi (PAU) IPB dan Laboratorium TEM Eijkman Jakarta.

Prosedur penelitian
Reidentifikasi Bakteri Inang
Bakteri inang diisolasi dari feses penderita diare di Kecamatan Cigudeg
Kabupaten Bogor. Reidentifikasi bakteri inang dilakukan melalui pewarnaan
Gram dan karakterisasi fisiologis menggunakan KIT API 20E (Biomeurex).
Spesies yang telah direidentifikasi diuji patogenitasnya pada agar darah dan diuji
resistensi terhadap antibiotik. Antibiotik yang digunakan adalah antibiotik generik
sebanyak delapan jenis yaitu; ampisilin, amoksisilin, ciprofloksasin, tetrasiklin,
eritromisin, amoksisilin-asam klavulanat, azithromisin, dan cefotaksime.
Sebanyak 200 µL kultur Photobacterium damselae dengan OD600 nm = 0.4
ditambahkan ke dalam 15 mL media nutrient agar (NA) (Oxoid) bersuhu 55 °C
kemudian dituangkan ke dalam cawan dan dibiarkan memadat. Setelah dingin,
diletakkan kertas cakram, kemudian diteteskan 10 µL antibiotik uji. Dibiarkan

7
selama 10 menit untuk antibiotik berdifusi. Inkubasi pada suhu 37 °C selama 24
jam, diamati zona bening yang terbentuk dan diukur diameter zona hambatnya.
Pengambilan Sampel Fag
Sampel fag litik berasal dari air Danau IPB, sungai Cidepit, dan sungai
Ciparigi, Bogor. Metode pengambilan sampel purposive sampling. Titik
pengambilan sampel sebanyak 3 titik dengan jarak 5 m dari setiap titik
pengambilan sampel. Sebanyak 10 mL sampel air diambil menggunakan gayung.
Selanjutnya disimpan dalam botol steril.
Isolasi Fag
Sampel fag litik disaring berdasarkan metode Pitt dan Gaston (1995) yang
dimodifikasi. Sebanyak 4.5 mL sampel dicampurkan dengan kultur
Photobacterium damselae OD600nm = 1 (108 CFU mL-1) sebanyak 0.5 mL dan
ditambahkan 5 mL Nutrien broth (NB) (DifcoTM). Campuran diinkubasi di dalam
Waterbath shaker (Certomat WR) selama 24 sampai 48 jam pada suhu 37 °C.
Kultur tersebut kemudian disentrifugasi (IEC Clinical Centrifuge 215, US) pada
kecepatan 402.48 x g selama 20 menit. Sebanyak 5 mL supernatan diambil
dengan syringe dan disaring dengan membran filter berpori 0.22 μm (Nylon
syringe filter). Supernatan yang telah disaring disimpan dalam tabung steril.
Keberadaan fag dalam sampel diuji dengan menggunakan metode agar dua
lapis atau DLA (Double layer Agar). Sebanyak 100 μL sampel fag diencerkan
menggunakan bufer Saline Magnesium (SM) (Lampiran 1). Pengenceran sampel
fag dimulai dari 10-1 sampai dengan 10-8. Setiap serial pengenceran sampel fag
masing-masing diambil 200 μL dan ditambahkan kultur bakteri inang umur 24
jam OD600nm = 1 (108 CFU mL-1) sebanyak 400 μL, selanjutnya diinkubasi di
dalam heating bath pada suhu 37 °C selama 30 menit. Campuran tersebut
ditambahkan ke dalam 5 mL soft agar (0.75% agar) yang telah ditambahkan
CaCl2 (1 mM) bersuhu 47 °C untuk lapisan atas, kemudian dituang pada hard
agar (1.5% agar) lapisan bawah agar. Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam
dan diamati plak yang terbentuk (Atterbury et al. 2007).
Pemurnian dan Titrasi Fag
Plak tunggal dengan ciri-ciri tersendiri diambil dengan menggunakan pipet
Pasteur dan dimasukkan ke dalam tabung, kemudian ditambahkan 2 sampai 3 mL
buffer saline magnesium (SM). Suspensi dihomogenkan dan dibiarkan selama 5
sampai 10 menit pada suhu ruang. Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi (IEC
Clinical Centrifuge 215, US) dengan kecepatan 3622.32 x g, selama 20 menit dan
diulangi sebanyak dua kali. Supernatan disaring menggunakan membran filter
berpori 0.22 μm untuk selanjutnya hasil saringan disimpan sebagai stok fag
(Goodridge et al. 2003). Fag yang telah murni ditentukan konsentrasinya dengan
menghitung jumlah plak yang terbentuk (PFU mL-1).

8
PFU mL-1

= Jumlah plak
d xV

Keterangan : d : Pengenceran ke V : Volume fag yang ditambahkan
Penentuan Kisaran Inang fag
Penentuan kisaran inang fag dilakukan dengan menguji stok fag
menggunakan spesies bakteri inang yang berbeda-beda. Bakteri inang yang
digunakan adalah Salmonella P38, Salmonella 84, Enteropathogenic Escherichia
coli (EPEC K 1.1), Proteus mirabilis, dan Bacillus pumilus. Bakteri-bakteri
tersebut merupakan koleksi bakteri patogen Dr dr Sri Budiarti. Uji penentuan
kisaran inang dilakukan berdasarkan modifikasi Hansen et al. (2007). Stok fag
diencerkan dimulai dari 10-1 sampai dengan 10-8. Masing-masing pengenceran
diambil sebanyak 200 μL ditambahkan ke dalam 400 μL kultur bakteri yang
berumur 24 jam dan diinkubasi 30 menit, selanjutnya ditambahkan 5 mL soft agar
kemudian dihomogenkan dan dituang ke cawan yang berisi hard agar. Agar
dibiarkan mengeras pada suhu kamar dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24
jam. Terbentuknya plak mengiindikasikan fag memiliki kisaran inang luas,
sebaliknya tidak terbentuknya plak mengindikasikan fag memiliki kisaran inang
sempit.
Pengamatan Morfologi Fag dengan Transmission Electron Microscope
(TEM)
Sebanyak 10 µL stok fag diteteskan pada grid (400 mesh), ditunggu selama
20 detik, selanjutnya dikeringkan dengan kertas saring. Sebanyak 5 μL uranil
asetat 2% diteteskan ke atas grid ditunggu selama 1 menit. Grid dikeringkan
dengan menggunakan kertas saring dan dibiarkan selama 20 menit agar benarbenar kering (Carey et al. 2006). Selanjutnya grid diletakkan pada holder
mikroskop elektron. Spesimen diamati dengan menggunakan mikroskop elektron
transmisi model JEOL JEM-1010 yang dioperasikan 80kV pada perbesaran
10000x-100000x.
Analisis Berat Molekul Protein Fag
Stok fag diukur kadar proteinnya dengan menggunakan metode Bradford
(1976). Berat molekul protein fag dianalisis dengan Sodium Dedocyle SulphatePoly Acrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Marker yang digunakan
adalah PageRegulerTM Prestained Protein Ladder dengan berat molekul berturutturut adalah 10, 17, 28, 34, 48, 55, 72, 95, 130, dan 180 kDa. Konsentrasi gel
pemisah sebesar 12% poliakrilamida yang ditempatkan pada bagian bawah.
Konsentrasi gel pengumpul sebesar 4% poliakrilamida yang diletakkan di bagian
atas setelah gel pemisah telah padat. Fag, kontrol (akuabides), dan marker,
masing-masing dicampurkan dengan bufer sampel dengan perbandingan 4:1

9
(4 bagian sampel dan 1 bagian buffer sampel). Campuran dihomogenkan, lalu
diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya dipanaskan dalam air mendidih selama 5
menit, lalu dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 60 μL. Elektroforesis
dijalankan dengan arus 20 mA dan tegangan 50 volt selama 3.5 jam.
Elektroforesis diakhiri pada saat pewarna sampel mencapai batas 0.5 cm hingga
1 cm dari bagian bawah gel. Visualisasi pita-pita protein yang terdapat pada gel
akrilamid dilihat melalui pewarnaan dengan menggunakan pewarna perak
(Lampiran 2).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Reidentifikasi Bakteri Inang
Pewarnaan Gram menunjukkan bakteri inang termasuk bakteri Gram negatif
dan berbentuk batang pendek. Berdasarkan karakterisasi fisiologis bakteri inang
pada API 20E (Tabel 1) menunjukkan 98.7 % identik Photobacterium damselae.
Reaksi positif hanya pada uji ADH (Argine dihidrolase), GLU (glukosa), SAC
(Saccarose), oksidase, dan katalase sedangkan uji fisiologis lainnya menunjukkan
reaksi negatif.
Tabel 1 Karakterisasi fisiologis isolat Photobacterium damselae
Uji fisiologis
Reaksi
ONPG (Ortho NitroPhenyl- βDGalactopiranosidase)
ADH (Argine dihidrolase)
+
LDC (Lysine Decarboxylase)
ODC (Ornithine Decarboxylase)
CIT (Citrate utilization)
H2S (H2S production)
UREA (Urease)
TDA (Trytophane Deaminase)
INDOL (Indol production)
VP (Voges Proskaeur)
GEL (Gelatinase)
- : tidak terjadi reaksi; + : ada reaksi

Uji Fisiologis
GLU (Glucosa)
MAN (Manitol)
INO(Inositol)
SOR (Sorbitol)
RHA (Rhamnose)
SAC (Saccarose)
MEL (Melibiose)
AMY (Amygdalin)
ARA (Arabinose)
OKSIDASE
KATALASE

Reaksi
+
+
+
+

Pengujian patogenisitas Photobacterium damselae pada agar darah
menunjukkan aktivitas α hemolisis (melisiskan sebagian sel darah merah).
α hemolisis ditandai dengan isolat bakteri yang diinokulasikan pada agar darah
berwarna hijau keabu-abuan (Gambar 2).

10

Gambar 2 Photobacterium damselae pada agar darah menunjukkan aktivitas
α- hemolisis ( )
Berdasarkan interpretasi diameter zona hambat CSLI (2007 dan 2012)
menunjukkan bahwa Photobacterium damselae telah resisten terhadap 6 jenis
antibiotik yang digunakan, yaitu ampisilin, amoksisilin, tetrasiklin, eritromisin,
azitromisin, dan cefotaksime. Dua jenis antibiotik lainnya yaitu ciprofloksasin dan
asam klavulanat-amoksisilin masih sensitif terhadap Photobacterium damselae
(Tabel 2).
Tabel 2 Uji resistensi Photobacterium damselae terhadap beberapa jenis antibiotik

No

1
2
3
4
5

6
7
8

Antibiotik

Ampisilin
Amoksisilin
Ciprofloksasin
Tetrasiklin
Asam
klavulanatamoksisilin
Azitromisin
Eritromisin
Cefotaksime

Konsentrasi
(µg)

Interpretasi
diameter
zona hambat (mm)*

Diameter
zona
hambat
rata-rata
(mm)
9
8.6
32.6
7.6

Keterangan

Sensitif

Resisten

10
10
5
30

≥ 17
≥ 32
≥ 21
≥ 19

≤ 13
≤ 12
≤ 15
≤ 14

10

≥ 18

≤ 13

15.6

Sensitif

15
15
30

≥ 18
≥ 23
≥ 23

≤ 13
≤ 13
≤ 14

7.3
7.6
8

Resisten
Resisten
Resisten

Resisten
Resisten
Sensitif
Resisten

* Berdasarkan CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute) 2007 & 2012

Isolasi fag
Fag litik Photobacterium damselae diisolasi dari air Danau IPB, sungai
Cidepit, dan Ciparigi masing-masing sebanyak tiga titik pengambilan sampel.
Hasil isolasi menunjukkan hanya dua lokasi yang terdapat fag, dan dari tiga titik
pengambilan sampel hanya satu titik saja didapatkan fag litik (Tabel 3). Fag litik
ditemukan pada titik pengambilan sampel ketiga di sungai Cidepit sedangkan
pada sungai Ciparigi ditemukan pada titik pengambilan sampel pertama.

11
Tabel 3 Isolasi fag litik Photobacterium damselae
No

Lokasi Sampel

1
Danau IPB
2
Sungai Cidepit
3
Sungai Ciparigi
- : tidak ada fag litik; + : ada fag litik

Titik pengambilan sampel
1
2
3
+
+
-

Fag yang terdapat didalam sampel ditandai dengan adanya plak. Ada 3
morfologi dan ukuran plak yang berbeda (Gambar 3). Ketiga jenis plak tersebut
adalah cloudy plak, turbid plak, dan clear plak. Selanjutnya plak-plak tersebut
dimurnikan untuk mendapatkan isolat murni fag litik.

b

c
a

Gambar 3 Morfologi plak; a) cloudy plak, b) turbid plak, c) clear plak
Isolat fag pertama berasal dari sungai Cidepit (F A9) yang memiliki
morfologi cloudy plak (samar-samar) dengan diameter 0,3 mm. Plak yang
terbentuk tidak kelihatan jelas. Pada sungai Ciparigi didapatkan dua isolat fag
F A91 morfologi plaknya clear (jelas) dengan diameter 3 mm sedangkan F A92
menunjukkan morfologi turbid berdiameter 1 mm. Turbid dan cloudy plak hampir
sama namun turbid plak masih kelihatan area lisisnya sel bakteri oleh fag
walaupun tidak keseluruhan. Hasil titrasi (PFU mL-1) ketiga isolat fag litik
berbeda-beda. Turbid plak memiliki konsentrasi tertinggi yaitu 62 x 106 (PFU
mL-1), konsentrasi clear plak 11 x 105 (PFU mL-1), dan konsentrasi cloudy plak
hanya 3 x 104 (PFU mL-1) (Tabel 4).

12
Tabel 4 Karakteristik plak dan konsentrasi (PFU mL-1) fag litik Photobacterium
damselae (F A9)
No Lokasi sampel
1

Sungai Cidepit

2

Sungai Ciparigi

Isolat fag
F A91
F A92
F A93

Karakteristik plak fag litik
Morfologi
Diameter
plak
plak (mm)
cloudy plak
0,3
clear plak
3
turbid plak
1

Konsentrasi
fag litik
(PFU mL-1)
3 x 104
11 x 105
62 x 106

Kisaran Inang Fag
Pengujian kisaran inang fag (Tabel 5) menunjukkan bahwa fag litik F A9
hanya dapat menginfeksi Photobacterium damselae, tetapi tidak dapat
menginfeksi Salmonella P38, Salmonella 84, Proteus mirabillis, EPEC K 1.1, dan
Bacillus pumilus. Ini mengindikasikan bahwa F A9 memiliki kisaran inang sempit
(spesifik hanya terhadap Photobacterium damselae).
Tabel 5 Kisaran inang fag litik F A9
Isolat fag litik
F A9

1
-

2
-

Bakteri inang*
3
4
-

5
+

6
-

* 1) Salmonella P38, 2) Salmonella 84, 3) EPEC K 1.1, 4) Proteus mirabilis,
5) Photobacterium damselae, 6) Bacillus pumilus; + : terbentuk plak; - : tidak
terbentuk plak.
Pengamatan Morfologi Fag dengan Transmission Electron Microscope
(TEM)
Morfologi fag F A9 dilakukan dengan menggunakan Transmision Electron
Microscope (TEM) model JEOL JEM-1010 yang dioperasikan 80kV. Perbesaran
yang digunakan adalah 50000 kali menggunakan pewarnaan negatif uranil asetat
2%. Morfologi F A9 menunjukkan kepala berbentuk ikosahedral dan ekor
kontraktril (Gambar 4). Ukuran kepala berdiameter 30 nm dan panjang ekor 60
nm. Berdasarkan karakteristik tersebut, menurut International Committee on
Taxonomy of Viruses (ICTV) fag F A9 termasuk famili Myoviridae. Famili
Myoviridae merupakan famili fag berekor dari ordo Cudovirales. Famili
Myoviridae terdiri atas spesies fag terbanyak kedua setelah famili Siphoviridae.

13

a

b

Gambar 4 Morfologi fag F A9 dengan pewarnaan negatif uranil asetat
2% dan perbesaran 50000 kali :a) kepala; b) ekor kontraktil.
Bar: 100 nm

Analisis Berat Molekul Protein Fag
Hasil SDS-PAGE yang diberi pewarna perak menunjukkan dalam suspensi
fag F A9 terdapat protein dengan berat molekul yang bervariasi (Sumur ke-3,
Gambar 5). Berat molekul protein masing-masing 109.06 kDa, 30.58 kDa, 17.01
kDa, dan 14.96 kDa. Keempat pita protein ini dapat mengindikasikan protein
penyusun F A9.
kDa
180
130
95
72
55
43
34
28
17

1

2

3
109.06

30.58
17.01
14.96

10

Gambar 5

Profil protein F A9 melalui SDS-PAGE; 1) protein marker,
2) kontrol (Akuabides), 3) F A9

14
Pembahasan
Pewarnaan Gram merupakan tahapan awal dalam identifikasi bakteri
berdasarkan karakeristik morfologi selnya. Prinsip dasar pewarnaan Gram adalah
adanya pewarna tanding (safranin) dan karakteristik komponen penyusun dinding
sel sehingga bakteri dapat dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif (Pelczar dan Chan 2005). Photobacterium damselae
termasuk bakteri Gram negatif. Hasil uji karakterisasi fisiologis pada API 20E
digunakan untuk mengidentifikasi bakteri sampai pada spesies. API 20E biasa
digunakan untuk identifikasi bakteri Gram negatif Enterobacteraceae dan bakteri
Gram negatif non fermentatif (Shayegani et al. 1978).
Kemampuan untuk melisiskan darah merah (hemolitik) merupakan indikasi
patogenisitas suatu bakteri. Pada agar darah Photobacterium damselae
menunjukkan aktivitas α-hemolisis (Gambar 2). α-hemolisis merupakan salah satu
faktor virulensi Photobacterium damselae. Berdasarkan hasil penelitian
Rivas et al. (2011) strain dari Photobacterium damselae memiliki dua aktivitas
hemolitik yang berbeda yaitu β hemolisis (large hemolytic halo, medium
hemolytic halo, dan small hemolytic halo) dan α-hemolisis (no hemolytic halo).
α-hemolisis ditandai adanya perubahan warna agar darah menjadi hijau keabuabuan. Perubahan warna agar darah tersebut disebabkan hemoglobin yang
terkandung di dalam darah diubah menjadi metahemoglobin. Fe2+ dioksidasi
menjadi Fe3+. Ini juga disebabkan Photobacterium damselae memiliki
kemampuan untuk mengikat besi (Fe). Osorio et al. (2010) melaporkan 10 gen
Photobacterium damselae subspesies damselae yang diisolasi dari manusia
mengkode penggunaan heme dan hemoglobin sebagai sumber besi.
Hasil pengujian Photobacterium damselae terhadap antibiotik (Tabel 2)
menunjukkan bakteri ini telah resisten terhadap antibiotik yang digunakan. Hasil
yang sama juga dilaporkan oleh Zanneti et al. (2001) dan Vaseeharan et al. (2005)
bahwa Photobacterium damselae sudah resisten terhadap amoksisilin, ampisilin,
tetrasiklin, dan eritromisin, namun Hundenborn et al. (2013) melaporkan
ciprofloksasin masih efektif terhadap Photobacterium damselae. Antibiotik yang
masih sensitif ini nantinya bisa digunakan sebagai kombinasi bersama fag litik.
Fag litik dapat menjadi alternatif dalam upaya mengatasi resistensi
antibiotik bakteri patogen. Fag litik Photobacterium damselae didapatkan dari
lingkungan perairan sungai Ciparigi Bogor (Tabel 3). Menurut Ashelford et al.
(2003) kepadatan fag pada lingkungan perairan diperkirakan 2.5 x 108 partikel per
milliliter. Fag tersebut sangat berperan penting dalam pengaturan kelimpahan dan
penyebaran inangnya (Carter dan Saunders 2007). Fag litik Photobacterium
damselae tidak ditemukan pada danau IPB mengindikasikan bahwa tidak
terdapatnya bakteri ini. Keberadaan fag sangat dipengaruhi keberadaan inang.
Melimpahnya populasi inang fag berimplikasi pada melimpahnya fag.
Photobacterium damselae merupakan bakteri halofilik. Tidak didapatkannya fag
litik pada danau IPB mengindikasikan lingkungan danau tersebut tidak cocok
untuk Photobacterium damselae terutama salinitasnya rendah sedangkan salinitas
pada sungai lebih tinggi dibandingkan pada danau.
Adanya fag dalam sampel ditandai dengan terbentuknya plak. Plak yang
terbentuk bisa terlihat setelah inkubasi pada suhu 37 °C dengan rentang waktu 18
sampai 24 jam. Plak merupakan sel bakteri yang dilisiskan oleh virus. Satu plak

15
yang terbentuk mengindikasikan satu koloni bakteri inang yang lisis oleh virus.
Pertumbuhan inang merupakan faktor yang dapat mempengaruhi pembentukan
plak dan faktor primer yang mempengaruhi produksi fag (Taj et al. 2013).
Pertumbuhan inang yang tidak merata akan mempengaruhi kemampuan infeksi
fag dari satu sel ke sel lainnya (Los et al. 2008).
Adsorpsi merupakan tahapan awal untuk infeksi fag ke dalam sel inangnya.
Waktu adsorpsi fag berbeda-beda sehingga bisa mempengaruhi pada
pembentukkan plak. Penambahan ion Ca2+ atau Mg2+ pada media tumbuh fag
tidak hanya menstabilkan koil DNA yang terdapat dalam kapsid dan
meningkatkan absorpsi tetapi juga mengatur efisiensi penetrasi DNA fag ke dalam
sel bakteri. Setelah absorpsi (DNA diinjeksikan), kation divalen berperan selama
translokasi DNA fag melewati membran sel dan menjaga stabilisasi DNA pada
tahapan injeksi (Sechaud et al. 1988).
Waktu lisis juga dapat mempengaruhi pembentukan plak. Waktu lisis
berkaitan dengan sintesis lisozim (Hadas et al. 1997) sehingga sering
memunculkan morfologi dan ukuran plak yang terbentuk, berbeda-beda (Gallet
et al. 2011). Kuo et al. (1966) melaporkan konsentrasi agar juga berperan dalam
pembentukan plak. Konsentrasi agar yang menunjukkan ukuran plak terbesar
adalah 0.6 % sampai 0.8 %. Ukuran plak dapat diperbesar dengan penambahan
antibiotik dan gliserol pada media tumbuh fag (Santos et al. 2009).
F A91 memiliki morfologi plak cloudy. Plak ini mengindikasikan bahwa
fag tersebut merupakan fag lisogenik. Fag lisogenik sewaktu-waktu akan
mengalami tahapan lisis. Lisisnya sel bakteri pada fag lisogenik akan membentuk
plak yang tidak jelas (samar-samar). Lisis ini dapat terjadi karena beberapa faktor,
diantaranya faktor genetik dan lingkungan (sinar ultraviolet) (Clokie dan
Kropinski 2009). Dibandingkan fag litik, fag lisogenik tidak dapat digunakan
untuk mengatasi bakteri patogen sehingga F A91 tidak dapat digunakan.
Fag F A92 dan F A93 yang memiliki morfologi clear plak dan turbid plak.
Morfologi plak tersebut mengindikasikan fag yang diisolasi adalah fag litik. Clear
dan turbid plak dapat melisiskan sel bakteri. Diindikasikan bahwa F A92 dan F
A93 adalah fag yang identik (F A9). Ini berdasarkan hasil pasase sebanyak 5 kali
menunjukkan adanya perubahan morfologi plak. Clear plak berubah menjadi
turbid plak begitu juga sebaliknya. Fenomena tersebut biasa terjadi karena adanya
adaptasi fag. Clear plak diameternya lebih besar daripada turbid plak (Tabel 4).
Ini mengindikasikan efek lisis clear plak lebih tinggi dibandingkan turbid plak.
Fag dengan efek lisis yang tinggi akan menghasilkan konsentrasi titer fag yang
lebih rendah. Konsentrasi clear plak (F A92) lebih rendah dibandingkan turbid
plak (F A93) yang memiliki efek lisis lebih rendah (Tabel 4). Konsentrasi titer fag
ditentukan berdasarkan banyaknya plak yang terbentuk (plaque forming unit
(PFU mL-1)) (Tortora et al. 2006).
Umumnya fag bersifat monovalen yaitu kisaran inang sempit hanya mampu
menginfeksi satu spesies bakteri. McLaughlin et al. (2006) menyatakan bahwa
sebagian besar fag hanya menginfeksi satu serotipe dalam satu spesies bakteri.
Walaupun demikian, ada beberapa fag juga bersifat polivalen (kisaran inang luas).
Polivalen fag dapat menginfeksi dua atau lebih spesies bakteri (Kalmansom dan
Bronfenbrenner 1942). F A9 menunjukkan kisaran inang sempit. F A9 hanya
menginfeksi Photobacterium damselae tetapi tidak lima bakteri inang lainnya

16
(Tabel 5). Diduga situs penempelan fag F A9 terdapat pada bagian polisakarida
Photobacterium damselae sebagai reseptornya.
Kisaran inang berkaitan erat dengan kecocokan pada reseptor. Setiap fag
memiliki reseptor yang bervariasi, variasi dari reseptor-reseptor ini yang berperan
besar terhadap spesifitas inang fag (Prescott et al. 2002). Reseptor menentukan
adsorpsi partikel-partikel fag terhadap sel-sel bakteri pada tahap awal infeksi
(Topley dan Wilson 1990). Pada fag berekor protein khusus terdapat pada bagian
tail spikes dan serabut ekor. Protein ini menempel pada struktur spesifik pada
permukaan luar bakteri inang. Flagelin, asam teikoat, polisakarida kapsular
(antigen-K), lipopolisakarida (antigen-O), dan membran protein spesifik yang
digunakan sebagai situs penempelan (Thompson et al. 2010).
Morfologi fag seperti bagian kepala (kapsid), ekor, dan asam inti tampak
melalui pengamatan menggunakan mikroskop elektron dengan pewarnaan negatif.
Pewarna negatif yang biasa digunakan adalah uranil asetat dan phospotungstate.
Penggunaan uranil asetat lebih menguntungkan dibandingkan phospotungstate.
Selain morfologi tampak lebih jelas, grid fag dapat disimpan dalam waktu
puluhan tahun (Clokie dan Kropinski 2009). Fag F A9 memiliki morfologi yang
identik dengan famili Myoviridae (Gambar 4). Myoviridae merupakan famili fag
berekor kontraktil dengan asam inti terdiri atas DNA utas ganda. Secara morfologi
F A9 identik dengan fag T4 yang juga termasuk Myoviridae. Kepala ikosahedral
dan ekor T4 terdiri atas selubung kontraktil. Ekor sangat berperan dalam proses
injeksi DNA fag ke dalam sel bakteri inang (Leiman et al. 2010). Ukuran fag
F A9 lebih kecil dibandingkan anggota Myoviridae lain yang telah dilaporkan.
Kapsid dan ekor fag terdiri atas protein. Protein-protein tersebut bervariasi
dan memiliki fungsi yang berbeda-beda. Fungsi tersebut meliputi perlindungan
fag terhadap ketahanannya dilingkungan dan berperan pada proses replikasi
sampai menyebabkan lisisnya sel inang. Melalui SDS-PAGE dapat diketahui berat
molekul protein pada fag yang bervariasi. Variasi berat molekul protein tersebut
mengindikasikan protein-protein penyusun fag.
Belum ada laporan penelitian sebelumnya mengenai berat molekul fag litik
Photobacterium damselae. Hasil analisa SDS-PAGE menunjukkan berat molekul
protein fag F A9 (Sumur ke-3, Gambar 5) yang bervariasi ini berbeda dengan
berat molekul protein penyusun fag lainnya pada famili Myoviridae yang pernah
dilaporkan. T4 protein penyusun kapsidnya adalah gp23 dengan berat molekul
proteinnya sebesar 43.5 kDa, protein pembungkus ekor (gp18) berat molekul
proteinnya 71.20 kDa, dan protein tabung ekor (gp19) dengan berat molekul
proteinnya 18. 5 kDa. Anggota fag Myoviridae lainnya seperti P2 dan P4 protein
penyusun kapsidnya (gpN) berat molekulnya 36.7 kDa, berat molekul protein
pembungkus ekor (gFI) lebih kecil yaitu 43.1 kDa, dan protein tabung ekor (gFII)
sebesar 18.9 kDa. Protein penyusun kapsid (gp23) pada fag Mu berat molekulnya
44 kDa, berat molekul protein pembungkus ekor (gp22) 56.9 kDa, dan berat
molekul penyusun tabung ekor (Tub) 22.3 kDa. Pada fag P1 protein penyusun
kapsidnya (gpT) 33 kDa, protein pembungkus ekor (gpL) 53 kDa, dan protein
tabung ekor (gpM) 12.8 kDa (Korol dan Tovkoch 2012).
Ukuran protein fag F A9 sebesar 14.96 kDa dan 17.01 kDa diduga
merupakan protein penyusun tabung ekor. Asumsi tersebut berdasarkan data
bahwa kisaran berat molekul protein penyusun tabung ekor pada famili
Myoviridae adalah 13 kDa–22 kDa. Berat molekul protein fag F A9 30.58 kDa

17
diduga merupakan protein penyusun kapsid dan berat molekul fag F A9 109.06
kDa diduga merupakan protein pembungkus ekor. Dugaan ini juga berdasarkan
data kisaran berat molekul penyusun kapsid pada Myoviridae 33 kDa-44 kDa dan
kisaran berat molekul protein pembungkus ekor 43 kDa-72 kDa (Korol dan
Tovkoch 2012). Meskipun ukuran protein pada F A9 lebih besar dari kisaran berat
molekul protein untuk protein pembungkus ekor, diasumsikan juga terdiri atas
bagian protein pada lempengan dasar fag F A9.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Fag litik Photobacterium damselae (F A9) didapatkan dari air sungai
Ciparigi, Bogor. F A9 termasuk famili Myoviridae yang memiliki morfologi
kepala ikosahedral berdiameter 30 nm, ekor kontraktril dengan panjang 60 nm.
Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan 4 pita protein dengan berat molekul
protein masing-masing 109.06 kDa, 30.58 kDa, 17.01 kDa, dan 1