Karakterisasi Bakteri Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi Riau dan Jambi
KARAKTERISASI BAKTERI NITRIFIKASI
KOLAM IKAN AIR TAWAR PROVINSI RIAU DAN JAMBI
MEGAWATI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Bakteri
Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi Riau dan Jambi adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Megawati
NIM G34100009
ABSTRAK
MEGAWATI. Karakterisasi Bakteri Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi
Riau dan Jambi. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan YUNI PUJI HASTUTI.
Akumulasi senyawa nitrogen anorganik dalam kolam budidaya ikan air
tawar dapat menurunkan kualitas kolam ikan. Permasalahan tersebut dapat diatasi
dengan pendekatan bioremediasi yang melibatkan aktivitas metabolisme mikroba
untuk menurunkan konsentrasi nitrogen anorganik sampai tingkat konsentrasi
yang aman. Salah satu proses mikrobial yang terlibat dalam bioremediasi adalah
nitrifikasi. Nitrifikasi adalah proses oksidasi amonium menjadi nitrit dan oksidasi
nitrit menjadi nitrat. Penelitian ini bertujuan melakukan karakterisasi bakteri
nitrifikasi yang diisolasi dari kolam ikan air tawar di Provinsi Riau dan Jambi.
Karakterisasi dilakukan terhadap 14 isolat yang merupakan bakteri Gram negatif.
Hasil uji oksidasi amonium menunjukkan bahwa terdapat 6 isolat mampu
melakukan aktivitas oksidasi amonium di atas 80%. Tiga isolat yang diuji kinetika
oksidasi amonium, yaitu RCC1, RCSC2, dan JCSC2 mempunyai nilai konstanta
Michaelis-Menten (Km) sebesar 2.44, 3.95, dan 7.99 mM. Isolat RCC1 yang
mempunyai nilai Km lebih kecil dibandingkan keduanya menunjukkan bahwa
isolat RCC1 mempunyai enzim dengan afinitas tinggi terhadap substratnya.
Kata kunci: karakterisasi bakteri, kualitas air, oksidasi amonium, nitrifikasi
ABSTRACT
MEGAWATI. Characterization of Nitrifying Bacteria of Freshwater Pond in Riau
and Jambi Province. Supervised by IMAN RUSMANA and YUNI PUJI
HASTUTI.
Accumulation of inorganic nitrogen compounds in a freshwater pond could
decrease water quality of a freshwater pond. This problem could be solved using
bioremediation approach involving microbial metabolic activities to decrease the
inorganic nitrogen concentration until the safe level. One of microbial processes
involved in bioremediation is nitrification. Nitrification is oxidation process of
ammonium to nitrite and nitrate. The objective of this research was to characterize
nitrifying bacteria isolated from freshwater ponds in Riau and Jambi Province.
The characterization was carried out on 14 isolates which were Gram-negative
bacteria. Ammonium oxidation test showed that 6 isolates could oxidize
ammonium up to 80%. Michaelis-Menten constant values (Km) of three isolates
i.e. RCC1, RCSC2, and JCSC2 isolates were 2.44, 3.95, and 7.99 mM
respectively. The RCC1 isolate had the smallest Km values, it indicated that this
isolate had enzymes with high affinity to their substrates.
Keywords: characterization of bacteria, water quality, ammonium oxidation,
nitrification
KARAKTERISASI BAKTERI NITRIFIKASI
KOLAM IKAN AIR TAWAR PROVINSI RIAU DAN JAMBI
MEGAWATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 ini ialah nitrogen, dengan
judul Karakterisasi Bakteri Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi Riau dan
Jambi.
Ungkapan terimakasih penulis sampaikan kepada:
1 Bapak Dr Ir Iman Rusmana, MSi dan Ibu Yuni Puji Hastuti, SPi, MSi
selaku pembimbing atas saran dan dukungan dalam penelitian dan
penyusunan karya ilmiah ini.
2 Keluarga tercinta, yaitu Bapak Atmaja (ayah), Ibu Asenih (ibu), Siti
Hardiyanti (adik), dan Oktavia Rahmawati (adik) serta keluarga besar
atas limpahan doa, kasih sayang, dan motivasinya.
3 Rekan satu bimbingan, yaitu Tiara AD, Nurlatiefah, Nindya S, Yuli SF,
Erma S, Kak Randi, Kak Masrukhin, Kak Aay, Kak Antri, dan Kak
Hendri atas motivasi dan bantuannya.
4 Rekan-rekan Mikrobiologi atas segala motivasi dan arahannya selama
penelitian.
5 Rekan-rekan Biologi 47 atas segala pengalaman dan motivasi.
6 Sahabat Pondok Aisyah, yaitu Desty, Tiara, Lupita, Tri, Khairunnisa,
Wanda, Astri, Sulis, dan Indah atas doa, motivasi, dan pengalaman
berharga menjadi keluarga kedua bagi saya.
7 Sahabat terkasih, antara lain Desty, Angga, Hanafi, Dwi, Olivia, dan
sahabat Rohis 22 atas doa dan motivasinya.
8 Semua pihak yang turut memberikan doa dan semangatnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Megawati
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Hasil
4
Pembahasan
9
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Karakteristik isolat bakteri nitrifikasi
Perbandingan hasil pengukuran OD sel pada media nitrifikasi autotrof
dan heterotrof per hari
Kemampuan isolat untuk mengoksidasi amonium dengan menghasilkan
senyawa nitrit dan nitrat setelah 5 hari inkubasi
Hasil uji kinetika nilai Km dan Vmaks
6
7
7
9
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
Hasil pemurnian dengan metode kuadran. (a) Isolat RCSC2, (b) Isolat
RCC1, (c) Isolat JCSC2
Hasil pewarnaan Gram. (a) Isolat RCSC2, (b) Isolat RCC1, (c) Isolat
JCSC2
Laju oksidasi amonium dan akumulasi nitrit isolat RCSC2, RCC1 dan
JCSC2
5
5
8
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Kurva standar amonium
Kurva standar nitrit
Kurva standar nitrat
Komposisi media nitrifikasi
13
13
13
14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Provinsi Riau dan Jambi memiliki sumberdaya perikanan yang cukup besar.
Berdasarkan data pada tahun 2007, Riau memiliki potensi perikanan budidaya
kolam seluas 8200 Ha dengan realisasi seluas 3685 Ha sedangkan Jambi memiliki
3000 Ha dengan realisasi seluas 1606 Ha (KKP 2009). Produksi perikanan
budidaya ikan air tawar di Provinsi Jambi pada tahun 2011 sebanyak 34478.8 ton
dengan budidaya terbesar berupa budidaya ikan patin (BPS 2013). Hasil produksi
tersebut tidak terlepas dari sistem budidaya yang dilakukan secara intensif. Pada
sistem budidaya intensif, ikan dipelihara dengan kepadatan tinggi dan semua
nutrisi diperoleh secara langsung dari pakan yang diberikan dengan kandungan
protein yang tinggi (Rohmana 2009).
Aktivitas budidaya ikan air tawar yang dilakukan dengan sistem intensif
menghasilkan limbah pakan yang tinggi, dari semua pakan yang diberikan hanya
70% yang dimakan oleh ikan dan sisanya sebanyak 30% akan lepas ke badan
perairan sebagai bahan pencemar atau limbah (Rachmansyah 2004). Degradasi
sisa pakan (bahan organik) tersebut akan menghasilkan senyawa nitrogen
anorganik berupa NH3 (amonia), NO3- (nitrat), dan NO2- (nitrit) (Widiyanto 2006).
Akumulasi senyawa nitrogen anorganik tersebut dapat menghambat pertumbuhan
bahkan menyebabkan kematian massal ikan-ikan yang dibudidayakan (Erlania et
al. 2010).
Permasalahan akumulasi senyawa nitrogen anorganik tersebut dapat diatasi
melalui pendekatan bioremediasi yang melibatkan aktivitas metabolisme mikroba
dengan tujuan menurunkan tingkat akumulasi sampai tingkat konsentrasi yang
aman (Widiyanto 2006). Konsentrasi yang aman untuk budidaya ikan air tawar,
yaitu amonia kurang dari 0.01 mg/l dan nitrit kurang dari 0.06 mg/l (BBPBAT
2014). Salah satu proses yang terlibat dalam menurunkan akumulasi senyawa
nitrogen anorganik tersebut adalah nitrifikasi. Nitrifikasi merupakan proses
mikrobial yang mengoksidasi komponen nitrogen (amonium) menjadi nitrit dan
nitrat. Nitrifikasi berlangsung melalui dua tahapan reaksi, yaitu pada tahap
pertama oksidasi amonium menjadi nitrit yang dilakukan oleh mikroba
pengoksidasi amonium, contohnya Nitrosomonas dan Nitrosococcus. Tahap
kedua adalah oksidasi nitrit menjadi nitrat oleh mikroba pengoksidasi nitrit,
contohnya Nitrobacter. Selain itu, ada kelompok bakteri heterotrofik dapat
melakukan nitrifikasi, contohnya Pseudomonas (EPA 2002).
Salah satu pendekatan bioremediasi dalam mengatasi permasalahan
lingkungan perairan budidaya memerlukan gambaran karakteristik bakteri
nitrifikasi. Karakteristik secara morfologi dan aktivitas bakteri mengoksidasi
amonium dan nitrit adalah hal yang perlu diamati dalam katakterisasi ini.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan melakukan karakterisasi bakteri nitrifikasi yang
diisolasi dari kolam ikan air tawar Provinsi Riau dan Jambi.
2
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan bisa dijadikan sebagai acuan dalam melakukan
karakterisasi bakteri nitrifikasi yang diisolasi dari kolam ikan air tawar dan
mengetahui kemampuan bakteri dalam mengoksidasi amonium.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai Juli 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Sampel
merupakan isolat yang diambil dari kolam ikan air tawar di Provinsi Riau dan
Jambi.
Bahan
Bahan yang digunakan ialah isolat bakteri nitrifikasi kolam ikan air tawar
sebanyak 14 isolat terdiri atas 5 isolat asal Jambi dan 9 isolat asal Riau koleksi
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Nama isolat dari
Riau ditandai dengan huruf awal R sedangkan isolat dari Jambi ditandai dengan
huruf awal J. Media yang digunakan adalah media cair nitrifikasi dan media padat
nitrifikasi (Rodina 1972 dalam Novita 2006). Reagen yang digunakan adalah
reagen amonium, reagen nitrit, dan reagen nitrat.
Prosedur Analisis Data
Pemurnian dan peremajaan isolat
Pemurnian isolat dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media
agar nitrifikasi melalui metode kuadran dan diinkubasi pada suhu ruang (28-31
°C) selama 5 hari. Koloni murni yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada media
agar nitrifikasi, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-4 hari hingga sel
bersifat murni.
Karakterisasi morfologi
Isolat murni hasil isolasi diamati morfologi koloninya, meliputi bentuk,
warna, elevasi, dan tepiannya. Bentuk sel diamati dan reaksi Gram dari tiap isolat
ditentukan dengan teknik pewarnaan Gram. Warna merah muda menunjukkan
bahwa sel bakteri bersifat Gram negatif sedangkan warna ungu menunjukkan
bahwa sel bakteri bersifat Gram positif (Hadioetomo 1983).
Pengujian isolat pada media autotrof dan heterotrof
Media agar nitrifikasi terdiri dari dua macam, yaitu media nitrifikasi
autotrof (CaCO3 sebagai sumber karbon) dan media nitrifikasi heterotrof (glukosa
3
sebagai sumber karbon). Isolat ditumbuhkan pada kedua media cair nitrifikasi dan
diinkubasi pada inkubator berpenggoyang dengan suhu ruang (28-31 °C).
Pertumbuhan sel isolat pada media nitrifikasi heterotrof dianalisis pada hari ketiga
sedangkan pertumbuhan sel isolat pada media nitrifikasi autotrof dianalisis pada
hari keempat dengan kerapatan optik (OD) menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 550 nm.
Uji aktivitas oksidasi amonium
Sebanyak 2 lup isolat murni diinokulasikan pada 10 ml media cair nitrifikasi,
kemudian diinkubasi pada inkubator berpenggoyang dengan suhu ruang (2831 °C) selama 5 hari. Pengukuran aktivitas oksidasi amonium dilakukan pada hari
ke-5. Pengukuran ini dilakukan melalui analisis kadar amonium, nitrit, dan nitrat.
Presentase jumlah amonium yang teroksidasi (AO) dan senyawa nitrat atau
nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:
[
]
[
[
]
]
Keterangan:
AO
: Persentase amonium yang teroksidasi
AK
: Konsentrasi amonium pada media kontrol
AP
: Konsentrasi amonium pada media yang diinokulasi bakteri
Persentase jumlah nitrat yang terbentuk (PNA) atau persentase jumlah nitrit
yang terbentuk (PNI) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
[
]
[
[
]
]
Keterangan:
PNA
: Persentase jumlah nitrat yang terbentuk
NT
: Kandungan nitrat pada suspensi perlakuan (diinokulasi isolat
bakteri)
NK
: Kandungan nitrat pada kontrol (tidak diinokulasi bakteri)
AK
: Kandungan amonium pada kontrol
AP
: Kandungan amonium pada suspensi perlakuan
Kinetika oksidasi amonium
Inokulum untuk pengujian disiapkan dengan menumbuhkan isolat pada 100
ml medium cair nitrifikasi yang menggunakan glukosa sebagai sumber karbon,
kemudian diinkubasi di atas inkubator berpenggoyang pada kecepatan 100 rpm
dan suhu ruang (28-31 °C) selama tiga hari. Kultur bakteri dibuat pelet dengan
cara sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Pelet dipisahkan
dan diresuspensi dengan medium nitrifikasi tanpa amonium. Sebanyak 2 ml kultur
bakteri diinokulasikan ke dalam 10 ml medium nitrifikasi dengan konsentrasi
amonium sebesar 0, 500, 1000, 1500, dan 2000 μM dilakukan secara duplo.
Kemudian diinkubasi selama 3 jam di atas inkubator berpenggoyang pada
kecepatan 100 rpm dan suhu ruang (28-31 °C). Kontrol masing-masing perlakuan
4
dibuat tanpa diinokulasi kultur bakteri. Pengukuran aktivitas oksidasi amonium
dilakukan setelah 3 jam inkubasi. Analisis kinetika oksidasi amonium dilakukan
dengan menggunakan persamaan kinetika Michaelis-Menten (White 2000). Nilai
Km (konstanta Michaelis-Menten) digunakan dalam menentukan ukuran afinitas
enzim-substrat (E-S), yang merupakan suatu indikator kekuatan ikatan kompleks
E-S atau suatu tetapan keseimbangan untuk disosiasi kompleks E-S menjadi E dan
S. Nilai Km kecil berarti afinitas enzim tinggi terhadap substrat, sedangkan bila
Km besar berlaku kebalikannya (Fox 1991 diacu dalam Putra 2009).
Analisis kadar amonium
Kadar amonium ditentukan dengan metode spektrofotometri. Sebanyak 2 ml
sampel yang telah disaring ditambah dengan 0.08 ml fenol alkohol 10%, 0.08 ml
sodium nitroprusid, dan 0.2 ml campuran hipoklorit teknis dan alkalin sitrat 20%
(1 : 4), kemudian didiamkan selama 1 jam pada kondisi gelap. Setiap setelah
pemberian pereaksi dilakukan pengadukan. Pemberian pereaksi akan
menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang
gelombang 640 nm (Eaton et al. 2005). Nilai absorban yang diperoleh dikonversi
menggunakan standar hingga diperoleh satuan dalam konsentrasi (μM).
Analisis kadar nitrit
Sebanyak 2 ml sampel yang telah disaring ditambah dengan 0.08 ml
pewarna nitrit. Pewarna nitrit dibuat dengan mencampurkan 1 gram sulfanilamid,
10 ml phosphoric acid 85%, dan 80 ml aquades dengan 0.1 gram NED (Naftalena
Etilena Diamina). Kemudian didiamkan selama 10 menit. Setiap setelah
pemberian pereaksi dilakukan pengadukan. Pemberian pereaksi akan
menghasilkan warna merah muda hingga keunguan. Warna yang terbentuk dibaca
serapannya pada panjang gelombang 543 nm (Eaton et al. 2005). Nilai absorban
yang diperoleh dikonversi menggunakan standar hingga diperoleh satuan dalam
konsentrasi (μM).
Analisis kadar nitrat
Sebanyak 1 ml sampel yang telah disaring ditambah dengan 0.2 ml larutan
natrium klorida, 1 ml asam sulfat 80%, dan 0.05 ml brucine sulfanilic acid,
kemudian dipanaskan selama 20 menit. Setiap setelah pemberian pereaksi
dilakukan pengadukan. Pemberian pereaksi akan menghasilkan warna kuning.
Warna yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang gelombang 410 nm (Rand
et al. 1979). Nilai absorban yang diperoleh dikonversi menggunakan standar
hingga diperoleh satuan dalam konsentrasi (μM).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Pemurnian dan peremajaan isolat bakteri berhasil dilakukan terhadap 14
isolat terdiri atas 5 isolat asal Jambi dan 9 isolat asal Riau. Semua isolat dapat
5
hidup secara aerobik dalam media yang mengandung amonium sebagai sumber
nitrogen dan karbonat sebagai sumber karbonnya. Pemurnian bakteri dilakukan
dengan metode kuadran agar menghasilkan koloni tunggal (Gambar 1). Hasil
pewarnaan Gram menunjukkan sel berwarna merah muda (Gambar 2).
(a)
(b)
(c)
Gambar 1 Hasil pemurnian dengan metode kuadran. (a) Isolat RCSC2,
(b) Isolat RCC1, (c) Isolat JCSC2
(a)
(b)
(c)
Gambar 2 Hasil pewarnaan Gram. (a) Isolat RCSC2, (b) Isolat RCC1,
(c) Isolat JCSC2
Berdasarkan pengamatan pada keempat belas isolat, terlihat bahwa isolat
mempunyai bentuk koloni yang didominasi oleh bentuk bundar dan tepian licin.
Warna koloninya sebagian besar berwarna putih, sedangkan isolat lainnya
berwarna kuning dan bening. Karakteristik morfologi pada sel dilakukan dengan
pewarnaan Gram, warna merah muda pada sel bakteri menunjukkan bahwa semua
sel bakteri berjenis Gram negatif. Sel pada sepuluh isolat berbentuk kokus
sedangkan empat isolat lainnya berbentuk basil (Tabel 1).
6
No
Isolat
1.
RBA1
2.
RCC1
3.
RCC2
4.
RCSC1
5.
RCSC2
6.
JASC
7.
JCSC2
8.
RCSA2
9.
JCC
10.
11.
RAA1
RASA1
12.
JDSA
13.
RDSC3
14.
JBSA1
Tabel 1 Karakteristik isolat bakteri nitrifikasi
Koloni
Jenis
Warna Bentuk Elevasi
Tepian
Gram
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Kuning Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Kuning Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Kuning Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
kawah
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Seperti
Bening Bundar
Licin
Negatif
kawah
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Seperti
Bening Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Sel
Bentuk
Kokus
Basil
Kokus
Kokus
Basil
Kokus
Basil
Basil
Kokus
Kokus
Kokus
Kokus
Kokus
Kokus
Pengujian Isolat pada Media Autotrof dan Heterotrof
Media nitrifikasi yang digunakan terdiri atas dua jenis, yaitu media
nitrifikasi autotrof dengan sumber karbon karbonat dan media nitrifikasi
heterotrof dengan sumber karbon glukosa. Berdasarkan hasil, pertumbuhan
bakteri pada media nitrifikasi heterotrof lebih cepat dibandingkan pertumbuhan
bakteri pada media nitrifikasi autotrof. Nilai Optical Density (OD) menunjukkan
kerapatan sel isolat pada masing-masing media. OD sel pada media nitrifikasi
heterotrof sebesar 0.058-0.124 sedangkan OD sel pada media nitrifikasi autotrof
sebesar 0.001-0.056 (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan sel pada
media nitrifikasi heterotrof lebih besar dibandingkan pada media nitrifikasi
autotrof.
7
Tabel 2
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Perbandingan hasil pengukuran OD sel pada media nitrifikasi autotrof
dan heterotrof per hari
OD sel
Isolat
Media nitrifikasi
Media nitrifikasi
autotrof
heterotrof
RBA1
0.014
0.124
RCC1
0.027
0.118
RCC2
0.001
0.112
RCSC1
0.001
0.109
RCSC2
0.002
0.108
JASC
0.010
0.099
JCSC2
0.015
0.096
RCSA2
0.002
0.096
JCC
0.033
0.067
RAA1
0.056
0.073
RASA1
0.036
0.077
JDSA
0.045
0.077
RDSC3
0.021
0.058
JBSA1
0.038
0.071
Uji Aktivitas Oksidasi Amonium
Kemampuan 14 isolat dalam mengoksidasi amonium diuji pada kondisi
aerob dengan konsentrasi amonium sebesar + 2000 M. erdasarkan hasil ji
aktivitas oksidasi amonium, terlihat bahwa semua isolat dapat mengoksidasi
amonium, bahkan terdapat 6 isolat yang mempunyai aktivitas di atas 80%.
Konsentrasi nitrit yang terakumulasi dari semua isolat relatif rendah, yaitu sekitar
0.02-1.21%. Sebelas isolat mempunyai aktivitas menghasilkan nitrat dengan
persentase 0.02-1.07%. Isolat RCSC2 mempunyai akumulasi nitrat sebesar 1.07%.
Tabel 3 Kemampuan isolat untuk mengoksidasi amonium dengan menghasilkan
senyawa nitrit dan nitrat setelah 5 hari inkubasi
No Isolat
Amonium
Amonium yang
Nitrit yang
Nitrat yang
Awal
dioksidasi
terbentuk
terbentuk
(µM)
µM
%
µM
%
µM
%
1. RBA1
2269.12 1469.12 64.74
1.36 0.09
0.00 0.00
2. RCC1
2269.12 2204.41 97.15
1.03 0.05
0.48 0.02
3. RCC2
2269.12 1913.24 84.32
1.24 0.06
2.30 0.12
4. RCSC1
2269.12 1869.12 82.37
0.99 0.05
0.33 0.02
5. RCSC2
2269.12 1772.06 78.09
0.90 0.05
18.96 1.07
6. JASC
2269.12 1933.83 85.22
0.41 0.02
2.40 0.12
7. JCSC2
2269.12 1995.59 87.95
5.55 0.28
1.49 0.07
8. RCSA2
2269.12 1877.94 82.76
1.29 0.07
1.84 0.10
9. JCC
2382.35
870.59 36.54
2.27 0.26
0.00 0.00
10. RAA1
2382.35
150.00
6.30
0.08 0.05
1.39 0.93
11. RASA1
2382.35 1147.06 48.15
3.26 0.28
0.00 0.00
12. JDSA
2382.35
426.47 17.90
5.15 1.21
0.23 0.05
13. RDSC3
2382.35
400.00 16.79
2.86 0.72
0.83 0.21
14. JBSA1
2382.35
873.53 36.67
0.59 0.07
0.48 0.05
8
450
10
400
9
8
350
7
300
6
250
5
200
4
150
3
100
2
50
1
0
0
500
1000
1500
2000
Keterangan :
Laju Akumulasi Nitrit (µM/jam)
Laju Oksidasi Amonium (µM/jam)
Laju rata-rata dan Kinetika Oksidasi Amonium
Bedasarkan uji aktivitas oksidasi amonium, dipilih tiga isolat untuk laju
rata-rata dan uji kinetika oksidasi amonium, yaitu isolat RCC1, RCSC2, dan
JCSC2. Isolat RCC1 mempunyai aktivitas oksidasi amonium sangat baik sekitar
97% dengan konsentrasi nitrit yang terbentuk sekitar 0.05% dan nitrat sebesar
0.02%. Isolat JCSC2 mempunyai aktivitas oksidasi amonium sebesar 87.95%,
nitrit yang terbentuk sebesar 0.28%, dan nitrat 0.07%. Isolat RCSC2 mempunyai
aktivitas pembentukan nitrat sebesar 1.07% dengan amonium yang teroksidasi
sebesar 78.09% dan nitrit 0.05% (Tabel 3).
Laju rata-rata oksidasi amonium isolat RCSC2 lebih tinggi dibandingkan
laju pada isolat JCSC2 dan RCC1. Laju rata-rata oksidasi amonium pada RCC1,
RCSC2, dan JCSC2 mengalami kenaikan seiring dengan pertambahan substrat
yang diberikan (Gambar 3).
Laju Oksidasi
Amonium
RCSC2
Laju Oksidasi
Amonium
RCC1
Laju Oksidasi
Amonium
JCSC2
Laju
Akumulasi
Nitrit RCSC2
Laju
Akumulasi
Nitrit RCC1
Laju
Akumulasi
Nitrit JCSC2
Konsentrasi Substrat (µM)
Gambar 3 Laju oksidasi amonium dan akumulasi nitrit isolat RCSC2, RCC1 dan
JCSC2
Uji kinetika oksidasi amonium dilakukan dengan konsentrasi amonium 0,
500, 1000, 1500, dan 2000 M. erdasarkan hasil ji kinetika oksidasi amonium,
isolat JCSC2 memiliki nilai kecepatan maksimum (Vmaks) dan konstanta
Michaelis-Menten (Km) lebih tinggi dibandingkan isolat RCC1 dan RCSC2. Nilai
Km terendah dimiliki oleh isolat RCC1 (Tabel 4).
9
No.
1.
2.
3.
Tabel 4 Hasil uji kinetika nilai Km dan Vmaks
Isolat
Km (mM)
Vmaks (mM/jam)
RCC1
2.44
0.56
RCSC2
3.95
1.00
JCSC2
7.99
1.43
Pembahasan
Berdasarkan hasil peremajaan pada 14 isolat, semua bakteri dapat tumbuh
secara aerobik pada media agar yang mengandung amonium sebagai sumber
nitrogen dan karbonat sebagai sumber karbon. Menurut Moat dan Foster (1988),
bakteri nitrifikasi hidup secara aerobik. Bakteri tersebut memerlukan oksigen
sebagai penerima elektron terakhir di dalam rangkaian proses respirasi untuk
pembentukan energi.
Isolat-isolat tersebut ditumbuhkan pada media agar dengan kondisi pH
sekitar 6.00-7.00 dan suhu berkisar 28-31 oC. Hasil pengamatan menunjukkan
bahwa bakteri dapat tumbuh setelah 3 hari masa inkubasi. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Holt et al. (1994) bahwa bakteri nitrifikasi umumnya dapat tumbuh
optimal pada pH antara 6.5-8.5 dan suhu 5-30 oC.
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa semua bakteri tersebut
merupakan bakteri Gram negatif dan sebanyak 4 isolat berbentuk basil dan 10
isolat berbentuk kokus. Menurut Holt et al. (1994), bakteri nitrifikasi umumnya
mempunyai ciri Gram negatif dan berbentuk kokus, basil, spiral, atau ellipsoid.
Isolat-isolat yang telah murni ditumbuhkan pada media nitrifikasi autotrof
dengan sumber karbon berupa karbonat dan media nitrifikasi heterotrof dengan
sumber karbon berupa glukosa. Berdasarkan pengamatan, pertumbuhan sel bakteri
pada media nitrifikasi heterotrof menunjukkan pertumbuhan sel lebih tinggi
dibandingkan dengan pertumbuhan sel pada media nitrifikasi autotrof (Tabel 2).
William et al. (1998) menyatakan bahwa media karbonat merupakan media
nitrifikasi autotrof yang membuat pertumbuhan bakteri lambat dan perbanyakan
selnya rendah. Menurut Tresnawati (2006), media nitrifikasi heterotrof
menghasilkan pertumbuhan sel yang lebih tinggi daripada pertumbuhan sel pada
media nitrifikasi autotrof. Berdasarkan penelitiannya, pertumbuhan sel pada
media heterotrof yang paling tinggi terjadi pada media glukosa sebagai sumber
karbon dengan aktivitas mengoksidasi amonium cukup tinggi.
Perbedaan pertumbuhan sel pada kedua media diduga karena perbedaan
senyawa yang digunakan untuk pembentukan energi, yaitu glukosa dan amonium.
Menurut Widiyanto (2006), isolat pada media heterotrof memanfaatkan sumber
karbon dari glukosa. Isolat tersebut mengoksidasi glukosa melalui siklus asam
sitrat sehingga didapatkan 38 ATP per molekul glukosa. Sedangkan isolat pada
media nitrifikasi autotrof memanfaatkan amonium sebagai sumber energi. Proses
oksidasi amonium menghasilkan 2 ATP per molekulnya sehingga mendapatkan
energi lebih sedikit daripada glukosa. Hal ini menyebabkan pertumbuhan isolat
pada media heterotrof lebih tinggi dibandingkan pada media autotrof.
Pada uji aktivitas oksidasi amonium, isolat ditumbuhkan di dalam media
cair nitrifikasi dengan pH sekitar 7.0 dan diinkubasi pada suhu 30 oC. Menurut
Paul dan Clark (1989), faktor-faktor yang mempengaruhi proses nitrifikasi di
antaranya keasaman (pH) dan suhu. Nitrifikasi dapat berjalan optimal pada pH
10
6.6-8.0 tetapi dapat terhambat pada pH di bawah 4.5, sedangkan suhu yang
optimal berkisar 30-35 oC tetapi dapat berjalan lambat pada suhu di bawah 5 oC
dan di atas 40 oC.
Nitrifikasi merupakan proses oksidasi amonium menjadi nitrit dengan
perantara hidroksilamin dan oksidasi senyawa nitrit menjadi nitrat (Paul dan Clark
1989). Uji aktivitas oksidasi amonium pada 14 isolat menunjukkan bahwa semua
isolat dapat mengoksidasi amonium, bahkan terdapat 6 isolat mempunyai
kemampuan mengoksidasi amonium di atas 80% (Tabel 3). Aktivitas oksidasi
amonium ini terlihat dari pengurangan konsentrasi amonium pada masing-masing
isolat. Pengurangan konsentrasi amonium mengindikasikan bahwa isolat tersebut
dapat memanfaatkan amonium sebagai sumber energi atau sumber nitrogen untuk
pembentukan biomassa sel. Amonium yang teroksidasi membentuk nitrit, terlihat
dari adanya konsentrasi nitrit pada setiap isolat. Hal ini mengindikasikan bahwa
isolat tersebut mempunyai enzim amonia monooksigenase (AMO) dan
hidroksilamin oksidase (HAO). Menurut Moir et al. (1996), amonium dioksidasi
menjadi nitrit dengan perantara hidroksilamin dan enzim yang terlibat dalam
aktivitas oksidasi tersebut adalah AMO dan HAO.
Berdasarkan hasil uji aktivitas isolat, konsentrasi nitrit pada semua isolat
menunjukkan persentase yang rendah, yaitu berkisar 0.02-1.21% (Tabel 3). Hal
ini dapat menjadi salah satu indikator adanya bakteri yang potensial sebagai agen
bioremediasi. Menurut Widiyanto (2006), tidak terbentuknya senyawa nitrit
merupakan salah satu dasar seleksi bakteri yang potensial sebagai agen
bioremediasi karena senyawa nitrit bersifat toksik terhadap hewan budidaya.
Sutka et al. (2006) mengemukakan bahwa terdapat aktivitas bakteri saat
mengoksidasi amonium menjadi nitrit, yaitu produksi N2O dari oksidasi
hidroksilamin (NH2OH) oleh bakteri nitrifikasi, Nitrosomonas europaea.
Sebelas isolat mempunyai aktivitas menghasilkan nitrat dengan persentase
0.02-1.07%. Isolat RCSC2 mempunyai persentase nitrat sebesar 1.07%. Isolat
tersebut diduga mempunyai enzim nitrit oksidase. Menurut Steinmuller dan Bock
(1977), aktivitas bakteri dalam mengoksidasi nitrit melibatkan enzim nitrit
oksidase.
Laju rata-rata oksidasi amonium yang diujikan pada isolat RCC1, RCSC2,
dan JCSC2 mempunyai pola kenaikan laju yang berbeda. Laju isolat RCSC2 dan
JCSC2 dalam mengoksidasi amonium mengalami kenaikan seiring dengan
penambahan substrat yang diberikan, yaitu dari konsentrasi amonium 0, 500, 1000,
1500, hingga 2000 µM. Sedangkan pada isolat RCC1 mengalami kenaikan laju
rata-rata pada konsentrasi 1000-1500 µM dan memberikan reaksi yang berbeda
pada konsentrasi 1500-2000 µM yaitu tidak mengalami kenaikan yang signifikan
(Gambar 3). Perbedaan laju tersebut menunjukkan perbedaan kemampuan ketiga
isolat dalam memanfaatkan amonium berdasarkan tingkat konsentrasi amonium
yang diberikan.
Berdasarkan hasil analisis kinetika Michaelis-Menten, isolat RCC1, RCSC2,
dan JCSC2 mempunyai nilai Vmaks (kecepatan maksimum) sebesar 0.56, 1.00,
dan 1.46 mM/jam dan nilai Km (konstanta Michaelis-Menten) sebesar 2.44, 3.95,
dan 7.99 mM (Tabel 4). Isolat RCC1 yang mempunyai nilai Km lebih kecil
dibandingkan keduanya menunjukkan bahwa isolat RCC1 mempunyai enzim
dengan afinitas tinggi terhadap substratnya.
11
SIMPULAN
Empat belas isolat bakteri nitrifikasi asal kolam ikan air tawar Riau dan
Jambi yang dikarakterisasi bersifat Gram negatif dengan bentuk sel kokus dan
basil. Enam isolat mampu melakukan aktivitas oksidasi amonium di atas 80%.
Tiga isolat yang diuji kinetika oksidasi amonium, yaitu RCC1, RSCS2, dan
JCSC2 mempunyai nilai konstanta Michaelis-Menten (Km) sebesar 2.44, 3.95,
dan 7.99 mM. Isolat RCC1 yang mempunyai nilai Km terkecil menunjukkan
bahwa isolat RCC1 mempunyai enzim dengan afinitas tinggi terhadap substratnya.
DAFTAR PUSTAKA
[BBPBAT] Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar. 2014. Baku Mutu
Kualitas Air Budidaya. BBPBAT [internet]. [diunduh 2014 Sep 1]. Tersedia
pada: http://www.bbpbat.net/index.php/artikel/60-baku-mutu-kualitas-airbudidaya.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2013. Jambi dalam angka. BPS [internet]. [diunduh
2013 Des 17]. Tersedia pada: http://jambi.bps.go.id/pub/fb/2013/jda2012/
files/assets/basichtml/page353.html.
Eaton AD, Clesceri LS, Greenberg AE, Rice EW. 2005. Standard Method of
Examination of Water and Wastewater. Ed ke-21. Washington DC (US):
APHA-AWWA-WPCF.
[EPA] US Enviromental Protection Agency. 2002. Nitrification. USEPA [internet].
[diunduh 2013 Des 12]. Tersedia pada: http://water.epa.gov/ lawsregs/
rulesregs/ sdwa/tcr/upload/ nitrification.pdf.
Erlania, Rusmaedi, Prasetio AB, Haryadi J. 2010. Dampak manajemen pakan dari
kegiatan budidaya ikan nila (Oreochromis niloticus) di keramba jaring
apung terhadap kualitas keramba jaring apung terhadap kualitas perairan
Danau Maninjau. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur. Jakarta
(ID): Pusat Riset Perikanan Budidaya. hlm 621-631.
Hadioetomo RS. 1983. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta (ID): PT
Gramedia Pustaka Utama.
Holt JG, Krieg NR, Smeath PHA. Stanley JT. Williams ST. 1994. Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore (US): Williams
and Wilkins Company.
[KKP] Kementerian Kelautan dan Perikanan. 2009. Kelautan dan Perikanan
dalam Angka 2009. Jakarta (ID): Pusat Data, Statistik dan Informasi.
Moat AG, Foster JW. 1988. Microbial Physiology. Ed ke-2. New York (US): John
Wiley & Sons, Inc.
Moir JWB, Crossman LC, Spiro S, Richardson DJ. 1996. The purification of
ammonia monooxygenase of Paracoccus denitrificans. FEBS Letters 387:
71-74.
Novita L. 2006. Aktivitas oksidasi amonium dan reduksi nitrat ASLT2 pada
sumber karbon yang berbeda [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
12
Paul EA, Clark FE. 1989. Soil Microbiology and Biochemistry. London (UK):
Academic Press.
Putra GPG. 2009. Penentuan kinetika enzim poligalakturonase (PG) endogenous
dari pup biji kakao. J Biol 8(1): 21-24.
Rachmansyah. 2004. Analisis daya dukung lingkungan Perairan Teluk Awarange
Kabupaten Barru, Sulawesi Selatan bagi pengembangan budidaya bandeng
dalam keramba jaring apung [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Rand MC, Greenberg AE, Taras MJ. 1979. Standard Method of Examination of
Water and Wastewater. Ed ke-14. Washington DC (US): APHA-AWWAWPCF.
Rohmana D. 2009. Konversi limbah budidaya ikan lele, Clarias sp. menjadi
biomassa bakteri heterotrof untuk perbaikan kualitas air dan makanan udang
galah, Macrobrachium rosenbergii. [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Steinmuller W, Bock E. 1977. Enzymatic studies on autotrophically,
mixotrophically, and heterotrophically grown Nitrobacter agilis with special
reference to nitrite oxidase. Arch Microbiol 115: 51-54.
Sutka RL, Ostrom NE, Ostrom PH, Breznak JA, Gandhi H, Pitt AJ, Li F. 2006.
Distinguishing nitrous oxide production from nitrification and
denitrification on the basis of isotopomer abundances. J Appl and Envir
Microbiol 72(1): 638–644.
Tresnawati T. 2006. Aktivitas bakteri pengoksidasi amonium isolat ASR1 dan
ASR2 asal tambak udang pada sumber karbon dan salinitas yang berbeda
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
White D. 2000. The Physiology and Biochemistry of Procaryotes. Ed ke-2. New
York (US): Oxford University Press.
Widiyanto T. 2006. Seleksi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi untuk bioremediasi
di tambak udang [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
William EH et al. 1998. Molecular analisis of bacterial communities in a threecompartement granular activated sludge system indicates community level
control by incompatile nitrification processes. J Appl and Envir Microbiol
64: 2528-2532.
13
Absorban (640 nm)
Lampiran 1 Kurva standar amonium
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 0,017x + 0,023
R² = 0,9991
0
10
20
30
40
Konsentrasi (µM)
50
60
Lampiran 2 Kurva standar nitrit
0,4
Absorban (543 nm)
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
y = 0,0352x + 0,0033
R² = 0,9996
0,05
0
0
2
4
6
8
Konsentrasi (µM)
10
12
Lampiran 3 Kurva standar nitrat
0,16
Absorban (410 nm)
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
y = 0,0099x + 0,006
R² = 0,984
0,02
0
0
5
10
Konsentrasi (µM)
15
14
Lampiran 4 Komposisi media nitrifikasi
Komposisi media nitrifikasi (g/L) (Rodina 1972 dalam Novita 2006)
13.5
0.7
0.1
0.5
0.014
0.18
0.1
0.2
0.5
KH2PO4
K2HPO4
MgCl2.6H2O
NaHCO3
FeCl3.6H2O
CaCl2.2H2O
NH4Cl
EDTA
Glukosa
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Depok pada tanggal 16 September 1992 sebagai anak
pertama dari tiga bersaudara, Siti Hardianti dan Oktavia Rahmawati, dengan ayah
bernama Atmaja dan ibu bernama Asenih.
Pada tahun 2010, penulis lulus dari SMA Negeri 3 Depok dan pada tahun
yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI).
Selama mengikuti perkuliahan di IPB, penulis aktif pada berbagai
organisasi mahasiswa. Penulis pernah menjadi pengurus BEM KM Institut
Pertanian Bogor pada tahun 2010/ 2011 dan melanjutkan kembali pada tahun
2011/2012 di dalam Kementerian Sosial dan Kesejahteraan Masyarakat dengan
menjadi Ketua Program Rumah Harapan. Penulis pernah juga menjadi pengurus
HIMABIO divisi Pengembangan Sumber Daya Mahasiswa pada tahun
2012/2013. Penulis juga aktif dalam beberapa kepanitian di kampus dan di
organisasi. Penulis mendapatkan beasiswa PPA (Peningkatan Prestasi Akademik)
dari semester tiga hingga semester delapan.
Pada tahun 2012, penulis melaksanakan studi lapang di Taman Nasional
Gunung Gede Pangrango (TNGGP) dengan topik Identifikasi Tumbuhan Paku di
TNGGP berdasarkan Ketinggian. Pada tahun 2013, penulis melaksanakan praktik
lapangan di PT Herlina Indah, Pulogadung, Jakarta dengan topik Pengolahan dan
Pengawasan Mutu Aquademin di PT Herlina Indah.
KOLAM IKAN AIR TAWAR PROVINSI RIAU DAN JAMBI
MEGAWATI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Bakteri
Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi Riau dan Jambi adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2014
Megawati
NIM G34100009
ABSTRAK
MEGAWATI. Karakterisasi Bakteri Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi
Riau dan Jambi. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan YUNI PUJI HASTUTI.
Akumulasi senyawa nitrogen anorganik dalam kolam budidaya ikan air
tawar dapat menurunkan kualitas kolam ikan. Permasalahan tersebut dapat diatasi
dengan pendekatan bioremediasi yang melibatkan aktivitas metabolisme mikroba
untuk menurunkan konsentrasi nitrogen anorganik sampai tingkat konsentrasi
yang aman. Salah satu proses mikrobial yang terlibat dalam bioremediasi adalah
nitrifikasi. Nitrifikasi adalah proses oksidasi amonium menjadi nitrit dan oksidasi
nitrit menjadi nitrat. Penelitian ini bertujuan melakukan karakterisasi bakteri
nitrifikasi yang diisolasi dari kolam ikan air tawar di Provinsi Riau dan Jambi.
Karakterisasi dilakukan terhadap 14 isolat yang merupakan bakteri Gram negatif.
Hasil uji oksidasi amonium menunjukkan bahwa terdapat 6 isolat mampu
melakukan aktivitas oksidasi amonium di atas 80%. Tiga isolat yang diuji kinetika
oksidasi amonium, yaitu RCC1, RCSC2, dan JCSC2 mempunyai nilai konstanta
Michaelis-Menten (Km) sebesar 2.44, 3.95, dan 7.99 mM. Isolat RCC1 yang
mempunyai nilai Km lebih kecil dibandingkan keduanya menunjukkan bahwa
isolat RCC1 mempunyai enzim dengan afinitas tinggi terhadap substratnya.
Kata kunci: karakterisasi bakteri, kualitas air, oksidasi amonium, nitrifikasi
ABSTRACT
MEGAWATI. Characterization of Nitrifying Bacteria of Freshwater Pond in Riau
and Jambi Province. Supervised by IMAN RUSMANA and YUNI PUJI
HASTUTI.
Accumulation of inorganic nitrogen compounds in a freshwater pond could
decrease water quality of a freshwater pond. This problem could be solved using
bioremediation approach involving microbial metabolic activities to decrease the
inorganic nitrogen concentration until the safe level. One of microbial processes
involved in bioremediation is nitrification. Nitrification is oxidation process of
ammonium to nitrite and nitrate. The objective of this research was to characterize
nitrifying bacteria isolated from freshwater ponds in Riau and Jambi Province.
The characterization was carried out on 14 isolates which were Gram-negative
bacteria. Ammonium oxidation test showed that 6 isolates could oxidize
ammonium up to 80%. Michaelis-Menten constant values (Km) of three isolates
i.e. RCC1, RCSC2, and JCSC2 isolates were 2.44, 3.95, and 7.99 mM
respectively. The RCC1 isolate had the smallest Km values, it indicated that this
isolate had enzymes with high affinity to their substrates.
Keywords: characterization of bacteria, water quality, ammonium oxidation,
nitrification
KARAKTERISASI BAKTERI NITRIFIKASI
KOLAM IKAN AIR TAWAR PROVINSI RIAU DAN JAMBI
MEGAWATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 ini ialah nitrogen, dengan
judul Karakterisasi Bakteri Nitrifikasi Kolam Ikan Air Tawar Provinsi Riau dan
Jambi.
Ungkapan terimakasih penulis sampaikan kepada:
1 Bapak Dr Ir Iman Rusmana, MSi dan Ibu Yuni Puji Hastuti, SPi, MSi
selaku pembimbing atas saran dan dukungan dalam penelitian dan
penyusunan karya ilmiah ini.
2 Keluarga tercinta, yaitu Bapak Atmaja (ayah), Ibu Asenih (ibu), Siti
Hardiyanti (adik), dan Oktavia Rahmawati (adik) serta keluarga besar
atas limpahan doa, kasih sayang, dan motivasinya.
3 Rekan satu bimbingan, yaitu Tiara AD, Nurlatiefah, Nindya S, Yuli SF,
Erma S, Kak Randi, Kak Masrukhin, Kak Aay, Kak Antri, dan Kak
Hendri atas motivasi dan bantuannya.
4 Rekan-rekan Mikrobiologi atas segala motivasi dan arahannya selama
penelitian.
5 Rekan-rekan Biologi 47 atas segala pengalaman dan motivasi.
6 Sahabat Pondok Aisyah, yaitu Desty, Tiara, Lupita, Tri, Khairunnisa,
Wanda, Astri, Sulis, dan Indah atas doa, motivasi, dan pengalaman
berharga menjadi keluarga kedua bagi saya.
7 Sahabat terkasih, antara lain Desty, Angga, Hanafi, Dwi, Olivia, dan
sahabat Rohis 22 atas doa dan motivasinya.
8 Semua pihak yang turut memberikan doa dan semangatnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2014
Megawati
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Prosedur Analisis Data
2
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Hasil
4
Pembahasan
9
SIMPULAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Karakteristik isolat bakteri nitrifikasi
Perbandingan hasil pengukuran OD sel pada media nitrifikasi autotrof
dan heterotrof per hari
Kemampuan isolat untuk mengoksidasi amonium dengan menghasilkan
senyawa nitrit dan nitrat setelah 5 hari inkubasi
Hasil uji kinetika nilai Km dan Vmaks
6
7
7
9
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
Hasil pemurnian dengan metode kuadran. (a) Isolat RCSC2, (b) Isolat
RCC1, (c) Isolat JCSC2
Hasil pewarnaan Gram. (a) Isolat RCSC2, (b) Isolat RCC1, (c) Isolat
JCSC2
Laju oksidasi amonium dan akumulasi nitrit isolat RCSC2, RCC1 dan
JCSC2
5
5
8
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
Kurva standar amonium
Kurva standar nitrit
Kurva standar nitrat
Komposisi media nitrifikasi
13
13
13
14
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Provinsi Riau dan Jambi memiliki sumberdaya perikanan yang cukup besar.
Berdasarkan data pada tahun 2007, Riau memiliki potensi perikanan budidaya
kolam seluas 8200 Ha dengan realisasi seluas 3685 Ha sedangkan Jambi memiliki
3000 Ha dengan realisasi seluas 1606 Ha (KKP 2009). Produksi perikanan
budidaya ikan air tawar di Provinsi Jambi pada tahun 2011 sebanyak 34478.8 ton
dengan budidaya terbesar berupa budidaya ikan patin (BPS 2013). Hasil produksi
tersebut tidak terlepas dari sistem budidaya yang dilakukan secara intensif. Pada
sistem budidaya intensif, ikan dipelihara dengan kepadatan tinggi dan semua
nutrisi diperoleh secara langsung dari pakan yang diberikan dengan kandungan
protein yang tinggi (Rohmana 2009).
Aktivitas budidaya ikan air tawar yang dilakukan dengan sistem intensif
menghasilkan limbah pakan yang tinggi, dari semua pakan yang diberikan hanya
70% yang dimakan oleh ikan dan sisanya sebanyak 30% akan lepas ke badan
perairan sebagai bahan pencemar atau limbah (Rachmansyah 2004). Degradasi
sisa pakan (bahan organik) tersebut akan menghasilkan senyawa nitrogen
anorganik berupa NH3 (amonia), NO3- (nitrat), dan NO2- (nitrit) (Widiyanto 2006).
Akumulasi senyawa nitrogen anorganik tersebut dapat menghambat pertumbuhan
bahkan menyebabkan kematian massal ikan-ikan yang dibudidayakan (Erlania et
al. 2010).
Permasalahan akumulasi senyawa nitrogen anorganik tersebut dapat diatasi
melalui pendekatan bioremediasi yang melibatkan aktivitas metabolisme mikroba
dengan tujuan menurunkan tingkat akumulasi sampai tingkat konsentrasi yang
aman (Widiyanto 2006). Konsentrasi yang aman untuk budidaya ikan air tawar,
yaitu amonia kurang dari 0.01 mg/l dan nitrit kurang dari 0.06 mg/l (BBPBAT
2014). Salah satu proses yang terlibat dalam menurunkan akumulasi senyawa
nitrogen anorganik tersebut adalah nitrifikasi. Nitrifikasi merupakan proses
mikrobial yang mengoksidasi komponen nitrogen (amonium) menjadi nitrit dan
nitrat. Nitrifikasi berlangsung melalui dua tahapan reaksi, yaitu pada tahap
pertama oksidasi amonium menjadi nitrit yang dilakukan oleh mikroba
pengoksidasi amonium, contohnya Nitrosomonas dan Nitrosococcus. Tahap
kedua adalah oksidasi nitrit menjadi nitrat oleh mikroba pengoksidasi nitrit,
contohnya Nitrobacter. Selain itu, ada kelompok bakteri heterotrofik dapat
melakukan nitrifikasi, contohnya Pseudomonas (EPA 2002).
Salah satu pendekatan bioremediasi dalam mengatasi permasalahan
lingkungan perairan budidaya memerlukan gambaran karakteristik bakteri
nitrifikasi. Karakteristik secara morfologi dan aktivitas bakteri mengoksidasi
amonium dan nitrit adalah hal yang perlu diamati dalam katakterisasi ini.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan melakukan karakterisasi bakteri nitrifikasi yang
diisolasi dari kolam ikan air tawar Provinsi Riau dan Jambi.
2
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan bisa dijadikan sebagai acuan dalam melakukan
karakterisasi bakteri nitrifikasi yang diisolasi dari kolam ikan air tawar dan
mengetahui kemampuan bakteri dalam mengoksidasi amonium.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai Juli 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Sampel
merupakan isolat yang diambil dari kolam ikan air tawar di Provinsi Riau dan
Jambi.
Bahan
Bahan yang digunakan ialah isolat bakteri nitrifikasi kolam ikan air tawar
sebanyak 14 isolat terdiri atas 5 isolat asal Jambi dan 9 isolat asal Riau koleksi
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Nama isolat dari
Riau ditandai dengan huruf awal R sedangkan isolat dari Jambi ditandai dengan
huruf awal J. Media yang digunakan adalah media cair nitrifikasi dan media padat
nitrifikasi (Rodina 1972 dalam Novita 2006). Reagen yang digunakan adalah
reagen amonium, reagen nitrit, dan reagen nitrat.
Prosedur Analisis Data
Pemurnian dan peremajaan isolat
Pemurnian isolat dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri pada media
agar nitrifikasi melalui metode kuadran dan diinkubasi pada suhu ruang (28-31
°C) selama 5 hari. Koloni murni yang diperoleh ditumbuhkan kembali pada media
agar nitrifikasi, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-4 hari hingga sel
bersifat murni.
Karakterisasi morfologi
Isolat murni hasil isolasi diamati morfologi koloninya, meliputi bentuk,
warna, elevasi, dan tepiannya. Bentuk sel diamati dan reaksi Gram dari tiap isolat
ditentukan dengan teknik pewarnaan Gram. Warna merah muda menunjukkan
bahwa sel bakteri bersifat Gram negatif sedangkan warna ungu menunjukkan
bahwa sel bakteri bersifat Gram positif (Hadioetomo 1983).
Pengujian isolat pada media autotrof dan heterotrof
Media agar nitrifikasi terdiri dari dua macam, yaitu media nitrifikasi
autotrof (CaCO3 sebagai sumber karbon) dan media nitrifikasi heterotrof (glukosa
3
sebagai sumber karbon). Isolat ditumbuhkan pada kedua media cair nitrifikasi dan
diinkubasi pada inkubator berpenggoyang dengan suhu ruang (28-31 °C).
Pertumbuhan sel isolat pada media nitrifikasi heterotrof dianalisis pada hari ketiga
sedangkan pertumbuhan sel isolat pada media nitrifikasi autotrof dianalisis pada
hari keempat dengan kerapatan optik (OD) menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 550 nm.
Uji aktivitas oksidasi amonium
Sebanyak 2 lup isolat murni diinokulasikan pada 10 ml media cair nitrifikasi,
kemudian diinkubasi pada inkubator berpenggoyang dengan suhu ruang (2831 °C) selama 5 hari. Pengukuran aktivitas oksidasi amonium dilakukan pada hari
ke-5. Pengukuran ini dilakukan melalui analisis kadar amonium, nitrit, dan nitrat.
Presentase jumlah amonium yang teroksidasi (AO) dan senyawa nitrat atau
nitrit yang terbentuk dihitung dengan rumus sebagai berikut:
[
]
[
[
]
]
Keterangan:
AO
: Persentase amonium yang teroksidasi
AK
: Konsentrasi amonium pada media kontrol
AP
: Konsentrasi amonium pada media yang diinokulasi bakteri
Persentase jumlah nitrat yang terbentuk (PNA) atau persentase jumlah nitrit
yang terbentuk (PNI) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
[
]
[
[
]
]
Keterangan:
PNA
: Persentase jumlah nitrat yang terbentuk
NT
: Kandungan nitrat pada suspensi perlakuan (diinokulasi isolat
bakteri)
NK
: Kandungan nitrat pada kontrol (tidak diinokulasi bakteri)
AK
: Kandungan amonium pada kontrol
AP
: Kandungan amonium pada suspensi perlakuan
Kinetika oksidasi amonium
Inokulum untuk pengujian disiapkan dengan menumbuhkan isolat pada 100
ml medium cair nitrifikasi yang menggunakan glukosa sebagai sumber karbon,
kemudian diinkubasi di atas inkubator berpenggoyang pada kecepatan 100 rpm
dan suhu ruang (28-31 °C) selama tiga hari. Kultur bakteri dibuat pelet dengan
cara sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Pelet dipisahkan
dan diresuspensi dengan medium nitrifikasi tanpa amonium. Sebanyak 2 ml kultur
bakteri diinokulasikan ke dalam 10 ml medium nitrifikasi dengan konsentrasi
amonium sebesar 0, 500, 1000, 1500, dan 2000 μM dilakukan secara duplo.
Kemudian diinkubasi selama 3 jam di atas inkubator berpenggoyang pada
kecepatan 100 rpm dan suhu ruang (28-31 °C). Kontrol masing-masing perlakuan
4
dibuat tanpa diinokulasi kultur bakteri. Pengukuran aktivitas oksidasi amonium
dilakukan setelah 3 jam inkubasi. Analisis kinetika oksidasi amonium dilakukan
dengan menggunakan persamaan kinetika Michaelis-Menten (White 2000). Nilai
Km (konstanta Michaelis-Menten) digunakan dalam menentukan ukuran afinitas
enzim-substrat (E-S), yang merupakan suatu indikator kekuatan ikatan kompleks
E-S atau suatu tetapan keseimbangan untuk disosiasi kompleks E-S menjadi E dan
S. Nilai Km kecil berarti afinitas enzim tinggi terhadap substrat, sedangkan bila
Km besar berlaku kebalikannya (Fox 1991 diacu dalam Putra 2009).
Analisis kadar amonium
Kadar amonium ditentukan dengan metode spektrofotometri. Sebanyak 2 ml
sampel yang telah disaring ditambah dengan 0.08 ml fenol alkohol 10%, 0.08 ml
sodium nitroprusid, dan 0.2 ml campuran hipoklorit teknis dan alkalin sitrat 20%
(1 : 4), kemudian didiamkan selama 1 jam pada kondisi gelap. Setiap setelah
pemberian pereaksi dilakukan pengadukan. Pemberian pereaksi akan
menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang
gelombang 640 nm (Eaton et al. 2005). Nilai absorban yang diperoleh dikonversi
menggunakan standar hingga diperoleh satuan dalam konsentrasi (μM).
Analisis kadar nitrit
Sebanyak 2 ml sampel yang telah disaring ditambah dengan 0.08 ml
pewarna nitrit. Pewarna nitrit dibuat dengan mencampurkan 1 gram sulfanilamid,
10 ml phosphoric acid 85%, dan 80 ml aquades dengan 0.1 gram NED (Naftalena
Etilena Diamina). Kemudian didiamkan selama 10 menit. Setiap setelah
pemberian pereaksi dilakukan pengadukan. Pemberian pereaksi akan
menghasilkan warna merah muda hingga keunguan. Warna yang terbentuk dibaca
serapannya pada panjang gelombang 543 nm (Eaton et al. 2005). Nilai absorban
yang diperoleh dikonversi menggunakan standar hingga diperoleh satuan dalam
konsentrasi (μM).
Analisis kadar nitrat
Sebanyak 1 ml sampel yang telah disaring ditambah dengan 0.2 ml larutan
natrium klorida, 1 ml asam sulfat 80%, dan 0.05 ml brucine sulfanilic acid,
kemudian dipanaskan selama 20 menit. Setiap setelah pemberian pereaksi
dilakukan pengadukan. Pemberian pereaksi akan menghasilkan warna kuning.
Warna yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang gelombang 410 nm (Rand
et al. 1979). Nilai absorban yang diperoleh dikonversi menggunakan standar
hingga diperoleh satuan dalam konsentrasi (μM).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Pemurnian dan peremajaan isolat bakteri berhasil dilakukan terhadap 14
isolat terdiri atas 5 isolat asal Jambi dan 9 isolat asal Riau. Semua isolat dapat
5
hidup secara aerobik dalam media yang mengandung amonium sebagai sumber
nitrogen dan karbonat sebagai sumber karbonnya. Pemurnian bakteri dilakukan
dengan metode kuadran agar menghasilkan koloni tunggal (Gambar 1). Hasil
pewarnaan Gram menunjukkan sel berwarna merah muda (Gambar 2).
(a)
(b)
(c)
Gambar 1 Hasil pemurnian dengan metode kuadran. (a) Isolat RCSC2,
(b) Isolat RCC1, (c) Isolat JCSC2
(a)
(b)
(c)
Gambar 2 Hasil pewarnaan Gram. (a) Isolat RCSC2, (b) Isolat RCC1,
(c) Isolat JCSC2
Berdasarkan pengamatan pada keempat belas isolat, terlihat bahwa isolat
mempunyai bentuk koloni yang didominasi oleh bentuk bundar dan tepian licin.
Warna koloninya sebagian besar berwarna putih, sedangkan isolat lainnya
berwarna kuning dan bening. Karakteristik morfologi pada sel dilakukan dengan
pewarnaan Gram, warna merah muda pada sel bakteri menunjukkan bahwa semua
sel bakteri berjenis Gram negatif. Sel pada sepuluh isolat berbentuk kokus
sedangkan empat isolat lainnya berbentuk basil (Tabel 1).
6
No
Isolat
1.
RBA1
2.
RCC1
3.
RCC2
4.
RCSC1
5.
RCSC2
6.
JASC
7.
JCSC2
8.
RCSA2
9.
JCC
10.
11.
RAA1
RASA1
12.
JDSA
13.
RDSC3
14.
JBSA1
Tabel 1 Karakteristik isolat bakteri nitrifikasi
Koloni
Jenis
Warna Bentuk Elevasi
Tepian
Gram
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Kuning Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Kuning Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Kuning Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Seperti
Putih
Bundar
Licin
Negatif
kawah
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Seperti
Bening Bundar
Licin
Negatif
kawah
Putih
Bundar Timbul
Licin
Negatif
Seperti
Bening Bundar
Licin
Negatif
tetesan
Sel
Bentuk
Kokus
Basil
Kokus
Kokus
Basil
Kokus
Basil
Basil
Kokus
Kokus
Kokus
Kokus
Kokus
Kokus
Pengujian Isolat pada Media Autotrof dan Heterotrof
Media nitrifikasi yang digunakan terdiri atas dua jenis, yaitu media
nitrifikasi autotrof dengan sumber karbon karbonat dan media nitrifikasi
heterotrof dengan sumber karbon glukosa. Berdasarkan hasil, pertumbuhan
bakteri pada media nitrifikasi heterotrof lebih cepat dibandingkan pertumbuhan
bakteri pada media nitrifikasi autotrof. Nilai Optical Density (OD) menunjukkan
kerapatan sel isolat pada masing-masing media. OD sel pada media nitrifikasi
heterotrof sebesar 0.058-0.124 sedangkan OD sel pada media nitrifikasi autotrof
sebesar 0.001-0.056 (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan sel pada
media nitrifikasi heterotrof lebih besar dibandingkan pada media nitrifikasi
autotrof.
7
Tabel 2
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Perbandingan hasil pengukuran OD sel pada media nitrifikasi autotrof
dan heterotrof per hari
OD sel
Isolat
Media nitrifikasi
Media nitrifikasi
autotrof
heterotrof
RBA1
0.014
0.124
RCC1
0.027
0.118
RCC2
0.001
0.112
RCSC1
0.001
0.109
RCSC2
0.002
0.108
JASC
0.010
0.099
JCSC2
0.015
0.096
RCSA2
0.002
0.096
JCC
0.033
0.067
RAA1
0.056
0.073
RASA1
0.036
0.077
JDSA
0.045
0.077
RDSC3
0.021
0.058
JBSA1
0.038
0.071
Uji Aktivitas Oksidasi Amonium
Kemampuan 14 isolat dalam mengoksidasi amonium diuji pada kondisi
aerob dengan konsentrasi amonium sebesar + 2000 M. erdasarkan hasil ji
aktivitas oksidasi amonium, terlihat bahwa semua isolat dapat mengoksidasi
amonium, bahkan terdapat 6 isolat yang mempunyai aktivitas di atas 80%.
Konsentrasi nitrit yang terakumulasi dari semua isolat relatif rendah, yaitu sekitar
0.02-1.21%. Sebelas isolat mempunyai aktivitas menghasilkan nitrat dengan
persentase 0.02-1.07%. Isolat RCSC2 mempunyai akumulasi nitrat sebesar 1.07%.
Tabel 3 Kemampuan isolat untuk mengoksidasi amonium dengan menghasilkan
senyawa nitrit dan nitrat setelah 5 hari inkubasi
No Isolat
Amonium
Amonium yang
Nitrit yang
Nitrat yang
Awal
dioksidasi
terbentuk
terbentuk
(µM)
µM
%
µM
%
µM
%
1. RBA1
2269.12 1469.12 64.74
1.36 0.09
0.00 0.00
2. RCC1
2269.12 2204.41 97.15
1.03 0.05
0.48 0.02
3. RCC2
2269.12 1913.24 84.32
1.24 0.06
2.30 0.12
4. RCSC1
2269.12 1869.12 82.37
0.99 0.05
0.33 0.02
5. RCSC2
2269.12 1772.06 78.09
0.90 0.05
18.96 1.07
6. JASC
2269.12 1933.83 85.22
0.41 0.02
2.40 0.12
7. JCSC2
2269.12 1995.59 87.95
5.55 0.28
1.49 0.07
8. RCSA2
2269.12 1877.94 82.76
1.29 0.07
1.84 0.10
9. JCC
2382.35
870.59 36.54
2.27 0.26
0.00 0.00
10. RAA1
2382.35
150.00
6.30
0.08 0.05
1.39 0.93
11. RASA1
2382.35 1147.06 48.15
3.26 0.28
0.00 0.00
12. JDSA
2382.35
426.47 17.90
5.15 1.21
0.23 0.05
13. RDSC3
2382.35
400.00 16.79
2.86 0.72
0.83 0.21
14. JBSA1
2382.35
873.53 36.67
0.59 0.07
0.48 0.05
8
450
10
400
9
8
350
7
300
6
250
5
200
4
150
3
100
2
50
1
0
0
500
1000
1500
2000
Keterangan :
Laju Akumulasi Nitrit (µM/jam)
Laju Oksidasi Amonium (µM/jam)
Laju rata-rata dan Kinetika Oksidasi Amonium
Bedasarkan uji aktivitas oksidasi amonium, dipilih tiga isolat untuk laju
rata-rata dan uji kinetika oksidasi amonium, yaitu isolat RCC1, RCSC2, dan
JCSC2. Isolat RCC1 mempunyai aktivitas oksidasi amonium sangat baik sekitar
97% dengan konsentrasi nitrit yang terbentuk sekitar 0.05% dan nitrat sebesar
0.02%. Isolat JCSC2 mempunyai aktivitas oksidasi amonium sebesar 87.95%,
nitrit yang terbentuk sebesar 0.28%, dan nitrat 0.07%. Isolat RCSC2 mempunyai
aktivitas pembentukan nitrat sebesar 1.07% dengan amonium yang teroksidasi
sebesar 78.09% dan nitrit 0.05% (Tabel 3).
Laju rata-rata oksidasi amonium isolat RCSC2 lebih tinggi dibandingkan
laju pada isolat JCSC2 dan RCC1. Laju rata-rata oksidasi amonium pada RCC1,
RCSC2, dan JCSC2 mengalami kenaikan seiring dengan pertambahan substrat
yang diberikan (Gambar 3).
Laju Oksidasi
Amonium
RCSC2
Laju Oksidasi
Amonium
RCC1
Laju Oksidasi
Amonium
JCSC2
Laju
Akumulasi
Nitrit RCSC2
Laju
Akumulasi
Nitrit RCC1
Laju
Akumulasi
Nitrit JCSC2
Konsentrasi Substrat (µM)
Gambar 3 Laju oksidasi amonium dan akumulasi nitrit isolat RCSC2, RCC1 dan
JCSC2
Uji kinetika oksidasi amonium dilakukan dengan konsentrasi amonium 0,
500, 1000, 1500, dan 2000 M. erdasarkan hasil ji kinetika oksidasi amonium,
isolat JCSC2 memiliki nilai kecepatan maksimum (Vmaks) dan konstanta
Michaelis-Menten (Km) lebih tinggi dibandingkan isolat RCC1 dan RCSC2. Nilai
Km terendah dimiliki oleh isolat RCC1 (Tabel 4).
9
No.
1.
2.
3.
Tabel 4 Hasil uji kinetika nilai Km dan Vmaks
Isolat
Km (mM)
Vmaks (mM/jam)
RCC1
2.44
0.56
RCSC2
3.95
1.00
JCSC2
7.99
1.43
Pembahasan
Berdasarkan hasil peremajaan pada 14 isolat, semua bakteri dapat tumbuh
secara aerobik pada media agar yang mengandung amonium sebagai sumber
nitrogen dan karbonat sebagai sumber karbon. Menurut Moat dan Foster (1988),
bakteri nitrifikasi hidup secara aerobik. Bakteri tersebut memerlukan oksigen
sebagai penerima elektron terakhir di dalam rangkaian proses respirasi untuk
pembentukan energi.
Isolat-isolat tersebut ditumbuhkan pada media agar dengan kondisi pH
sekitar 6.00-7.00 dan suhu berkisar 28-31 oC. Hasil pengamatan menunjukkan
bahwa bakteri dapat tumbuh setelah 3 hari masa inkubasi. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Holt et al. (1994) bahwa bakteri nitrifikasi umumnya dapat tumbuh
optimal pada pH antara 6.5-8.5 dan suhu 5-30 oC.
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa semua bakteri tersebut
merupakan bakteri Gram negatif dan sebanyak 4 isolat berbentuk basil dan 10
isolat berbentuk kokus. Menurut Holt et al. (1994), bakteri nitrifikasi umumnya
mempunyai ciri Gram negatif dan berbentuk kokus, basil, spiral, atau ellipsoid.
Isolat-isolat yang telah murni ditumbuhkan pada media nitrifikasi autotrof
dengan sumber karbon berupa karbonat dan media nitrifikasi heterotrof dengan
sumber karbon berupa glukosa. Berdasarkan pengamatan, pertumbuhan sel bakteri
pada media nitrifikasi heterotrof menunjukkan pertumbuhan sel lebih tinggi
dibandingkan dengan pertumbuhan sel pada media nitrifikasi autotrof (Tabel 2).
William et al. (1998) menyatakan bahwa media karbonat merupakan media
nitrifikasi autotrof yang membuat pertumbuhan bakteri lambat dan perbanyakan
selnya rendah. Menurut Tresnawati (2006), media nitrifikasi heterotrof
menghasilkan pertumbuhan sel yang lebih tinggi daripada pertumbuhan sel pada
media nitrifikasi autotrof. Berdasarkan penelitiannya, pertumbuhan sel pada
media heterotrof yang paling tinggi terjadi pada media glukosa sebagai sumber
karbon dengan aktivitas mengoksidasi amonium cukup tinggi.
Perbedaan pertumbuhan sel pada kedua media diduga karena perbedaan
senyawa yang digunakan untuk pembentukan energi, yaitu glukosa dan amonium.
Menurut Widiyanto (2006), isolat pada media heterotrof memanfaatkan sumber
karbon dari glukosa. Isolat tersebut mengoksidasi glukosa melalui siklus asam
sitrat sehingga didapatkan 38 ATP per molekul glukosa. Sedangkan isolat pada
media nitrifikasi autotrof memanfaatkan amonium sebagai sumber energi. Proses
oksidasi amonium menghasilkan 2 ATP per molekulnya sehingga mendapatkan
energi lebih sedikit daripada glukosa. Hal ini menyebabkan pertumbuhan isolat
pada media heterotrof lebih tinggi dibandingkan pada media autotrof.
Pada uji aktivitas oksidasi amonium, isolat ditumbuhkan di dalam media
cair nitrifikasi dengan pH sekitar 7.0 dan diinkubasi pada suhu 30 oC. Menurut
Paul dan Clark (1989), faktor-faktor yang mempengaruhi proses nitrifikasi di
antaranya keasaman (pH) dan suhu. Nitrifikasi dapat berjalan optimal pada pH
10
6.6-8.0 tetapi dapat terhambat pada pH di bawah 4.5, sedangkan suhu yang
optimal berkisar 30-35 oC tetapi dapat berjalan lambat pada suhu di bawah 5 oC
dan di atas 40 oC.
Nitrifikasi merupakan proses oksidasi amonium menjadi nitrit dengan
perantara hidroksilamin dan oksidasi senyawa nitrit menjadi nitrat (Paul dan Clark
1989). Uji aktivitas oksidasi amonium pada 14 isolat menunjukkan bahwa semua
isolat dapat mengoksidasi amonium, bahkan terdapat 6 isolat mempunyai
kemampuan mengoksidasi amonium di atas 80% (Tabel 3). Aktivitas oksidasi
amonium ini terlihat dari pengurangan konsentrasi amonium pada masing-masing
isolat. Pengurangan konsentrasi amonium mengindikasikan bahwa isolat tersebut
dapat memanfaatkan amonium sebagai sumber energi atau sumber nitrogen untuk
pembentukan biomassa sel. Amonium yang teroksidasi membentuk nitrit, terlihat
dari adanya konsentrasi nitrit pada setiap isolat. Hal ini mengindikasikan bahwa
isolat tersebut mempunyai enzim amonia monooksigenase (AMO) dan
hidroksilamin oksidase (HAO). Menurut Moir et al. (1996), amonium dioksidasi
menjadi nitrit dengan perantara hidroksilamin dan enzim yang terlibat dalam
aktivitas oksidasi tersebut adalah AMO dan HAO.
Berdasarkan hasil uji aktivitas isolat, konsentrasi nitrit pada semua isolat
menunjukkan persentase yang rendah, yaitu berkisar 0.02-1.21% (Tabel 3). Hal
ini dapat menjadi salah satu indikator adanya bakteri yang potensial sebagai agen
bioremediasi. Menurut Widiyanto (2006), tidak terbentuknya senyawa nitrit
merupakan salah satu dasar seleksi bakteri yang potensial sebagai agen
bioremediasi karena senyawa nitrit bersifat toksik terhadap hewan budidaya.
Sutka et al. (2006) mengemukakan bahwa terdapat aktivitas bakteri saat
mengoksidasi amonium menjadi nitrit, yaitu produksi N2O dari oksidasi
hidroksilamin (NH2OH) oleh bakteri nitrifikasi, Nitrosomonas europaea.
Sebelas isolat mempunyai aktivitas menghasilkan nitrat dengan persentase
0.02-1.07%. Isolat RCSC2 mempunyai persentase nitrat sebesar 1.07%. Isolat
tersebut diduga mempunyai enzim nitrit oksidase. Menurut Steinmuller dan Bock
(1977), aktivitas bakteri dalam mengoksidasi nitrit melibatkan enzim nitrit
oksidase.
Laju rata-rata oksidasi amonium yang diujikan pada isolat RCC1, RCSC2,
dan JCSC2 mempunyai pola kenaikan laju yang berbeda. Laju isolat RCSC2 dan
JCSC2 dalam mengoksidasi amonium mengalami kenaikan seiring dengan
penambahan substrat yang diberikan, yaitu dari konsentrasi amonium 0, 500, 1000,
1500, hingga 2000 µM. Sedangkan pada isolat RCC1 mengalami kenaikan laju
rata-rata pada konsentrasi 1000-1500 µM dan memberikan reaksi yang berbeda
pada konsentrasi 1500-2000 µM yaitu tidak mengalami kenaikan yang signifikan
(Gambar 3). Perbedaan laju tersebut menunjukkan perbedaan kemampuan ketiga
isolat dalam memanfaatkan amonium berdasarkan tingkat konsentrasi amonium
yang diberikan.
Berdasarkan hasil analisis kinetika Michaelis-Menten, isolat RCC1, RCSC2,
dan JCSC2 mempunyai nilai Vmaks (kecepatan maksimum) sebesar 0.56, 1.00,
dan 1.46 mM/jam dan nilai Km (konstanta Michaelis-Menten) sebesar 2.44, 3.95,
dan 7.99 mM (Tabel 4). Isolat RCC1 yang mempunyai nilai Km lebih kecil
dibandingkan keduanya menunjukkan bahwa isolat RCC1 mempunyai enzim
dengan afinitas tinggi terhadap substratnya.
11
SIMPULAN
Empat belas isolat bakteri nitrifikasi asal kolam ikan air tawar Riau dan
Jambi yang dikarakterisasi bersifat Gram negatif dengan bentuk sel kokus dan
basil. Enam isolat mampu melakukan aktivitas oksidasi amonium di atas 80%.
Tiga isolat yang diuji kinetika oksidasi amonium, yaitu RCC1, RSCS2, dan
JCSC2 mempunyai nilai konstanta Michaelis-Menten (Km) sebesar 2.44, 3.95,
dan 7.99 mM. Isolat RCC1 yang mempunyai nilai Km terkecil menunjukkan
bahwa isolat RCC1 mempunyai enzim dengan afinitas tinggi terhadap substratnya.
DAFTAR PUSTAKA
[BBPBAT] Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar. 2014. Baku Mutu
Kualitas Air Budidaya. BBPBAT [internet]. [diunduh 2014 Sep 1]. Tersedia
pada: http://www.bbpbat.net/index.php/artikel/60-baku-mutu-kualitas-airbudidaya.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2013. Jambi dalam angka. BPS [internet]. [diunduh
2013 Des 17]. Tersedia pada: http://jambi.bps.go.id/pub/fb/2013/jda2012/
files/assets/basichtml/page353.html.
Eaton AD, Clesceri LS, Greenberg AE, Rice EW. 2005. Standard Method of
Examination of Water and Wastewater. Ed ke-21. Washington DC (US):
APHA-AWWA-WPCF.
[EPA] US Enviromental Protection Agency. 2002. Nitrification. USEPA [internet].
[diunduh 2013 Des 12]. Tersedia pada: http://water.epa.gov/ lawsregs/
rulesregs/ sdwa/tcr/upload/ nitrification.pdf.
Erlania, Rusmaedi, Prasetio AB, Haryadi J. 2010. Dampak manajemen pakan dari
kegiatan budidaya ikan nila (Oreochromis niloticus) di keramba jaring
apung terhadap kualitas keramba jaring apung terhadap kualitas perairan
Danau Maninjau. Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur. Jakarta
(ID): Pusat Riset Perikanan Budidaya. hlm 621-631.
Hadioetomo RS. 1983. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta (ID): PT
Gramedia Pustaka Utama.
Holt JG, Krieg NR, Smeath PHA. Stanley JT. Williams ST. 1994. Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Baltimore (US): Williams
and Wilkins Company.
[KKP] Kementerian Kelautan dan Perikanan. 2009. Kelautan dan Perikanan
dalam Angka 2009. Jakarta (ID): Pusat Data, Statistik dan Informasi.
Moat AG, Foster JW. 1988. Microbial Physiology. Ed ke-2. New York (US): John
Wiley & Sons, Inc.
Moir JWB, Crossman LC, Spiro S, Richardson DJ. 1996. The purification of
ammonia monooxygenase of Paracoccus denitrificans. FEBS Letters 387:
71-74.
Novita L. 2006. Aktivitas oksidasi amonium dan reduksi nitrat ASLT2 pada
sumber karbon yang berbeda [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
12
Paul EA, Clark FE. 1989. Soil Microbiology and Biochemistry. London (UK):
Academic Press.
Putra GPG. 2009. Penentuan kinetika enzim poligalakturonase (PG) endogenous
dari pup biji kakao. J Biol 8(1): 21-24.
Rachmansyah. 2004. Analisis daya dukung lingkungan Perairan Teluk Awarange
Kabupaten Barru, Sulawesi Selatan bagi pengembangan budidaya bandeng
dalam keramba jaring apung [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Rand MC, Greenberg AE, Taras MJ. 1979. Standard Method of Examination of
Water and Wastewater. Ed ke-14. Washington DC (US): APHA-AWWAWPCF.
Rohmana D. 2009. Konversi limbah budidaya ikan lele, Clarias sp. menjadi
biomassa bakteri heterotrof untuk perbaikan kualitas air dan makanan udang
galah, Macrobrachium rosenbergii. [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Steinmuller W, Bock E. 1977. Enzymatic studies on autotrophically,
mixotrophically, and heterotrophically grown Nitrobacter agilis with special
reference to nitrite oxidase. Arch Microbiol 115: 51-54.
Sutka RL, Ostrom NE, Ostrom PH, Breznak JA, Gandhi H, Pitt AJ, Li F. 2006.
Distinguishing nitrous oxide production from nitrification and
denitrification on the basis of isotopomer abundances. J Appl and Envir
Microbiol 72(1): 638–644.
Tresnawati T. 2006. Aktivitas bakteri pengoksidasi amonium isolat ASR1 dan
ASR2 asal tambak udang pada sumber karbon dan salinitas yang berbeda
[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
White D. 2000. The Physiology and Biochemistry of Procaryotes. Ed ke-2. New
York (US): Oxford University Press.
Widiyanto T. 2006. Seleksi bakteri nitrifikasi dan denitrifikasi untuk bioremediasi
di tambak udang [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
William EH et al. 1998. Molecular analisis of bacterial communities in a threecompartement granular activated sludge system indicates community level
control by incompatile nitrification processes. J Appl and Envir Microbiol
64: 2528-2532.
13
Absorban (640 nm)
Lampiran 1 Kurva standar amonium
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 0,017x + 0,023
R² = 0,9991
0
10
20
30
40
Konsentrasi (µM)
50
60
Lampiran 2 Kurva standar nitrit
0,4
Absorban (543 nm)
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
y = 0,0352x + 0,0033
R² = 0,9996
0,05
0
0
2
4
6
8
Konsentrasi (µM)
10
12
Lampiran 3 Kurva standar nitrat
0,16
Absorban (410 nm)
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
y = 0,0099x + 0,006
R² = 0,984
0,02
0
0
5
10
Konsentrasi (µM)
15
14
Lampiran 4 Komposisi media nitrifikasi
Komposisi media nitrifikasi (g/L) (Rodina 1972 dalam Novita 2006)
13.5
0.7
0.1
0.5
0.014
0.18
0.1
0.2
0.5
KH2PO4
K2HPO4
MgCl2.6H2O
NaHCO3
FeCl3.6H2O
CaCl2.2H2O
NH4Cl
EDTA
Glukosa
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Depok pada tanggal 16 September 1992 sebagai anak
pertama dari tiga bersaudara, Siti Hardianti dan Oktavia Rahmawati, dengan ayah
bernama Atmaja dan ibu bernama Asenih.
Pada tahun 2010, penulis lulus dari SMA Negeri 3 Depok dan pada tahun
yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI).
Selama mengikuti perkuliahan di IPB, penulis aktif pada berbagai
organisasi mahasiswa. Penulis pernah menjadi pengurus BEM KM Institut
Pertanian Bogor pada tahun 2010/ 2011 dan melanjutkan kembali pada tahun
2011/2012 di dalam Kementerian Sosial dan Kesejahteraan Masyarakat dengan
menjadi Ketua Program Rumah Harapan. Penulis pernah juga menjadi pengurus
HIMABIO divisi Pengembangan Sumber Daya Mahasiswa pada tahun
2012/2013. Penulis juga aktif dalam beberapa kepanitian di kampus dan di
organisasi. Penulis mendapatkan beasiswa PPA (Peningkatan Prestasi Akademik)
dari semester tiga hingga semester delapan.
Pada tahun 2012, penulis melaksanakan studi lapang di Taman Nasional
Gunung Gede Pangrango (TNGGP) dengan topik Identifikasi Tumbuhan Paku di
TNGGP berdasarkan Ketinggian. Pada tahun 2013, penulis melaksanakan praktik
lapangan di PT Herlina Indah, Pulogadung, Jakarta dengan topik Pengolahan dan
Pengawasan Mutu Aquademin di PT Herlina Indah.