Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker dari Kapang Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut Kappaphycus alvarezii
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN
ANTIBAKTERI DAN ANTIKANKER DARI KAPANG
Xylaria psidii KT30 YANG DIISOLASI DARI RUMPUT LAUT
Kappaphycus alvarezii
ARIS MUNANDAR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA *
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Purifikasi dan
Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker dari Kapang Xylaria psidii
KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut Kappaphycus alvarezii” adalah benar
karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Aris Munandar
NIM C351110051
*
Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerjasama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerjasama yang terkait.
RINGKASAN
ARIS MUNANDAR. Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan
Antikanker dari Kapang Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut
Kappaphycus alvarezii. Dibimbing oleh KUSTIARIYAH TARMAN, TATI
NURHAYATI, dan APON ZAENAL MUSTOPA.
Protein kapang KT30 dapat menghambat bakteri Bacillus pumilus
BTCCB530, Listeria sp. BTCC B693, Salmonella typhi P2KIM Collection,
Staphylacoccus aureus P2KIM Collection, dan Pseudomonas sp. BTCC B675.
Protein tersebut juga mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel HeLa (kanker
serviks) dengan IC50 264,7 μg/mL. Aktivitas antibakteri dan antikanker protein
yang dihasilkan kapang KT30 masih belum optimal sehingga perlu dilakukan
upaya untuk meningkatkan aktivitasnya secara bertahap dari optimasi
pertumbuhan, purifikasi, dan karakterisasi protein tersebut.
Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap yaitu optimasi pertumbuhan kapang
KT30, purifikasi protein, uji aktivitas antikanker dan karakterisasi protein.
Optimasi pertumbuhan dilakukan dengan kombinasi perlakuan konsentrasi NaCl
dan waktu panen. Pengendapan dilakukan dengan saturasi 60%-90% pada setiap
100 mL supernatan kapang KT30. Kromatografi filtrasi gel dilakukan dengan fase
diam Sephadex G-50 dan fase gerak metanol 30%. Uji antibakteri dilakukan pada
fraksi amonium sulfat, supernatan, dan fraksi protein untuk mendapatkan fraksi
aktifnya. Uji antikanker terhadap sel Chang (sel hati) dan sel HeLa (kanker
serviks) dilakukan dengan metode MTT sitotoksik. Kadar protein diuji
menggunakan bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. Karakterisasi protein
kapang KT30 meliputi bobot molekul dan stabilitas terhadap suhu, pH, enzim,
inhibitor, dan detergen.
Pertumbuhan kapang KT30 paling optimum terdapat pada perlakuan NaCl
0% dengan waktu panen hari ke-15 dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap
bakteri Escherichia coli NBRC 14237 dan Bacillus subtilis BTCC 2530 dengan
diameter zona hambat sebesar 2,33 mm dan 1,3 mm. Pengendapan protein kapang
KT30 paling optimum terdapat pada konsentrasi amonium sulfat 90% dengan
rendemen sebesar 1,67 g/100 mL. Fraksi amonium sulfat tersebut memiliki
aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri E. coli dan B. subtilis dengan
diameter zona hambat sebesar 2 mm. Fraksi protein 11 dan 12 dari kapang KT30
merupakan fraksi aktif dengan aktivitas antibakteri tertinggi terhadap B. subtilis
dan E. coli sebesar 2 mm.
Hasil uji antikanker terhadap sel Chang dan sel HeLa menunjukkan bahwa
protein KT30 bersifat tidak toksik. Berdasarkan perhitungan, nilai IC50 fraksi
amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 adalah 670,86 dan 1451,68 µg/mL. Fraksi
amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 memiliki kadar protein sebesar 9,013 dan
0,604 mg/mL. Fraksi 11-12 kapang KT30 memiliki bobot molekul masing-masing
sebesar 23,42 kDa, 20,09 kDa, dan 14,33 kDa. Protein kapang KT30 stabil pada
suhu 60°C setelah pemanasan 30 menit dan kisaran pH 6 – 12, serta enzim pepsin,
tripsin, dan lisozim tapi tidak stabil terhadap inhibitor EDTA serta detergen
tween 20, SDS, dan triton X-100.
Kata kunci: antibakteri, antikanker, kapang, protein, Xylaria psidii
SUMMARY
ARIS MUNANDAR. Purification and Characterization of Antibacterial and
Anticancer Protein of Fungus Xylaria psidii KT30 Isolated from Kappaphycus
alvarezii. Supervised by KUSTIARIYAH TARMAN, TATI NURHAYATI, and
APON ZAENAL MUSTOPA.
The protein of an algicolous fungus KT30 inhibited Bacillus pumilus BTCC
B530, Listeria sp. BTCC B693, Salmonella typhi P2KIM Collection,
Staphylacoccus aureus P2KIM Collection, and Pseudomonas sp. BTCC B675.
The protein also showed anticancer activity against HeLa cell line (cervical
cancer) with IC50 264.7 μg/mL. Antibacterial and anticancer activities of protein
were produced by fungus KT30 still less optimal, therefore it is necessary to
improve the protein activity gradually from optimize of fungal growth,
purification and characterization of protein were performed.
This research was carried out in three steps, including optimize of fungal
growth, purification of protein, anticancer activity assay and characterization of
the protein. Optimise of growth was done with combination of NaCl concentration
and harvest day. Precipitation was done by with 60%-90% on each 100 mL
supernatant of fungus KT30. Gel chromatography filtration was done by
Sephadex G-50 with methanol 30% as mobile phase. Antibacterial activities was
done on fraction ammonium sulfat, supernatant, and protein fraction to get active
fraction. Anticancer against Chang cell line (liver cell) and HeLa cell line
(cervical cancer) was done by MTT cytotoxic method. Protein concentration assay
was done by bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. Characterization of
protein of fungus KT30 including molecular weight, and stability to temperature,
pH, enzyme, inhibitor, and detergent.
The optimal of fungal growth was obtained on NaCl 0% after 15 days
cultivation and showed antibacterial activity against Escherichia coli NBRC
14237 and Bacillus subtilis BTCC 2530 with diameter of clear zones were
2.33 mm and 1.3 mm. The optimal protein precipitation showed after 90%
saturation of ammonium sulfat with yield 1.67 g/100 mL. Fraction ammonium
sulfat showed the highest antibacterial activity against E. coli and B. subtilis with
diameter of clear zone 2 mm. Fractions 11 and 12 were the most active ones
against B. subtilis and E. coli i.e 2 mm.
Anticancer assay showed protein of fungus KT30 was not toxic against
Chang cell line and HeLa cell line. Based on calculation, IC50 value protein of
fraction ammonium sulfat 90% and fractions 11-12 were 670.86 and
1451.68 µg/mL. The protein concentration of fraction ammonium sulfat 90% and
fractions 11-12 were 9.013 and 0.604 mg/mL. Three bands were detected from the
fractions 11-12 indicated molecular weights of 23.42 kDa, 20.09 kDa, and
14.33 kDa. The proteins of the fungus were stable on 60oC after 30 minutes of
heating and pH 6-10. The proteins were stable on pepsin, trypsin, and lysozyme
but not stable to EDTA, detergent, tween 20 SDS, and Triton X-100.
Key words: antibacterial, anticancer, fungi, protein, Xylaria psidii
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN
ANTIBAKTERI DAN ANTIKANKER DARI KAPANG Xylaria
psidii KT30 YANG DIISOLASI DARI RUMPUT LAUT
Kappaphycus alvarezii
ARIS MUNANDAR
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Linawati Hardjito, MS
Judul Tesis
Nama
NIM
: Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker
dari Kapang Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput
Laut Kappaphycus alvarezii
: Aris Munandar
: C351110051
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi
Ketua
Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi
Anggota
Dr A. Zaenal Mustopa, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Tati Nurhayati, SPi, M.Si
Dr Ir Dahrul Syah, M.Sc, Agr
Tanggal Ujian: 20 Februari 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Shalawat serta salam
semoga tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW beserta keluarga dan para
sahabat-sahabatnya. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak
bulan Januari sampai September 2013 ialah protein bioaktif, dengan judul
Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker dari Kapang
Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut Kappaphycus alvarezii.
Penelitian ini merupakan bagian penelitian Pengembangan Protein Antikanker
dari Kapang Endofit Indigenous Laut Indonesia Xylaria psidii KT30 yang didanai
Kementrian Riset dan Teknologi melalui Program Insentif Riset Sinas (RD-2012718; RD-2013-0552). Penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ibu Dr rer nat Kustiariyah Tarman, SPi, MSi, Ibu Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi,
dan Bapak Apon Zaenal Mustopa, MSi yang telah mengarahkan selaku komisi
pembimbing
2. Ibu Dr Ir Linawati Hardjito, MS yang telah memberikan masukan selaku
penguji luar komisi
3. Istri (Siti Nuralipah) dan Anakku (Khadafi Darul Alifi Maqbulah) tercinta atas
do’a, kasih sayang, kesabaran, dan semangat yang diberikan
4. Bapak (Endang Supanda, SPd), Mamah (Popon Tursini, SPd), Abi (KH. Aan
Andi), Umi (Hj. Wawat Fatmawati), Adik-adikku (Nie, Ani, Tengku, Bakar,
Nawa, Ubah, dan Aulia) serta seluruh keluarga atas doa dan kasih sayangnya
(keluarga besar yang luar biasa)
5. Ibu Linda Sukmarini, MEng, Ibu Rifqiyah Nurumami, MS, Bapak Muhammad
Ridwan, SFarm, Bapak Erik Firdian, Bapak Kurniawan, Dwianty Putri
Meitasari, SPt, Hana Nurullita Prestisia, SPi, Fakhrul Umam, Yunita Sari, Ike
Rahmawati, SSi, Adyos Bobby Chandra, MSi, dan Aksar Chair Lages, SPi atas
bantuan dan masukannya selama penelitian
6. Yulia Oktavia, Made Suhandana, Aulia Andhikawati, Patmawati, Aidil
Fadlihamdi, dan Mita Gabriella Inthe atas bantuan dan masukannya selama
penelitian dan penulisan
7. Pascasarjana THP 2011 dan 2010 atas bantuan dan dukungannya selama ini
8. Rektor Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, Dekan Fakultas Pertanian, Ketua
Program Studi Perikanan, rekan-rekan di Fakultas Pertanian atas dukungannya,
dan seluruh pihak yang telah membantu selama penelitian.
Semoga penulisan karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan
seluruh pihak.
Bogor, Februari 2014
Aris Munandar
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ...................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
x
1 PENDAHULUAN ..............................................................................
Latar Belakang ....................................................................................
Perumusan Masalah.............................................................................
Tujuan dan Manfaat Penelitian ............................................................
1
1
2
3
2 OPTIMASI PERTUMBUHAN DAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI
KAPANG Xylaria psidii KT30 ............................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan .............................................................................................
4
4
5
7
8
3 PURIFIKASI PROTEIN ANTIBAKTERI DARI KAPANG Xylaria
psidii KT30 .........................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan .............................................................................................
10
10
11
12
14
4 KARAKTERISASI DAN AKTIVITAS PROTEIN ANTIKANKER DARI
KAPANG Xylaria psidii KT30 ................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan .............................................................................................
15
15
15
18
23
5 PEMBAHASAN UMUM .....................................................................
24
6 SIMPULAN UMUM DAN SARAN .....................................................
Simpulan Umum .................................................................................
Saran ...................................................................................................
27
27
27
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
28
DAFTAR TABEL
2.1 Komposisi bahan dan estimasi jumlah bakteri pada standar McFarland ......
3.1 Rendemen protein fraksi amonium sulfat kapang X. psidii KT30
pada saturasi berbeda ........................................................................
4.1 Pembuatan larutan standar BSA dengan konsentrasi 20-2000 µg/mL
4.2 Konsentrasi separating dan stacking gel ............................................
4.3 Kadar protein kapang X. psidii KT30.................................................
4.4 Stabilitas protein kapang X. psidii KT30 pda suhu, pH, detergen,
inhibitor, dan enzim ..........................................................................
6
12
17
17
20
22
DAFTAR GAMBAR
1 Kerangka pemikiran ...........................................................................
2.1 Biomassa kapang Xylaria psidii KT30 yang ditumbuhkan pada media
dengan salinitas berbeda ....................................................................
2.2 Aktivitas antibakteri X. psidii KT30 yang dikultur pada salinitas
berbeda .............................................................................................
3.1 Aktivitas antibakteri fraksi amonium sulfat dan supernatan kapang
X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda ........................................
3.2 Aktivitas antibakteri fraksi protein kapang X. psidii KT30 terhadap
bakteri patogen..................................................................................
4.1 Sel Chang dan HeLa pada uji antikanker ............................................
4.2 Bobot molekul protein kapang Xylaria psidii KT30 ............................
5.1 Pertumbuhan kapang Xylaria psidii KT30 pada media berbeda ..........
5.2 Protein fraksi amonium sulfat kapang Xylaria psidii KT30 .................
3
7
9
13
14
19
21
24
25
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media PDA ........................................................................
2 Komposisi media PDB ........................................................................
3 Hasil uji statistik interaksi perlakuan konsentrasi NaCl dan waktu
panen...................................................................................................
4 Hasil uji statistik perbedaan amonium sulfat ........................................
5 Perhitungan nilai IC50 ..........................................................................
6 Kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA) .....................................
7 Perhitungan bobot molekul..................................................................
8 Aktivitas antibakteri kapang KT30 ......................................................
9 Perhitungan konsentrasi per disc .........................................................
33
33
33
34
35
35
36
36
37
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Frekuensi infeksi yang disebabkan oleh mikroorganisme patogen di dunia
semakin meningkat dan menjadi penyebab kematian terutama di negara
berkembang (Khan et al. 2007; Mukhtar dan Ghori 2012). Agen antimikroba telah
banyak ditemukan, tetapi mikroorganisme patogen menjadi semakin resisten.
Menurut Kwong et al. (2010) agen infeksi memiliki potensi menginfeksi manusia
pada bagian yang berbeda-beda. Bakteri Streptococcus pneumonia menjadi
penyebab penyakit tertinggi diikuti oleh Escherichia coli dan Staphylacoccus
aureus. Secara umum, infeksi bakteri pada perempuan jumlahnya lebih tinggi
dibandingkan laki-laki. Selain infeksi mikroorganisme patogen, jenis penyakit
yang semakin meningkat di dunia adalah kanker.
Penderita kanker di dunia pada tahun 2008 mencapai 12,662 juta dan
7,564 juta diantaranya meninggal dunia. Jenis kanker yang menyebabkan
tingginya angka kematian pada perempuan adalah kanker leher rahim (serviks).
Kanker serviks di dunia mencapai 530 ribu kasus (4,2%) dan di wilayah Asia
Tenggara angka kematiannya mencapai 8,3% (Ferlay et al. 2010). Menurut WHO
(2008), 136 laki-laki dan 109 perempuan pada tiap 100 ribu populasi penduduk
di Indonesia meninggal dunia akibat kanker. Prevalensi penyakit kanker
di Indonesia mencapai 0,4% berdasarkan diagnosis oleh tenaga kesehatan. Pada
tahun 2004, kasus kanker serviks di Indonesia mencapai 3.818 (13%), dan 193
diantaranya meninggal dunia (BPPK 2008).
Kanker merupakan penyakit dimana kontrol pertumbuhan hilang dari satu
atau lebih sel yang mengarah menjadi massa padat (Thurston 2006). Kanker
serviks disebabkan infeksi Human Papillomavirus (HPV) yang diawali dalam sel
pada permukaan leher rahim. Pengendalian penyakit kanker serviks, skrining, dan
pengobatan dilakukan berdasarkan prinsip-prinsip epidemiologik. Kebijakan
pengendalian penyakit kanker di Indonesia diperkuat dengan terbitnya keputusan
Menteri Kesehatan nomor 1163/Menkes/SK/X/2007 tentang kelompok kerja
pengendalian penyakit kanker serviks dan payudara. Deteksi lesi-kanker menjadi
kanker membutuhkan waktu sekitar 10 tahun sehingga dapat dilakukan
pencegahan menjadi kanker (Dwipoyono 2009).
Pencegahan penyakit yang disebabkan infeksi mikroorganisme patogen dan
kanker dapat dilakukan menggunakan bahan alam. Makro dan mikroorganisme
menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas biologis. Menurut
Soemiati (2009), sumber bahan alam dapat diperoleh dari biota laut misalnya
kapang laut endofit. Kapang laut endofit memiliki aktivitas antibakteri dan
antikanker sehingga dapat dijadikan sumber untuk bahan obat.
Kapang laut endofit memiliki aktivitas antibakteri berdasarkan laporan
beberapa hasil penelitian. Kapang endofit dari mangrove Penicillium
janthinellum, Aspergillus conicus, dan Phomopsis sp. dilaporkan memiliki
aktivitas antibakteri dengan zona hambat pada kisaran 7 – 27 mm (Bharathidasan
dan Panneerselvam 2011). Samuel et al. (2011) melaporkan kapang Geotrichum
candidum memiliki aktivitas antibakteri terhadap Micrococcus sp., Bacillus
subtilis, Vibrio cholera, E. coli, dan Pseudomonas putida. Preaustinoid A dan B
yang diisolasi dari kapang Penicillium sp. dilaporkan bersifat bakteriostatik
2
terhadap E. coli, Bacillus sp., Staphylacoccus aureus, dan Pseudomonas
aeruginosa (Selim et al. 2012).
Hasil penelitian beberapa tahun terakhir juga menunjukkan adanya aktivitas
antikanker dari kapang laut. Menurut Atalla et al. (2008) kapang Varicosporina
ramulosa menghasilkan senyawa ergosterol yang efektif menghambat 50% sel
kanker hati dan paru-paru pada konsentrasi 99,7 dan 74,9 μg/mL. Nursid et al.
(2010) melaporkan bahwa metabolit sekunder kapang MFW-01-08 dari ascidia
Aplidium longithorax memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara
T47D dengan nilai IC50 sebesar 92,6 μg/mL. Kapang Emericella nidulans
dilaporkan oleh Nursid et al. (2011) dapat memproduksi emestrin (C27H21N2S2)
yang juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan
nilai IC50 sebesar 1,8 μg/mL.
Kapang endofit Xylaria psidii KT30 diisolasi dari rumput laut Kappaphycus
alvarezii yang biasa dimanfaatkan sebagai penghasil karaginan. Kapang KT30
menghasilkan metabolit sekunder yang mempunyai aktivitas antibakteri dan
antikanker. Ekstrak etil asetat dari kapang KT30 memiliki aktivitas antibakteri
terhadap bakteri patogen pada manusia dan ikan. Kapang KT30 juga memiliki
aktivitas antikanker terhadap human bladder carcinoma cell line 5637 (ATCC
HTB-9) (kanker kandung kemih) dengan nilai IC50 sebesar 4 μg /mL (NaCl 0%)
dan 14 μg/mL (NaCl 3%) (Tarman et al. 2011). Menurut Tarman et al. (2012),
protein ekstraseluler yang diekstrak dari media kultur kapang KT30 juga memiliki
aktivitas antibakteri dan antikanker. Protein kapang KT30 dapat menghambat
bakteri Bacillus pumilus BTCC B530, Listeria sp. BTCC B693, Salmonella typhi
P2KIM Collection, Staphylacoccus aureus P2KIM Collection, dan
Pseudomonas sp. BTCC B675. Protein tersebut juga mempunyai aktivitas
antikanker terhadap sel HeLa (kanker serviks) dengan IC50 264,7 μg/mL.
Protein memiliki aktivitas biologis sehingga dapat dijadikan sumber bahan
obat alami. Protein tersebut berperan sebagai antibakteri, antifungal, dan
antikanker (Rodrigues et al. 2009; Zheng et al. 2010). Aktivitas antibakteri dan
antikanker protein yang dihasilkan kapang KT30 masih belum optimal sehingga
perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan aktivitas protein tersebut (Tarman
et al. 2012). Peningkatan aktivitas dari protein kapang KT30 dilakukan bertahap
mulai dari optimasi pertumbuhan, purifikasi, dan karakterisasi protein tersebut.
Perumusan Masalah
Agen antimikroba telah banyak ditemukan, tetapi mikroorganisme patogen
menjadi semakin resisten. Kanker serviks merupakan salah satu penyebab
kematian tertinggi pada perempuan. Obat antibakteri dan antikanker baru
diharapkan dapat mengatasi masalah tersebut, salah satu sumbernya adalah
kapang X. psidii. Kapang X. psidii KT30 dapat menghasilkan protein yang
memiliki aktivitas antibakteri dan antikanker terhadap sel HeLa, namun aktivitas
yang dihasilkan masih rendah. Protein KT30 memiliki aktivitas antibakteri
terhadap bakteri Gram-positif dan negatif dengan diameter zona hambat 1-2 mm.
Aktivitas antikanker protein KT30 terhadap sel HeLa memiliki nilai IC50 sebesar
264,7 μg/mL. Oleh karena itu, perlu dilakukan peningkatan aktivitas antibakteri
dan antikanker dari protein kapang KT30. Upaya peningkatan aktivitas diawali
dengan optimasi pertumbuhan kapang KT30 dalam memproduksi protein dengan
3
rendemen dan aktivitas yang tinggi. Protein yang dihasilkan kemudian dipurifikasi
untuk mendapatkan protein yang murni. Protein tersebut dikarakterisasi untuk
mengetahui sifatnya misal stabilitasnya terhadap suhu, pH, enzim, detergen,
inhibitor, dan bobot molekulnya. Protein tersebut diuji antibakteri dan antikanker
untuk mengetahui aktivitasnya. Perumusan masalah disajikan dalam kerangka
pemikiran pada Gambar 1.
Protein dari kapang
X.psidii
Resistensi
mikroorganisme
patogen
Infeksi
mikroorganisme dan
penyakit kanker
serviks
Kanker serviks
penyebab kematian
tertinggi
Optimasi produksi
protein X.psidii
Purifikasi dan
karakterisasi protein
X.psidii
Informasi kandidat
obat antibakteri dan
antikanker
Gambar 1 Kerangka pemikiran
Tujuan dan Manfaat Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah:
a. menentukan pertumbuhan optimum dan aktivitas antibakteri kapang
KT30
b. menentukan rendemen protein dan fraksi paling aktif
c. menentukan aktivitas antikanker dan karakter (bobot molekul dan
stabilitas) protein kapang KT30.
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk informasi kandidat obat
baru yang berasal dari produk alam hasil perairan.
4
2 OPTIMASI PERTUMBUHAN DAN AKTIVITAS
ANTIBAKTERI KAPANG Xylaria psidii KT30
Pendahuluan
Xylaria psidii KT30 merupakan kapang yang diisolasi dari rumput laut
Kappaphycus alvarezii BRKA-1 dari Desa Labuange, Kabupaten Barru, Sulawesi
Selatan. Kapang KT30 menghasilkan pigmen berwarna merah yang dikeluarkan
pada media berbeda dengan intensitas yang berbeda. Pigmen tersebut dapat
terdeteksi pada panjang gelombang 518 nm (Tarman 2011). Klasifikasi X. psidii
adalah sebagai berikut (Rodger et al. 1992):
Filum
: Ascomycota
Kelas
: Sordariomycetes
Ordo
: Xylariales
Famili
: Xylariaceae
Genus
: Xylaria
Spesies
: Xylaria psidii
Ekstrak etil asetat dari kapang KT30 memiliki aktivitas dalam menghambat
bakteri E. coli, B. subtilis, Pseudomonas aeruginosa, dan bakteri patogen pada
ikan contohnya Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida, dan Yersinia
ruckeri. Kapang KT30 juga memiliki aktivitas antikanker terhadap kanker
kandung kemih pada ekstrak etil asetat dari kultur air tawar dan laut (Tarman
et al. 2011).
Menurut Tarman et al. (2012) protein yang dihasilkan kapang KT30
memiliki aktivitas antibakteri dan antikanker. Aktivitas protein yang dihasilkan
kapang tersebut masih belum optimal. Hasil tersebut menunjukkan adanya potensi
protein dari kapang KT30 sebagai bahan obat terutama untuk antibakteri dan
antikanker terhadap kanker serviks. Mikroorganisme patogen menyebabkan
frekuensi infeksi di dunia semakin meningkat dan menjadi penyebab kematian
terutama di negara berkembang (Khan et al. 2007; Mukhtar dan Ghori 2012).
Kanker serviks merupakan salah satu jenis kanker yang menyebabkan kematian
tertinggi terutama perempuan. Menurut Maliya (2004) di negara berkembang
seperti Indonesia kematian yang disebabkan oleh kanker menduduki urutan atas
bersama penyakit kardiovaskuler. Menurut Dwipiyono (2009) insiden penyakit
kanker serviks di Indonesia terjadi pada ± 15/100.000 orang.
Peningkatan aktivitas dari protein kapang KT30 harus dilakukan mulai dari
tahap awal yaitu optimasi pertumbuhan. Hal tersebut harus dilakukan untuk
mengetahui kondisi optimum untuk pertumbuhan kapang KT30. Kondisi tersebut
ditunjukkan oleh biomassa dan aktivitas antibakteri kapang KT30. Pertumbuhan
kapang adalah pertambahan volume sel, spora atau konidia kapang berubah
menjadi miselium atau koloni. Pertumbuhan kapang sama seperti mikroorganisme
pada umumnya yang terbagi menjadi beberapa fase yaitu fase lag, akselerasi,
eksponensial, deselerasi, stasioner, dan kematian. Penentuan pertumbuhan kapang
dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain berat kering massa sel
(miselium), kadar total nitrogen dari massa sel, dan kadar total asam nukleat dari
massa sel (Gandjar et al. 2006). Tahap penelitian ini bertujuan untuk menentukan
pertumbuhan optimum dan aktivitas antibakteri kapang KT30.
5
Bahan dan Metode
Tahapan penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Januari - Maret 2013.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Protein Rekombinan, Vaksin, dan Sistem
Pengantaran Terarah, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bioteknologi,
Cibinong, Kabupaten Bogor.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat kapang X. psidii
KT30, Potato Dextrose Agar (PDA), Potato Dextrose Broth (PDB), Nutrient
Broth (NB), Nutrient Agar (NA), NaCl, E. coli, B. subtilis, dan larutan NaCl
0,85%. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH-meter (CyberScan
ph510), timbangan (CHQ-DJ1002B), otoklaf (ES-315), laminar flow (ESCO),
oven (Frolaibo SAS), petri, inkubator (NB-205V), dan orbital shaker (LIPI).
Kultur padat kapang KT30 (Gandjar et al. 2006)
Media yang digunakan untuk kultur padat adalah PDA (komposisi media
PDA disajikan pada Lampiran 1). Media PDA sebanyak 3,9 g dilarutkan hingga
100 mL, lalu disterilkan pada otoklaf (121oC, 20 menit). Media PDA yang sudah
steril dituang dalam cawan petri dan didiamkan hingga padat. Potongan hifa
kapang KT30 diambil dan dimasukkan dalam cawan petri. Kapang KT30
diinkubasi pada suhu ruang selama ± 3-4 hari.
Kultur cair kapang KT30 (Gandjar et al. 2006)
Media yang digunakan untuk kultur cair adalah PDB (komposisi media
PDA disajikan pada Lampiran 2). Media PDB sebanyak 2,4 g dilarutkan hingga
100 mL, lalu disterilkan dalam otoklaf. Potongan hifa kapang KT30 diambil dan
dimasukkan dalam media PDB. Kultur cair dilakukan pada media dengan volume
5 mL dan 25 mL. Kultur cair kapang KT30 diinkubasi pada suhu ruang dan
orbital shaker dengan kecepatan 120 rpm selama ± 3-4 hari.
Optimasi pertumbuhan kapang KT30 (Gandjar et al. 2006)
Media yang digunakan untuk optimasi pertumbuhan adalah PDB dengan
volume 50 mL. Kapang KT30 hasil kultur cair 25 mL disiapkan, hifa diambil dan
dimasukkan ke dalam media PDB. Kapang KT30 diinkubasi pada suhu ruang dan
orbital shaker dengan kecepatan 120 rpm.
Optimasi pertumbuhan dilakukan dengan kombinasi perlakuan konsentrasi
NaCl dan waktu panen. Konsentrasi NaCl yang digunakan pada media kultur
adalah 0%, 1%, dan 3%, sedangkan panen dilakukan setiap 3 hari selama 21 hari
(hari ke-3, 6, 9, 12, 15, 18, dan 21). Biomassa dan supernatan kapang KT30
dipisahkan dengan menggunakan kertas saring. Bobot biomassa ditimbang setelah
pengeringan dengan oven pada suhu 60oC selama 24 jam (Handajani dan Purwoko
2008). Bobot biomassa dihitung berdasarkan persamaan berikut:
Keterangan:
Bobot awal
Bobot akhir
Bobot biomassa = bobot akhir − bobot awal
: Bobot kertas saring
: Bobot biomassa kering dan kertas saring
Supernatan diambil 1 mL dalam tube dan diuji antibakteri dengan metode
difusi agar (Lay 1994). Konsentrasi supernatan yang digunakan untuk uji
6
antibakteri adalah 114,31 μg/disc. kontrol positif yang digunakan adalah
kloramfenikol dengan konsentrasi 30 μg/disc.
Uji aktivitas antibakteri (Lay 1994, Wooton 2013)
Bakteri yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri adalah Bacillus
subtilis BTCC 2530 dan Escherichia coli NBRC 14237. Pada inokulasi, bakteri
ditambahkan sebanyak 5 μL dari stok bakteri dalam 5 mL media NB (beef extract
0,3%, pepton 1%, NaCl 0,5%). Bakteri diinkubasi pada suhu 37oC dengan
kecepatan shaker 150 rpm selama ± 16 jam. Bakteri diencerkan dengan
menggunakan standar McFarland 2 (6 x 108 CFU/mL) dan diukur pada
spektrofotometri (600 nm).
Standar McFarland digunakan untuk melakukan perbandingan visual dari
densitas bakteri pada media. Standar McFarland dapat dibuat dari dua larutan
yaitu 1% barium klorida (BaCl2) encer dan 1% asam sulfat (H2SO4) encer dengan
komposisi sesuai dengan standar. Komposisi bahan dan estimasi jumlah bakteri
pada standar McFarland dapat dilihat pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Komposisi bahan dan estimasi jumlah bakteri pada standar McFarland
0,5
1
2
3
1% Barium klorida (mL)
0,05
0,1
0,2
0,3
1% Asam sulfat (mL)
9,95
9,9
9,8
9,7
Estimasi kepadatan bakteri x 108 CFU/mL
1,5
3
6
9
Bakteri yang sudah disesuaikan dengan standar McFarland ditambahkan
sebanyak 3 mL ke dalam 17 mL NA (beef extract 0,3%, pepton 1%, NaCl 0,5%,
dan bakto agar 2%), dan didiamkan hingga padat. Kertas cakram (diameter 6 mm)
yang sudah ditambahkan 20 μL sampel dimasukkan dalam media NA. Inkubasi
dilakukan pada suhu 37oC selama ±24 jam, kemudian zona hambat yang
dihasilkan diukur diameternya dalam mm, setelah dikurangi diameter kertas
cakram.
Analisis data
Rancangan yang digunakan untuk optimasi pertumbuhan adalah rancangan
acak lengkap (RAL) pola faktorial dengan 3 kali ulangan. Perlakuan terdiri dari 2
faktor percobaan yaitu konsentrasi NaCl dengan taraf 0%, 1%, 3% dan waktu
panen dengan taraf 3, 6, 9, 12, 15, 18, dan 21 hari. Menurut Mattjik (2002), model
umum RAL pola faktorial adalah:
Yijk = μ + Ai + Bj + (AB)ijk +∈ijk
Keterangan:
Yijk
: Respon pengaruh perlakuan faktor A pada taraf i dan perlakuan
faktor B pada taraf j ulangan ke-k
µ
: Pengaruh rata-rata umum
Ai
: Pengaruh perlakuan faktor A pada taraf i
Bj
: Pengaruh perlakuan faktor B pada taraf j
(AB)ij : Pengaruh interaksi faktor A pada taraf ke-i dengan perlakuan faktor
B ke-j
∈ ijk
: Pengaruh acak (galat percobaan)
7
Hasil dan Pembahasan
Optimasi pertumbuhan kapang X. psidii KT30 dilakukan pada konsentrasi
NaCl yang berbeda selama 21 hari. Pertumbuhan yang dihasilkan kapang KT30
memiliki perbedaan pada tiap perlakuan NaCl dan waktu panen. Perbedaan pada
tiap perlakuan ditunjukkan oleh bobot biomassa kapang KT30 yang berbeda.
Biomassa kapang KT30 yang ditumbuhkan pada media dengan salinitas yang
berbeda dapat dilihat pada Gambar 2.1. Kapang KT30 pada tiap perlakuan
mengalami fase pertumbuhan eksponensial sampai hari ke-6. Berdasarkan hasil
perhitungan menurut Jouncey and Ross (1982), laju pertumbuhan spesifik
(specific growth rate) paling tinggi terdapat pada perlakuan NaCl 0% yaitu
sebesar 64,62%. Laju pertumbuhan spesifik perlakuan NaCl 1% dan 3% masingmasing adalah 43,61% dan 59,17%. Perlakuan NaCl 0% menghasilkan bobot
biomassa paling tinggi yaitu 0,96 g/50 mL. Bobot biomassa pada waktu panen
selanjutnya relatif sama karena sudah mengalami fase stasioner.
Kapang KT30 pada perlakuan NaCl 0% dapat tumbuh lebih baik
dibandingkan perlakuan lainnya. Hal ini diduga karena X. psidii merupakan
kapang terestrial yang pertama kali diisolasi dari buah jambu (Psidium guajava)
yang berasal dari Hawai (Rodger et al. 1992). Menurut Chasanah et al. (2012),
beberapa kapang terestrial dapat beradaptasi juga dengan lingkungan laut dan
masih tumbuh pada konsentrasi 4% NaCl. Jingjing et al. (2011) melaporkan
bahwa kapang yang habitatnya bukan dari laut dapat tumbuh pada konsentrasi
NaCl 3%, tapi pertumbuhannya lambat pada NaCl 6%. Kapang KT30 yang
diisolasi dari rumput laut Kappaphycus alvarezii memiliki kemampuan adaptasi
tersebut.
Bobot Biomassa (g/50 mL)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
3
6
9
12
15
18
21
Waktu Panen (hari)
Gambar 2.1 Biomassa kapang Xylaria psidii KT30 yang ditumbuhkan
pada media dengan salinitas berbeda. −♦− NaCl 3%,
−■− NaCl 1%, −▲− NaCl 0%
Hasil uji statistik (Lampiran 3) menunjukkan bahwa interaksi antara
konsentrasi NaCl dan waktu panen berpengaruh nyata (p0,05) terhadap rendemen protein
fraksi amonium sulfat kapang KT30. Rendemen protein fraksi amonium sulfat
tertinggi dihasilkan pada saturasi amonium sulfat 90% sebesar 1,67 g/100 mL
(1,67%). Menurut Wang (2006), kelarutan protein tergantung pada konsentrasi
amonium sulfat dalam larutan. Konsentrasi amonium sulfat tidak boleh menurun
dalam larutan agar protein dapat mengendap, maka harus dilakukan pengadukan
selama proses pengendapan berlangsung.
Fraksi amonium sulfat yang dihasilkan kemudian dilarutkan dengan bufer
Tris-HCl pH 7,4 dengan perbandingan 1:1 dan diuji antibakteri. Gambar 3.1
13
Zona Hambat (mm)
menunjukkan aktivitas antibakteri fraksi amonium sulfat dan supernatan kapang
X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda. Fraksi amonium sulfat 90% memiliki
aktivitas antibakteri tertinggi dengan diameter zona hambat 2 mm terhadap bakteri
B. subtilis dan E. coli. Fraksi amonium sulfat dengan saturasi 60%-80% memiliki
aktivitas yang relatif kecil terutama pada bakteri E. coli, sedangkan supernatan
60%-90% memiliki aktivitas relatif stabil terhadap bakteri E. coli dan B. subtilis
dengan diameter zona hambat yang berkisar pada 0,5-2 mm. Hasil pengendapan
dengan saturasi amonium sulfat 90% akan digunakan pada tahap selanjutnya
karena memiliki aktivitas antibakteri paling tinggi.
Protein antibakteri memiliki implikasi yang besar terhadap inangnya karena
dapat melindungi dari kerusakan parah akibat infeksi oleh bakteri. Protein
antibakteri memiliki karakteristik fisiologi dan biokimia yang berbeda tergantung
dari organisme yang diisolasinya (Zheng et al. 2010). Malik et al. (2008)
menyatakan protein bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri biasanya diisolasi
pada fase eksponensial akhir atau stasioner. Protein bioaktif yang dilepaskan
ke lingkungan secara perlahan dan terus menerus dapat mencegah kolonisasi
ruang yang berdekatan dengan pesaing. Mikroorganisme laut yang menghasilkan
protein antibiotik dapat berkontribusi untuk proses inaktivasi alami
mikroorganisme pada lingkungan laut.
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
B. subtilis (Jam ke-4)
B. subtilis (Jam ke-20)
E. coli (Jam ke-4)
E. coli (Jam ke-20)
Gambar 3.1 Aktivitas antibakteri fraksi amonium sulfat dan supernatan
kapang X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda
Fraksi aktif protein kapang KT30
Fraksi amonium sulfat 90% kapang X. psidii KT30 dimurnikan melalui
kromatografi filtrasi gel. Prinsip pemurnian dengan filtrasi gel adalah pemisahan
protein berdasarkan ukuran partikel dan sangat baik digunakan pada tahap akhir
pemurnian. Fase diam yang digunakan adalah Sephadex G-50 dan fase geraknya
adalah metanol 30%. Menurut Ratnakomala (2009), fase gerak yang digunakan
pada kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-50 biasanya
menggunakan larutan bufer. Penggunaan bufer sebagai eluen memberikan hasil
pemisahan yang kurang baik. Hal ini dikarenakan protein tersebut banyak
mengandung gugus hidrofobik yang memiliki kelarutan yang rendah pada eluen
14
berupa bufer. Interaksi hidrofobik dapat dikurangi dengan penambahan senyawa
organik seperti metanol, etanol, dan asetonitril.
Volume fraksi amonium sulfat yang dimasukkan ke dalam kolom adalah
1 mL, fraksi yang dihasilkan juga ditampung dengan volume yang sama. Laju alir
yang dibutuhkan untuk menampung fraksi yang dihasilkan adalah 2 menit/mL.
Fraksi yang dihasilkan kemudian diuji antibakteri. Aktivitas antibakteri fraksi
protein kapang X. psidii KT30 dapat dilihat pada Gambar 3.2.
Aktivitas antibakteri dari fraksi protein kapang KT30 terhadap bakteri
B. subtilis dihasilkan pada fraksi 8-16. Hasil tersebut menunjukkan adanya puncak
utama pada fraksi 11 dan 12 yang menghasilkan diameter zona hambat sebesar
2 mm. Aktivitas antibakteri dari fraksi protein kapang KT30 terhadap E. coli
terdapat pada fraksi 8, 10-13, dan 16. Secara keseluruhan, fraksi 11-12 memiliki
aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan fraksi aktif yang lainnya.
Zona Hambat (mm)
2.5
2
1.5
1
0.5
0
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Fraksi
Gambar 3.2 Aktivitas antibakteri fraksi protein kapang X. psidii KT30
terhadap bakteri patogen (□) B. subtilis dan (■) E. coli
Hasil pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel menunjukkan pemisahan
yang baik dari protein dari kapang KT30. Hal tersebut ditunjukkan terpisahnya
molekul protein dengan bobot molekul yang berbeda. Pemurnian secara parsial
dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-50 dapat
menghasilkan protein yang berperan sebagai antibakteri. Penelitian Huang et al.
(2006) menunjukkan bahwa protein dari kepitin
ANTIBAKTERI DAN ANTIKANKER DARI KAPANG
Xylaria psidii KT30 YANG DIISOLASI DARI RUMPUT LAUT
Kappaphycus alvarezii
ARIS MUNANDAR
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA *
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Purifikasi dan
Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker dari Kapang Xylaria psidii
KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut Kappaphycus alvarezii” adalah benar
karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Aris Munandar
NIM C351110051
*
Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerjasama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerjasama yang terkait.
RINGKASAN
ARIS MUNANDAR. Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan
Antikanker dari Kapang Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut
Kappaphycus alvarezii. Dibimbing oleh KUSTIARIYAH TARMAN, TATI
NURHAYATI, dan APON ZAENAL MUSTOPA.
Protein kapang KT30 dapat menghambat bakteri Bacillus pumilus
BTCCB530, Listeria sp. BTCC B693, Salmonella typhi P2KIM Collection,
Staphylacoccus aureus P2KIM Collection, dan Pseudomonas sp. BTCC B675.
Protein tersebut juga mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel HeLa (kanker
serviks) dengan IC50 264,7 μg/mL. Aktivitas antibakteri dan antikanker protein
yang dihasilkan kapang KT30 masih belum optimal sehingga perlu dilakukan
upaya untuk meningkatkan aktivitasnya secara bertahap dari optimasi
pertumbuhan, purifikasi, dan karakterisasi protein tersebut.
Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap yaitu optimasi pertumbuhan kapang
KT30, purifikasi protein, uji aktivitas antikanker dan karakterisasi protein.
Optimasi pertumbuhan dilakukan dengan kombinasi perlakuan konsentrasi NaCl
dan waktu panen. Pengendapan dilakukan dengan saturasi 60%-90% pada setiap
100 mL supernatan kapang KT30. Kromatografi filtrasi gel dilakukan dengan fase
diam Sephadex G-50 dan fase gerak metanol 30%. Uji antibakteri dilakukan pada
fraksi amonium sulfat, supernatan, dan fraksi protein untuk mendapatkan fraksi
aktifnya. Uji antikanker terhadap sel Chang (sel hati) dan sel HeLa (kanker
serviks) dilakukan dengan metode MTT sitotoksik. Kadar protein diuji
menggunakan bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. Karakterisasi protein
kapang KT30 meliputi bobot molekul dan stabilitas terhadap suhu, pH, enzim,
inhibitor, dan detergen.
Pertumbuhan kapang KT30 paling optimum terdapat pada perlakuan NaCl
0% dengan waktu panen hari ke-15 dan memiliki aktivitas antibakteri terhadap
bakteri Escherichia coli NBRC 14237 dan Bacillus subtilis BTCC 2530 dengan
diameter zona hambat sebesar 2,33 mm dan 1,3 mm. Pengendapan protein kapang
KT30 paling optimum terdapat pada konsentrasi amonium sulfat 90% dengan
rendemen sebesar 1,67 g/100 mL. Fraksi amonium sulfat tersebut memiliki
aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri E. coli dan B. subtilis dengan
diameter zona hambat sebesar 2 mm. Fraksi protein 11 dan 12 dari kapang KT30
merupakan fraksi aktif dengan aktivitas antibakteri tertinggi terhadap B. subtilis
dan E. coli sebesar 2 mm.
Hasil uji antikanker terhadap sel Chang dan sel HeLa menunjukkan bahwa
protein KT30 bersifat tidak toksik. Berdasarkan perhitungan, nilai IC50 fraksi
amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 adalah 670,86 dan 1451,68 µg/mL. Fraksi
amonium sulfat 90% dan fraksi 11-12 memiliki kadar protein sebesar 9,013 dan
0,604 mg/mL. Fraksi 11-12 kapang KT30 memiliki bobot molekul masing-masing
sebesar 23,42 kDa, 20,09 kDa, dan 14,33 kDa. Protein kapang KT30 stabil pada
suhu 60°C setelah pemanasan 30 menit dan kisaran pH 6 – 12, serta enzim pepsin,
tripsin, dan lisozim tapi tidak stabil terhadap inhibitor EDTA serta detergen
tween 20, SDS, dan triton X-100.
Kata kunci: antibakteri, antikanker, kapang, protein, Xylaria psidii
SUMMARY
ARIS MUNANDAR. Purification and Characterization of Antibacterial and
Anticancer Protein of Fungus Xylaria psidii KT30 Isolated from Kappaphycus
alvarezii. Supervised by KUSTIARIYAH TARMAN, TATI NURHAYATI, and
APON ZAENAL MUSTOPA.
The protein of an algicolous fungus KT30 inhibited Bacillus pumilus BTCC
B530, Listeria sp. BTCC B693, Salmonella typhi P2KIM Collection,
Staphylacoccus aureus P2KIM Collection, and Pseudomonas sp. BTCC B675.
The protein also showed anticancer activity against HeLa cell line (cervical
cancer) with IC50 264.7 μg/mL. Antibacterial and anticancer activities of protein
were produced by fungus KT30 still less optimal, therefore it is necessary to
improve the protein activity gradually from optimize of fungal growth,
purification and characterization of protein were performed.
This research was carried out in three steps, including optimize of fungal
growth, purification of protein, anticancer activity assay and characterization of
the protein. Optimise of growth was done with combination of NaCl concentration
and harvest day. Precipitation was done by with 60%-90% on each 100 mL
supernatant of fungus KT30. Gel chromatography filtration was done by
Sephadex G-50 with methanol 30% as mobile phase. Antibacterial activities was
done on fraction ammonium sulfat, supernatant, and protein fraction to get active
fraction. Anticancer against Chang cell line (liver cell) and HeLa cell line
(cervical cancer) was done by MTT cytotoxic method. Protein concentration assay
was done by bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. Characterization of
protein of fungus KT30 including molecular weight, and stability to temperature,
pH, enzyme, inhibitor, and detergent.
The optimal of fungal growth was obtained on NaCl 0% after 15 days
cultivation and showed antibacterial activity against Escherichia coli NBRC
14237 and Bacillus subtilis BTCC 2530 with diameter of clear zones were
2.33 mm and 1.3 mm. The optimal protein precipitation showed after 90%
saturation of ammonium sulfat with yield 1.67 g/100 mL. Fraction ammonium
sulfat showed the highest antibacterial activity against E. coli and B. subtilis with
diameter of clear zone 2 mm. Fractions 11 and 12 were the most active ones
against B. subtilis and E. coli i.e 2 mm.
Anticancer assay showed protein of fungus KT30 was not toxic against
Chang cell line and HeLa cell line. Based on calculation, IC50 value protein of
fraction ammonium sulfat 90% and fractions 11-12 were 670.86 and
1451.68 µg/mL. The protein concentration of fraction ammonium sulfat 90% and
fractions 11-12 were 9.013 and 0.604 mg/mL. Three bands were detected from the
fractions 11-12 indicated molecular weights of 23.42 kDa, 20.09 kDa, and
14.33 kDa. The proteins of the fungus were stable on 60oC after 30 minutes of
heating and pH 6-10. The proteins were stable on pepsin, trypsin, and lysozyme
but not stable to EDTA, detergent, tween 20 SDS, and Triton X-100.
Key words: antibacterial, anticancer, fungi, protein, Xylaria psidii
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN
ANTIBAKTERI DAN ANTIKANKER DARI KAPANG Xylaria
psidii KT30 YANG DIISOLASI DARI RUMPUT LAUT
Kappaphycus alvarezii
ARIS MUNANDAR
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Linawati Hardjito, MS
Judul Tesis
Nama
NIM
: Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker
dari Kapang Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput
Laut Kappaphycus alvarezii
: Aris Munandar
: C351110051
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Kustiariyah Tarman, SPi, MSi
Ketua
Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi
Anggota
Dr A. Zaenal Mustopa, MSi
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Tati Nurhayati, SPi, M.Si
Dr Ir Dahrul Syah, M.Sc, Agr
Tanggal Ujian: 20 Februari 2014
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Shalawat serta salam
semoga tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW beserta keluarga dan para
sahabat-sahabatnya. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak
bulan Januari sampai September 2013 ialah protein bioaktif, dengan judul
Purifikasi dan Karakterisasi Protein Antibakteri dan Antikanker dari Kapang
Xylaria psidii KT30 yang Diisolasi dari Rumput Laut Kappaphycus alvarezii.
Penelitian ini merupakan bagian penelitian Pengembangan Protein Antikanker
dari Kapang Endofit Indigenous Laut Indonesia Xylaria psidii KT30 yang didanai
Kementrian Riset dan Teknologi melalui Program Insentif Riset Sinas (RD-2012718; RD-2013-0552). Penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ibu Dr rer nat Kustiariyah Tarman, SPi, MSi, Ibu Dr Tati Nurhayati, SPi, MSi,
dan Bapak Apon Zaenal Mustopa, MSi yang telah mengarahkan selaku komisi
pembimbing
2. Ibu Dr Ir Linawati Hardjito, MS yang telah memberikan masukan selaku
penguji luar komisi
3. Istri (Siti Nuralipah) dan Anakku (Khadafi Darul Alifi Maqbulah) tercinta atas
do’a, kasih sayang, kesabaran, dan semangat yang diberikan
4. Bapak (Endang Supanda, SPd), Mamah (Popon Tursini, SPd), Abi (KH. Aan
Andi), Umi (Hj. Wawat Fatmawati), Adik-adikku (Nie, Ani, Tengku, Bakar,
Nawa, Ubah, dan Aulia) serta seluruh keluarga atas doa dan kasih sayangnya
(keluarga besar yang luar biasa)
5. Ibu Linda Sukmarini, MEng, Ibu Rifqiyah Nurumami, MS, Bapak Muhammad
Ridwan, SFarm, Bapak Erik Firdian, Bapak Kurniawan, Dwianty Putri
Meitasari, SPt, Hana Nurullita Prestisia, SPi, Fakhrul Umam, Yunita Sari, Ike
Rahmawati, SSi, Adyos Bobby Chandra, MSi, dan Aksar Chair Lages, SPi atas
bantuan dan masukannya selama penelitian
6. Yulia Oktavia, Made Suhandana, Aulia Andhikawati, Patmawati, Aidil
Fadlihamdi, dan Mita Gabriella Inthe atas bantuan dan masukannya selama
penelitian dan penulisan
7. Pascasarjana THP 2011 dan 2010 atas bantuan dan dukungannya selama ini
8. Rektor Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, Dekan Fakultas Pertanian, Ketua
Program Studi Perikanan, rekan-rekan di Fakultas Pertanian atas dukungannya,
dan seluruh pihak yang telah membantu selama penelitian.
Semoga penulisan karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan
seluruh pihak.
Bogor, Februari 2014
Aris Munandar
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ...................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................
x
1 PENDAHULUAN ..............................................................................
Latar Belakang ....................................................................................
Perumusan Masalah.............................................................................
Tujuan dan Manfaat Penelitian ............................................................
1
1
2
3
2 OPTIMASI PERTUMBUHAN DAN AKTIVITAS ANTIBAKTERI
KAPANG Xylaria psidii KT30 ............................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan .............................................................................................
4
4
5
7
8
3 PURIFIKASI PROTEIN ANTIBAKTERI DARI KAPANG Xylaria
psidii KT30 .........................................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan .............................................................................................
10
10
11
12
14
4 KARAKTERISASI DAN AKTIVITAS PROTEIN ANTIKANKER DARI
KAPANG Xylaria psidii KT30 ................................................................
Pendahuluan ........................................................................................
Bahan dan Metode...............................................................................
Hasil dan Pembahasan .........................................................................
Simpulan .............................................................................................
15
15
15
18
23
5 PEMBAHASAN UMUM .....................................................................
24
6 SIMPULAN UMUM DAN SARAN .....................................................
Simpulan Umum .................................................................................
Saran ...................................................................................................
27
27
27
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
28
DAFTAR TABEL
2.1 Komposisi bahan dan estimasi jumlah bakteri pada standar McFarland ......
3.1 Rendemen protein fraksi amonium sulfat kapang X. psidii KT30
pada saturasi berbeda ........................................................................
4.1 Pembuatan larutan standar BSA dengan konsentrasi 20-2000 µg/mL
4.2 Konsentrasi separating dan stacking gel ............................................
4.3 Kadar protein kapang X. psidii KT30.................................................
4.4 Stabilitas protein kapang X. psidii KT30 pda suhu, pH, detergen,
inhibitor, dan enzim ..........................................................................
6
12
17
17
20
22
DAFTAR GAMBAR
1 Kerangka pemikiran ...........................................................................
2.1 Biomassa kapang Xylaria psidii KT30 yang ditumbuhkan pada media
dengan salinitas berbeda ....................................................................
2.2 Aktivitas antibakteri X. psidii KT30 yang dikultur pada salinitas
berbeda .............................................................................................
3.1 Aktivitas antibakteri fraksi amonium sulfat dan supernatan kapang
X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda ........................................
3.2 Aktivitas antibakteri fraksi protein kapang X. psidii KT30 terhadap
bakteri patogen..................................................................................
4.1 Sel Chang dan HeLa pada uji antikanker ............................................
4.2 Bobot molekul protein kapang Xylaria psidii KT30 ............................
5.1 Pertumbuhan kapang Xylaria psidii KT30 pada media berbeda ..........
5.2 Protein fraksi amonium sulfat kapang Xylaria psidii KT30 .................
3
7
9
13
14
19
21
24
25
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media PDA ........................................................................
2 Komposisi media PDB ........................................................................
3 Hasil uji statistik interaksi perlakuan konsentrasi NaCl dan waktu
panen...................................................................................................
4 Hasil uji statistik perbedaan amonium sulfat ........................................
5 Perhitungan nilai IC50 ..........................................................................
6 Kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA) .....................................
7 Perhitungan bobot molekul..................................................................
8 Aktivitas antibakteri kapang KT30 ......................................................
9 Perhitungan konsentrasi per disc .........................................................
33
33
33
34
35
35
36
36
37
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Frekuensi infeksi yang disebabkan oleh mikroorganisme patogen di dunia
semakin meningkat dan menjadi penyebab kematian terutama di negara
berkembang (Khan et al. 2007; Mukhtar dan Ghori 2012). Agen antimikroba telah
banyak ditemukan, tetapi mikroorganisme patogen menjadi semakin resisten.
Menurut Kwong et al. (2010) agen infeksi memiliki potensi menginfeksi manusia
pada bagian yang berbeda-beda. Bakteri Streptococcus pneumonia menjadi
penyebab penyakit tertinggi diikuti oleh Escherichia coli dan Staphylacoccus
aureus. Secara umum, infeksi bakteri pada perempuan jumlahnya lebih tinggi
dibandingkan laki-laki. Selain infeksi mikroorganisme patogen, jenis penyakit
yang semakin meningkat di dunia adalah kanker.
Penderita kanker di dunia pada tahun 2008 mencapai 12,662 juta dan
7,564 juta diantaranya meninggal dunia. Jenis kanker yang menyebabkan
tingginya angka kematian pada perempuan adalah kanker leher rahim (serviks).
Kanker serviks di dunia mencapai 530 ribu kasus (4,2%) dan di wilayah Asia
Tenggara angka kematiannya mencapai 8,3% (Ferlay et al. 2010). Menurut WHO
(2008), 136 laki-laki dan 109 perempuan pada tiap 100 ribu populasi penduduk
di Indonesia meninggal dunia akibat kanker. Prevalensi penyakit kanker
di Indonesia mencapai 0,4% berdasarkan diagnosis oleh tenaga kesehatan. Pada
tahun 2004, kasus kanker serviks di Indonesia mencapai 3.818 (13%), dan 193
diantaranya meninggal dunia (BPPK 2008).
Kanker merupakan penyakit dimana kontrol pertumbuhan hilang dari satu
atau lebih sel yang mengarah menjadi massa padat (Thurston 2006). Kanker
serviks disebabkan infeksi Human Papillomavirus (HPV) yang diawali dalam sel
pada permukaan leher rahim. Pengendalian penyakit kanker serviks, skrining, dan
pengobatan dilakukan berdasarkan prinsip-prinsip epidemiologik. Kebijakan
pengendalian penyakit kanker di Indonesia diperkuat dengan terbitnya keputusan
Menteri Kesehatan nomor 1163/Menkes/SK/X/2007 tentang kelompok kerja
pengendalian penyakit kanker serviks dan payudara. Deteksi lesi-kanker menjadi
kanker membutuhkan waktu sekitar 10 tahun sehingga dapat dilakukan
pencegahan menjadi kanker (Dwipoyono 2009).
Pencegahan penyakit yang disebabkan infeksi mikroorganisme patogen dan
kanker dapat dilakukan menggunakan bahan alam. Makro dan mikroorganisme
menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas biologis. Menurut
Soemiati (2009), sumber bahan alam dapat diperoleh dari biota laut misalnya
kapang laut endofit. Kapang laut endofit memiliki aktivitas antibakteri dan
antikanker sehingga dapat dijadikan sumber untuk bahan obat.
Kapang laut endofit memiliki aktivitas antibakteri berdasarkan laporan
beberapa hasil penelitian. Kapang endofit dari mangrove Penicillium
janthinellum, Aspergillus conicus, dan Phomopsis sp. dilaporkan memiliki
aktivitas antibakteri dengan zona hambat pada kisaran 7 – 27 mm (Bharathidasan
dan Panneerselvam 2011). Samuel et al. (2011) melaporkan kapang Geotrichum
candidum memiliki aktivitas antibakteri terhadap Micrococcus sp., Bacillus
subtilis, Vibrio cholera, E. coli, dan Pseudomonas putida. Preaustinoid A dan B
yang diisolasi dari kapang Penicillium sp. dilaporkan bersifat bakteriostatik
2
terhadap E. coli, Bacillus sp., Staphylacoccus aureus, dan Pseudomonas
aeruginosa (Selim et al. 2012).
Hasil penelitian beberapa tahun terakhir juga menunjukkan adanya aktivitas
antikanker dari kapang laut. Menurut Atalla et al. (2008) kapang Varicosporina
ramulosa menghasilkan senyawa ergosterol yang efektif menghambat 50% sel
kanker hati dan paru-paru pada konsentrasi 99,7 dan 74,9 μg/mL. Nursid et al.
(2010) melaporkan bahwa metabolit sekunder kapang MFW-01-08 dari ascidia
Aplidium longithorax memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara
T47D dengan nilai IC50 sebesar 92,6 μg/mL. Kapang Emericella nidulans
dilaporkan oleh Nursid et al. (2011) dapat memproduksi emestrin (C27H21N2S2)
yang juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan
nilai IC50 sebesar 1,8 μg/mL.
Kapang endofit Xylaria psidii KT30 diisolasi dari rumput laut Kappaphycus
alvarezii yang biasa dimanfaatkan sebagai penghasil karaginan. Kapang KT30
menghasilkan metabolit sekunder yang mempunyai aktivitas antibakteri dan
antikanker. Ekstrak etil asetat dari kapang KT30 memiliki aktivitas antibakteri
terhadap bakteri patogen pada manusia dan ikan. Kapang KT30 juga memiliki
aktivitas antikanker terhadap human bladder carcinoma cell line 5637 (ATCC
HTB-9) (kanker kandung kemih) dengan nilai IC50 sebesar 4 μg /mL (NaCl 0%)
dan 14 μg/mL (NaCl 3%) (Tarman et al. 2011). Menurut Tarman et al. (2012),
protein ekstraseluler yang diekstrak dari media kultur kapang KT30 juga memiliki
aktivitas antibakteri dan antikanker. Protein kapang KT30 dapat menghambat
bakteri Bacillus pumilus BTCC B530, Listeria sp. BTCC B693, Salmonella typhi
P2KIM Collection, Staphylacoccus aureus P2KIM Collection, dan
Pseudomonas sp. BTCC B675. Protein tersebut juga mempunyai aktivitas
antikanker terhadap sel HeLa (kanker serviks) dengan IC50 264,7 μg/mL.
Protein memiliki aktivitas biologis sehingga dapat dijadikan sumber bahan
obat alami. Protein tersebut berperan sebagai antibakteri, antifungal, dan
antikanker (Rodrigues et al. 2009; Zheng et al. 2010). Aktivitas antibakteri dan
antikanker protein yang dihasilkan kapang KT30 masih belum optimal sehingga
perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan aktivitas protein tersebut (Tarman
et al. 2012). Peningkatan aktivitas dari protein kapang KT30 dilakukan bertahap
mulai dari optimasi pertumbuhan, purifikasi, dan karakterisasi protein tersebut.
Perumusan Masalah
Agen antimikroba telah banyak ditemukan, tetapi mikroorganisme patogen
menjadi semakin resisten. Kanker serviks merupakan salah satu penyebab
kematian tertinggi pada perempuan. Obat antibakteri dan antikanker baru
diharapkan dapat mengatasi masalah tersebut, salah satu sumbernya adalah
kapang X. psidii. Kapang X. psidii KT30 dapat menghasilkan protein yang
memiliki aktivitas antibakteri dan antikanker terhadap sel HeLa, namun aktivitas
yang dihasilkan masih rendah. Protein KT30 memiliki aktivitas antibakteri
terhadap bakteri Gram-positif dan negatif dengan diameter zona hambat 1-2 mm.
Aktivitas antikanker protein KT30 terhadap sel HeLa memiliki nilai IC50 sebesar
264,7 μg/mL. Oleh karena itu, perlu dilakukan peningkatan aktivitas antibakteri
dan antikanker dari protein kapang KT30. Upaya peningkatan aktivitas diawali
dengan optimasi pertumbuhan kapang KT30 dalam memproduksi protein dengan
3
rendemen dan aktivitas yang tinggi. Protein yang dihasilkan kemudian dipurifikasi
untuk mendapatkan protein yang murni. Protein tersebut dikarakterisasi untuk
mengetahui sifatnya misal stabilitasnya terhadap suhu, pH, enzim, detergen,
inhibitor, dan bobot molekulnya. Protein tersebut diuji antibakteri dan antikanker
untuk mengetahui aktivitasnya. Perumusan masalah disajikan dalam kerangka
pemikiran pada Gambar 1.
Protein dari kapang
X.psidii
Resistensi
mikroorganisme
patogen
Infeksi
mikroorganisme dan
penyakit kanker
serviks
Kanker serviks
penyebab kematian
tertinggi
Optimasi produksi
protein X.psidii
Purifikasi dan
karakterisasi protein
X.psidii
Informasi kandidat
obat antibakteri dan
antikanker
Gambar 1 Kerangka pemikiran
Tujuan dan Manfaat Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah:
a. menentukan pertumbuhan optimum dan aktivitas antibakteri kapang
KT30
b. menentukan rendemen protein dan fraksi paling aktif
c. menentukan aktivitas antikanker dan karakter (bobot molekul dan
stabilitas) protein kapang KT30.
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk informasi kandidat obat
baru yang berasal dari produk alam hasil perairan.
4
2 OPTIMASI PERTUMBUHAN DAN AKTIVITAS
ANTIBAKTERI KAPANG Xylaria psidii KT30
Pendahuluan
Xylaria psidii KT30 merupakan kapang yang diisolasi dari rumput laut
Kappaphycus alvarezii BRKA-1 dari Desa Labuange, Kabupaten Barru, Sulawesi
Selatan. Kapang KT30 menghasilkan pigmen berwarna merah yang dikeluarkan
pada media berbeda dengan intensitas yang berbeda. Pigmen tersebut dapat
terdeteksi pada panjang gelombang 518 nm (Tarman 2011). Klasifikasi X. psidii
adalah sebagai berikut (Rodger et al. 1992):
Filum
: Ascomycota
Kelas
: Sordariomycetes
Ordo
: Xylariales
Famili
: Xylariaceae
Genus
: Xylaria
Spesies
: Xylaria psidii
Ekstrak etil asetat dari kapang KT30 memiliki aktivitas dalam menghambat
bakteri E. coli, B. subtilis, Pseudomonas aeruginosa, dan bakteri patogen pada
ikan contohnya Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida, dan Yersinia
ruckeri. Kapang KT30 juga memiliki aktivitas antikanker terhadap kanker
kandung kemih pada ekstrak etil asetat dari kultur air tawar dan laut (Tarman
et al. 2011).
Menurut Tarman et al. (2012) protein yang dihasilkan kapang KT30
memiliki aktivitas antibakteri dan antikanker. Aktivitas protein yang dihasilkan
kapang tersebut masih belum optimal. Hasil tersebut menunjukkan adanya potensi
protein dari kapang KT30 sebagai bahan obat terutama untuk antibakteri dan
antikanker terhadap kanker serviks. Mikroorganisme patogen menyebabkan
frekuensi infeksi di dunia semakin meningkat dan menjadi penyebab kematian
terutama di negara berkembang (Khan et al. 2007; Mukhtar dan Ghori 2012).
Kanker serviks merupakan salah satu jenis kanker yang menyebabkan kematian
tertinggi terutama perempuan. Menurut Maliya (2004) di negara berkembang
seperti Indonesia kematian yang disebabkan oleh kanker menduduki urutan atas
bersama penyakit kardiovaskuler. Menurut Dwipiyono (2009) insiden penyakit
kanker serviks di Indonesia terjadi pada ± 15/100.000 orang.
Peningkatan aktivitas dari protein kapang KT30 harus dilakukan mulai dari
tahap awal yaitu optimasi pertumbuhan. Hal tersebut harus dilakukan untuk
mengetahui kondisi optimum untuk pertumbuhan kapang KT30. Kondisi tersebut
ditunjukkan oleh biomassa dan aktivitas antibakteri kapang KT30. Pertumbuhan
kapang adalah pertambahan volume sel, spora atau konidia kapang berubah
menjadi miselium atau koloni. Pertumbuhan kapang sama seperti mikroorganisme
pada umumnya yang terbagi menjadi beberapa fase yaitu fase lag, akselerasi,
eksponensial, deselerasi, stasioner, dan kematian. Penentuan pertumbuhan kapang
dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain berat kering massa sel
(miselium), kadar total nitrogen dari massa sel, dan kadar total asam nukleat dari
massa sel (Gandjar et al. 2006). Tahap penelitian ini bertujuan untuk menentukan
pertumbuhan optimum dan aktivitas antibakteri kapang KT30.
5
Bahan dan Metode
Tahapan penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Januari - Maret 2013.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Protein Rekombinan, Vaksin, dan Sistem
Pengantaran Terarah, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bioteknologi,
Cibinong, Kabupaten Bogor.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat kapang X. psidii
KT30, Potato Dextrose Agar (PDA), Potato Dextrose Broth (PDB), Nutrient
Broth (NB), Nutrient Agar (NA), NaCl, E. coli, B. subtilis, dan larutan NaCl
0,85%. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pH-meter (CyberScan
ph510), timbangan (CHQ-DJ1002B), otoklaf (ES-315), laminar flow (ESCO),
oven (Frolaibo SAS), petri, inkubator (NB-205V), dan orbital shaker (LIPI).
Kultur padat kapang KT30 (Gandjar et al. 2006)
Media yang digunakan untuk kultur padat adalah PDA (komposisi media
PDA disajikan pada Lampiran 1). Media PDA sebanyak 3,9 g dilarutkan hingga
100 mL, lalu disterilkan pada otoklaf (121oC, 20 menit). Media PDA yang sudah
steril dituang dalam cawan petri dan didiamkan hingga padat. Potongan hifa
kapang KT30 diambil dan dimasukkan dalam cawan petri. Kapang KT30
diinkubasi pada suhu ruang selama ± 3-4 hari.
Kultur cair kapang KT30 (Gandjar et al. 2006)
Media yang digunakan untuk kultur cair adalah PDB (komposisi media
PDA disajikan pada Lampiran 2). Media PDB sebanyak 2,4 g dilarutkan hingga
100 mL, lalu disterilkan dalam otoklaf. Potongan hifa kapang KT30 diambil dan
dimasukkan dalam media PDB. Kultur cair dilakukan pada media dengan volume
5 mL dan 25 mL. Kultur cair kapang KT30 diinkubasi pada suhu ruang dan
orbital shaker dengan kecepatan 120 rpm selama ± 3-4 hari.
Optimasi pertumbuhan kapang KT30 (Gandjar et al. 2006)
Media yang digunakan untuk optimasi pertumbuhan adalah PDB dengan
volume 50 mL. Kapang KT30 hasil kultur cair 25 mL disiapkan, hifa diambil dan
dimasukkan ke dalam media PDB. Kapang KT30 diinkubasi pada suhu ruang dan
orbital shaker dengan kecepatan 120 rpm.
Optimasi pertumbuhan dilakukan dengan kombinasi perlakuan konsentrasi
NaCl dan waktu panen. Konsentrasi NaCl yang digunakan pada media kultur
adalah 0%, 1%, dan 3%, sedangkan panen dilakukan setiap 3 hari selama 21 hari
(hari ke-3, 6, 9, 12, 15, 18, dan 21). Biomassa dan supernatan kapang KT30
dipisahkan dengan menggunakan kertas saring. Bobot biomassa ditimbang setelah
pengeringan dengan oven pada suhu 60oC selama 24 jam (Handajani dan Purwoko
2008). Bobot biomassa dihitung berdasarkan persamaan berikut:
Keterangan:
Bobot awal
Bobot akhir
Bobot biomassa = bobot akhir − bobot awal
: Bobot kertas saring
: Bobot biomassa kering dan kertas saring
Supernatan diambil 1 mL dalam tube dan diuji antibakteri dengan metode
difusi agar (Lay 1994). Konsentrasi supernatan yang digunakan untuk uji
6
antibakteri adalah 114,31 μg/disc. kontrol positif yang digunakan adalah
kloramfenikol dengan konsentrasi 30 μg/disc.
Uji aktivitas antibakteri (Lay 1994, Wooton 2013)
Bakteri yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri adalah Bacillus
subtilis BTCC 2530 dan Escherichia coli NBRC 14237. Pada inokulasi, bakteri
ditambahkan sebanyak 5 μL dari stok bakteri dalam 5 mL media NB (beef extract
0,3%, pepton 1%, NaCl 0,5%). Bakteri diinkubasi pada suhu 37oC dengan
kecepatan shaker 150 rpm selama ± 16 jam. Bakteri diencerkan dengan
menggunakan standar McFarland 2 (6 x 108 CFU/mL) dan diukur pada
spektrofotometri (600 nm).
Standar McFarland digunakan untuk melakukan perbandingan visual dari
densitas bakteri pada media. Standar McFarland dapat dibuat dari dua larutan
yaitu 1% barium klorida (BaCl2) encer dan 1% asam sulfat (H2SO4) encer dengan
komposisi sesuai dengan standar. Komposisi bahan dan estimasi jumlah bakteri
pada standar McFarland dapat dilihat pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Komposisi bahan dan estimasi jumlah bakteri pada standar McFarland
0,5
1
2
3
1% Barium klorida (mL)
0,05
0,1
0,2
0,3
1% Asam sulfat (mL)
9,95
9,9
9,8
9,7
Estimasi kepadatan bakteri x 108 CFU/mL
1,5
3
6
9
Bakteri yang sudah disesuaikan dengan standar McFarland ditambahkan
sebanyak 3 mL ke dalam 17 mL NA (beef extract 0,3%, pepton 1%, NaCl 0,5%,
dan bakto agar 2%), dan didiamkan hingga padat. Kertas cakram (diameter 6 mm)
yang sudah ditambahkan 20 μL sampel dimasukkan dalam media NA. Inkubasi
dilakukan pada suhu 37oC selama ±24 jam, kemudian zona hambat yang
dihasilkan diukur diameternya dalam mm, setelah dikurangi diameter kertas
cakram.
Analisis data
Rancangan yang digunakan untuk optimasi pertumbuhan adalah rancangan
acak lengkap (RAL) pola faktorial dengan 3 kali ulangan. Perlakuan terdiri dari 2
faktor percobaan yaitu konsentrasi NaCl dengan taraf 0%, 1%, 3% dan waktu
panen dengan taraf 3, 6, 9, 12, 15, 18, dan 21 hari. Menurut Mattjik (2002), model
umum RAL pola faktorial adalah:
Yijk = μ + Ai + Bj + (AB)ijk +∈ijk
Keterangan:
Yijk
: Respon pengaruh perlakuan faktor A pada taraf i dan perlakuan
faktor B pada taraf j ulangan ke-k
µ
: Pengaruh rata-rata umum
Ai
: Pengaruh perlakuan faktor A pada taraf i
Bj
: Pengaruh perlakuan faktor B pada taraf j
(AB)ij : Pengaruh interaksi faktor A pada taraf ke-i dengan perlakuan faktor
B ke-j
∈ ijk
: Pengaruh acak (galat percobaan)
7
Hasil dan Pembahasan
Optimasi pertumbuhan kapang X. psidii KT30 dilakukan pada konsentrasi
NaCl yang berbeda selama 21 hari. Pertumbuhan yang dihasilkan kapang KT30
memiliki perbedaan pada tiap perlakuan NaCl dan waktu panen. Perbedaan pada
tiap perlakuan ditunjukkan oleh bobot biomassa kapang KT30 yang berbeda.
Biomassa kapang KT30 yang ditumbuhkan pada media dengan salinitas yang
berbeda dapat dilihat pada Gambar 2.1. Kapang KT30 pada tiap perlakuan
mengalami fase pertumbuhan eksponensial sampai hari ke-6. Berdasarkan hasil
perhitungan menurut Jouncey and Ross (1982), laju pertumbuhan spesifik
(specific growth rate) paling tinggi terdapat pada perlakuan NaCl 0% yaitu
sebesar 64,62%. Laju pertumbuhan spesifik perlakuan NaCl 1% dan 3% masingmasing adalah 43,61% dan 59,17%. Perlakuan NaCl 0% menghasilkan bobot
biomassa paling tinggi yaitu 0,96 g/50 mL. Bobot biomassa pada waktu panen
selanjutnya relatif sama karena sudah mengalami fase stasioner.
Kapang KT30 pada perlakuan NaCl 0% dapat tumbuh lebih baik
dibandingkan perlakuan lainnya. Hal ini diduga karena X. psidii merupakan
kapang terestrial yang pertama kali diisolasi dari buah jambu (Psidium guajava)
yang berasal dari Hawai (Rodger et al. 1992). Menurut Chasanah et al. (2012),
beberapa kapang terestrial dapat beradaptasi juga dengan lingkungan laut dan
masih tumbuh pada konsentrasi 4% NaCl. Jingjing et al. (2011) melaporkan
bahwa kapang yang habitatnya bukan dari laut dapat tumbuh pada konsentrasi
NaCl 3%, tapi pertumbuhannya lambat pada NaCl 6%. Kapang KT30 yang
diisolasi dari rumput laut Kappaphycus alvarezii memiliki kemampuan adaptasi
tersebut.
Bobot Biomassa (g/50 mL)
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
3
6
9
12
15
18
21
Waktu Panen (hari)
Gambar 2.1 Biomassa kapang Xylaria psidii KT30 yang ditumbuhkan
pada media dengan salinitas berbeda. −♦− NaCl 3%,
−■− NaCl 1%, −▲− NaCl 0%
Hasil uji statistik (Lampiran 3) menunjukkan bahwa interaksi antara
konsentrasi NaCl dan waktu panen berpengaruh nyata (p0,05) terhadap rendemen protein
fraksi amonium sulfat kapang KT30. Rendemen protein fraksi amonium sulfat
tertinggi dihasilkan pada saturasi amonium sulfat 90% sebesar 1,67 g/100 mL
(1,67%). Menurut Wang (2006), kelarutan protein tergantung pada konsentrasi
amonium sulfat dalam larutan. Konsentrasi amonium sulfat tidak boleh menurun
dalam larutan agar protein dapat mengendap, maka harus dilakukan pengadukan
selama proses pengendapan berlangsung.
Fraksi amonium sulfat yang dihasilkan kemudian dilarutkan dengan bufer
Tris-HCl pH 7,4 dengan perbandingan 1:1 dan diuji antibakteri. Gambar 3.1
13
Zona Hambat (mm)
menunjukkan aktivitas antibakteri fraksi amonium sulfat dan supernatan kapang
X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda. Fraksi amonium sulfat 90% memiliki
aktivitas antibakteri tertinggi dengan diameter zona hambat 2 mm terhadap bakteri
B. subtilis dan E. coli. Fraksi amonium sulfat dengan saturasi 60%-80% memiliki
aktivitas yang relatif kecil terutama pada bakteri E. coli, sedangkan supernatan
60%-90% memiliki aktivitas relatif stabil terhadap bakteri E. coli dan B. subtilis
dengan diameter zona hambat yang berkisar pada 0,5-2 mm. Hasil pengendapan
dengan saturasi amonium sulfat 90% akan digunakan pada tahap selanjutnya
karena memiliki aktivitas antibakteri paling tinggi.
Protein antibakteri memiliki implikasi yang besar terhadap inangnya karena
dapat melindungi dari kerusakan parah akibat infeksi oleh bakteri. Protein
antibakteri memiliki karakteristik fisiologi dan biokimia yang berbeda tergantung
dari organisme yang diisolasinya (Zheng et al. 2010). Malik et al. (2008)
menyatakan protein bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri biasanya diisolasi
pada fase eksponensial akhir atau stasioner. Protein bioaktif yang dilepaskan
ke lingkungan secara perlahan dan terus menerus dapat mencegah kolonisasi
ruang yang berdekatan dengan pesaing. Mikroorganisme laut yang menghasilkan
protein antibiotik dapat berkontribusi untuk proses inaktivasi alami
mikroorganisme pada lingkungan laut.
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
B. subtilis (Jam ke-4)
B. subtilis (Jam ke-20)
E. coli (Jam ke-4)
E. coli (Jam ke-20)
Gambar 3.1 Aktivitas antibakteri fraksi amonium sulfat dan supernatan
kapang X. psidii KT30 pada saturasi yang berbeda
Fraksi aktif protein kapang KT30
Fraksi amonium sulfat 90% kapang X. psidii KT30 dimurnikan melalui
kromatografi filtrasi gel. Prinsip pemurnian dengan filtrasi gel adalah pemisahan
protein berdasarkan ukuran partikel dan sangat baik digunakan pada tahap akhir
pemurnian. Fase diam yang digunakan adalah Sephadex G-50 dan fase geraknya
adalah metanol 30%. Menurut Ratnakomala (2009), fase gerak yang digunakan
pada kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-50 biasanya
menggunakan larutan bufer. Penggunaan bufer sebagai eluen memberikan hasil
pemisahan yang kurang baik. Hal ini dikarenakan protein tersebut banyak
mengandung gugus hidrofobik yang memiliki kelarutan yang rendah pada eluen
14
berupa bufer. Interaksi hidrofobik dapat dikurangi dengan penambahan senyawa
organik seperti metanol, etanol, dan asetonitril.
Volume fraksi amonium sulfat yang dimasukkan ke dalam kolom adalah
1 mL, fraksi yang dihasilkan juga ditampung dengan volume yang sama. Laju alir
yang dibutuhkan untuk menampung fraksi yang dihasilkan adalah 2 menit/mL.
Fraksi yang dihasilkan kemudian diuji antibakteri. Aktivitas antibakteri fraksi
protein kapang X. psidii KT30 dapat dilihat pada Gambar 3.2.
Aktivitas antibakteri dari fraksi protein kapang KT30 terhadap bakteri
B. subtilis dihasilkan pada fraksi 8-16. Hasil tersebut menunjukkan adanya puncak
utama pada fraksi 11 dan 12 yang menghasilkan diameter zona hambat sebesar
2 mm. Aktivitas antibakteri dari fraksi protein kapang KT30 terhadap E. coli
terdapat pada fraksi 8, 10-13, dan 16. Secara keseluruhan, fraksi 11-12 memiliki
aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan fraksi aktif yang lainnya.
Zona Hambat (mm)
2.5
2
1.5
1
0.5
0
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Fraksi
Gambar 3.2 Aktivitas antibakteri fraksi protein kapang X. psidii KT30
terhadap bakteri patogen (□) B. subtilis dan (■) E. coli
Hasil pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel menunjukkan pemisahan
yang baik dari protein dari kapang KT30. Hal tersebut ditunjukkan terpisahnya
molekul protein dengan bobot molekul yang berbeda. Pemurnian secara parsial
dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-50 dapat
menghasilkan protein yang berperan sebagai antibakteri. Penelitian Huang et al.
(2006) menunjukkan bahwa protein dari kepitin