Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Listeria Monocytogenes Dari Susu Sapi Segar Di Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
Listeria monocytogenes DARI SUSU SAPI SEGAR
DI KABUPATEN ENREKANG SULAWESI SELATAN

KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Listeria monocytogenes dari Susu Sapi Segar di Kabupaten Enrekang
Sulawesi Selatan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, November 2016
Kusumandari Indah Prahesti
NIM B253130011

RINGKASAN
KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Listeria
monocytogenes dari Susu Sapi Segar di Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan.
Dibimbing oleh FACHRIYAN HASMI PASARIBU dan NI LUH PUTU IKA
MAYASARI.
Listeria monocytogenes merupakan salah satu bakteri patogen yang
mendapat perhatian dalam industri pangan dan kesehatan masyarakat. Bakteri ini
menginfeksi manusia melalui bahan pangan sehingga menimbulkan penyakit
listeriosis. Kajian epidemiologi pada sejumlah wabah listeriosis yang disebabkan
oleh L. monocytogenes memberikan indikasi bahwa susu dan produk susu
merupakan bahan pangan yang potensial terhadap kontaminasi dan transmisi L.
monocytogenes ke manusia. Kabupaten Enrekang merupakan salah satu wilayah
yang menjadi priotitas pengembangan peternakan sapi perah di Propinsi Sulawesi
Selatan. Pemerahan susu umumnya dilakukan secara manual oleh peternak, yang
memungkinkan terjadinya kontaminasi pada susu segar yang dihasilkan, namun

belum ada informasi terjadinya kontaminasi L. monocytogenes pada susu segar
yang dihasilkan. Oleh karena itu diperlukan penelitian tentang keberadaan L.
monocytogenes dan karakterisasi bakteri tersebut pada susu sapi segar di
Kabupaten Enrekang.
Sebanyak 107 contoh susu segar dikumpulkan dari lima kecamatan di
Kabupaten Enrekang dan digabungkan ke dalam 31 sampel pool untuk dilakukan
isolasi dan identifikasi bakteri. Tahap pengayaan dilakukan dalam media Listeria
Enrichment Broth (LEB) kemudian dilakukan kultur pada media Listeria Selective
Agar Base (LSA), dilanjutkan dengan uji biokimiawi. Isolat L. monocytogenes
yang diperoleh dikonfirmasi dengan metode polymerase chain reaction (PCR)
kemudian dilakukan pengurutan oligonukleotida. Identifikasi serotype dilakukan
dengan PCR multipleks.
Hasil penelitian menunjukkan keberadaan L. monocytogenes pada 21 isolat
sampel yang berhasil dikonfirmasi dengan PCR. Analisa pengurutan
oligonukleotida dari isolat L. monocytogenes yang diperoleh pada penelitian ini
menunjukkan persentase nilai kemiripan sebesar 99% dengan strain L.
monocytogenes yang terdapat pada basis data di GenBank. Identifikasi serotipe
menunjukkan bahwa keseluruhan 21 isolat tersebut termasuk dalam serogrup 2,
yaitu serotipe 1/2c dan 3c.
Kata kunci: Listeria monocytogenes, susu segar, isolasi dan identifikasi, serotipe,

PCR.

SUMMARY
KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI. Isolation and Identification of Listeria
monocytogenes from Raw Milk in Enrekang District South Sulawesi. Supervised
by FACHRIYAN HASMI PASARIBU and NI LUH PUTU IKA MAYASARI.
Listeria monocytogenes is a pathogenic bacteria which was concerned in
food industry and public health. This bacteria infects human through food, causing
listeriosis. Epidemiology study on listeriosis outbreaks indicated that milk and
milk products are potential for L. monocytogenes contamination and transmission
to human. Enrekang district is one of priority areas for dairy farm development in
South Sulawesi. Farming was done traditionally and the milking process was done
manually, which enable contamination to the milk. The aims of this study were to
isolate L. monocytogenes in raw milk in Enrekang District, South Sulawesi, to
analyze the molecular characterization of L. monocytogenes, and to determine the
bacteria serotypes.
A total of 107 raw milk samples were collected from five sub-districts in
Enrekang and pooled into 31 pool for further isolation and identification of the
bacteria. Enrichment cultures in Listeria Enrichment Broth (LEB) were done prior
to plating on Listeria Selective Agar Base (LSA) media and followed by

biochemical tests. Isolated L. monocytogenes were confirmed by polymerase
chain reaction (PCR) and the PCR products were sequenced. Multiplex PCR was
applied for molecular serotyping of the isolated L. monocytogenes.
Result showed that L. monocytogenes were found in 21 samples and were
confirmed by PCR. The DNA sequence analysis showed that the isolates found in
this study have 99% similiarity with L. monocytogenes strains in GenBank
database. Molecular serotyping showed that all 21 isolates belong to serogroup 2,
comprising serotype 1/2c and 3c.
Keywords: Listeria monocytogenes, fresh milk, isolation and identification,
serotyping, PCR.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
Listeria monocytogenes DARI SUSU SAPI SEGAR
DI KABUPATEN ENREKANG SULAWESI SELATAN

KUSUMANDARI INDAH PRAHESTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi Medik

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Drh Agustin Indrawati, M Biomed

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2015 ini adalah
tentang bakteri Listeria monocytogenes, dengan judul Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Listeria monocytogenes dari Susu Sapi Segar di Kabupaten Enrekang
Sulawesi Selatan.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Drh Fachriyan Hasmi
Pasaribu dan Ibu Dr Drh Ni Luh Putu Ika Mayasari selaku pembimbing dalam
penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada ketua Lab Mikrobiologi dan Ketua Lab Bioteknologi Terpadu
Fakultas Peternakan Unhas, kepada laboran Lab Divisi Mikrobiologi Medik dan
laboran Lab Pendidikan dan Layanan FKH IPB. Selanjutnya kepada seluruh staf
dosen, pegawai, dan rekan–rekan mahasiswa Prodi Mikrobiologi Medik.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, suami, ibu
mertua, serta seluruh keluarga, atas segala doa, dukungan, dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2016
Kusumandari Indah Prahesti

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vii

DAFTAR GAMBAR

vii

DAFTAR LAMPIRAN

vii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis Penelitian

1
1
2
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Karakter Listeria monocytogenes
Patogenesis Listeria monocytogenes
Virulensi Listeria monocytogenes
Listera monocytogenes pada Bahan Pangan
Serotipe Listeria monocytogenes

3
3
5
7
8
9

3 METODE
Waktu dan Tempat
Pengambilan Contoh Susu Segar
Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar
Kultur pada Media Agar Darah dan Uji Biokimiawi
Ekstraksi DNA
Identifikasi Gen Hemolisin (hly) dan Gen Invasive Associated
Protein (iap)
Identifikasi Serotipe Listeria monocytogenes dengan Metode PCR
Pengurutan Oligonukleotida (Sekuensing) DNA
Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari Listeria
monocytogenes
Analisa Hasil Pengurutan Oligonukleotida
Analisa Data
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL
Pengambilan Contoh Susu Segar
Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar
Kultur pada Media Agar dan Uji Biokimiawi
Kualitas DNA Bakteri Hasil Ekstraksi

Identifikasi Parsial Gen iap dan hly dari Listeria monocytogenes
Identifikasi Serotipe Isolat Listeria monocytogenes
Keberadaan Listeria monocytogenes pada Susu Sapi Segar di
Kabupaten Enrekang
Pengurutan Oligonukleotida Listeria monocytogenes
Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari
Listeria monocytogenes

10
10
10
11
11
11
12
13
13
13
14
14

14
14
14
15
15
17
17
20
22
23
23

DAFTAR ISI (lanjutan)

PEMBAHASAN

25

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran

27
27
27

DAFTAR PUSTAKA

28

LAMPIRAN

30

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Klasifikasi Listeria monocytogenes
Diferensiasi karakteristik Listeria spp.
Identifikasi spesies L. monocytogenes melalui prosedur PCR
Komposisi antigen somatik (O) dan antigen flagelar (H) pada serotipe L.
monocytogenes
Primer yang digunakan untuk identifikasi spesies L. monocytogenes
Primer yang digunakan untuk identifikasi serotipe L. monocytogenes
Lokasi dan jumlah contoh susu segar yang diambil dari 5 kecamatan di
Kabupaten Enrekang
Hasil uji biokimiawi dari isolat L. monocytogenes ATCC 7644 dan 24
isolat sampel diduga L. monocytogenes
Resume hasil identifikasi L. monocytogenes dengan metode kultur
konvensional dan PCR
Asal sampel dan jumlah isolat yang terdeteksi L. monocytogenes
Analisa kemiripan urutan oligonukleotida isolat sampel L.
monocytogenes dengan basis data GenBank

3
4
5
9
12
13
14
16
20
22
21

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Skema invasi intraseluler L. monocytogenes
Skema posisi primer iap dan HlyA pada Genom L. monocytogenes
Hasil kultur pada media LSA
Hasil pewarnaan Gram
Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer iap
Hasil elektroforesis produk PCR menggunakan primer hlyA
Hasil elektroforesis produk PCR multipleks
Kondisi kandang tempat pengambilan sampel susu segar
Hasil persejajaran nukleotida isolat sampel dengan beberapa strain L.
monocytogenes yang terdapat pada basis data GenBank

7
12
15
16
18
19
21
23
22

DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil pengukuran kualitas DNA bakteri hasil ekstraksi
2 Hasil pengurutan oligonukleotida dari isolat kontrol positif L.
monocytogenes ATCC 7644 dan isolat sampel 18A, 18B, 20, 25A, dan
25B
3 Kromatogram isolat kontrol positif L. monocytogenes ATCC 7644
4 Kromatogram isolat sampel 18A
5 Kromatogram isolat sampel 18B
6 Kromatogram isolat sampel 20
7 Kromatogram isolat sampel 25A
8 Kromatogram isolat sampel 25B

30

31
32
33
34
35
36
37

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Listeria monocytogenes merupakan salah satu bakteri patogen yang
mendapat perhatian dalam industri pangan dan kesehatan masyarakat. L.
monocytogenes terdapat secara luas ditanah, tumbuhan, air permukaan, serta
ditemukan pula pada silase, saluran pembuangan, dan limbah rumah potong, susu
sapi, dan feses hewan serta manusia. Bakteri ini menginfeksi manusia melalui
bahan pangan sehingga menimbulkan penyakit listeriosis. Kajian epidemiologi
pada sejumlah wabah listeriosis yang disebabkan oleh L. monocytogenes
memberikan indikasi bahwa susu dan produk susu merupakan bahan pangan yang
potensial terhadap kontaminasi dan transmisi L. monocytogenes ke manusia.
Sumber cemaran L. monocytogenes pada susu dan produknya dapat ditemukan
pada rantai pengolahan pangan, termasuk pada susu mentah yang baru diperah,
lingkungan, peralatan, alat pengemas, pengelolaan sampah, hingga higiene
karyawan yang terlibat (Lovett dan Twedt 2004). Sanjaya et al. (2007)
menyebutkan bahwa cemaran mikroba pada susu dapat terjadi pada ambing, alat
penampung susu, alat penyimpan susu, rantai transportasi, industri pengolahan,
sampai dengan konsumen. Hewan ternak yang terinfeksi oleh L. monocytogenes
akan melepaskan bakteri tersebut melalui susu, darah, dan fesesnya. Donnely
(2001) menyebutkan sapi dan domba yang terinfeksi oleh L. monocytogenes tanpa
disertai gejala klinis dapat melepaskan sel L. monocytogenes pada susu segar yang
dihasilkannya.
Pada manusia, kelompok beresiko tinggi terhadap listeriosis adalah wanita
hamil, bayi dalam kandungan, dan individu yang mengalami gangguan sistem
kekebalan (Garbutt 1997). Kasus kematian pada manusia akibat L. monocytogenes
dilaporkan terjadi di beberapa negara Eropa, antara lain di Irlandia pada tahun
2000 ditemukan satu kasus kematian pada manusia karena meningitis.Di Amerika
Serikat juga dilaporkan adanya 425 kasus kematian dari 1.850 kasus listeriosis
pada manusia. Diperkirakan setiap tahun terjadi 2500 kasus listeriosis pada
manusia di Amerika Serikat (FSAI 2005). Di Indonesia belum tersedia data
maupun laporan yang mencatat kejadian listeriosis pada manusia. Keberadaan L.
monocytogenes pada susu segar di Indonesia juga belum tercatat, data yang ada
sifatnya terbatas untuk penelitian. Yuliati dan Malaka (2013) telah melakukan
isolasi dan mengamati karakteristik pertumbuhan L. monocytogenes pada susu
segar dengan penyimpanan pada suhu 4oC. Isolat diperoleh dari susu segar yang
dikoleksi dari peternakan sapi perah di Makassar, Sulawesi Selatan. Penelitian
tersebut menunjukkan perbedaan pembentukan filamen dan pigmen secara
perlahan setelah dilakukan penyimpanan susu pada suhu 4 oC. Perbedaan
pembentukan filamen ini kemungkinan disebabkan oleh adanya perbedaan
serotipe bakteri tersebut. Sugiri et al. (2013) melakukan identifikasi serotipe L.
monocytogenes yang diisolasi dari daging ayam segar di pasar tradisional dan
supermarket di Bandung, Jawa Barat. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa
seluruh isolat L. monocytogenes yang diisolasi termasuk dalam serogrup 1/2b, 3b,
dan 7. Serotipe spesies L. monocytogenes ditentukan oleh keberadaan protein

2
permukaan yang spesifik, yaitu antigen somatik (O) dengan 15 subtipe dan
antigen flagelar (H) dengan 4 subtipe. Serotipe spesifik Listeria ditentukan oleh
kombinasi spesifik antara antigen O dan antigen H, menghasilkan 12 serotipe L.
monocytogenes, yaitu 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, dan 7
(Seeliger dan Jones 1986). Penelitian telah membuktikan bahwa hanya serotipe
1/2a, 1/2b, dan 4b yang menjadi 98% penyebab terjadinya wabah listeriosis pada
manusia (Wiedmann et al. 1996, Jacquet et al. 2002).

Perumusan Masalah
Epidemiologi L. monocytogenes sangat penting bagi kesehatan manusia
berkaitan dengan terjadinya wabah listeriosis yang disebabkan kontaminasi
bakteri ini pada berbagai bahan pangan yang dikonsumsi manusia, termasuk
daging, susu dan produk susu. Kabupaten Enrekang merupakan salah satu wilayah
yang menjadi priotitas pengembangan peternakan sapi perah di Propinsi Sulawesi
Selatan dengan populasi sapi perah sebanyak 1200 ekor pada tahun 2014. Populasi
terbesar, yaitu sebanyak hampir 50% dari total populasi sapi perah terdapat di
Kecamatan Cendana. Usaha ternak dilakukan secara tradisional dan umumnya
pada skala kecil (3–8 ekor) dengan produktivitas harian 5–8 liter/ekor/hari.
Pemerahan susu umumnya dilakukan secara manual oleh peternak, yang
memungkinkan terjadinya kontaminasi pada susu segar yang dihasilkan, namun
belum ada informasi terjadinya kontaminasi L. monocytogenes pada susu segar
yang dihasilkan. Oleh karena itu diperlukan penelitian tentang keberadaan L.
monocytogenes dan karakterisasi bakteri tersebut pada susu sapi segar di
Kabupaten Enrekang.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi bakteri L. monocytogenes dari susu
sapi segar di Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan, melakukan karakterisasi
secara molekuler terhadap isolat yang diperoleh, dan menentukan serotipenya.

Hipotesis Penelitian
Hipotesis penelitian ini adalah bakteri L. monocytogenesdapat diisolasi
dari susu sapi segar di Kabupaten Enrekang, Sulawesi Selatan, secara genetik
memiliki kesamaan dengan beberapa strain L. monocytogenes yang terdapat pada
basis data di GenBank, dan memiliki serotipe yang sama dengan yang sudah
pernah ditemukan di Indonesia.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA

Karakter Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes merupakan bakteri batang Gram-positif,
berukuran diameter 0.5 μm dan panjang 1–2 μm, tidak membentuk spora, serta
bersifat fakultatif anaerob yang tumbuh pada suhu -4 sampai dengan 50 oC.
Bakteri ini bersifat katalase positif, oksidase negatif, H2S negatif, dan
menghasilkan β-hemolysin yang membentuk zona bening pada agar darah (Farber
dan Peterkin 1991, Gyles et al. 2010, Liu 2006). L. monocytogenes membentuk
reaksi Christie, Atkins, and Munch-Petersen (CAMP) dengan hemolisin dari
bakteri Staphylococcus aureus. Bakteri ini bersifat motil bila ditumbuhkan pada
suhu 20–25oC dengan adanya pertumbuhan flagela peritrikus. Flagela tersebut
tidak terbentuk bila bakteri ditumbuhkan pada suhu tubuh 35–37 oC (Gyles et al.
2010).
Genus Listeria termasuk dalam kelas Bacilli dan ordo Bacillales. Enam
spesies yang termasuk dalam genus Listeria adalah L. monocytogenes, L. innocua,
L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, dan L. grayi. Dari keenam spesies tersebut,
L. monocytogenes dan L. ivanovii yang bersifat patogen. L. ivanovii menginfeksi
hewan namun jarang ditemukan pada manusia sedangkan L. monocytogenes
menginfeksi hewan dan manusia (Liu 2006). Klasifikasi L. monocytogenes
ditampilkan pada Tabel 1. L. monocytogenes terdapat secara luas ditanah,
tumbuhan, air permukaan, serta ditemukan pula pada silase, saluran pembuangan
dan limbah rumah potong, susu sapi, dan feses hewan serta manusia. L.
monocytogenes telah diisolasi dari sapi, kambing, dan unggas, namun jarang
ditemukan pada hewan liar (Farber dan Peterkin 1991).
Tabel 1 Klasifikasi L. monocytogenes
Kerajaan
Divisi
Kelas
Ordo
Famili
Genus
Spesies

Bacteria
Firmicutes
Bacilli
Bacillales
Listeriaceae
Listeria
Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes dapat dibedakan dari spesies Listeria lainnya
melalui uji Christie, Atkins, and Munch-Petersen (CAMP) dan reaksi fermentasi
karbohidrat. Pine et al. (1989) menyatakan bahwa L. monocytogenes dan L.
innocua memfermentasi glukosa, laktosa, dan rhamnosa pada kondisi anaerob; L.
grayi dan L. murrayi memfermentasi galaktosa; dan hanya spesies L.ivanovii dan
L. seeligeri yang memfermentasi xylosa. Diferensiasi karakteristik spesies Listeria
spp. ditunjukkan pada Tabel 2. Kemampuan menghemolisa darah merupakan
salah satu karakter L. monocytogenes yang dapat dibedakan dengan lima spesies
genus Listeria lainnya yaitu L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri dan
L. grayi. Hanya tiga spesies yang mempunyai kemampuan hemolitik, yaitu L.
monocytogenes, L. seeligeri dan L. ivanovii.

4

Tabel 2 Diferensiasi karakteristik Listeria spp.a
Karakteristik
β-hemolisis
Uji CAMP
S. aureus
R. equi
Fermentasi
α-metil-Dmannoside
rhamnosa
xylosa
Virulensi pada
mencit
a

L.
monocytogenes
+

Spesies Listeria
L.
L.
L.
innocua
ivanovii
welshimeri
–
+
–

L.
seeligeri
+

+
–

–
–

–
+

–
–

+
–

+

+

–

+

–

+
–
+

vb
–
–

–
+
–

vb
+
–

–
+
–

Sumber: Farber dan Peterkin 1991
v: beragam

b

Identifikasi spesies L. monocytogenes telah banyak dilakukan melalui
pengujian molekuler. Liu (2006) menyebutkan metode molekuler yang paling
banyak digunakan untuk identifikasi L. monocytogenes adalah metode amplifikasi
asam nukleat yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode PCR mampu
mengamplifikasi target spesifik sehingga memberikan hasil yang sangat spesifik,
sensitif, cepat, dan mudah untuk deteksi L. monocytogenes terhadap spesimen
yang diuji. Produk DNA yang sudah diamplifikasi dapat divisualisasi dengan
elektroforesis gel agarose dan UV transluminator, untuk kemudian dideteksi
menggunakan metode DNA stain, DNA sequencing, microarray analysis, dan
sebagainya. Tabel 3 menunjukkan gen–gen target yang digunakan untuk
identifikasi spesies L. monocytogenes yaitu gen 16S dan 23S rRNA, intergenic
spacer regions, hly, inlA, inlB, iap, dan gen-gen lainnya (Liu 2006).

5
Tabel 3 Identifikasi spesies L. monocytogenes melalui prosedur PCRa
Spesies
Listeria
monocytogenes

Gen Target
gen 16S rRNA
gen 23S rRNA
16S/23S rRNA
intergenicregions
hly
plcA
plcB
actA
prfA
inlA
inlB
iap
lma/dth18
fbp
flaA
pepC
clpE
lmo0733

a

Protein

LLO
PI-PLC
PC-PLC
ActA
Transcriptional regulator PrfA
Internalin A
Internalin B
Invassion associated protein
LmA antigen/delayed-type
hypersensitivity protein
Fibronectin-binding protein
Flagellin A
Aminopeptidase C
ClpATPase
Putative transcriptional regulator

Sumber: Liu 2006

Patogenesis Listeria monocytogenes
Infeksi L. monocytogenes yang bersifat invasif menyebabkan penyakit
listeriosis. Terdapat dua bentuk gejala klinis yang diakibatkan oleh infeksi L.
monocytogenes yaitu listerial gastroenteritis/gastrointestinal illness (bentuk
saluran pencernaan) dan invasive listeriosis (bentuk invasif). Pada listerial
gastroenteritis, gejala klinis ditandai dengan mual, muntah, kram perut dan diare
yang akan tampak setelah tertelannya bakteri selama lebih dari 12 jam (Dalton et
al. 1997, Lovett dan Twedt 2004). Perubahan keasaman lambung akibat
penggunaan obat–obatan antasida dan cimetidine dapat meningkatkan kepekaan
terhadap infeksi Listeria. Manusia yang menelan sejumlah 1.000 sel L.
monocytogenes akan menimbulkan gejala klinis seperti flu (rasa tidak enak badan,
demam ringan) dan diare. Dilaporkan antara 1–10% manusia terinfeksi tanpa
menunjukkan gejala klinis, namun dapat melepaskan L. monocytogenes melalui
feses (Lovett dan Twedt 2004).
Umumnya, infeksi dimulai oleh tertelannya L. monocytogenes, melalui
makanan terkontaminasi, yang mampu bertahan terhadap enzim proteolitik dan
keasaman (pH 2.0) di dalam lambung, garam empedu, serta mekanisme
pertahanan non-spesifik. Gambar 1 menunjukkan proses terjadinya invasive
listeriosis, (a) bakteri menyerang mukosa saluran pencernaan dan melekat pada
sel usus dibantu oleh D-galaktosa yang ada pada permukaan sel bakteri. Bakteri
kemudian menginvasi makrofag (sel parenkim) dan (b) terperangkap dalam
vakuola yang disebut fagosom, (c) selanjutnya bakteri tersebut menghasilkan
toksin listeriolisin O (LLO), phosphatidylinositol-spesific phospholipase C (PIPLC),
dan phosphatidylcholine-spesific phospholipase C (PC-PLC) yang mempunyai
kemampuan sitolitik untuk merusak fagosom agar dapat masuk ke dalam

6
sitoplasma. Ketiga toksin tersebut juga mencegah pencernaan bakteri oleh enzim
hidrolitik yang dihasilkan oleh lisosom, (d) secara cepat bakteri berkembang biak
di dalam sitoplasma dan membentuk F-aktin, (e) bakteri akan menginvasi sel lain
dengan bantuan F-aktin, mengakibatkan kerusakan sel dan septikemia. Setelah
berhasil menginvasi sel lain, bakteri berada dalam vakuola dengan membran
ganda, dan (f) melanjutkan siklus hidupnya dengan terus menginvasi sel lain.
Lima hari hingga tiga minggu setelah tertelan, bakteri ini menyebar ke seluruh
tubuh dan mengakibatkan kerusakan pada sistem syaraf, jantung, mata, organ lain
dan fetus. Infeksi pada sistem syaraf dapat menimbulkan meningitis, ensefalitis
dan abses dengan tingkat fatalitas hingga 70%. Pada wanita hamil, bentuk ini
mengakibatkan aborsi dan kematian bayi saat dilahirkan dengan rata-rata tingkat
kematian sebesar 80% (Lovett dan Twedt 2004; Hamon et al. 2006).
Pada individu dengan kondisi respon imun sel T tidak cukup, bakteri L.
monocytogenes yang mencapai hati dan limpa akan segera bermultiplikasi di
dalam hepatosit dan sel makrofag, kemudian dibawa oleh darah menuju ke
berbagai organ termasuk otak dan uterus. Pada kedua organ tersebut, L.
monocytogenes mampu melakukan penetrasi terhadap blood-brain barrier dan
placental barrier (Doyle 1987). Beberapa kondisi individu yang dapat mengalami
gangguan respon sistem imun yaitu usia lanjut, wanita hamil, janin dan bayi baru
lahir, pasien gangguan ginjal, penderita diabetes mellitus, serta individu yang
menderita HIV-AIDS. Kemampuan L. monocytogenes untuk menimbulkan
septikemia tergantung beberapa faktor, seperti jumlah bakteri yang tertelan, status
kekebalan tubuh induk semang dan keganasan galur bakteri yang menginfeksi.
Dilaporkan bahwa tertelannya sejumlah 1000 CFU/g L. monocytogenes yang
mencemari pangan dapat mengakibatkan listeriosis (CAC 2007).

7

Gambar 1 Skema invasi intraseluler L. monocytogenes (Hamon et al. 2006)

Virulensi Listeria monocytogenes
Beberapa faktor yang mempengaruhi patogenesis L. monocytogenes antara
lain kemampuan pertumbuhan intraseluler, kandungan senyawa besi, kemampuan
melawan sel fagosit, dan menghasilkan hemolisin. Toksin hemolisin yang
dihasilkan oleh L. monocytogenes disebut Listeriolisin O (LLO), dan merupakan
faktor virulensi yang utama. Sekresi hemolisin sangat penting dalam pertumbuhan
intraseluler dan pengenalan organisme ini oleh sel T (Farber dan Peterkin 1991).
Toksin Listeriolisin O (LLO), yang analog dengan toksin Streptolisin O
(SLO), pertama kali diisolasi dari supernatan dari kultur L. monocytogenes dan
menunjukkan struktur sebagai sulfhydryl (SH)-activated cytolysin. Hof dan Hefner
(1988) melaporkan bahwa hanya L. monocytogenes dan L. ivanovii yang
menghasilkan β-hemolisin. Strain L. innocua dan L. welshimeri, keduanya nonhemolitik, bersifat non-virulen, sedangkan L. seeligeri bersifat hemolitik lemah
namun non-virulen. Semua strain L. monocytogenes memproduksi LLO (ukuran
60 kDa), strain L. ivanovii dan L. seeligeri juga memproduksi eksotoksin
dependent-thiol dengan jumlah sepersepuluh dari L. monocytogenes. Toksin
hemolisin tidak ditemukan pada strain L. innocua dan L. welshimeri.

8
Toksin hemolisin lain yang ditemukan pada beberapa strain L.
monocytogenes dan secara imunologi berbeda dari LLO pertama kali dilaporkan
oleh Parrisius et al. (1986). Dua tipe hemolisin teridentifikasi pada klon dari L.
monocytogenes yang dikonstruksi pada Escherichia coli. Hemolisin pertama
adalah suatu protein dengan ukuran 23kDa, kemungkinan sebagai faktor CAMP,
tidak mengalami reaksi silang dengan antilisteriolisin maupun antibodi anti-SLO.
Hemolisin kedua mengalami reaksi silang dengan anti-SLO. Vicente et al. (1985)
mengidentifikasi 12 rekombinan yang mengekspresikan aktivitas β-hemolitik
setelah kloning genom DNA L. monocytogenes pada sel E. coli. Kedua klon yang
menunjukkan aktivitas hemolitik dapat terdeteksi setelah dilakukan sonikasi pada
subkloning lanjutan. Pada filtrasi gel yang dilakukan setelah sonikasi,
menghasilkan dua puncak aktivitas hemolitik, yaitu protein dengan ukuran 22 kDa
dan 48 kDa, menunjukkan dua jenis hemolisin.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Farber dan Peterkin (1991),
digunakan transposon mutagenesis untuk mengidentifikasi peranan hemolisin
sebagai faktor virulensi dari L. monocytogenes. Transposon mutagenesis
digunakan untuk menginaktivasi determinan genetik pembentukan hemolisin,
yaitu tiga non-hemolitik (Hly-) transkonjugan dan satu hemolitik (Hly+)
transkonjugan. Hly- menghasilkan protein 49 kDa yang non-virulen, sedangkan
Hly+ menghasilkan protein 58 kDa yang bersifat virulen dan hemolitik.

Listeria monocytogenes pada Bahan Pangan
Listeria monocytogenes dapat ditemukan pada lingkungan, seperti debu,
tanah, air laut dan tawar, tanaman, hewan liar dan domestik, makanan hewan
termasuk silase, limbah rumah potong hewan, selokan dan sedikit ditemukan pada
feses (Donnelly 2001; Garbutt 1997). L. monocytogenes juga ditemukan pada
buah-buahan, susu mentah, keju, daging, produk daging, hot dog yang tidak
dimasak, ikan, rennet, daging unggas, ayam masak yang disimpan pada suhu
dingin, ayam masak siap saji, susu pasteurisasi dan produk susu lainnya (Garbutt
1997).
Hewan ternak yang terinfeksi L. monocytogenes dapat melepaskan L.
monocytogenes melalui susu dan fesesnya. Donelly (2001), melaporkan adanya
pelepasan sel L. monocytogenes yang tinggi pada susu yang dihasilkan oleh sapi
dan domba terinfeksi tanpa disertai gejala klinis. Menurut Sanjaya et al. (2007),
cemaran mikroba pada susu dapat terjadi pada ambing, alat penampung susu, alat
penyimpan susu, transportasi, industri pengolahan dan konsumen. Sumber
cemaran L. monocytogenes pada susu dan produknya dapat ditemukan pada rantai
pengolahan, termasuk susu mentah, lingkungan, peralatan, alat pengemas,
pengelolaan sampah, pengendali hewan pengganggu hingga higiene karyawan
yang terlibat (Lovett dan Twedt 2004).
Listeria monocytogenes termasuk golongan bakteri fakultatif anaerobik
dan psikrotrofik yang tumbuh pada kisaran suhu 1–44 oC dengan pertumbuhan
optimal pada suhu 35–37 oC (Ray 2001). Bakteri ini mampu tumbuh dan
berkembang biak dalam pangan yang disimpan pada suhu 4 oC selama 12 minggu.
Oleh karena itu listeriosis selalu dihubungkan dengan konsumsi susu, daging atau
sayuran yang telah disimpan pada suhu refrigerator dalam waktu lama.

9
Sel L. monocytogenes masih mampu tumbuh dalam susu yang telah
dipasteurisasi pada suhu 71 oC selama 15 detik, susu yang dipasteurisasi secara
komersial dengan High Temperature Short Time (HTST) serta dalam produk susu
seperti es krim, keju, yogurt dan susu skim (Johansson 1998; Piyasena et al. 1998).
Forsythe dan Hayes (1998) melaporkan bahwa sel L. monocytogenes masih dapat
ditemukan pada susu pasteurisasi dengan suhu 72 oC selama 15 detik di hari kedua
masa penyimpanan dalam suhu 4 oC. Pertumbuhan sel semakin meningkat setiap
hari hingga 2500 sel per ml pada hari kelima.

Serotipe Listeria monocytogenes
Spesies dari genus Listeria memiliki protein permukaan yang spesifik,
yaitu antigen somatik (O) dan antigen flagelar (H). Kedua jenis antigen
permukaan tersebut merupakan target pengujian serologis yang paling utama
dalam identifikasi strain dari L. monocytogenes. Telah diketahui bahwa terdapat
15 subtipe antigen O (I–XV) dan 4 subtipe antigen H (A–D) (Seeliger dan Jones
1986). Penentuan strain individual Listeria ditentukan dari kombinasi spesifik
antara antigen O dan antigen H (Tabel 4).
Tabel 4 Komposisi antigen somatik (O) dan antigen flagelar (H) pada serotipe
Listeria monocytogenesa
Serotipe
1/2 a
1/2 b
1/2 c
3a
3b
3c
4a
4b
4c
4d
4e
7
a

Antigen O
I, II
I, II
I, II
II, IV
II, IV
II, IV
(V), VII, IX
V, VI
V, VII
(V), VI, VIII
V, VI, (VIII), (IX)
XII, XIII

Antigen H
A, B
A, B, C
B, D
A, B
A, B, C
B, D
A, B, C
A, B, C
A, B, C
A, B, C
A, B, C
A, B, C

Sumber: Seeliger dan Jones 1986

Pengujian serologis terhadap terjadinya aglutinasi antigen O dan H
menghasilkan 12 serotipe L. monocytogenes, yaitu 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a,
4b, 4c, 4d, 4e, dan 7. Metode serotyping selain berguna dalam diferensiasi spesies
Listeria, juga sangat diperlukan untuk menentukan subtipe dan kelompok klonal
dari L. monocytogenes (Liu 2006). Penelitian telah membuktikan bahwa hanya
serotipe 1/2a, 1/2b, dan 4b yang menjadi 98% penyebab terjadinya wabah
listeriosis pada manusia, serotipe 4a dan 4c jarang dikaitkan dengan terjadinya
wabah listeriosis (Wiedmann et al. 1996; Jacquet et al. 2002). Listeria
monocytogenes serotipe 4b paling banyak diisolasi dari kejadian wabah epidemik
listeriosis, sedangkan serotipe 1/2a dan 1/2b dikaitkan dengan terjadinya infeksi
sporadik (Wiedmann et al. 1996). Serotipe 1/2b dan 4a umumnya diisolasi dari

10
domba yang mengalami ensefalitis, sedangkan serotipe 1/2a paling banyak
menjadi penyebab septisemia dan aborsi (Low dan Donachie 1997).
Borucki dan Call (2003) melakukan identifikasi serotipe dari 122 strain L.
monocytogenes asal manusia, hewan, dan lingkungan dengan metode multipleks
dan mismatch amplification mutation assay (MAMA) PCR. Strain L.
monocytogenes dibagi menjadi 3 genetik lineage (atau divisi), divisi I terdiri atas
serotipe 1/2b, 3b, 4b, 4d, dan 4e; divisi II terdiri atas serotipe 1/2a, 1/2c, 3a, dan
3c; divisi III terdiri atas serotipe 4a dan 4c. Doumith et al. (2004)
mengembangkan metode PCR multipleks yang lebih sederhana untuk
mengidentifikasi serotipe L. monocytogenes dan berhasil memisahkan strain–
strain L. monocytogenes ke dalam empat serogrup, yaitu grup 1 terdiri dari
serotipe 1/2a dan 3a; grup 2 terdiri dari serotipe 1/2c dan 3c; grup 3 terdiri dari
serotipe 1/2b, 3b, dan 7; dan grup 4 terdiri dari serotipe 4b, 4d, dan 4e.

3 METODE

Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2015 sampai dengan Maret 2016.
Pengambilan sampel susu segar dilakukan di Kabupaten Enrekang Propinsi
Sulawesi Selatan. Tahap isolasi dan identifikasi bakteri L. monocytogenes
dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bioteknologi Terpadu
Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin, sedangkan tahap konfirmasi spesies
L. monocytogenes dan identifikasi serotipe dilakukan di Laboratorium Divisi
Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner dan di Laboratorium Pendidikan dan Layanan, Fakultas
Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.

Pengambilan Contoh Susu Segar
Jumlah populasi sapi perah betina produktif di Kabupaten Enrekang adalah
1020 ekor (BPS 2014). Contoh susu segar diambil dari 10% dari total populasi
sapi perah betina produktif, yaitu minimal 102 sampel. Pengambilan sampel
dilakukan secara aseptik sebanyak 100 ml susu segar per ekor sapi. Sampel
tersebut dimasukkan ke dalam botol kaca steril, diberi kode sampel, dan
ditempatkan di dalam kotak pendingin yang dilengkapi dengan ice pack untuk
pengangkutan ke laboratorium dan selanjutnya dilakukan penggabungan (pooling)
yang terdiri dari 3–5 sampel per pool. Penggabungan (pooling) dilakukan
berdasarkan kandang tempat pengambilan contoh susu yang lokasinya berdekatan.
Sebanyak 5 ml susu segar diambil dari tiap sampel individu dan dimasukkan ke
dalam tabung erlenmeyer steril. Sampel pool dengan volume 25 ml selanjutnya
digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri.

11
Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar
Kultur pada Media Agar dan Uji Biokimiawi
Tahap pengayaan dilakukan menggunakan media Buffered Listeria
Enrichment Broth (Buffered LEB, CM 0897, Oxoid, England). Sebanyak 25 ml
contoh susu segar ditambahkan ke dalam 225 ml LEB kemudian diinkubasi pada
suhu 30 oC selama 24 jam, 48 jam, dan 7 hari. Setelah inkubasi 24 jam, dilakukan
tahap isolasi dengan menumbuhkan sebanyak satu ose larutan tersebut pada media
Listeria Selective Agar Base (Oxford Agar, CM 0856, Oxoid, England) dengan
suplementasi Listeria Selective Supplement (Oxford formula, SR 0140). Inkubasi
pada media Listeria Selective Agar Base dilakukan pada suhu 35–37 oC selama
24–48 jam. Cara yang sama dilakukan setelah inkubasi pada media LEB selama
48 jam dan 7 hari apabila tidak ada pertumbuhan bakteri pada media LSA dari
biakan media LEB yang diinkubasi selama 24 jam.
Adanya pertumbuhan Listeria ditandai dengan koloni pada media Listeria
Selective Agar Base berukuran diameter 1 mm dengan halo berwarna coklat–
hitam. Sebanyak 3–5 koloni tersebut kemudian diuji lanjut dengan pewarnaan
Gram dan uji biokimiawi, yaitu uji fermentasi karbohidrat (rhamnosa, mannitol,
dan xylosa), uji motilitas pada media sulfide-indol-motilitas (SIM), uji katalase,
uji KOH 3%, dan uji hemolisa pada media agar darah. Strain L. monocytogenes
ATCC 7644 digunakan sebagai kontrol positif.
Ekstraksi DNA
DNA bakteri diekstraksi dengan menggunakan PrestoTM Mini gDNA
Bacteria Kit (Geneaid Biotech Ltd.). Sampel sebanyak 109 sel bakteri dimasukkan
ke dalam tabung mikrosentrifugasi ukuran 1.5 ml, kemudian disentrifugasi
14000–16000×g selama 1 menit dan supernatannya dibuang. Sebanyak 200 µl
Gram+ buffer (mengandung lisozim 4 mg/ml) ditambahkan ke dalam sampel
untuk meresuspensi pelet kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit.
Sebanyak 20 µl Proteinase K kemudian ditambahkan ke dalam tabung dan
diinkubasi pada suhu 60 oC selama 10 menit. Sebanyak 200 µl GB buffer
ditambahkan ke dalam tabung sampel kemudian dihomogenkan dengan vortex
selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu 70 oC selama 10 menit untuk
memastikan lisat menjadi bening. Pada tahap ini, dilakukan pemanasan Elution
buffer (sebanyak 200 µl per sampel) hingga mencapai suhu 70 oC. Sebanyak 200
µl etanol absolut ditambahkan untuk menghilangkan endapan pada tabung.
Tabung GD column ditempatkan pada tabung koleksi ukuran 2 ml, selanjutnya
campuran sampel dipindahkan ke dalam GD column dan disentrifugasi 14000–
16000×g selama 2 menit. Tabung koleksi beserta cairan yang tersisa dibuang,
kemudian GD column ditempatkan pada tabung koleksi yang baru. Proses
pencucian dilakukan dengan menambahkan 400 µl W1 buffer ke dalam GD
column, disentrifugasi 14000 –16000×g selama 30 detik, kemudian cairan yang
tersisa dibuang dan GD column ditempatkan kembali pada tabung koleksi.
Sebanyak 600 µl Wash buffer ditambahkan ke dalam GD column, disentrifugasi
14000–16000×g selama 30 detik, kemudian cairan yang tersisa dibuang dan GD
column ditempatkan kembali pada tabung koleksi. Sentrifugasi 14000–16000×g
dilakukan selama 3 menit untuk mengeringkan matriks column. GD column
ditempatkan pada tabung mikro ukuran 1.5 ml dan ditambahkan 100 µl Elution

12
buffer yang telah dipanaskan sebelumnya, selanjutnya didiamkan selama 3 menit
agar Elution buffer terabsorbsi seluruhnya. Tahap akhir dilakukan sentrifugasi
14000–16000×g selama 30 detik untuk memperoleh DNA hasil ekstraksi.
Konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Identifikasi Gen Hemolisin (hly) dan Gen Invasive Associated Protein (iap)
Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk identifikasi spesies L.
monocytogenes dilakukan menggunakan primer yang spesifik untuk gen hemolisin
(hly) dan invasive associated protein (iap) (Swetha et al. 2012). Sekuens primer
yang digunakan ditampilkan pada Tabel 5.
Tabel 5 Primer yang digunakan untuk identifikasi spesies L. monocytogenesa
Primer

Gen
Target

iap

iap

hlyA

hly

a

Sekuens primer
For: 5'–ACAAGCTGCACCTGTTGCAG–3'
Rev: 5'–TGACAGCGTGTGTAGTAGCA–3'
For: 5'–GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAA–3'
Rev: 5'–GCAACGTATCCTCCAGAGTGATCG–3'

Ukuran
produk
(bp)

Suhu
Annealing
(oC)

131

59

456

54

Sumber: Swetha et al. 2012

Gambar 2 Skema posisi primer iap dan hlyA pada genom L. monocytogenes
Reaksi amplifikasi dilakukan menggunakan kit QIAGEN® HotStarTaq
Plus Mastermix sesuai dengan panduan perusahaan. Campuran reaksi amplifikasi
mengandung 1 µl template DNA bakteri, 10 µM µM masing–masing primer
sebanyak 1µl, 10 µl 2×QIAGEN HotStarTaq Plus Mastermix (mengandung 5U
taq polymerase, PCR buffer dengan 3 mM MgCl2, dan 400 µM dNTP), dan
RNAse free water dengan volume akhir 20 µl. Kondisi siklus PCR adalah sebagai
berikut: 95 oC selama 3 menit diikuti dengan 35 siklus dengan suhu 95 oC selama
1 menit, 54–59 oC (suhu annealing masing–masing primer seperti tercantum pada
tabel 8) selama 30 detik, 72 oC selama 1 menit, dan tahap akhir 72 oC selama 10
menit. Produk PCR divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarose 1.5%
yang mengandung etidium bromida 0.4 μg/ml dan diamati menggunakan UV
transluminator.

13
Identifikasi Serotipe Listeria monocytogenes dengan Metode PCR
Sampel–sampel yang menunjukkan hasil positif sebagai bakteri L
monocytogenes selanjutnya diidentifikasi serotipenya dengan metode PCR
multipleks yang mengacu pada Doumith et al. (2004). Tabel 6 menampilkan
sekuens primer dan spesifisitas serotipenya yang digunakan dalam PCR
multipleks.
Tabel 6 Primer yang digunakan untuk identifikasi serotipe L. monocytogenesa
Primer

Sekuen primer

For: 5'–AGGGCTTCAAGGACTTACCC–3'
Rev: 5'–ACGATTTCTGCTTGCCATTC–3'
lmo1118 For: 5'–AGGGGTCTTAAATCCTGGAA–3'
Rev: 5'–CGGCTTGTTCGGCATACTTA–3'
ORF2819 For: 5'–AGCAAAATGCCAAAACTCGT–3'
Rev: 5'–CATCACTAAAGCCTCCCATTG–3'
ORF2110 For: 5'–AGTGGACAATTGATTGGTGAA–3'
Rev: 5'–CATCCATCCCTTACTTTGGAC–3'
a
Sumber: Doumith et al. 2004

lmo0737

Ukuran
produk (bp)

Spesifisitas serotipe

691

1/2a, 1/2c, 3a, 3c

906

1/2c, 3c

471

1/2b, 3b, 4b, 4d, 4e

597

4b, 4d, 4e

Reaksi amplifikasi multipleks dilakukan menggunakan QIAGEN®
Multiplex PCR Kit sesuai dengan panduan perusahaan. Campuran reaksi
amplifikasi mengandung 1 µl template DNA bakteri, 10 µM masing–masing
primer sebanyak 0.4 µl, 10 µl 1×QIAGEN Multipleks PCR Mastermix, dan
RNAse free water dengan volume akhir 20 µl. Siklus PCR diawali dengan predenaturasi pada suhu 95 oC selama 15 menit, diikuti dengan 35× (94 oC selama 30
detik, 57 oC selama 90 detik dan 72 oC selama 90 detik) dan ekstensi akhir pada 72
o
C selama 10 menit. Produk PCR multipleks divisualisasi menggunakan
elektroforesis gel agarose 1.5% yang mengandung etidium bromida 0.4 μg/ml dan
diamati menggunakan UV transluminator.

Pengurutan Oligonukleotida (Sekuensing) DNA
Pengurutan Oligonukleotida Parsial Gen hly dari Listeria monocytogenes
Produk-produk PCR yang menunjukkan hasil positif selanjutnya
disekuensing. Sekuensing DNA dilakukan menggunakan BigDye® Terminator
v3.1 cycle sequencing kit serta primer hlyA-forward. Tahap pertama diawali
dengan purifikasi produk PCR menggunakan Centricon®-100 columns. Sebanyak
2 ml air deionisasi dimasukkan ke dalam column, ditambahkan sampel produk
PCR, kemudian disentrifugasi 3000×g selama 10 menit. Wadah penampung
ampas dibuang dan vial dilekatkan. Column selanjutnya dibalik dan disentrifugasi
270×g selama 2 menit. Tahap kedua adalah cycle sequencing dengan campuran
reaksi 4 µl 2×Ready Reaction Premix, 2 µl 5×BigDye sequencing buffer, primer
dengan konsentrasi 3.2 pmol/µl, 3–10 ng template, dan air deionisasi sampai
volume 20 µl. Reaksi cycle sequencing dimulai dengan denaturasi awal pada suhu
96 ºC selama 1 menit, diikuti dengan 25 siklus pada suhu 96 oC selama 10 detik,
50 oC selama 5 detik, dan 60 oCselama 4 menit. Tahap ketiga adalah purifikasi
produk cycle sequencing menggunakan Centri-Sep™ spin columns. Diawali
dengan menambahkan 2 µl sodium dodecyl sulfate 2.2% kemudian dipanaskan

14
pada suhu 95 oC selama 5 menit. Campuran produk ekstensi kemudian
dimasukkan ke dalam spin column dan disentrifugasi 730×g selama 2 menit untuk
mengkoleksi sampel. Tahap keempat, sampel dimasukkan ke dalam mesin
sequencer untuk dibaca susunan oligonukleotidanya.
Analisa Hasil Pengurutan Oligonukleotida (Sekuensing) DNA
Hasil sekuensing DNA dianalisa dengan perangkat lunak BioEdit®
sequence alignment editor (Hall 1999). Parameter yang dianalisa adalah
menentukan kemiripan susunan oligonukleotida dari isolat sampel dengan
beberapa strain L. monocytogenes yang terdapat pada basis data di GenBank.

Analisa Data
Seluruh data yang diperoleh dari penelitian ini dianalisa secara deskriptif.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL
Pengambilan Contoh Susu Segar
Contoh susu segar diambil dari 107 ekor sapi secara acak dari lokasi
pemeliharaan sapi perah pada 5 kecamatan, yaitu Kecamatan Enrekang, Cendana,
Baraka, Anggeraja, dan Alla. Kelima kecamatan tersebut merupakan sentra
pemeliharaan sapi perah di Kabupaten Enrekang, Sulawesi Selatan. Sebanyak 107
contoh susu segar kemudian digabung menjadi 31 pool berdasarkan kandang
tempat pengambilan contoh susu yang lokasinya berdekatan. Tabel 7
menampilkan jumlah contoh susu segar yang diambil dari masing–masing
kecamatan.
Tabel 7 Lokasi dan jumlah contoh susu segar yang diambil dari 5 kecamatan di
Kabupaten Enrekang
No. Kecamatan
1.
2.
3.
4.
5.

Cendana
Anggeraja
Baraka
Enrekang
Alla
Jumlah

Jumlah sampel
(ekor)
45
24
11
21
6
107

Jumlah pool

Kode Sampel

14
7
3
5
2
31

1–14
15–19, 30–31
20–22
23–27
28–29

15
Isolasi dan Identifikasi Listeria monocytogenes dari Susu Segar
Kultur pada Media Agar dan Uji Biokimiawi
Kultur pada media Listeria Selective Agar (LSA) setelah dilakukan
pengayaan pada media Listeria Enrichment Broth (LEB) menunjukkan hasil
keseluruhan sampel 31 pool dapat tumbuh pada media selektif tersebut dan
sebagian besar kultur terdiri atas 2 koloni bakteri yang berbeda, yaitu koloni yang
membentuk halo berwarna coklat–hitam dan koloni yang tidak membentuk halo.
Kultur kontrol positif bakteri Listeria monocytogenes ATCC 7644 pada media
LSA menghasilkan koloni bakteri berukuran diameter 1 mm dengan halo
berwarna coklat–hitam (Gambar 3a).

a

b

Gambar 3 Hasil kultur pada media LSA. Koloni yang diduga L. monocytogenes
membentuk halo berwarna coklat–hitam dan berukuran 1 mm. (a)
kultur isolat kontrol positif bakteri L. monocytogenes, (b) kultur isolat
sampel yang diduga L. monocytogenes
Pewarnaan Gram dari 31 koloni menunjukkan hasil sebanyak 24 koloni
yang berbentuk batang dan bersifat Gram positif. Gambar 4 menunjukkan hasil
pewarnaan Gram dari isolat kontrol positif dan isolat sampel diduga L.
monocytogenes. Sejumlah 24 koloni yang menunjukkan bakteri Gram positif dan
berbentuk batang, selanjutnya diuji lanjut dengan uji biokimiawi, yaitu uji
fermentasi karbohidrat (rhamnosa, mannitol, dan xylosa), uji motilitas pada media
sulfide-indol-motilitas (SIM), uji katalase, uji KOH 3%, dan uji hemolisa pada
media agar darah. Tabel 8 menunjukkan hasil uji biokimiawi dari isolat L.
monocytogenes ATCC 7644 dan 24 isolat sampel yang diduga L. monocytogenes.
Uji biokimiawi dari L. monocytogenes ATCC 7644 menunjukkan hasil
positif untuk uji motilitas, fermentasi rhamnosa, uji KOH, dan uji hemolisa, serta
hasil negatif untuk uji fermentasi xylosa, fermentasi mannitol, dan uji katalase.
Hasil uji biokimiawi terhadap 24 isolat sampel menunjukkan sebanyak 21 isolat
adalah L. monocytogenes. Dua puluh satu isolat tersebut menunjukkan hasil positif
untuk fermentasi rhamnosa dan uji katalase, serta hasil negatif untuk fermentasi
xylosa, fermentasi mannitol, dan uji KOH. Pada pengujian motilitas, terdapat 5
dari 21 isolat yang menunjukkan hasil negatif, sedangkan pada pengujian
hemolisa dengan media agar darah terdapat 9 dari 21 isolat yang menunjukkan
hasil negatif.

16

Gambar 4 Hasil pewarnaan Gram. Bakteri L. monocytogenes berrbentuk batang
dan bersifat Gram positif. (a) Isolat bakteri L. monocytogenes ATCC
7644 dan (b) isolat sampel yang diduga L. monocytogenes
Listeria monocytogenes diketahui bersifat motil bila ditumbuhkan pada
suhu 20–25 oC dengan adanya pertumbuhan flagella peritrikus (Gyles et al. 2010).
Pengujian motilitas dilakukan pada media semisolid dengan inkubasi pada suhu
22–30 oC karena gen flaA yang mengkode subunit flagellin mengalami downregulation pada temperatur yang lebih tinggi. Motilitas L. monocytogenes
ditunjukkan oleh pertumbuhan berbentuk payung pada media semisolid. Pada
pengujian motilitas, sering kali ditemukan isolat L. monocytogenes yang non motil,
sehingga hasil pengujian motilitas saja tidak cukup untuk menentukan isolat
tersebut adalah L. monocytogenes atau bukan (Gorski 2008). Struktur flagellar
berkontribusi terhadap virulensi patogen gastrointestinal, baik sebagai efektor
motilitas, sebagai adesin, atau sebagai suatu apparatus sekresi untuk faktor
virulensi. L. monocytogenes menggunakan flagella untuk meningkatkan efisiensi
invasi sel epitel (Bigot et al. 2005). Telah dilaporkan pula bahwa flagella L.
monocytogenes digunakan untuk motilitas, bukan sebagai adhesin, untuk
meningkatkan invasi sel inang (O’Neil dan Marquis 2006).
Kemampuan L. monocytogenes menghasilkan zona hemolisa pada media
agar darah disebabkan adanya toksin hemolisin yang disebut Listeriolisin O
(LLO). Listeriolisin O merupakan faktor virulensi yang utama.Sekresi hemolisin
sangat penting dalam pertumbuhan intraseluler dan pengenalan organisme ini oleh
sel T (Farber dan Peterkin 1991).

17
Tabel 8 Hasil uji biokimiawi dari isolat L. monocytogenes ATCC 7644 dan 24
isolat sampel diduga L. monocytogenes
No.

No.
isolat

Bentuk

Sifat
Gram

Uji biokimiawi
motilitas

mannitol

xylosa

rhamnosa

KOH

katalase

hemolisa

+

–

–

+

–

+

+

positif

+

–

–

+

–

+

–

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

batang

positif

+

–

–

+

–

+

–

batang

positif

–

–

–

+

–

+

–

1

Kontrol
+ Lm

batang

positif

2

2B

batang

3

4A

4

4B

5

5B

6

7A

batang

positif

–

–

+

+

–

+

–

7

7B

batang

positif

–

–

–

+

–

+

–

8

14A

batang

positif

+

–

–

+

–

+

–

9

14B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

–

batang

positif

+

+

–

+

–

+

–

–

–

+

–

+

–

10

a

15B

a

11

16B

batang

positif

+

12

17

batang

positif

+

–

–

+

–

+

–

13

18A

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

14

18B

batang

positif

–

–

–

+

–

+

+

15

19Ba

batang

positif

–

–

–

–

–

+

–

16

20

batang

positif

–

–

–

+

–

+

+

17

21B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

18

22B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

19

23B

batang

positif

–

–

–

+

–

+

+

20

24A

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

21

25A

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

22

25B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

23

26B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

24

29B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

–

25

30B

batang

positif

+

–

–

+

–

+

+

Kualitas DNA Bakteri Hasil Ekstraksi
Ekstraksi DNA bakteri dilakukan menggunakan PrestoTM Mini gDNA
Bacteria Kit (Geneaid Biotech Ltd.). Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil
ekstraksi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm.Panjang gelombang 260 nm merupakan absorbansi maksimal untuk asam
nukleat, sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan absorbansi maksimal
untuk protein. Perbandingan nilai absorbansi 260 nm dengan 280 nm menjadi
ukuran kemurnian DNA, yaitu DNA dengan tingkat kemurnian yang baik bila
nilai rasio A260/A280 adalah 1.8–2.0 (Barbas et al. 2001). Isolat kontrol positif L.
monocytogenes ATCC 7644 dan 24 isolat sampel menghasilkan konsentrasi DNA
bakteri yang bervariasi. Konsentrasi tertinggi adalah isolat nomer 4B yaitu 241.2
ng/μl dan konsentrasi terendah adalah isolat 29B, yaitu 10.9 ng/μl. Tingkat
kemurnian DNA terendah pada isolat 4B dan 19B dengan nilai rasio A260/A280

18
sebesar 1.55, nilai tersebut mengindikasikan adanya kontaminasi oleh protein atau
fenol. Hasil pengukuran kualitas DNA bakteri hasil ekstraksi ditampilkan pada
Lampiran 1.
Identifikasi Parsial Gen iap dan hly