19
genetik dilakukan dengan karakterisasi secara morfologi dan secara molekuler dengan penanda ISSR.
a. Karakterisasi morfologi
Pengamatan dilakukan terhadap : Tinggi tunas cm, pengukuran menggunakan mistar dari pangkal batang
hingga pucuk Jumlah daun, penghitungan berdasarkan jumlah daun yang telah terbuka
penuh Jumlah cabang
Jumlah akar Bentuk, warna dan tepi daun
Pengamatan terhadap bentuk, warna dan tepi daun dilakukan berdasarkan deskripsi yang dikeluarkan oleh IPGRI 1999.
Analisis stomata Sampel yang digunakan adalah daun yang berasal dari planlet yang telah
tumbuh sempurna. Pengamatan stomata dilakukan pada irisan paradermal. Metode analisis stomata menggunakan sediaan preparat segar Mulyono
2011. Sampel daun dipotong dengan ukuran 0.2 x 0.2 cm, kemudian bagian bawah daun ditempelkan pada selotip yang panjangnya + 2 cm.
Daun dikupas secara perlahan dengan menggunakan pisau silet dan sedikit air, sampai terbentuk lapisan tipis dan terlihat transparan. Lapisan tipis
yang tertinggal pada selotip merupakan lapisan epidermis daun. Kemudian selotip tersebut diletakkan di atas gelas preparat dan ditutup dengan gelas
penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop pada perbesaran 400 kali. Luas bidang pandang
mikroskop pada perbesaran 400 kali adalah 0.19625 mm
2
. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah stomata dan ukuran stomata. Pengamatan
jumlah stomata pada setiap daun dilakukan pada 3 bidang pandang yang berbeda. Jumlah stomata setiap perlakuan merupakan rata-rata jumlah
stomata dari 3 daun. Ukuran stomata setiap perlakuan merupakan rata-rata ukuran stomata dari 3 daun. Tiap daun diukur 5 stomata secara acak.
20
b. Analisis Molekuler dengan Penanda ISSR
Sampel daun diambil dari planlet hasil karakterisasi morfologi. Tahapan analisis ISSR : isolasi DNA dengan menggunakan metode Doyle dan Doyle
1990; uji kualitas DNA berdasarkan metode Sambrook et al. 1989 serta optimasi program PCR dan amplifikasi DNA berdasarkan penelitian Martasari et
al. 2012. Primer ISSR yang digunakan berasal dari penelitian sebelumnya oleh Husni 2010, sebanyak delapan primer yaitu ISSR-1 sampai ISSR-8 Tabel 1.
Tabel 1 Susunan basa delapan primer ISSR yang digunakan No
Nama Primer Susunan Basa
1 ISSR-1
5’-CAACACACACACACACA-3’ 2
ISSR-2 5’-ACACACACACACACACCA-3’
3 ISSR-3
5’-ACACACACACACACACTG-3’ 4
ISSR-4 5’-TAATCCTCCTCCTCCTCC-3’
5 ISSR-5
5’-TCCTCCTCCTCCTCCGC-3’ 6
ISSR-6 5’-CGTTCCTCCTCCTCCTCC-3’
7 ISSR-7
5’-GTGTGTGTGTGTGTGTTC-3’ 8
ISSR-8 5’-AGAGAGAGAGAGAGAGTC-3’
Isolasi DNA Total Isolasi DNA dilakukan dengan metode CTAB Cetyl Trimetyl Ammonium
Bromide. Daun sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam mortar yang berisi nitrogen cair, kemudian digerus sampai hancur. Buffer ekstraksi CTAB sebanyak + 700 µ l
ditambahkan ke dalam mortar dan digerus hingga merata. Sampel dipindahkan ke dalam 1.5 ml microtube menggunakan pipet, kemudian microtube direndam
dalam waterbath bersuhu 65 C selama 30 menit. Sampel selanjutnya diinkubasi di
suhu ruang selama 10 menit. Sampel kemudian ditambah CIA Chloroform : Isoamylalcohol 24:1 sebanyak + 700 µl dan dibolak-balik secara perlahan hingga
tercampur merata. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4
C selama 10 – 15 menit. Larutan DNA yang berwarna bening di bagian atas akan memisah dari larutan chloroform yang tercampur dengan bagian sel yang
lainnya berwarna hijau. Fase atas tersebut + 500 – 650 µl dipindahkan ke
21
microtube baru. Isopropanol dingin sebanyak 1x volume sampel ditambahkan ke dalam microtube dan dibolak-balik secara perlahan. Sampel kemudian diinkubasi
di suhu ruang selama 10 menit, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm pada suhu 4
C selama 10 – 15 menit. Fase atas dibuang, dan endapan DNA di dasar microtube dicuci dengan 70 ethanol. Endapan DNA
dikeringanginkan di suhu ruang selama 15 – 20 menit, kemudian dilarutkan dengan 50 – 100 µ l air bebas ion untuk dijadikan stok DNA dan disimpan pada
suhu -20 C.
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan menggunakan larutan agarose 0.8 dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1X yang dialirkan arus listrik dari
muatan negatif ke muatan positif selama 50 menit pada voltase 50 volt. Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu
dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA.
Amplifikasi DNA dengan PCR
Reaksi amplifikasi PCR dilakukan menggunakan 25 µ l yang terdiri dari 1 µ l DNA, 2 µ l primer 40 µM, 1 µ l dNTP 10 mM, 0.2 µ l DNA Taq polymerase
5 unitµl, 3 µl buffer PCR, 1.5 µl MgCl
2
25 mM dan 16.3 µl air bebas ion. Denaturasi awal dilakukan pada suhu 94
C selama 3 menit. Tahapan PCR
meliputi
35 siklus, yaitu denaturasi awal pada suhu 94 C selama 54 detik,
annealing pada suhu 43 C selama 45 detik dan ekstensi pada suhu 72
C selama 2 menit. Siklus PCR diakhiri dengan satu siklus ekstensi akhir pada suhu 72
C selama 5 menit Martasari et al. 2012.
Visualisasi Hasil PCR
Elektroforesis dilakukan untuk mengetahui hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR, dilakukan melalui elektroforesis horizontal dengan 1.8
agarose yang dilarutkan dalam 100 ml buffer TAE 1X, pada tegangan 57 voltase selama 3 jam. Selanjutnya gel direndam dalam 0.5 µgml EtBr dalam ruang gelap
22
selama 15 menit dan dibilas dalam H
2
O selama 10 menit. Visualisasi dilakukan di atas lampu UV dengan menggunakan alat BiodocAnalyze.
c. Analisis Data Hasil Evaluasi Keragaman Genetik