Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan
ANALISIS MOLEKULER DAN FENOTIPE GALUR PADI
TRANSGENIK IR64 GENERASI T3 YANG MENGANDUNG
PENANDA AKTIVASI UNTUK TOLERANSI KEKERINGAN
HABIB VIO NANDA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Molekuler dan
Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda
Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2015
Habib Vio Nanda
NIM G84100054
ABSTRAK
HABIB VIO NANDA. Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik
IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi
Kekeringan. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMISENO dan TRI
JOKO SANTOSO.
Padi transgenik cv. IR64 penanda aktivasi telah dikembangkan dengan cara
mengintroduksikan konstruk penanda aktivasi transposon Ac/Ds. Tanaman padi
transgenik tersebut belum dianalisis fenotipenya yang berkaitan dengan toleransi
cekaman kekeringan. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi galur-galur tanaman
padi transgenik cv. IR64 generasi T3 yang menunjukkan toleransi terhadap
kekeringan. Metode seleksi tanaman dilakukan dengan menumbuhkan tanaman
padi, menguji toleransinya terhadap kekeringan, mendeteksi keberadaan gen bar
dan hpt, dan mengidentifikasi perubahan karakter agronomisnya. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa sebanyak 33 dari 84 tanaman diketahui toleran terhadap
kekeringan. Setelah dilakukan analisis PCR diperoleh sebanyak 23 tanaman
positif mengandung gen bar dan mengindikasikan mutan yang stabil. Secara
umum, tanaman padi transgenik cv. IR64 generasi T3 mengalami perubahan
karakter agronomis jika dibandingkan dengan tanaman nontransgenik. Sebanyak
sembilan tanaman mengalami peningkatan tinggi tanaman, sebanyak enam
tanaman memiliki umur panen lebih cepat, dan sebanyak 21 tanaman memiliki
bobot 100 butir gabah isi yang lebih tinggi dari tanaman nontransgenik.
Kata kunci: Padi (Oriza sativa L.), penanda aktivasi, toleran kekeringan
ABSTRACT
HABIB VIO NANDA. Molecular and Phenotipic Analysis of T3 Generation
Transgenic Rice cv. IR64 Containing Activation Tagging Construct for Tolerance
to Drought Stress. Supervised by DJAROT SASONGKO HAMISENO and TRI
JOKO SANTOSO.
Activation tagging transgenic rice cv. IR64 had been developed by
introducing a construct of activation tagging transposon Ac/Ds. Phenotipic
character associated with drought stress tolerance of the transgenic rice lines have
not been analyzed. This study aimed to evaluate T3 generation of activation
tagging transgenic rice lines cv. IR64 to drought stress treatment. The
methodology of study consisted of several steps including germination of samples
seeds, screening the seedling with drought strees treatment, molecular analysis of
the rice lines identify hpt and bar genes, and observation of agronomic character.
Results of study showed that there were 34 out of 84 plants that tolerant to
drought stress. A total of 23 plants of tolerant plants were detected carrying only
bar gene after PCR analysis and indicated that the plants were stable mutants.
Generaly, compared to the non-transgenic plants, there were changes in several
agronomic parameters of transgenic rice plants cv. IR64 T3 generation. A total of
nine plants increased of its height, six plants had a faster harvesting time, and 21
plants had higher weight of 100 seeds compared by non-transgenic plants.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.), activation tagged, drought stress tolerance
ANALISIS MOLEKULER DAN FENOTIPE GALUR PADI
TRANSGENIK IR64 GENERASI T3 YANG MENGANDUNG
PENANDA AKTIVASI UNTUK TOLERANSI KEKERINGAN
HABIB VIO NANDA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul Skripsi : Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64
Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi
Kekeringan
Nama
: Habib Vio Nanda
NIM
: G84100054
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hamiseno, MS
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M App Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis limpahkan hehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa
atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya
ilmiah yang berjudul “Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik
IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi
Kekeringan”.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Djarot Sasongko H.
MS dan Dr Tri Joko Santoso, MSi selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan saran, kritik, dan bimbingannya selama penyusunan karya ilmiah.
Selain itu, terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman Biokimia 47
dan semua pihak yang telah membantu kelancaran penelitian ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan karya ilmiah
ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan
berguna dalam penulisan ini. Penulis juga berharap karya tulis ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Maret 2015
Habib Vio Nanda
DAFTAR ISI
ABSTRAK
iv
PRAKATA
iv
DAFTAR ISI
v
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL
6
PEMBAHASAN
11
SIMPULAN DAN SARAN
14
Simpulan
14
Saran
14
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
24
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung)
Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering)
Kuantitas dan kemurnian DNA daun padi
Tanaman yang dapat pulih setelah perlakuan cekaman kekeringan
Tinggi tanaman padi IR64 transgenik generasi T3
Umur panen padi IR64 transgenik generasi T3
Bobot 100 butir gabah tanaman padi IR64 transgenik generasi T3
4
4
8
9
10
10
11
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon
Kecambah biji padi yang ditambah dengan larutan basta
Kecambah biji padi di dalam trey tanpa perlakuan basta
Tanaman padi sebelum perlakuan kekeringan
Tanaman padi setelah perlakuan kekeringan selama 8 hari
Amplifikasi PCR padi transgenik menggunakan primer gen hpt
Amplifikasi PCR padi transgenik menggunakan primer gen bar
2
6
7
7
8
9
10
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Bagan alir penelitian
Benih tanaman padi transgenik IR64 yang tumbuh pada media basta
Benih tanaman padi transgenik IR64 yang tumbuh tanpa perlakuan basta
Seleksi tanaman padi yang toleran cekaman kekeringan dengan
Keberadaan gen hpt dan bar dalam tanaman transgenik IR64 generasi T3
Pengamatan karakter agronomi padi transgenik penanda aktivasi
17
18
19
20
22
23
PENDAHULUAN
Tanaman padi telah banyak digunakan sebagai model dalam penelitian
untuk mendapatkan padi yang memiliki sifat unggul. Hal ini dilakukan untuk
meningkatkan produksi ataupun kualitas padi seperti yang diinginkan
(Mulyaningsih et al. 2010). Salah satu sifat unggul yang diinginkan ada pada
tanaman padi yaitu toleransi tanaman terhadap cekaman abiotik, seperti
kekeringan. Kekeringan berpengaruh buruk terhadap pertumbuhan tanaman dan
dapat menurunkan produktivitas tanaman sebesar 70% (Bray et al. 2000). Dalam
kondisi kekurangan air, tanaman harus memiliki sistem pertahanan untuk
menanggapi cekaman kekeringan agar dapat bertahan hidup (Widyasari et al.
2004). Mengatasi masalah tersebut, penggunaan tanaman padi yang toleran
terhadap kekeringan merupakan langkah sederhana yang dapat dilakukan (Lestari
dan Mariska 2006). Tanaman padi yang toleran terhadap kekeringan ini dapat
dikembangkan melalui teknik rekayasa genetika. Proses isolasi dan identifikasi
terkait gen yang toleran terhadap kekeringan dapat dilakukan, sehingga fungsi dari
gen-gen tersebut dapat dipelajari lebih lanjut (Santoso et al. 2013).
Berdasarkan penjelasan Trijatmiko et al. (2005), bahwa proses identifikasi
terkait fungsi suatu gen dapat dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu forward
genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan dengan
menguji perbedaan fenotipe tanaman mutan dengan tipe liar atau melakukan
skrining populasi mutan over ekspresi dengan teknik penanda aktivasi (activation
tagging), selanjutnya dilakukan analisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian
dilanjutkan ke sekuen gennya. Pendekatan reverse genetics dilakukan dengan
berpedoman dari informasi sekuen gen yang telah diketahui (Sisharmini et al.
2009; Santoso et al. 2013).
Penelitian ini menggunakan sampel tanaman padi transgenik kultivar IR64
yang diketahui mengandung vektor penanda aktivasi. Penanda aktivasi adalah
potongan DNA yang dapat meningkatkan ekspresi gen-gen di daerah sekitar
insersi. Vektor penanda aktivasi berdasar transposon yang digunakan dalam
penelitian ini adalah pAc-DsATag-Bar-gosGFP (Gambar 1) (Trijatmiko et al.
2005). Vektor penanda aktivasi ini mengandung dua elemen. Elemen pertama,
yaitu elemen Ac (activator) yang mengkode enzim transposase di bawah kontrol
promotor Ac. Elemen kedua, yaitu elemen Ds (dissociation) berisi elemen 4x
enhancer dari promotor 35S CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) dan gen yang
menyandi ketahanan terhadap basta di bawah kendali promotor Ubiquitin
(Sisharmini 2009). Transposon Ac/Ds dapat diidentifikasi menggunakan gen hpt
dan gen bar. Gen hpt merupakan marka penyeleksi yang mengidentifikasi
keberadaan transposon Ac, sedangkan gen bar merupakan marka penyeleksi untuk
mengidentifikasi keberadaan transposon Ds (Marsch-Martinez et al. 2002).
Vektor penanda aktivasi yang menyisip ke dalam gen tanaman padi akan
meningkatkan aktivitas gen tanaman tersebut, sehingga ekspresi gen juga akan
meningkat (Marsch-Martinez et al. 2002). Peningkatan ekspresi ini yang nantinya
akan diidentifikasi untuk menentukan fungsi dari gen tersebut. Selanjutnya
tanaman ini bisa diseleksi berdasarkan sifat yang diinginkan, dalam hal ini bersifat
toleran kekeringan (Sisharmini et al. 2009).
2
Gambar 1
Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon
yang terdiri atas 2 elemen, yaitu Ac dan Ds.
Keterangan: Elemen Ac (bawah) dan elemen Ds
(atas) pada daerah T-DNAnya (Trijatmiko et al.
2005).
Populasi tanaman padi transgenik kultivar IR64 dibentuk dengan cara
mengintroduksikan konstruk penanda aktivasi transposon Ac/Ds ke dalam genom
tanaman padi IR64 dengan bantuan A. tumefaciens. Populasi tersebut sudah
diketahui positif mengandung konstruk penanda aktivasi, namun belum diketahui
perubahan karakternya akibat aktivasi dari sisipan konstruks tersebut. Karakter
agronomis suatu tanaman dapat diamati berdasarkan sifat yang tampak secara
visual. Identifikasi karakter agronomi dalam penelitian ini meliputi tinggi
tanaman, jumlah malai produktif, umur panen, dan bobot 100 butir (Sisharmini et
al. 2013). Populasi tanaman padi transgenik kultivar IR64 generasi T3
diindikasikan mengandung individu yang memiliki sifat beraneka ragam sebagai
akibat dari insersi transposon Ac/Ds (Marsch-Martinez et al. 2002).
Penelitian ini bertujuan mengevaluasi galur-galur tanaman padi transgenik
varietas IR64 generasi T3 yang mengandung elemen transposon penanda aktivasi
yang tahan terhadap cekaman kekeringan. Penelitian ini diharapkan dapat
memperoleh galur-galur yang toleran terhadap cekaman kekeringan sehingga
dapat langsung dikembangkan menjadi varietas tanaman baru. Selain itu, galurgalur tanaman padi toleran kekeringan dapat digunakan sebagai materi tanaman
untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen-gen yang terkait dengan toleransi
terhadap kekeringan.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah padi IR64
transgenik penanda aktivasi generasi T3 sebagai subjek penelitian, padi Gajah
Mungkur, IR20, Cabaccu, IR64 tipe liar sebagai pembanding, etanol 70%,
nitrogen cair, buffer ekstraksi (Tris-HCl pH 8.0, etilen diamin tetraasetat (EDTA),
natrium klorida (NaCl), setiltrimetil amonium bromide (CTAB), polivinil
3
pirolidon (PVP), dan merkaptoetanol), larutan TE (Tris-EDTA), DNA hasil PCR,
2x KAPA2G Fast, primer hpt dan bar, cetakan DNA, DMSO, ddH2O, bubuk
agarosa, Gel Red, loading dye, 1x bufer TAE, dan marker 1 kb (0.1 µg/µL).
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah microfuge, pipet mikro, neraca analitik,
autoklaf, vorteks, UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad, elektroforesis,
erlenmeyer, kertas aluminium, penangas air, microwave, gelas ukur, mesin PCR
Bio-Rad 100.
Prosedur Penelitian
Seleksi Benih Padi Menggunakan Larutan Basta (Santoso et al. 2013)
Sebanyak 30 galur padi transgenik dan kontrol, masing-masing 20 biji
dikecambahkan di dalam cawan petri berisi kertas saring yang selalu basah.
Setelah 3 hari, semua kecambah galur transgenik dan 5 kecambah kontrol
dipindahkan ke dalam cawan petri baru berisi kertas saring yang diberi larutan
basta dengan konsentrasi 200 mg/L sebanyak 10 mL. Pengujian ini dilakukan
untuk menyeleksi kecambah yang tahan terhadap basta dengan yang tidak tahan
terhadap basta. Kecambah yang tahan terhadap basta akan tumbuh, sedangkan
yang tidak tahan terhadap basta pertumbuhannya akan terhambat. Setelah 6 hari,
kecambah yang tumbuh dipindahkan kedalam pot yang berisi media tanah:pasir
dan pupuk (1:1:1).
Penumbuhan padi tanpa perlakuan basta (Santoso et al. 2013)
Varietas padi yang digunakan adalah varietas IR64 transgenik penanda
aktivasi generasi T3, yang memiliki gen mutan dari hasil transformasi transposon
Ac/Ds, serta kontrol yang digunakan adalah varietas IR64, cabacu, gajah mungkur,
dan IR20. Sebanyak 60 benih diambil dari tiap varietas. Benih di oven selama
semalam pada suhu 50 oC. Benih padi kemudian ditanam menggunakan tray
dengan media yang terdiri atas tanah, pasir, dan pupuk (1:1:1). Setiap lubang tray
berisi 5 benih padi. Benih tersebut disiram dengan air secukupnya pada pagi dan
sore hari hingga tumbuh tunas.
Perlakuan Toleransi Kekeringan (Santoso et al. 2013)
Padi dipindahkan ke media pot yang berisi tanah, pasir, dan pupuk (1:1:1) di
ditumbuhkan selama 3-4 minggu dengan disiram air sebanyak 50 mL pada pagi
dan sore hari. Kemudian diberikan perlakuan kekeringan selama 8 hari, dengan
cara tidak diberi air selama perlakuan. Selanjutnya dilakukan pengamatan
terhadap respon padi yang menunjukkan gejala daun layu dan daun mengering.
Setelah diperlakukan kekeringan, padi disiram sebanyak 50 mL air untuk proses
recovery (pemuliahan). Sampel padi yang mengalami recovery dibiarkan hidup
selama 2-3 minggu, agar dapat dilakukan isolasi DNA. Penilaian skor
penggulungan dan pengeringan daun dilakukan berdasarkan skor pengamatan
seperti yang dijelaskan pada Standard Evaluation System for Rice (IRRI 1996;
Silitonga et al. 2003) yang tertera pada Tabel 1 dan Tabel 2.
4
Tabel 1 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung
pada fase vegetatif)
Skor/Skala
0
3
5
7
9
Keterangan
Daun-daun sehat
Daun-daun melipat (sangat berbentuk huruf V)
Daun betul-betul kuncup (membentuk huruf U)
Ujung-ujung daun bersentuhan (bentuk O)
Daun menggulung ketat
Tabel 2 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering pada
fase vegetatif)
Skor/Skala
0
1
3
5
7
9
Keterangan
Tidak ada gejala
Ujung daun sedikit mengering
Ujung daun mengering sampai ¼ panjang dari semua daun
¼ sampai ½ dari semua daun betul-betul kering
Lebih dari 2/3 dari semua daun betul-betul kering
Tanaman mati
Isolasi DNA daun padi (Doyle & Doyle 1987)
Sampel yang digunakan untuk isolasi adalah daun padi mutan varietas IR64.
Daun padi dipanen dengan mengambil daun padi yang masih muda. Daun padi
kemudian dimasukkan ke dalam tabung effendorf yang telah diberi label dan
ditempatkan di dalam cool box. Daun padi yang sudah dipanen selanjutnya
digerus. Penggerusan dilakukan dengan merendam tabung effendorf yang berisi
daun padi dengan nitrogen cair supaya daun membeku, dan dihaluskan dengan
menggerus daun dengan sumpit di dalam tabung tersebut. Daun yang sudah halus
kemudian ditambah dengan buffer CTAB 1000 µL. Buffer CTAB dengan
kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel.
Tahap selanjutnya dilakukan proses inkubasi selama 15 menit di dalam
penangas air dengan suhu 65 oC. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan
kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam sampel. Sebanyak 100 µL Naasetat dan 1000 µL larutan Chisam ditambahkan ke dalam suspensi, selanjutnya
dilakukan sentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Na-asetat adalah
senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk
senyawa kompleks dengan CTAB-potassium asetat-protein-debris sel. Suspensi
bagian atas kemudian dipisahkan ke dalam tabung baru yang telah diberi label. Ke
dalam tabung ditambahkan Na-asetat sebanyak 1/10 dan isopropanol sebanyak 2/3
dari rata-rata suspensi yang diambil dari hasil sentrifus. Penambahan isopropanol
yang berfungsi untuk pengendapan protein dan dilanjutkan proses presipitasi
DNA dengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai penghilang pengotor.
Larutan kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama
15 menit untuk mendapatkan DNA. Setelah itu dilakukan dekantasi dan
ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL ke dalam tabung. Suspensi kemudian
disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan hasil
sentrifus dibuang dan tubung dikeringkan didalam oven selama ±5 menit. Setelah
itu ditambahkan TE-RNAse sebanyak 50 µL ke dalam tabung, selanjutnya di
inkubasi dengan suhu 37 oC selama 30 menit didalam inkubator.
5
Pengukuran kuantitas dan kemurnian DNA (Thermo Fisher Scientific 2009)
Ekstrak DNA padi hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan menggunakan
spektrofotometer nanodrop. Volume yang digunakan untuk pengukuran pada
nanodrop sebanyak 1 µL. Larutan blanko yang digunakan adalah buffer TE
sebanyak 1 µL. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan untuk mengetahui kemurnian ekstrak DNA dilakukan dengan
menggunakan perbandingan absorbansi 260/280 (A260/280).
Kalibrasi nanodrop harus dilakukan sebelum digunakan untuk pengukuran
sampel DNA. Buffer TE sebanyak 1 µL ke dalam pedestal dan ditutup kembali.
Toolbar blank ditekan dan tunggu hingga tertulis masukkan sampel. Sampel
dimasukkan sebanyak 1 µL ke dalamnya dan tekan tombol F1. Tombol reports
diklik dan dilanjutkan dengan tombol exports, print, graph, dan print ke Microsoft
XPS document writer.
Menurut Brown (2001) DNA yang murni mempunyai nilai absorbansi 260
dibagi dengan nilai absorbansi 280 (A260/280) berkisar 1.8 hingga 2.0. Apabila
nilainya kurang dari 1.8 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan
protein dan untuk menghilangkannya ditambahkan proteinase. Apabila nilainya
lebih dari 2.0 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan RNA, dan
untuk menghilangkannya ditambahkan ribonuklease.
DNA yang telah diperoleh dari hasil isolasi dan telah dilakukan uji
kuantitatif selanjutnya diencerkan. Pengenceran yang dilakukan adalah
pengenceran 10 kali dan dibuat stok sebanyak 50 µL. Stok DNA yang diperoleh
diambil sebanyak 5 µL dan ditambahkan dengan Nuclease Free Water (NF)
sebanyak 45 µL ke dalam tube 0.5 mL.
Amplifikasi DNA menggunakan PCR (Sambrook et al. 2001)
Amplifikasi gen tanaman padi mutan yang toleran terhadap kekeringan
dilakukan dengan menggunakan primer hpt dan bar. Amplifikasi PCR dilakukan
pada volume total reaksi 10 µl yang mengandung 1 µl DNA genomik cetakan,
ddH2O sebanyak 2.5 µL, 5 µL 2X Kapa 2G, 0.5 µL sepasang primer spesifik
masing-masing dengan konsentrasi 5 µM, dan 0.5 µL DMSO.
Setiap reaksi dilakukan pada tabung mikro 200 µl. Reaksi amplifikasi
dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95 ºC
selama 3 menit sebanyak 1 siklus, dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri atas
denaturasi pada suhu 95 ºC selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 63ºC
selama 15 detik, pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 20 detik.
Pemanjangan primer terakhir selama 7 menit pada suhu 72 oC. Produk PCR
(amplikon) kemudian dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa.
Elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al. 2001)
Elektroforesis DNA yang dilakukan mengacu pada metode Sambrook &
Russell (2001). Terlebih dahulu disiapkan 1% gel agarosa dengan 1x buffer TE.
Agarosa dipanaskan sampai mendidih lalu diamkan pada suhu ruang beberapa
detik. Saat suhu agarosa cukup dingin lalu dituangkan pada cetakan. Setelah gel
agarosa memadat kemudian dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang
berisi 1x buffer TE. Sebanyak 6 µl produk PCR dari masing-masing sampel
ditambahkan dengan 1 µl loading dye dan dicampur sempurna, kemudian
dimasukkan ke dalam sumur di dalam gel. Untuk menentukan ukuran dari produk
6
PCR disertakan juga DNA standar (1 kb) sebagai pembanding. Sampel
dielektroforesis dengan tegangan 95 volt selama kurang lebih 40 menit.
Analisis Karakter Agronomi (Sisharmini et al. 2013)
Analisis karakter agronomi ini dilakukan dengan mengamati tinggi tanaman,
bobot 100 butir, dan umur panen padi. Tinggi tanaman padi diukur mulai dari
pangkal batang di atas permukaan tanah hingga ujung daun tertinggi. Tinggi
tanaman padi ini dapat digolongkan ke dalam tiga golongan, yaitu tinggi (>130
cm), sedang (110-130 cm), dan rendah (
TRANSGENIK IR64 GENERASI T3 YANG MENGANDUNG
PENANDA AKTIVASI UNTUK TOLERANSI KEKERINGAN
HABIB VIO NANDA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Molekuler dan
Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda
Aktivasi untuk Toleransi Kekeringan adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2015
Habib Vio Nanda
NIM G84100054
ABSTRAK
HABIB VIO NANDA. Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik
IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi
Kekeringan. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO HAMISENO dan TRI
JOKO SANTOSO.
Padi transgenik cv. IR64 penanda aktivasi telah dikembangkan dengan cara
mengintroduksikan konstruk penanda aktivasi transposon Ac/Ds. Tanaman padi
transgenik tersebut belum dianalisis fenotipenya yang berkaitan dengan toleransi
cekaman kekeringan. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi galur-galur tanaman
padi transgenik cv. IR64 generasi T3 yang menunjukkan toleransi terhadap
kekeringan. Metode seleksi tanaman dilakukan dengan menumbuhkan tanaman
padi, menguji toleransinya terhadap kekeringan, mendeteksi keberadaan gen bar
dan hpt, dan mengidentifikasi perubahan karakter agronomisnya. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa sebanyak 33 dari 84 tanaman diketahui toleran terhadap
kekeringan. Setelah dilakukan analisis PCR diperoleh sebanyak 23 tanaman
positif mengandung gen bar dan mengindikasikan mutan yang stabil. Secara
umum, tanaman padi transgenik cv. IR64 generasi T3 mengalami perubahan
karakter agronomis jika dibandingkan dengan tanaman nontransgenik. Sebanyak
sembilan tanaman mengalami peningkatan tinggi tanaman, sebanyak enam
tanaman memiliki umur panen lebih cepat, dan sebanyak 21 tanaman memiliki
bobot 100 butir gabah isi yang lebih tinggi dari tanaman nontransgenik.
Kata kunci: Padi (Oriza sativa L.), penanda aktivasi, toleran kekeringan
ABSTRACT
HABIB VIO NANDA. Molecular and Phenotipic Analysis of T3 Generation
Transgenic Rice cv. IR64 Containing Activation Tagging Construct for Tolerance
to Drought Stress. Supervised by DJAROT SASONGKO HAMISENO and TRI
JOKO SANTOSO.
Activation tagging transgenic rice cv. IR64 had been developed by
introducing a construct of activation tagging transposon Ac/Ds. Phenotipic
character associated with drought stress tolerance of the transgenic rice lines have
not been analyzed. This study aimed to evaluate T3 generation of activation
tagging transgenic rice lines cv. IR64 to drought stress treatment. The
methodology of study consisted of several steps including germination of samples
seeds, screening the seedling with drought strees treatment, molecular analysis of
the rice lines identify hpt and bar genes, and observation of agronomic character.
Results of study showed that there were 34 out of 84 plants that tolerant to
drought stress. A total of 23 plants of tolerant plants were detected carrying only
bar gene after PCR analysis and indicated that the plants were stable mutants.
Generaly, compared to the non-transgenic plants, there were changes in several
agronomic parameters of transgenic rice plants cv. IR64 T3 generation. A total of
nine plants increased of its height, six plants had a faster harvesting time, and 21
plants had higher weight of 100 seeds compared by non-transgenic plants.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.), activation tagged, drought stress tolerance
ANALISIS MOLEKULER DAN FENOTIPE GALUR PADI
TRANSGENIK IR64 GENERASI T3 YANG MENGANDUNG
PENANDA AKTIVASI UNTUK TOLERANSI KEKERINGAN
HABIB VIO NANDA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Judul Skripsi : Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik IR64
Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi
Kekeringan
Nama
: Habib Vio Nanda
NIM
: G84100054
Disetujui oleh
Dr Djarot Sasongko Hamiseno, MS
Pembimbing I
Dr Tri Joko Santoso, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M App Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis limpahkan hehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa
atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya
ilmiah yang berjudul “Analisis Molekuler dan Fenotipe Galur Padi Transgenik
IR64 Generasi T3 yang Mengandung Penanda Aktivasi untuk Toleransi
Kekeringan”.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr Djarot Sasongko H.
MS dan Dr Tri Joko Santoso, MSi selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan saran, kritik, dan bimbingannya selama penyusunan karya ilmiah.
Selain itu, terima kasih juga penulis sampaikan kepada teman-teman Biokimia 47
dan semua pihak yang telah membantu kelancaran penelitian ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan karya ilmiah
ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan
berguna dalam penulisan ini. Penulis juga berharap karya tulis ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, Maret 2015
Habib Vio Nanda
DAFTAR ISI
ABSTRAK
iv
PRAKATA
iv
DAFTAR ISI
v
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
3
Prosedur Penelitian
3
HASIL
6
PEMBAHASAN
11
SIMPULAN DAN SARAN
14
Simpulan
14
Saran
14
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
17
RIWAYAT HIDUP
24
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung)
Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering)
Kuantitas dan kemurnian DNA daun padi
Tanaman yang dapat pulih setelah perlakuan cekaman kekeringan
Tinggi tanaman padi IR64 transgenik generasi T3
Umur panen padi IR64 transgenik generasi T3
Bobot 100 butir gabah tanaman padi IR64 transgenik generasi T3
4
4
8
9
10
10
11
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon
Kecambah biji padi yang ditambah dengan larutan basta
Kecambah biji padi di dalam trey tanpa perlakuan basta
Tanaman padi sebelum perlakuan kekeringan
Tanaman padi setelah perlakuan kekeringan selama 8 hari
Amplifikasi PCR padi transgenik menggunakan primer gen hpt
Amplifikasi PCR padi transgenik menggunakan primer gen bar
2
6
7
7
8
9
10
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
Bagan alir penelitian
Benih tanaman padi transgenik IR64 yang tumbuh pada media basta
Benih tanaman padi transgenik IR64 yang tumbuh tanpa perlakuan basta
Seleksi tanaman padi yang toleran cekaman kekeringan dengan
Keberadaan gen hpt dan bar dalam tanaman transgenik IR64 generasi T3
Pengamatan karakter agronomi padi transgenik penanda aktivasi
17
18
19
20
22
23
PENDAHULUAN
Tanaman padi telah banyak digunakan sebagai model dalam penelitian
untuk mendapatkan padi yang memiliki sifat unggul. Hal ini dilakukan untuk
meningkatkan produksi ataupun kualitas padi seperti yang diinginkan
(Mulyaningsih et al. 2010). Salah satu sifat unggul yang diinginkan ada pada
tanaman padi yaitu toleransi tanaman terhadap cekaman abiotik, seperti
kekeringan. Kekeringan berpengaruh buruk terhadap pertumbuhan tanaman dan
dapat menurunkan produktivitas tanaman sebesar 70% (Bray et al. 2000). Dalam
kondisi kekurangan air, tanaman harus memiliki sistem pertahanan untuk
menanggapi cekaman kekeringan agar dapat bertahan hidup (Widyasari et al.
2004). Mengatasi masalah tersebut, penggunaan tanaman padi yang toleran
terhadap kekeringan merupakan langkah sederhana yang dapat dilakukan (Lestari
dan Mariska 2006). Tanaman padi yang toleran terhadap kekeringan ini dapat
dikembangkan melalui teknik rekayasa genetika. Proses isolasi dan identifikasi
terkait gen yang toleran terhadap kekeringan dapat dilakukan, sehingga fungsi dari
gen-gen tersebut dapat dipelajari lebih lanjut (Santoso et al. 2013).
Berdasarkan penjelasan Trijatmiko et al. (2005), bahwa proses identifikasi
terkait fungsi suatu gen dapat dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu forward
genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan dengan
menguji perbedaan fenotipe tanaman mutan dengan tipe liar atau melakukan
skrining populasi mutan over ekspresi dengan teknik penanda aktivasi (activation
tagging), selanjutnya dilakukan analisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian
dilanjutkan ke sekuen gennya. Pendekatan reverse genetics dilakukan dengan
berpedoman dari informasi sekuen gen yang telah diketahui (Sisharmini et al.
2009; Santoso et al. 2013).
Penelitian ini menggunakan sampel tanaman padi transgenik kultivar IR64
yang diketahui mengandung vektor penanda aktivasi. Penanda aktivasi adalah
potongan DNA yang dapat meningkatkan ekspresi gen-gen di daerah sekitar
insersi. Vektor penanda aktivasi berdasar transposon yang digunakan dalam
penelitian ini adalah pAc-DsATag-Bar-gosGFP (Gambar 1) (Trijatmiko et al.
2005). Vektor penanda aktivasi ini mengandung dua elemen. Elemen pertama,
yaitu elemen Ac (activator) yang mengkode enzim transposase di bawah kontrol
promotor Ac. Elemen kedua, yaitu elemen Ds (dissociation) berisi elemen 4x
enhancer dari promotor 35S CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) dan gen yang
menyandi ketahanan terhadap basta di bawah kendali promotor Ubiquitin
(Sisharmini 2009). Transposon Ac/Ds dapat diidentifikasi menggunakan gen hpt
dan gen bar. Gen hpt merupakan marka penyeleksi yang mengidentifikasi
keberadaan transposon Ac, sedangkan gen bar merupakan marka penyeleksi untuk
mengidentifikasi keberadaan transposon Ds (Marsch-Martinez et al. 2002).
Vektor penanda aktivasi yang menyisip ke dalam gen tanaman padi akan
meningkatkan aktivitas gen tanaman tersebut, sehingga ekspresi gen juga akan
meningkat (Marsch-Martinez et al. 2002). Peningkatan ekspresi ini yang nantinya
akan diidentifikasi untuk menentukan fungsi dari gen tersebut. Selanjutnya
tanaman ini bisa diseleksi berdasarkan sifat yang diinginkan, dalam hal ini bersifat
toleran kekeringan (Sisharmini et al. 2009).
2
Gambar 1
Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon
yang terdiri atas 2 elemen, yaitu Ac dan Ds.
Keterangan: Elemen Ac (bawah) dan elemen Ds
(atas) pada daerah T-DNAnya (Trijatmiko et al.
2005).
Populasi tanaman padi transgenik kultivar IR64 dibentuk dengan cara
mengintroduksikan konstruk penanda aktivasi transposon Ac/Ds ke dalam genom
tanaman padi IR64 dengan bantuan A. tumefaciens. Populasi tersebut sudah
diketahui positif mengandung konstruk penanda aktivasi, namun belum diketahui
perubahan karakternya akibat aktivasi dari sisipan konstruks tersebut. Karakter
agronomis suatu tanaman dapat diamati berdasarkan sifat yang tampak secara
visual. Identifikasi karakter agronomi dalam penelitian ini meliputi tinggi
tanaman, jumlah malai produktif, umur panen, dan bobot 100 butir (Sisharmini et
al. 2013). Populasi tanaman padi transgenik kultivar IR64 generasi T3
diindikasikan mengandung individu yang memiliki sifat beraneka ragam sebagai
akibat dari insersi transposon Ac/Ds (Marsch-Martinez et al. 2002).
Penelitian ini bertujuan mengevaluasi galur-galur tanaman padi transgenik
varietas IR64 generasi T3 yang mengandung elemen transposon penanda aktivasi
yang tahan terhadap cekaman kekeringan. Penelitian ini diharapkan dapat
memperoleh galur-galur yang toleran terhadap cekaman kekeringan sehingga
dapat langsung dikembangkan menjadi varietas tanaman baru. Selain itu, galurgalur tanaman padi toleran kekeringan dapat digunakan sebagai materi tanaman
untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen-gen yang terkait dengan toleransi
terhadap kekeringan.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah padi IR64
transgenik penanda aktivasi generasi T3 sebagai subjek penelitian, padi Gajah
Mungkur, IR20, Cabaccu, IR64 tipe liar sebagai pembanding, etanol 70%,
nitrogen cair, buffer ekstraksi (Tris-HCl pH 8.0, etilen diamin tetraasetat (EDTA),
natrium klorida (NaCl), setiltrimetil amonium bromide (CTAB), polivinil
3
pirolidon (PVP), dan merkaptoetanol), larutan TE (Tris-EDTA), DNA hasil PCR,
2x KAPA2G Fast, primer hpt dan bar, cetakan DNA, DMSO, ddH2O, bubuk
agarosa, Gel Red, loading dye, 1x bufer TAE, dan marker 1 kb (0.1 µg/µL).
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah microfuge, pipet mikro, neraca analitik,
autoklaf, vorteks, UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad, elektroforesis,
erlenmeyer, kertas aluminium, penangas air, microwave, gelas ukur, mesin PCR
Bio-Rad 100.
Prosedur Penelitian
Seleksi Benih Padi Menggunakan Larutan Basta (Santoso et al. 2013)
Sebanyak 30 galur padi transgenik dan kontrol, masing-masing 20 biji
dikecambahkan di dalam cawan petri berisi kertas saring yang selalu basah.
Setelah 3 hari, semua kecambah galur transgenik dan 5 kecambah kontrol
dipindahkan ke dalam cawan petri baru berisi kertas saring yang diberi larutan
basta dengan konsentrasi 200 mg/L sebanyak 10 mL. Pengujian ini dilakukan
untuk menyeleksi kecambah yang tahan terhadap basta dengan yang tidak tahan
terhadap basta. Kecambah yang tahan terhadap basta akan tumbuh, sedangkan
yang tidak tahan terhadap basta pertumbuhannya akan terhambat. Setelah 6 hari,
kecambah yang tumbuh dipindahkan kedalam pot yang berisi media tanah:pasir
dan pupuk (1:1:1).
Penumbuhan padi tanpa perlakuan basta (Santoso et al. 2013)
Varietas padi yang digunakan adalah varietas IR64 transgenik penanda
aktivasi generasi T3, yang memiliki gen mutan dari hasil transformasi transposon
Ac/Ds, serta kontrol yang digunakan adalah varietas IR64, cabacu, gajah mungkur,
dan IR20. Sebanyak 60 benih diambil dari tiap varietas. Benih di oven selama
semalam pada suhu 50 oC. Benih padi kemudian ditanam menggunakan tray
dengan media yang terdiri atas tanah, pasir, dan pupuk (1:1:1). Setiap lubang tray
berisi 5 benih padi. Benih tersebut disiram dengan air secukupnya pada pagi dan
sore hari hingga tumbuh tunas.
Perlakuan Toleransi Kekeringan (Santoso et al. 2013)
Padi dipindahkan ke media pot yang berisi tanah, pasir, dan pupuk (1:1:1) di
ditumbuhkan selama 3-4 minggu dengan disiram air sebanyak 50 mL pada pagi
dan sore hari. Kemudian diberikan perlakuan kekeringan selama 8 hari, dengan
cara tidak diberi air selama perlakuan. Selanjutnya dilakukan pengamatan
terhadap respon padi yang menunjukkan gejala daun layu dan daun mengering.
Setelah diperlakukan kekeringan, padi disiram sebanyak 50 mL air untuk proses
recovery (pemuliahan). Sampel padi yang mengalami recovery dibiarkan hidup
selama 2-3 minggu, agar dapat dilakukan isolasi DNA. Penilaian skor
penggulungan dan pengeringan daun dilakukan berdasarkan skor pengamatan
seperti yang dijelaskan pada Standard Evaluation System for Rice (IRRI 1996;
Silitonga et al. 2003) yang tertera pada Tabel 1 dan Tabel 2.
4
Tabel 1 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung
pada fase vegetatif)
Skor/Skala
0
3
5
7
9
Keterangan
Daun-daun sehat
Daun-daun melipat (sangat berbentuk huruf V)
Daun betul-betul kuncup (membentuk huruf U)
Ujung-ujung daun bersentuhan (bentuk O)
Daun menggulung ketat
Tabel 2 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering pada
fase vegetatif)
Skor/Skala
0
1
3
5
7
9
Keterangan
Tidak ada gejala
Ujung daun sedikit mengering
Ujung daun mengering sampai ¼ panjang dari semua daun
¼ sampai ½ dari semua daun betul-betul kering
Lebih dari 2/3 dari semua daun betul-betul kering
Tanaman mati
Isolasi DNA daun padi (Doyle & Doyle 1987)
Sampel yang digunakan untuk isolasi adalah daun padi mutan varietas IR64.
Daun padi dipanen dengan mengambil daun padi yang masih muda. Daun padi
kemudian dimasukkan ke dalam tabung effendorf yang telah diberi label dan
ditempatkan di dalam cool box. Daun padi yang sudah dipanen selanjutnya
digerus. Penggerusan dilakukan dengan merendam tabung effendorf yang berisi
daun padi dengan nitrogen cair supaya daun membeku, dan dihaluskan dengan
menggerus daun dengan sumpit di dalam tabung tersebut. Daun yang sudah halus
kemudian ditambah dengan buffer CTAB 1000 µL. Buffer CTAB dengan
kandungan garam yang tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel.
Tahap selanjutnya dilakukan proses inkubasi selama 15 menit di dalam
penangas air dengan suhu 65 oC. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan
kerja buffer ekstrak yang ditambahkan ke dalam sampel. Sebanyak 100 µL Naasetat dan 1000 µL larutan Chisam ditambahkan ke dalam suspensi, selanjutnya
dilakukan sentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Na-asetat adalah
senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk
senyawa kompleks dengan CTAB-potassium asetat-protein-debris sel. Suspensi
bagian atas kemudian dipisahkan ke dalam tabung baru yang telah diberi label. Ke
dalam tabung ditambahkan Na-asetat sebanyak 1/10 dan isopropanol sebanyak 2/3
dari rata-rata suspensi yang diambil dari hasil sentrifus. Penambahan isopropanol
yang berfungsi untuk pengendapan protein dan dilanjutkan proses presipitasi
DNA dengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai penghilang pengotor.
Larutan kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama
15 menit untuk mendapatkan DNA. Setelah itu dilakukan dekantasi dan
ditambahkan etanol 70% sebanyak 200 µL ke dalam tabung. Suspensi kemudian
disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan hasil
sentrifus dibuang dan tubung dikeringkan didalam oven selama ±5 menit. Setelah
itu ditambahkan TE-RNAse sebanyak 50 µL ke dalam tabung, selanjutnya di
inkubasi dengan suhu 37 oC selama 30 menit didalam inkubator.
5
Pengukuran kuantitas dan kemurnian DNA (Thermo Fisher Scientific 2009)
Ekstrak DNA padi hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan menggunakan
spektrofotometer nanodrop. Volume yang digunakan untuk pengukuran pada
nanodrop sebanyak 1 µL. Larutan blanko yang digunakan adalah buffer TE
sebanyak 1 µL. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 260 nm,
sedangkan untuk mengetahui kemurnian ekstrak DNA dilakukan dengan
menggunakan perbandingan absorbansi 260/280 (A260/280).
Kalibrasi nanodrop harus dilakukan sebelum digunakan untuk pengukuran
sampel DNA. Buffer TE sebanyak 1 µL ke dalam pedestal dan ditutup kembali.
Toolbar blank ditekan dan tunggu hingga tertulis masukkan sampel. Sampel
dimasukkan sebanyak 1 µL ke dalamnya dan tekan tombol F1. Tombol reports
diklik dan dilanjutkan dengan tombol exports, print, graph, dan print ke Microsoft
XPS document writer.
Menurut Brown (2001) DNA yang murni mempunyai nilai absorbansi 260
dibagi dengan nilai absorbansi 280 (A260/280) berkisar 1.8 hingga 2.0. Apabila
nilainya kurang dari 1.8 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan
protein dan untuk menghilangkannya ditambahkan proteinase. Apabila nilainya
lebih dari 2.0 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan RNA, dan
untuk menghilangkannya ditambahkan ribonuklease.
DNA yang telah diperoleh dari hasil isolasi dan telah dilakukan uji
kuantitatif selanjutnya diencerkan. Pengenceran yang dilakukan adalah
pengenceran 10 kali dan dibuat stok sebanyak 50 µL. Stok DNA yang diperoleh
diambil sebanyak 5 µL dan ditambahkan dengan Nuclease Free Water (NF)
sebanyak 45 µL ke dalam tube 0.5 mL.
Amplifikasi DNA menggunakan PCR (Sambrook et al. 2001)
Amplifikasi gen tanaman padi mutan yang toleran terhadap kekeringan
dilakukan dengan menggunakan primer hpt dan bar. Amplifikasi PCR dilakukan
pada volume total reaksi 10 µl yang mengandung 1 µl DNA genomik cetakan,
ddH2O sebanyak 2.5 µL, 5 µL 2X Kapa 2G, 0.5 µL sepasang primer spesifik
masing-masing dengan konsentrasi 5 µM, dan 0.5 µL DMSO.
Setiap reaksi dilakukan pada tabung mikro 200 µl. Reaksi amplifikasi
dilakukan dengan program sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 95 ºC
selama 3 menit sebanyak 1 siklus, dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri atas
denaturasi pada suhu 95 ºC selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 63ºC
selama 15 detik, pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 20 detik.
Pemanjangan primer terakhir selama 7 menit pada suhu 72 oC. Produk PCR
(amplikon) kemudian dielektroforesis dengan menggunakan gel agarosa.
Elektroforesis gel agarosa (Sambrook et al. 2001)
Elektroforesis DNA yang dilakukan mengacu pada metode Sambrook &
Russell (2001). Terlebih dahulu disiapkan 1% gel agarosa dengan 1x buffer TE.
Agarosa dipanaskan sampai mendidih lalu diamkan pada suhu ruang beberapa
detik. Saat suhu agarosa cukup dingin lalu dituangkan pada cetakan. Setelah gel
agarosa memadat kemudian dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang
berisi 1x buffer TE. Sebanyak 6 µl produk PCR dari masing-masing sampel
ditambahkan dengan 1 µl loading dye dan dicampur sempurna, kemudian
dimasukkan ke dalam sumur di dalam gel. Untuk menentukan ukuran dari produk
6
PCR disertakan juga DNA standar (1 kb) sebagai pembanding. Sampel
dielektroforesis dengan tegangan 95 volt selama kurang lebih 40 menit.
Analisis Karakter Agronomi (Sisharmini et al. 2013)
Analisis karakter agronomi ini dilakukan dengan mengamati tinggi tanaman,
bobot 100 butir, dan umur panen padi. Tinggi tanaman padi diukur mulai dari
pangkal batang di atas permukaan tanah hingga ujung daun tertinggi. Tinggi
tanaman padi ini dapat digolongkan ke dalam tiga golongan, yaitu tinggi (>130
cm), sedang (110-130 cm), dan rendah (