Fractination of anticancer protein from a marine fungus Xylaria psidii KT30 and their cytotoxicity against HeLa cell line

1

FRAKSINASI PROTEIN ANTIKANKER DARI
KAPANG LAUT Xylaria psidii KT30 DAN
SITOTOKSISITASNYA TERHADAP SEL HeLa

MITA GEBRIELLA INTHE

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

2

3

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Fraksinasi Protein
Antikanker dari Kapang Laut Xylaria psidii KT30 dan Sitotoksisitasnya Terhadap

Sel HeLa adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, November 2013
Mita Gebriella Inthe
NRP C351110161

4

5

RINGKASAN
MITA GEBRIELLA INTHE. Fraksinasi Protein Antikanker dari Kapang Laut
Xylaria psidii KT30 dan Sitotoksisitasnya Terhadap Sel HeLa. Dibimbing oleh
KUSTIARIYAH TARMAN dan MEGA SAFITHRI.

Kanker serviks merupakan kanker penyebab kematian kedua terbesar pada
wanita di Indonesia setelah kanker payudara. Salah satu upaya pengobatan kanker
dapat dilakukan dengan memanfaatkan senyawa dari bahan alam. Salah satu
mikroorganisme yang mempunyai potensi sebagai antikanker adalah kapang
endofit. Kapang endofit dari lingkungan laut dapat diisolasi dari rumput laut,
lamun, spons, dan mangrove. Xylaria psidii KT30 adalah kapang yang diisolasi
dari rumput laut dan dapat menghasilkan protein antikanker.
Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh fraksi protein ekstraseluler
dari kapang laut X. psidii KT30 dan menentukan sitotoksisitasnya terhadap
sel Chang dan sel HeLa. Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahapan. Tahap
pertama kultivasi kapang laut X. psidii KT30 menggunakan media Potato
Dextrose Agar (PDA) dan Potato Dextrose Broth (PDB) dan isolasi protein
kapang dengan metode pengendapan menggunakan ammonium sulfat 90%. Tahap
kedua uji toksisitas dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Tahap ketiga
fraksinasi protein dengan kromatografi DEAE Sephadex A-50 dan uji
sitotoksisitas pada sel Chang (ATCC CCL 13) dan sel HeLa (ATCC CCL 2).
Kapang laut X. psidii KT30 menghasilkan rendemen protein ekstraseluler
sebesar 0,090%. Nilai LC50 protein kasar 104,95 ppm. Fraksinasi protein kapang
laut Xylaria psidii KT30 menghasilkan lima puncak fraksi protein yang terdiri
dari fraksi I (tabung ke-2 sampai ke-12), fraksi II (tabung ke-13 sampai ke-49),

fraksi III (tabung ke-50 sampai ke-61), fraksi IV (tabung ke-62 sampai ke-72),
dan fraksi V (tabung ke-73 sampai ke-100). Penentuan bobot molekul protein
dengan SDS-PAGE pada fraksi terpilih didapatkan tiga band dengan bobot
molekul yaitu 23,99, 32,88, dan 37,30 kDa.
Hasil uji sitotoksisitas pada sel Chang menunjukkan bahwa protein kasar
dan protein fraksi terpilih (F3.1, F3.2, dan F4) aman terhadap sel normal dengan
inhibisi kurang dari 50%, sedangkan pada sel HeLa Nilai IC50 protein fraksi
terpilih terhadap sel kanker serviks (HeLa) pada penelitian ini tidak bisa
ditentukan karena pada konsentrasi terbesar (1080 μg/mL) tidak menghasilkan
% inhibisi lebih dari 50%. Ekstrak kasar protein kapang laut memiliki nilai
IC50 69,89 μg/mL. Morfologi sel Chang dan sel HeLa yang diamati
dibawah mikroskop menunjukkan bentuk sel Chang dan sel HeLa yang tanpa
perlakuan tampak melekat pada bagian permukaan tempat tumbuh sel, selain itu
sel juga masih berbentuk epithelial-like. Sel Chang dan sel HeLa yang telah
mendapat perlakuan dan mengalami inhibisi kurang dari 50% masih sama dengan
bentuk sel hidup, namun pada beberapa sel terlihat telah mengalami kerusakan.
Kata kunci : BSLT, kanker serviks, MTT assay, Xylaria psidii

6

SUMMARY
MITA GEBRIELLA INTHE. Fractination of anticancer protein from a marine
fungus Xylaria psidii KT30 and their cytotoxicity against HeLa cell line.
Supervised by KUSTIARIYAH TARMAN and MEGA SAFITHRI.

Cervical cancer is the most common death cause of cancer in Indonesia
after human breast cancer. One of the efforts of cancer treatment is the utilization
of natural product. Some microorganism have potential as anticancer such as
endophytic fungi. Endophytic fungi from the marine habitats can be isolated from
seaweeds, seagrasses, sponges, and mangroves. Xylaria psidii KT30 is fungus
from seaweed that can produce anticancer protein.
This study aimed to obtain protein fraction from Xylaria psidii KT30 and
determine their toxicity against Chang and HeLa cells. The research was carried
out in 3 stages. Phase 1 Xylaria psidii KT30 was cultivated in Potato Dextrose
Agar (PDA) and Potato Dextrose Broth (PDB) medium, the metabolites was
extracted using 90% of ammonium sulfate. Phase 2 the toxicity was determined
by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Phase 3 was the final stage, the
fractionation process was conducted using DEAE Sephadex A-50 column
chromatography and cytotoxic assay using Chang (ATCC CCL 13) and HeLa
(ATCC CCL 2) cells.

Xylaria psidii KT30 yielded 0,090% of extracellular protein. The results
revealed that LC50 of protein extract was 104,95 ppm. Fractionation of protein
produced five protein fraction groups comprised of fraction I (2-12), fraction II
(13-49), fraction III (50-61), fraction IV (62-72), and fraction V (73-100). Based
on the results of SDS-PAGE, the molecular weight of selected fractions were
23,99; 32,88 and 37,30 kDa.
Cytotoxicity assay results in Chang cells showed that the crude extract and
fractions of selected proteins (F3.1, F3.2, and F4) was not active against normal
cells with inhibition less than 50%, while in IC50 value of HeLa cell protein
fractions F3.1, F3.2 and F4 against cervical cancer cells (HeLa) in this study could
not be determined because in highest concentration (1080 mg/mL) did not
produce % inhibition more than 50% of the HeLa cells. The results revealed that
IC50 of the crude extract proteins of marine fungus was 69,89 μg/mL.
Keywords: BSLT, cervical cancer, MTT assay, Xylaria psidii

7

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

8

9

FRAKSINASI PROTEIN ANTIKANKER DARI
KAPANG LAUT Xylaria psidii KT30 DAN
SITOTOKSISITASNYA TERHADAP SEL HeLa

MITA GEBRIELLA INTHE

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

10

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis: Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS

11

Judul Tesis
Nama
NIM

: Fraksinasi Protein Antikanker dari Kapang Laut

Xylaria psidii KT30 dan Sitotoksisitasnya Terhadap Sel Hela
: Mita Gebriella Inthe
: C351110161

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi
Ketua

Dr Mega Safithri, SSi MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Tati Nurhayati, SPi MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 30 Oktober 2013

Tanggal Lulus:

12

13

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas
segala rahmat dan karunia-Nya sehingga tesis dengan judul “Fraksinasi Protein
Antikanker dari Kapang Laut Xylaria psidii KT30 dan Sitotoksisitasnya
Terhadap Sel HeLa” ini dapat diselesaikan.
Kesuksesan penulis mengikuti pendidikan di Sekolah Pascasarjana IPB ini
tidak lepas dari dukungan berbagai pihak. Penulis menyampaikan banyak terima

kasih yang setulusnya kepada:
1

Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi selaku ketua komisi pembimbing dan
Dr Mega Safithri, SSi MSi. sebagai anggota komisi pembimbing atas
kesediaan waktu untuk membimbing, memberikan arahan dan masukan
selama penyusunan tesis ini.

2

Dr Tati Nurhayati, SPi MSi selaku Ketua Program Studi Teknologi Hasil
Perairan.

3

Bapak dan Ibu staf pengajar, staf administrasi dan laboran Program Studi
Teknologi Hasil Perairan yang telah banyak membantu dan kerjasamanya
yang baik selama penulis menempuh studi.

4

Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas Beasiswa Pendidikan
yang diberikan selama penulis kuliah dan Menteri Riset dan Teknologi yang
telah mendanai penelitian penulis melalui Program Insentif Riset Sinas
(RD-2013-0552)

5

Keluarga besar penulis, papa, mama, Desryani, Dean Anugrah serta Sandro
Takalalumang atas motivasi, doa dan semangat selama penulis menempuh
studi.

6

Teman-teman S2 THP 2011, 2010 dan 2012 atas kerjasama yang baik selama
studi.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Semoga

karya ilmiah ini membawa manfaat bagi seluruh civitas IPB khususnya dan
masyarakat Indonesia umumnya.
Bogor, November 2013
Mita Gebriella Inthe

14

15

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

x

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
2
2
2

2 FRAKSINASI PROTEIN ANTIKANKER KAPANG LAUT
Xylaria psidii KT30
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan

3
4
7
12

3 SITOTOKSISITAS PROTEIN KAPANG LAUT Xylaria psidii
KT30 TERHADAP SEL KANKER HeLa
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan

13
14
16
20

4 PEMBAHASAN UMUM
Simpulan dan Saran

20
22

DAFTAR PUSTAKA

23

LAMPIRAN

29

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

43

16

DAFTAR TABEL
1 Komposisi gel penahan dan pemisah SDS-PAGE
2 Hasil uji BSLT protein kasar kapang laut Xylaria psidii KT30
3 Persentase rendemen protein fraksi terpilih kapang laut X. psidii
KT30
4 Data hasil uji sitotoksisitas protein kasar kapang laut X. psidii
KT30 terhadap sel HeLa

6
8
11
19

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Diagram alir tahapan penelitian
Kapang laut Xylaria psidii KT30 dalam media padat PDA
Kapang laut Xylaria psidii KT30 dalam media cair PDB
Hasil fraksinasi protein kapang laut Xylaria psidii
KT30 menggunakan kromatografi kolom DEAE Sephadex A-50
Hasil SDS-PAGE
Perlakuan konsentrasi protein terhadap sel Chang
Perlakuan konsentrasi protein terhadap sel HeLa
Morfologi sel Chang
Morfologi sel HeLa

5
8
8
11
12
17
18
20
20

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Data rendemen pelet kapang endofit Xylaria psidii KT30
Data hasil uji senyawa bioaktif pada sel Chang
Data hasil uji senyawa bioaktif pada sel HeLa
Contoh perhitungan penentuan LC50
Tabel analisis probit
Morfologi sel Chang dan sel HeLa

30
31
34
36
38
38

1

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Biota laut merupakan kekayaan alam yang sangat melimpah. Berbagai
upaya telah dilakukan manusia untuk mengetahui bahan atau senyawa yang
terkandung dalam biota laut. Upaya ini menunjukkan hasil dengan adanya
kandungan senyawa bioaktif baru (novel compounds) yang tidak ditemukan pada
biota darat. Sejak tahun 1970-an, perhatian mulai tertuju pada penemuan
obat-obatan dari laut. Sebagai gambaran, lebih dari 10.000 senyawa bioaktif telah
berhasil diisolasi dari biota laut dan sekitar 300 paten dari senyawa tersebut telah
berhasil dipublikasi selama kurun waktu 30 tahun (1969-1999) (Yan 2004).
Salah satu mikroorganisme sumber utama metabolit sekunder adalah kapang
endofit (Strobel dan Daisy 2003). Saat ini, kapang endofit dengan keragaman
metabolit serta bioaktivitasnya yang tinggi sangat menarik untuk diteliti. Beberapa
metabolit kapang endofit menunjukkan aktivitas antibakteri, antifungi, hormon
pertumbuhan tanaman, dan insektisida (Tan dan Zou 2001). Metabolit sekunder
dari isolat kapang endofit dapat pula digunakan sebagai obat antikanker dan
autoimun (Hasan et al. 2007). Salah satu kapang yang memiliki aktivitas biologis
adalah Xylaria sp. Metabolit sekunder dari isolat kapang endofit Xylaria sp. dapat
digunakan sebagai obat antikanker dan autoimun (Paulus
et al. 2006;
Hasan et al. 2007; Romero et al. 2008; Xu et al. 2008; Pongcharoen et al. 2008;
Chen et al. 2009; Silva et al. 2010; Yin et al. 2011; Wu 2011; Song et al. 2012).
Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan sebagai produk farmasi
antikanker harus diujikan terlebih dahulu dengan uji sitotoksik. Uji sitotoksik
merupakan salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan
senyawa yang bersifat toksik pada sel (Kurnijasanti et al. 2008). Penelitian
Tarman et al. (2011) menunjukkan bahwa 5 dari 11 isolat kapang endofit yang
diisolasi dari makroalga, kayu, dan moluska, memiliki potensi sebagai
sumber bahan bioaktif. Hasil ekstraksi dari Xylaria psidii (KT30) dan
Mycelium sterilium (KT31) menunjukkan aktivitas antibakteri dan sitotoksik
tetapi dalam aktivitas minor (Tarman et al. 2011). Setelah tahap praskrining
terhadap senyawa antikanker, maka perlu dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas
menggunakan sel kanker secara in vitro.
Diantara jenis kanker yang ada, kanker serviks (leher rahim) merupakan
kanker yang menempati posisi pertama diantara sepuluh kanker primer yang
diderita wanita di Indonesia dengan presentase yang besar yaitu 28,66%
(Wijaya 2011). Sel kanker leher rahim (sel HeLa) terjadi akibat infeksi
Human Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan
sel leher rahim normal. Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui
mengekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Kedua onkogen tersebut
merupakan protein yang dapat menghambat ekspresi gen p53 sebagai gen penekan
kanker. Pada peristiwa ini onkogen lebih tinggi dibandingkan p53 sehingga
proliferasi sel kanker menjadi tidak terkendali (Prayitno 2005; Shoeb 2006;
Michael dan Doherty 2005).

2

Berbagai alternatif dilakukan untuk pengobatan kanker seperti pembedahan
atau operasi, radiasi, dan kemoterapi. Perbedaan pemberian pengobatan sangat
tergantung pada stadium kanker, jenisnya, dan kondisi umum penderita itu
sendiri. Namun, dalam prosesnya setiap pengobatan yang dilakukan memiliki efek
samping yang dirasakan oleh penderita kanker serviks, misalnya terjadinya
penurunan sel-sel darah (akan kembali normal sekitar seminggu kemudian),
infeksi (ditandai dengan demam, rasa panas saat buang air kecil, menggigil dan
luka yang memerah, bengkak, dan rasa hangat), anemia, pendarahan seperti
mimisan, rambut rontok, kulit gatal dan kering, mual dan muntah, dehidrasi dan
tekanan darah rendah, sembelit atau konstipasi, diare, dan gangguan syaraf
(Anica et al. 2011).
Sampai sekarang belum ditemukan obat yang memenuhi kriteria terapi yang
optimal terhadap para penderitanya, sehingga perlu dikembangkan obat baru yang
mempunyai efek terapi yang baik (Heti 2009). Xylaria psidii KT30 adalah salah
satu jenis kapang yang dapat menghasilkan protein antikanker, akan tetapi fraksi
aktif dari protein antikanker tersebut serta sitotoksisitasnya belum diketahui.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan fraksi aktif dan
menentukan sitotoksisitas protein kapang laut Xylaria psidii KT30 terhadap sel
Chang dan sel HeLa.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah sebagai informasi ilmiah untuk pengembangan
farmasi obat antikanker baru dan pengembangan komoditas hasil perairan
khususnya untuk jenis kapang laut.

Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah:
1 Melakukan fraksinasi protein antikanker yang terdiri dari kultivasi, isolasi
protein kasar, purifikasi dengan kromatografi penukar ion, dan penentuan
bobot molekul dengan SDS-PAGE dari kapang laut Xylaria psidii KT30.
2 Melakukan uji toksisitas protein kasar dengan metode BSLT dan uji
sitotoksisitas protein kapang laut Xylaria psidii KT30 terhadap sel Chang dan
sel HeLa.

3

2 FRAKSINASI PROTEIN ANTIKANKER KAPANG LAUT
Xylaria psidii KT30

Pendahuluan

Latar belakang
Indonesia dikenal sebagai negara bahari dengan luas 75% berupa lautan,
memiliki kekayaan yang melimpah sumber daya hayati. Sumber daya hayati laut
terdiri dari tumbuhan misalnya alga serta hewan misalnya ikan, moluska, karang
lunak, spons, ekinodermata, askidin dan tunikata. Beberapa jenis hewan tertentu
merupakan sumber vitamin, protein dan mineral. Selain hewan dan tumbuhan air,
mikroorganisme laut juga dilaporkan menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat
digunakan dalam bidang farmasi (Ma’at 2003).
Kecenderungan pemakaian bahan alam terutama tumbuhan, hewan, dan
mikroorganisme sebagai obat-obatan semakin meningkat, karena mahalnya obat
sintetik dan berbagai efek sampingnya yang merugikan. Salah satu
mikroorganisme yang berpotensi untuk dimanfaatkan adalah kapang laut.
Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa tanaman menghasilkan senyawa
aktif yang berkhasiat sebagai obat. Senyawa aktif yang dihasilkan diantaranya
adalah protein bioaktif, yang biasanya digunakan sebagai protein pertahanan bagi
tanaman inangnya (Cragg dan Newman 2009)
Protein bioaktif menarik perhatian para peneliti karena dapat dikembangkan
potensinya sebagai senyawa toksik pada imunotoksin. Protein dikonjugasikan
dengan antibodi untuk mengenali sel target sehingga tidak menyerang sel lainnya.
Imunotoksin digunakan untuk perlakuan penyakit pada manusia misalnya kanker,
AIDS, dan penyakit generatif (Minami et al.1992).
Penyakit kanker merupakan penyakit yang menjadi salah satu ancaman
utama terhadap kesehatan karena merupakan penyebab kematian kedua setelah
penyakit jantung. Setiap tahunnya sekitar 7,6 juta orang di seluruh dunia
meninggal karena kanker. Kanker serviks menduduki peringkat kedua yang
diderita oleh perempuan. Setiap tahunnya sekitar 53.000 kasus kanker serviks
terjadi, sebanyak 85% kasus kanker serviks berasal dari negara berkembang
(Asiancancer 2012). Menurut Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2008,
kanker serviks merupakan jenis kanker tertinggi kedua di Indonesia dengan
persentasi pasien rawat inap sebesar 10,3%. Yayasan Kanker Indonesia tahun
2006 menerangkan berdasarkan patologi di 13 center, kanker serviks menempati
urutan pertama dengan angka 16%, yang kemudian disusul dengan kanker
payudara 15%.
Xylaria psidii KT30 adalah salah satu jenis kapang yang dapat
menghasilkan protein antikanker (Tarman et al. 2011). Penelitian ini bertujuan
untuk mendapatkan fraksi aktif protein antikanker dari Xylaria psidii KT30.

4

Bahan dan Metode

Waktu dan tempat penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan September
2013. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan,
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut
Pertanian Bogor.
Bahan dan alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kapang laut
KT30 koleksi Kustiariyah Tarman. Bahan yang digunakan untuk kultur
kapang laut adalah media Potato Dextrose Broth (PDB), Potato Dextrose Agar
(PDA), NaCl, dan akuades. Bahan yang digunakan dalam proses
pengendapan protein adalah amonium sulfat dan Tris HCl 10 mM pH 7,4.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu
Erlenmeyer, timbangan digital MC Series, pH meter HM Digital, shaker Gemmy
VRN 360, hot plate MS 400, magnetic stirrer, kertas saring, spektrofotometer
CECIL series 2, inkubator MILLIPORE, cawan petri, dan sentrifus HIMAC CR
21 G.
Metode penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu kultivasi kapang laut
X. psidii KT30 menggunakan media PDA dan PDB, isolasi protein menggunakan
ammonium sulfat 90%, fraksinasi protein kasar dengan kromatografi penukar ion.
Tahap selanjutnya penentuan bobot molekul dengan SDS-PAGE dan dilanjutkan
dengan uji toksisitas dengan metode BSLT. Data dianalisis dengan metode
Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 kali ulangan dan jika berpengaruh
nyata maka diuji lanjut menggunakan uji Duncan (Steel and Torrie 1993). Secara
ringkas tahapan penelitian tersebut disajikan dalam bentuk diagram alir yang
disajikan pada Gambar 1.
Kultivasi kapang laut Xylaria psidii KT30
Kultur disiapkan dengan memindahkan kapang dari media padat (PDA) ke
media cair (PDB). Kapang dalam prekultur diinkubasi selama 7 hari. Prekultur
selanjutnya digunakan sebagai biakan. Sebanyak 5% prekultur dimasukkan ke
dalam tabung Erlenmeyer yang berisi 350 mL media PDB dan diinkubasi
selama sembilan hari dalam suhu ruang dengan bantuan shaker (120 rpm).

5

Kapang laut
X. psidii KT30

Kultivasi kapang laut

Penyaringan

Pelet

Supernatan

Pengendapan
(amonium sulfat 90%)

Sentrifuse
(10.000 rpm, 30menit)

Supernatan
kasar

Pelet

Uji toksisitas (Bioassay)
(BSLT)

Fraksinasi protein dengan
kromatografi penukar ion

Uji sitotoksisitas pada
sel Chang dan sel HeLa
Gambar 1 Diagram alir tahapan penelitian

6

Isolasi protein kapang laut Xylaria psidii KT30
Koleksi supernatan digunakan sebagai ekstrak kasar yang proteinnya
diendapkan menggunakan amonium sulfat yaitu 90% (Munandar 2013).
Penambahan amonium sulfat ke dalam tabung Erlenmeyer yang
berisi
supernatan dilakukan sedikit demi sedikit dengan selang waktu 5 menit
setiap penambahan amonium sulfat. Penyimpanan hasil pengendapan
dilakukan selama satu malam. Proses berikutnya adalah pengaturan pH hasil
pengendapan sampai pH 7,4 diikuti sentrifugasi supernatan hasil
pengendapan pada kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit. Koleksi pelet
hasil sentrifugasi didilusi menggunakan Tris HCL 10 Mm pH 7,4,
sedangkan supernatan diambil sebanyak 1,5 mL. Pelet hasil dilusi dan
supernatan yang dikoleksi digunakan untuk uji aktivitas antikanker.
Fraksinasi protein dengan kromatografi (Ustadi et al. 2005)
Tahap pemurnian pertama dilakukan dengan kromatografi penukar ion
dengan bahan pengelusi bufer B (bufer gel pemisah, Tris-HCl pH 7,4). Sebanyak
75 mL larutan TrisCl pH 7,4 dan 4 mL larutan SDS 10% (b/v) ditambahkan
dengan akuades hingga volume total 100 mL. Matriks menggunakan kolom
DEAE Sephadex A-50 (30.0 x 30.0 cm) dengan laju aliran 1 mL/menit. Jumlah
volume tiap fraksi ditampung sebanyak 5 mL. Masing-masing fraksi diuji
konsentrasi protein dengan spektrofotometer uv =280 nm dan diuji aktivitasnya
tiap fraksi dengan metode BSLT.
Penentuan bobot molekul dengan SDS-PAGE (Rosenberg 1996)
Metode SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis) yang
dikerjakan dalam penelitian ini menggunakan 4%
stacking gel dan 8% gel akrilamida. Metode ini menggunakan matriks dari gel
yang disusun oleh akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida yang berpolimerisasi
melalui mekanisme radikal bebas dengan bantuan katalisator N,N,N’N,tetramethylene-diamine (TEMED) dan inisiator ammonium persulfate (APS).
Komposisi pembuatan gel penahan dan pemisah SDS-PAGE dapat dilihat pada
Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi gel penahan dan pemisah SDS-PAGE
Komponen
Larutan stok akrilamida
Bufer gel pemisah
Bufer gel pengumpul
Akuades
Amonium persulfat
TEMED

Gel pemisah (8%)
2,66 mL
2,50 mL
3,18 mL
50,00 µL
5,00 µL

Gel penahan (4%)
0,67 mL
1,25 mL
3,00 mL
50,00 µL
5,00 µL

Konsentrasi akrilamida yang digunakan dalam analisis ini adalah 8% (b/v).
Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan perak. Deteksi SDS-PAGE dilakukan
dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur jarak migrasi
brompenol blue. Gel tersebut dicelup dan direndam dalam larutan fiksasi (25%
methanol + 12% asam asetat) selama 1 jam sambil digoyang konstan. Gel direndam
dalam 50% (v/v) etanol selama 2 x 20 menit. Larutannya diganti dengan larutan

7

pengembang kemudian dicuci dengan akuabidestilata. Gel yang telah dicuci
ditambahkan larutan perak nitrat selama 30 menit kemudian dicuci lagi dengan
akuabides 2 x 20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na2CO3 dan formal
dehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.
Uji
toksisitas
metode
Brine
Shrimp
Lethality
Test
(BSLT)
(Carballo et al. 2002)
Uji toksisitas dilakukan dengan larva Artemia salina sebagai hewan uji.
Mula-mula telur A. salina ditetaskan di dalam air laut di bawah lampu TL 20
watt. Setelah 48 jam telur menetas menjadi nauplii instar III/IV dan siap
digunakan sebagai hewan uji. Larva A. salina dimasukkan ke dalam vial yang
telah berisi larutan sampel dengan seri dosis 50, 100, 250, 500, 750 dan 1000
ppm dengan 3 kali ulangan. Semua vial diinkubasi pada suhu kamar selama 24
jam di bawah penerangan lampu TL 20 watt.
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan melihat jumlah
Artemia salina yang mati pada tiap konsentrasi. Penentuan harga LC50 dalam
µg/mL atau ppm dilakukan menggunakan analisis probit dengan program
MINITAB.
Hasil dan Pembahasan
Kultivasi kapang laut Xylaria psidii KT30
Kapang Xylaria psidii KT30 merupakan kapang endofit yang diisolasi dari
makroalga Kappaphycus alvarezii (Tarman 2011). Kapang laut yang digunakan
dalam penelitian ini diperoleh dari isolat yang ditumbuhkan dalam medium padat
PDA. Kapang tersebut diremajakan dan diinokulasikan pada media cair PDB.
Medium PDB merupakan medium yang sangat cocok untuk pertumbuhan kapang
karena terdapat banyak pati dan nitrogen yang berasal dari asam amino yang
terdapat pada kentang (Kumala dan Muhammad 2008).
Prekultur kapang diawali dengan kultivasi pada medium PDB 50 mL
sebagai masa adaptasi selama seminggu. Miselium kapang yang telah tumbh
dipindahkan pada medium PDB 350 mL serta ditambahkan NaCl 3% dan diaduk
dengan bantuan shaker selama sembilan hari dengan kecepatan 120 rpm.
Pertumbuhan kapang pada media padat terlihat dari benang-benang putih yang
mengelilingi keping inokulan. Miselium akan bertambah banyak dan mengikat
keping-keping tersebut menjadi suatu bentuk yang padat terjalin kuat oleh
hifa-hifa miselium.
Pertumbuhan kapang pada media cair ditandai dengan adanya miselium
yang berbentuk bulat dan berwarna putih yang melayang pada media. Hal ini
sesuai dengan Pratomo (2006) bahwa ketika ditumbuhkan dalam media PDB
miseliumnya akan tampak berwarna putih, lama-kelamaan warna miselium
berubah menjadi coklat muda sampai tua, sel-sel miselium biasanya panjang.
Protein target dalam penelitian ini adalah protein ekstraseluler, sehingga
diperlukan suatu proses pemisahan. Pemisahan miselium dari mediumnya harus
melalui suatu penyaringan sebab miselium tidak bisa diambil seperti perlakuan
pada butir (Gandjar et al. 2006). Proses penyaringan menghasilkan supernatan
kapang yang kemudian dimurnikan melalui proses pengendapan. Volume awal
kultur produksi adalah 350 mL. Volume panen yang diperoleh setelah tujuh hari
masa kultur sebesar 300 mL.

8

Biomassa tidak digunakan karena protein target selama masa pertumbuhan telah
disekresikan ke dalam medium pertumbuhan. Morfologi kapang X. psidii KT30
dalam media padat dan cair dapat dilihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.

Gambar 2 Kapang laut Xylaria psidii KT30 dalam media padat PDA

Gambar 3 Kapang laut Xylaria psidii KT30 dalam media cair PDB
Isolasi protein kapang laut Xylaria psidii KT30
Isolasi protein kapang laut pada penelitian ini menggunakan teknik
sentrifugasi dan melalui pengendapan. Teknik sentrifugasi digunakan untuk
memisahkan protein dengan sel kapang. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan
gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik pengendapan
menggunakan penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi 90%
(Munandar 2013).
Protein kasar hasil penyaringan kemudian dipresipitasi dengan
menggunakan amonium sulfat. Metode presipitasi dibagi menjadi 2 grup utama,
yakni (1) metode kelarutan protein dikurangi dan presipitasi dilakukan dengan
mengubah beberapa sifat fisika-kimia pelarut, misalnya pH, konstanta dielektrik,
kekuatan ionik, dan tersedianya air dan (2) Metode presipitasi protein yang
disebabkan oleh interaksi diantara protein dan agen presipitasi (Sivasankar 2005).
Rendemen yang dihasilkan untuk protein kasar adalah 0,090%.
Pengendapan (pemekatan) protein dengan amonium sulfat merupakan
metode yang sering digunakan karena amonium sulfat memiliki daya larut yang
tinggi di dalam air, relatif murah, dan kestabilan protein di dalam larutan
amonium sulfat dapat bertahan bertahun-tahun. Pemilihan amonium sulfat
didasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air dan
interaksi ionik protein dengan garam serta daya tolak menolak protein yang

9

bermuatan sama. Penambahan amonium sulfat pada konsentrasi kejenuhan
tertentu menyebabkan interaksi air pada protein tertentu menurun dan protein
akan saling berinteraksi, beragregrat dan akhirnya mengendap. Fenomena ini
dikenal sebagai salting out. Protein yang mengendap pada konsentrasi kejenuhan
amonium sulfat tinggi adalah protein dengan bobot molekul rendah
(Widyarti 2006).
Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan.
Molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin banyak yang
menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein
sehingga mengakibatkan protein saling berinteraksi kemudian mengendap
(Bisswanger 2004). Proses penyaringan menghasilkan supernatan kapang yang
kemudian dimurnikan melalui proses pengendapan. Supernatan yang dihasilkan
dari proses penyaringan adalah sebanyak 300 mL. Sebelum diendapkan,
supernatan disesuaikan pH-nya sampai pH 7,4. Hasil pengendapan disentrifugasi
untuk memisahkan antara ekstrak kasar dengan media.
Tingkat toksisitas (Bioassay) hasil pengendapan
Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan untuk produk
antikanker harus diujikan terlebih dahulu dengan uji toksisitas. Uji toksisitas
merupakan salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan
senyawa yang bersifat toksik pada sel (Kurnijasanti et al. 2008). Salah satu
metode uji toksisitas adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang digunakan
untuk praskrining terhadap senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor
(Widyastuti 2008). Hewan uji yang digunakan dalam BSLT adalah
Artemia salina L.
Tujuan utama tahapan ini adalah untuk mengetahui protein kasar yang
dihasilkan oleh kapang laut X. psidii KT30 yang paling berpotensi. Selain itu,
tujuannya adalah mengetahui konsentrasi yang dapat membunuh dari setengah
populasi Artemia salina. Nilai tersebut menggambarkan bioaktivitas metabolit
yang dihasilkan dari kapang laut X. psidii KT30. Semakin kecil nilai konsentrasi
yang dapat membunuh setengah populasi larva maka akan semakin tinggi
bioaktivitasnya, begitu pula sebaliknya. Data hasil uji BSLT protein kasar
kapang laut X. psidii KT30 disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Data hasil uji BSLT protein kasar kapang laut Xylaria psidii KT30
Konsentrasi
(ppm)
50
100
250
500
750
1000

Log
konsentrasi
1,69
2,00
2,39
2,69
2,87
3,00

Persen
mortalitas
40,00
46,66
66,66
73,33
80,00
90,00

Probit
4,75
4,90
5,41
5,61
5,84
6,28

LC50

104,95 ppm

Hasil uji toksisitas menggunakan protein kasar kapang laut
Xylaria psidii KT30 menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi protein kasar

10

akan menyebabkan semakin besarnya persentase kematian. Persamaan regresi
hubungan antara log konsentrasi dengan mortalita Artemia salina dari protein
kasar kapang laut Xylaria psidii KT30 yaitu Y= 1,094x + 2,789, Y menunjukkan
konsentrasi mortalitas, X menunjukkan log konsentrasi dan R menunjukkan
koefisien korelasi antara X dan Y. Persamaan regresi Y= 1,094x + 2,789
menunjukkan bahwa setiap penambahan konsentrasi sebanyak 1 log (5 ppm)
menyebabkan kenaikan mortalitas probit sebesar 1,094. Berdasarkan persamaan
tersebut diperoleh nilai koefisen korelasi (R2) sebesar 0,984.
Nilai LC50 adalah konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian 50%
populasi Artemia salina yang digunakan dalam penelitian. Nilai LC50 dapat
dihitung dengan menggunakan regresi linear. Nilai LC50 protein kasar kapang laut
Xylaria psidii KT30 yang dihasilkan dari perhitungan sebesar 104,95 ppm.
Menurut Meyer et al. (1982) suatu ekstrak tanaman dianggap sebagai bioaktif
apabila ekstrak tersebut memiliki nilai LC50 lebih kecil atau sama dengan
1.000 mg/L. Nilai tersebut menunjukkan bahwa protein kasar dari kapang laut
Xylaria psidii KT30 termasuk dalam kategori toksik. Beberapa hasil penelitian
terhadap senyawa bioaktif yang diuji dengan Artemia salina (BSLT)
menunjukkan adanya korelasi spesifik terhadap uji antikanker bila mempunyai
LC50 < 1.000 ppm.
Komponen toksik yang terdapat pada protein kasar jika diberikan pada
A. salina dapat menyebabkan kematian hewan tersebut. Artemia salina
merupakan pemakan bahan-bahan organik sehingga komponen-komponen dari
ekstrak yang akan terakumulasi terus menerus di dalam tubuh A. salina. Zat
tersebut akan masuk kemudian distribusikan dan ditranslokasi ke seluruh badan,
kadarnya akan meningkat seiring dengan waktu dan akan menyebabkan kematian
pada A. salina (Abatzopolulos et al. 2010).
Fraksinasi protein kapang laut Xylaria psidii KT30
Fraksinasi protein merupakan suatu langkah awal yang penting untuk
mendapatkan komponen biologis suatu protein dalam upaya memahami fungsi
biologisnya. Ada beberapa faktor yang harus diketahui sebelum melakukan
fraksinasi protein ataupun memisahkan suatu protein tunggal dari suatu campuran
protein antara lain berat molekul, muatan, serta sifat hidrofobiknya. Berdasarkan
faktor-faktor tersebut metode dalam purifikasi protein terbagi menjadi dua yakni
metode kromatografi dan non-kromatografi. Metode non-kromatografi dalam hal
ini antara lain elektroforesis, presipitasi, serta filtrasi membran (Sanagi 2001).
Penelitian ini menggunakan matriks DEAE Sephadex A-50. Matriks ini
termasuk dalam golongan fungsional diethylaminoethyl, terbuat dari dextran,
sejenis polisakarida. Dextran termasuk dalam golongan penukar ion yang lemah.
Kode A-50 adalah penukar ion dengan kapasitas 50, artinya jumlah 50 muatan
dan potensi muatannya per unit berat atau miliequivalen grup ion per milligram
berat kering matrik (Boyer 2000).
Hasil fraksinasi ekstrak protein kasar dari kapang laut Xylaria psidii KT30
yang dipisahkan kromatografi kolom DEAE Sephadex A-50 sampai 100 fraksi.
Hasil fraksinasi protein disajikan pada Gambar 4. Pengukuran kandungan protein
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm. Hal ini disebabkan
protein pada umumnya menyerap cahaya pada panjang gelombang 280 nm karena
adanya residu asam amino triptofan, fenilalanin, dan tirosin (Boyer 2000). Hasil

11

absorbansi menghasilkan lima puncak fraksi protein yang terdiri dari fraksi I
(tabung ke-2 sampai ke-12), fraksi II (tabung ke-13 sampai ke-49), fraksi III
(tabung ke-50 sampai ke-61), fraksi IV (tabung ke-62 sampai ke-72), dan fraksi V
(tabung ke-73 sampai ke-100).
I

Absorbansi 280 nm (U/mL)

0.12
0.1

III
0.08

II

0.06

IV

V

0.04
0.02
0
0

20

40

60

80

100

Nomor tabung

Gambar 4 Hasil fraksinasi protein kapang laut Xylaria psidii KT30 menggunakan
kromatografi kolom DEAE Sephadex A-50
Fraksi protein kapang laut X. psidii KT30 kemudian dikeringkan dengan
metode pengeringan beku (Freezedry) dan dihitung rendemennya. Fraksi yang
memiliki rendemen tertinggi adalah fraksi F3.1 (tabung ke-53), F3.2 (tabung
ke-60), dan F4 (tabung ke-69). Data hasil rendemen disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Persentase rendemen protein fraksi terpilih kapang laut X. psidii KT30
Hasil

Jumlah (%)

Fraksi F3.1

3,7

Fraksi F3.2

2,7

Fraksi F4

1,8

Penentuan bobot molekul dengan SDS-PAGE
Penentuan bobot molekul dilakukan menggunakan SDS-PAGE. Sampel
yang digunakan adalah protein kasar dan fraksi protein terpilih yaitu fraksi F3.1
(tabung ke-53), F3.2 (tabung ke-60), dan F4 (tabung ke-69). Fraksi protein
terpilih yang digunakan merupakan hasil fraksinasi yang memiliki nilai
absorbansi dan rendemen tertinggi (Tabel 3). Hasil analisis menggunakan
SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 5.

12

Gambar 5 Hasil SDS-PAGE ( M (marker), CE (protein kasar), F3.1 (tabung
ke-53), F3.2 (tabung ke-60), F4 (tabung ke-69) )
Hasil penentuan bobot molekul dapat dilihat dari Gambar 5 pada fraksi
protein terpilih F3.1, F3.2, dan F4 menghasilkan tiga band dengan bobot molekul
23,99; 32,8, dan 37,30 kDa. Hal ini menunjukkan bahwa isolasi dan purifikasi
yang dilakukan belum optimal, sehingga perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut
dengan metode yang lainnya. Berdasarkan bobot molekulnya, protein kapang laut
X. psidii KT30 termasuk dalam golongan protease (Barret et al. 2004). Protease
dari mikroorganisme memperlihatkan bobot molekul dari 18 kDa sampai 126 kDa
(Rao et al. 1998). Penelitian lain yang dilakukan oleh Hu et al. 2012 terhadap
kapang Xylaria hypoxylon menyatakan monomer protein terestimasi sebesar
43 kDa. Protease kapang X. psidii KT30 menunjukkan bobot molekul yang lebih
rendah dibandingkan dengan bobot molekul dari kapang Xylaria hypoxylon,
namun lebih tinggi dibandingkan protease dari jamur Pleurotus eryngii sebesar
11,8 kDa (Wang dan Ng 2001), Pleurotus citrinopileatus sebesar 18 kDa
(Cui et al. 2007), dan Helvella lacunosa sebesar 33,5 kDa (Zhang et al. 2010).
Berdasarkan penelitian yang telah dilaporkan sebelumnya, maka protease yang
dihasilkan dari kapang laut X. psidii KT30 menunjukkan jenis protein yang baru.
Simpulan
1 Protein kasar kapang laut Xylaria psidii KT30 dikategorikan senyawa toksik
dengan nilai LC50 104,9 ppm.
2 Penentuan bobot molekul dengan SDS-PAGE pada fraksi terpilih didapatkan
tiga band dengan bobot molekul yaitu 23,99; 32,88, dan 37,30 kDa.

13

3 SITOTOKSISITAS PROTEIN KAPANG LAUT
Xylaria psidii KT30 TERHADAP Sel Chang dan Sel HeLa

Pendahuluan

Latar belakang
Kanker leher rahim atau disebut juga kanker serviks adalah sejenis kanker
yang 99,7% disebabkan oleh human papilloma virus (HPV) onkogenik, yang
menyerang leher rahim. Jumlah kematian akibat kanker serviks di dunia
diperkirakan lebih dari 300.000 per tahun, dan banyak dari mereka yang
meninggal adalah ibu-ibu muda. Tingkat morbiditas kanker leher rahim di
Indonesia menempati posisi pertama dibandingkan dengan kanker yang lain
(Canavan dan Doshi 2000).
Kanker leher rahim terjadi jika sel-sel yang ada di daerah tersebut
membelah secara tak terkendali dan menjadi abnormal. Jika sel-sel tersebut terus
membelah, maka akan terbentuk suatu massa jaringan yang disebut tumor. Tumor
dapat bersifat jinak atau ganas. Jika tumor tersebut menjadi ganas, maka
keadaannya disebut sebagai kanker leher rahim (Lio 2006).
Pengobatan kanker yang umum dilakukan saat ini adalah dengan cara
kemoterapi. Kemoterapi adalah terapi kimia dengan menggunakan zat-zat
kemoterapi untuk menekan pertumbuhan kanker. Zat-zat kimia yang digunakan
dapat dari hasil sintesis kimia, semisintetik, fitokimia, bioaktif hewan dan dari
mikroorganisme (Taneja et al. 2005).
Metode kemoterapi dilakukan dengan cara memberikan obat dalam bentuk
senyawa kimia untuk membunuh sel-sel kanker dalam tubuh pasien. Kemoterapi
dapat diberikan melalui mulut atau injeksi, kadang-kadang dapat juga langsung
pada bagian tubuh yang terkena kanker. Kebanyakan kemoterapi diberikan secara
infus melalui pembuluh darah vena. Namun, teknik kemoterapi di samping
membunuh sel-sel kanker juga dapat mengakibatkan rusaknya sel-sel normal yang
kebetulan menyerap obat tersebut. Efek samping pengobatan ini cukup berat,
misalnya mual, muntah, rambut rontok, dan lain-lain (Anica et al. 2011).
Operasi bedah merupakan pilihan efektif untuk tipe kanker yang tidak
terikat erat pada jaringan tubuh lainnya, serta sel-sel kankernya terbungkus dalam
satu kesatuan. Namun, teknik pembedahan ini menjadi kurang menguntungkan
pada jenis kanker terbuka karena dapat meninggalkan sisa-sisa sel kanker yang
dapat tumbuh kembali di kemudian hari. Teknik operasi bedah juga tidak dapat
digunakan untuk jenis kanker yang sudah bermetastasis. Saat ini dengan mahalnya
obat kemoterapi sintetik dan meningkatnya kasus penyakit kanker maka
pengobatan kanker difokuskan pada komponen fitokimia dan bioaktif dari
mikroba dan hewan yang berpotensi menekan pertumbuhan sel normal atau reaksi
metabolik (Kumaran et al. 2009).
Sampai sekarang belum ditemukan obat yang memenuhi kriteria terapi yang
optimal terhadap para penderitanya, sehingga perlu dikembangkan obat baru yang
mempunyai efek terapi yang baik (Heti 2009). Xylaria psidii KT30 adalah salah

14

satu jenis kapang yang dapat menghasilkan protein antikanker. Sitotoksisitas
kapang laut X. psidii KT30 belum diketahui sehingga penelitian ini bertujuan
untuk menentukan sitotoksisitas protein kapang laut X. psidii KT30 terhadap sel
Chang (sel normal) dan sel HeLa.
Bahan dan Metode
Tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan
Teknologi Hasil Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian
Bogor, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut
Pertanian Bogor, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa
Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kapang laut
Xylaria psidii KT30. Pengujian sitotoksisitas digunakan bahan antara lain sel
kanker serviks (HeLa ATCC CCL 2), sel hati normal (Chang ATCC CCL 13),
Doxorubicin, Fetal Bovine Serum (FBS), Media Rosewall Park Memorial Institute
(RPMI) 1640, 3-(4-,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida
(MTT), larutan SDS 10%, HCl, kristal formazan, dan Phosphate Buffered Saline
(PBS). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi,
micropipet, well plate, inkubator MILLIPORE, microplate reader C-MAG
HS Series H24 dan sentrifus HIMAC CR 21 G.
Metode penelitian
Uji sitotoksisitas ekstrak protein kapang laut Xylaria psidii KT30 terhadap
sel Chang (Hseu et al. 2006)
Pembuatan media sel kanker (LCAG 2009)
Media DMEM bubuk dimasukkan ke dalam botol steril dan ditambahkan
3,7 gram NaHCO3, antibiotik penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian
dihomogenisasi dan ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi
1000 mL.
Persiapan kultur sel Chang (Li et al. 2011)
Sel Chang ditumbuhkan dalam flask yang berisi media DMEM. Sel yang
telah tumbuh (menempel pada dinding flask), kemudian medianya dibuang dan
sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan PBS. Enzim tripsin ditambahkan
sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan selama 5 menit, kemudian ditambahkan media
DMEM. Suspensi tersebut disentrifuse pada kecepatan 700g selama 5 menit.
Supernatan yang diperoleh dibuang dan pelet (sel Chang) yang diperoleh
ditambah dengan 5 mL DMEM. Jumlah sel Chang dihitung hingga
masing-masing sumur akan terisi 5.000 sel dalam 100 μL kultur sel Chang, dan

15

dimasukkan ke dalam tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut
diinkubasi selama 24 jam (over night) dalam inkubator CO2.
Sitotoksisitas protein
Kultur sel Chang yang telah diinkubasi selama 24 jam medianya dibuang,
kemudian dilanjutkan dengan penambahan sampel protein dari kapang laut
X. psidii KT30. Sampel protein yang diuji yaitu protein kasar dan protein fraksi
terpilih. Tahap awal perlakuan sampel protein adalah dengan membuat stok
larutan sampel dengan konsentrasi masing-masing 10.000 ppm, yang dibuat
dengan cara melarutkan 10 mg sampel protein dengan 50 μL DMSO, kemudian
ditambah dengan 950 μL DMEM. Masing-masing larutan sampel protein
diencerkan dengan menambahkan DMEM untuk mendapatkan konsentrasi akhir
pada microplate. Konsentrasi yang digunakan pada semua sampel adalah 7, 16,
32, 75, 150, 250, 500, dan 1.000 ppm. Sumur microplate yang berisi sel Chang
dari tahap sebelumnya (kultur sel Chang), ditambahkan 100 μL larutan sampel
protein yang uji di atas sebagai perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM
sebagai kontrol negatif. Campuran dalam microplate tersebut diinkubasi selama
48 jam dalam inkubator CO2.
Uji sitotoksisitas dengan MTT (CCRC 2000)
Sel Chang yang telah diinkubasi 48 jam, dimasukkan garam tetrazolium
5 mg/mL sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran menjadi kuning. Inkubasi
selama 4 jam pada inkubator CO2. Setelah diinkubasi dan telah terbentuk kristal
formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan
dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur. Warna larutan menjadi ungu. Nilai
absorban dari formazan yang terbentuk diukur dengan microplate reader pada
panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan dilakukan triplo.
Uji sitotoksisitas ekstrak protein kapang laut Xylaria psidii KT30 terhadap
sel HeLa (Hseu et al. 2006)
Pembuatan media sel kanker (LCAG 2009)
Media DMEM bubuk dimasukkan ke dalam botol steril dan ditambahkan
3,7 gram NaHCO3, antibiotik penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS, kemudian
dihomogenisasi dan ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi
1.000 mL.
Persiapan kultur sel HeLa (Li et al. 2011)
Sel HeLa ditumbuhkan dalam flask yang berisi media DMEM, setelah sel
tumbuh (menempel pada dasar flask), media dibuang dan sel HeLa dalam flask
dibilas dengan larutan PBS. Setelah itu, dimasukkan enzim tripsin sebanyak 5 mL,
lalu dinkubasikan selama 5 menit, dan kemudian ditambahkan media DMEM.
Suspensi tersebut disentrifuse pada kecepatan 700g selama 5 menit. Supernatan
yang diperoleh dibuang dan pellet (sel HeLa) yang diperoleh ditambah dengan
5 mL DMEM. Jumlah sel HeLa dihitung hingga masing-masing sumur akan terisi
5.000 unit sel dari 100 μL kultur sel HeLa, dan dimasukkan ke dalam tiap sumur
sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam (over night)
dalam inkubator CO2.

16

Sitotoksisitas protein
Kultur sel HeLa yang telah diinkubasi selama 24 jam medianya dibuang,
kemudian dilanjutkan dengan perlakuan ekstrak. Protein yang diuji meliputi
protein kasar dan protein fraksi terpilih. Tahap awal perlakuan sampel adalah
dengan membuat stok larutan sampel protein dengan konsentrasi masing-masing
10.000 ppm yang dibuat dengan cara melarutkan 10 mg sampel protein dengan
50 μL DMSO, kemudian ditambah dengan 950 μL DMEM. Masing-masing
larutan sampel protein kemudian diencerkan dengan menambahkan DMEM untuk
mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate. Konsentrasi yang digunakan
pada sampel yang diuji meliputi protein kasar, protein fraksi terpilih adalah 30,
60, 90, 180, 270, 360, 720, dan 1080 ppm. Sumur microplate yang berisi sel HeLa
dari tahap sebelumnya (kultur sel HeLa), ditambahkan 100 μL larutan sampel
protein yang uji di atas sebagai perlakuan dan ditambahkan 100 μL DMEM
sebagai kontrol negatif. Campuran dalam microplate tersebut diinkubasi selama
48 jam dalam inkubator CO2.
Uji sitotoksisitas dengan MTT (CCRC 2000)
Sel HeLa yang telah diinkubasi 48 jam, dimasukkan garam tetrazolium
5 mg/mL sebanyak 10 μL tiap sumur. Campuran garam tetrazolium yang
berwarna kuning diinkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2. Larutan ekstrak
dibuang setelah terbentuk kristal formazan. Kristal formazan yang terbentuk
dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur. Warna larutan menjadi
ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur dengan microplate
reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan dilakukan triplo.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai
absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi menjadi %
inhibisi dengan menggunakan rumus (Zhang et al. 2005):
% Inhibisi = A kontrol−A sampel x 100%.
A kontrol
Analisis statistik untuk membandingkan inhibisi tiap ekstrak dilakukan
dengan menggunakan One-Way ANOVA dengan SPSS. Jika terdapat perbedaan
yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program
SPSS.

Hasil dan Pembahasan
Sitotoksisitas protein kapang laut Xylaria psidii KT30 pada sel Chang
Uji sitotoksisitas dalam penelitian ini dilakukan untuk melihat seberapa
besar tingkat sitotoksisitas protein kasar, protein F3.1, F3.2, dan F4 kapang laut
Xylaria psidii KT30 terhadap sel normal (Chang) dan sel HeLa. Uji sitotoksisitas
awal dilakukan terhadap sel Chang. Sel Chang adalah kultur sel yang diisolasi
dari hati manusia.
Uji MTT merupakan uji yang sensitif, kuantitatif, dan terpercaya. Reaksi
MTT merupakan reaksi reduksi selular yang didasarkan pada pemecahan garam

17

tetrazolium MTT berwarna kuning menjadi kristal formazan berwarna biru
keungguan (Basmal et al. 2009). Metode perubahan warna tersebut digunakan
untuk mendeteksi adanya proliferasi sel. Sel yang mengalami proliferasi,
mitokondria akan menyerap MTT sehingga sel-sel tersebut akan berwarna ungu
akibat terbentuknya kristal tetrazolium (formazan). Konsentrasi formazan yang
berwarna ungu dapat ditentukan secara spektrofotometri visibel dan berbanding
lurus dengan jumlah sel hidup. Semakin besar absorbansi menunjukkan semakin
banyak jumlah sel yang hidup (Depamede et al. 2009).
80

a

70

a
a

60

Inhibisi ( %)

50
b

40
30

b

b

20
10

b
bc

0
-10
-20

b

7

b

b
b

b
c

dd

16

b cd

cdd

d dd

cdd

c
c cd
bcd
dd

32

75

150

250

500

1000

Doxo

Konsentrasi (ppm)
Huruf yang berbeda menunjukkan perbedaaan nyata (p