DNA Barkode Spodoptera exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah dan Dataran Tinggi di Jawa
DNA BARKODE Spodoptera exigua Hubn. POPULASI
DATARAN RENDAH DAN DATARAN TINGGI DI JAWA
ANDI TRISNANDI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul DNA Barkode Spodoptera
exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah dan Dataran Tinggi di Jawa adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Andi Trisnandi
NIM G34090046
ABSTRAK
ANDI TRISNANDI. DNA Barkode Spodoptera exigua Hubn. Populasi Dataran
Rendah dan Dataran Tinggi di Jawa. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan I MADE
SAMUDRA.
Spodoptera exigua menginfestasi tanaman bawang merah pada dataran rendah
dan bawang daun pada dataran tinggi di Jawa. Berdasarkan morfologi ngengat S.
exigua yang menginfestasi tanaman bawang pada dataran tinggi mempunyai ukuran
morfologi lebih besar dibandingkan dataran rendah. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mempelajari variasi genetik pada perbedaan morfologi ngengat S. exigua berdasarkan
analisis gen cythocrhome oxydase subunit 1 (COI) sebagai DNA Barkode. Sampel
DNA S. exigua dikoleksi dari populasi dataran rendah (Cirebon dan Brebes) dan
dataran tinggi (Bandung dan Cipanas) di Jawa dengan menggunakan perangkap
berferomon dan kemudian dilakukan proses analisis DNA. Database sekuen gen COI
ngengat S. exigua dibandingkan dengan S. exigua sekuen gen COI yang berasal dari
Jepang, Cina, Thailand, Canada, dan Florida. Amplifikasi dan sekuen gen COI secara
parsial menghasilkan 530 pb nukleotida. Hasil alignment DNA antara sampel di
empat lokasi di Jawa memperlihatkan tidak adanya variasi nukleotida pada gen
COI. Pada konstruksi filogeni berdasarkan gen COI terdapat tiga kelompok utama S.
exigua yaitu kelompok pertama S. exigua di Jawa membentuk clade dengan S. exigua
asal Jepang, Thailand dan China, kelompok kedua dan ketiga adalah empat haplotipe
S. exigua asal Florida dan Canada. Perbedaan haplotipe ini dapat berfungsi sebagai
barkode untuk membedakan variasi di dalam spesies S. exigua di berbagai belahan
dunia
Kata kunci: Gen COI, mitokondria, haplotipe, Spodoptera exigua, bawang merah
ABSTRACT
ANDI TRISNANDI. DNA Barcodes of Spodoptera exigua Hubn. in Lowlands
and Highlands in Java. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and I MADE SAMUDRA.
Spodoptera exigua infests shallot in lowlands and leek in highlands n Java.
Based on the morphology of body size, moth of S. exigua that infests onion plants in
highland has bigger than in the lowland S. exigua. This research was aimed to study
genetic variations COI gene of moth S. exigua as the DNA Barcode for this species.
DNA sample of moth S. exigua was collected from populations in lowlands
(Cirebon and Brebes) and higlands (Bandung and Cipanas) in Java by using baited
with pheromone lure and then performed process of DNA analysis. The moth S.
exigua COI gene sequences from this study were aligned with COI gene
sequences of moth S. exigua from Japan, China, Thailand, Florida-USA, and Canada.
This study obtained a total of 530 bp nucleotides of partial COI gene. Alignment of
four DNA sequences of partial COI gene from four locations in Java showed no
nucleotide variation in COI gene among samples from Java. The phylogenetic tree
of COI gene revealed three major clades. The first clade S. exigua from Java
grouped in the same clade with that of S. exigua from Japan, Thailand, and China.
The second and third clades were haplotype clades of S. exigua from Florida-USA
and Canada, respectively. These different haplotypes could be used as the DNA
barcode to differentiate the intraspesific variations of S. exigua in the world
Keywords: COI gene, mitochondria, haploptype, Spodoptera exigua, shallot
DNA BARKODE Spodoptera exigua Hubn. POPULASI
DATARAN RENDAH DAN DATARAN TINGGI DI JAWA
ANDI TRISNANDI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : DNA Barkode Spodoptera exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah
dan Dataran Tinggi di Jawa
Nama
: Andi Trisnandi
NIM
: G34090046
Disetujui oleh
Dr Ir Rika Raffiudin, MSi
Pembimbing I
Dr Ir I Made Samudra, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi: DNA Barkode Spodoplera exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah
dan Dataran Tinggi i Jawa
Nama
: Andi Trisnandi
: 034090046
NIM
Disetujui oleh
_ J;VfWW'
Dr Ir Rika Raffiudin, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
Ｎｾ＠
Dr Ir I Made Samudra, MSc
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari hingga juni 2013 ini ialah DNA
barkode, dengan judul DNA barkode Spodoptera exigua di dataran rendah dan dataran
tinggi di Jawa.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Rika Raffiudin, MSi dan Bapak Dr
Ir I Made Samudra, MSc selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Bapak Suwito dan Bapak Jusuf (staf Balai Besar Bioteknologi dan
Pengembangan Sumberdaya Genetik Pertanian) yang telah membantu pelaksanaan
penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh
keluarga atas segala doa, serta teman – teman Biologi 46, Ical, Kak Gina, Kak Eni, Kak
Uce, dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan seluruhnya atas segala bantuan dan
dukungan kepada penulis
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2013
Andi Trisnandi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
ABSTRAK
ii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE PENELITIAN
2
Bahan
2
Ekstraksi dan Presipitasi DNA
2
Amplifikasi DNA
3
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
4
Alignment DNA dan analisis filogeni
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Koleksi Sampel Ngengat Bawang S. exigua
4
Amplifikasi dan Alignment Sekuen DNA Gen COI
5
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni Sekuen DNA Gen COI
9
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1 Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Spodoptera exigua (No.
Akses GenBank NC019622)............................................................................. 3
2 Data hasil koleksi S. exigua yang digunakan dalam penelitian ........................ 4
3 Data sampel ingroup (S. exigua) dan outgroup (S. litura dan S. littoralis)
yang digunakan untuk analisis gen COI pada penelitian ini
6
4 Jarak genetik berdasarkan sekuen DNA gen COI ingroup dan outgroup ......... 9
DAFTAR GAMBAR
1 Ngengat S. exigua di dataran tinggi dan ngengat S. exigua di dataran
rendah………………………………………………………………………... 5
2 Amplikon pita DNA gen COI S. exigua..…………………………………….6
3 Alignment DNA gen COI S. exigua……………………………………… 8
4 Konstruksi pohon filogeni
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria ngengat S. exigua
menggunakan primer forward COI-47F
2 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria ngengat S. exigua
menggunakan primer reverse COI-916R
12
13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ulat bawang Spodoptera exigua Hubn. (Lepidoptera: Noctuidae), merupakan
salah satu spesies dari genus Spodoptera yang bersifat kosmopolit, dan polifag yang
berasal dari Asia Tenggara. Persebaran S. exigua hampir berada diseluruh belahan bumi
kecuali Amerika Selatan (Brown dan Drewhurst 1975). Ulat ini ditemukan di
Amerika Utara pada tahun 1876, ketika itu ditemukan di Oregon dan Florida (Capinera
2001).
Persebaran S. exigua diberbagai belahan bumi dibantu oleh sifatnya yang
dapat hidup di lebih dari satu tanaman inang. Beberapa tanaman yang menjadi inang
dari ulat S. exigua adalah asparagus, kacang, brokoli, cabai, kembang kol,
seledri, jagung, bawang, tomat, dan tembakau (Capinera 2001). Ulat S. exigua
banyak menginfestasi tanaman bawang di Jawa, antara lain bawang merah dan
bawang daun (Kalshoven 1981). Infestasi dari S. exigua dapat menyebabkan
kehilangan hasil hingga 57% (Ditjen Hortikultura 2010). Infestasi ulat bawang ditandai
dengan bercak putih transparan pada bagian epidermis daun karena daun bagian
epidermis dalamnya dimakan.
Pada dataran tinggi, tanaman bawang yang dapat tumbuh dengan baik
adalah bawang daun dan pada dataran rendah adalah bawang merah. Berdasarkan
morfologi populasi ngengat S. exigua yang menginfestasi tanaman bawang pada
dataran tinggi mempunyai ukuran morfologi lebih besar dibandingkan dataran
rendah (Samudra 29 November 2012, komunikasi pribadi). Pada penelitian ini
digunakan DNA barkode untuk melihat secara molekuler variasi genetik ulat
bawang S. exigua Hubn. berdasarkan gen cytochrome oxydase subunit 1 (COI)
dengan pengambilan sampel pada empat populasi berdasarkan ketinggian yaitu dua
lokasi di dataran rendah (Cirebon dan Berebes) dan dua lokasi di dataran tinggi
(Bandung dan Cipanas).
DNA barkode adalah suatu sistem baru yang menjadi salah satu
alternatif pelengkap atau komplemen yang dapat memperkuat identifikasi morfologi
secara cepat dan akurat (Lahaye et al. 2008). DNA barkode dirancang untuk
mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan menggunakan DNA
pendek yang distandardisasi (Hebert dan Gregory 2005). Teknik ini dapat
menyediakan sebuah “barkode biologi” dari
urutan
pendek
DNA
yang
distandardisasi untuk mengenali suatu spesies (Hajibabaei et al. 2006). Pada
teknik DNA barkode digunakan gen DNA mitokondria gen COI karena dapat
digunakan untuk mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Hebert et al. 2003).
DNA mitokondria bersifat haploid, tidak ada rekombinan, memiliki jumlah kopi
yang banyak, dan diturunkan secara maternal (maternal inherited) (Harrison 1989).
Nagoshi et. al (2010) menggunakan DNA barkode untuk mengidentifikasi
spesies serangga yang invasif dari genus Spodoptera di Florida. Spesies lokal
Spodoptera yang terdapat di Florida adalah S. eridania, S. exigua, dan S. frugiperda.
Berdasarkan gen COI didapatkan spesies invasif Spodoptera di Florida yaitu S.
litura dan S. littoralis. Identifikasi spesies invasif dilakukan perbandingan analisis
sekuen gen COI S. litura (HM756093) asal Taiwan dan S. littoralis (HM756074) asal
Portugal dengan sekuen S. litura dan S. littoralis yang terdapat di Florida
2
.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari variasi genetik gen COI Spodoptera
exigua Hubn. pada empat populasi di dataran rendah (Brebes dan Cirebon) dan dataran
tinggi (Bandung dan Cipanas) di Jawa untuk digunakan sebagai database DNA barkode.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat untuk digunakan sebagai database dan sebagai penciri
molekuler dari spesies Spodoptera exigua asal Jawa.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai dengan Juni 2013 bagian
Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ialah DNA yang diekstraksi pada bagian
toraks ngengat S. exigua. Sampel diambil dari daerah dataran rendah (Brebes dan
Cirebon) dan dataran tinggi (Bandung dan Cipanas). Pengambilan sampel dilakukan
dengan menggunakan perangkap berferomon. Feromon exi (yang diperoleh dari BB
Biogen), yaitu feromon analog S. exigua betina yang berguna untuk menarik S.
exigua jantan. Sampel yang didapatkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml
yang berisi alkohol absolut.
Ekstraksi dan Presipitasi DNA
Sumber DNA yang digunakan berasal dari bagian toraks ngengat S. exigua.
DNA diekstraksi dengan menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide) (CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0, 3 ml 0.5 M
NaEDTA pH 8.0, 6.135 g NaCl, 1.5 g CTAB, air hingga 75 ml) dan presipitasi
etanol berdasarkan metode Sambrook et al. (1989) dengan modifikasi (Raffiudin
dan Crozier 2007). Toraks yang disimpan dalam alkohol absolut kemudian
dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi larutan Tris-HCL EDTA (TE) (2
M Tris HCl-EDTA pH 8, 2 M EDTA) 500 µl untuk menggantikan alkohol absolut
dalam jaringan dengan pergantian TE dilakukan sebanyak 3 kali.
Bagian toraks dipotong menggunakan pisau scalpel steril dan dimasukkan dalam
tabung 1.5 ml lalu tabung direndam dalam nitrogen cair agar jaringan
mengeras. Kemudian ditambahkan CTAB 500 µl (CTAB 0.2 % (b/v) dan ProteinaseK 10 µl (5 g/ml) untuk melisis protein, lalu diinkubasi pada suhu 55 °C selama 2
jam. Setelah itu tabung disentrifugasi 11 300 g (10 menit), supernatan dipindahkan
ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 250 µl PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl
alcohol = 25:24:1) dan diputar membentuk angka 8 (1 menit). Tabung yang sudah
3
diputar kemudian disentrifugasi kembali 11 300 g (5 menit) dan akan membentuk
dua lapisan larutan yaitu lapisan PCI pada bagian bawah tabung dibuang dan lapisan
atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru. Selanjutnya
tabung yang berisi DNA ditambahkan 400 µl larutan CIAA (Chloroform :
Isoamyl alkohol = 24:1), diputar kembali (1 menit) dan disentrifugasi 11 300 g (1
menit). Tahapan CIAA dilakukan sebanyak dua kali, dan didapatkan DNA pada
lapisan bagian atas dipindahkan pada tabung baru 1.5 ml, kemudian ditambahkan
isopropanol 600 µl dan disimpan semalam pada suhu -4 °C.
Tahapan berikutnya ialah presipitasi DNA dilakukan dengan sentrifugasi 11 300
g (30 menit) pada suhu 4 °C untuk mendapatkan endapan DNA. Isopropanol
kemudian dibuang dan ditambahkan alkohol 70% (v/v) lalu disentrifugasi 11 300 g
(10 menit) pada suhu 4 °C. Setelah itu alkohol 70% dibuang dan pelet DNA
dikeringkan dengan cara divakum 650 mm/Hg (30 menit) sampai kandungan alkohol
hilang. Selanjutnya endapan DNA murni hasil ekstraksi ditambahkan 20 µl TE
(0.5 mM) kemudian disimpan dalam suhu -4 °C untuk dilanjutkan ke tahapan analisis
berikutnya.
Amplifikasi DNA
DNA diamplifikasi secara in vitro dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan mesin thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC1).
Gen target yang diamplifikasi adalah gen COI, dengan menggunakan primer forward
COI-47F dan reverse-916R (Tabel 1). Sekuen kedua primer ini adalah hasil
modifikasi dari primer forward COI-45F dan reverse-914R (Nagoshi et al. 2010),
yaitu dengan penambahan dua basa pada ujung 3’ (Tabel 1). Modifikasi primer
dilakukan karena hasil pita DNA dari gen target yang dihasilkan dengan
menggunakan primer dari Nagoshi menghasilkan pita yang tipis dan dengan suhu
annealing yang rendah yaitu 48 °C Primer tersebut mengamplifikasi sekuen
sebesar ± 800 pb.
Total pereaksi yang digunakan dalam proses PCR adalah 20 µl terdiri atas
akuades steril 7.4 µl, primer forward 0.8 µl, primer reverse 0.8 µl, Kapa Taq
ReadyMix DNA Polymerase 10 µl (buffer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4
mM, KapaTaq DNA Polymerase 0.05 U/ µl) dan cetakan DNA 1µl. Proses
amplifkasi pada mesin PCR terdiri atas lima tahap, yaitu pradenaturation pada
suhu 94°C selama 2 menit. Kemudian sebanyak 30 siklus dilakukan pada proses
denaturation 1 menit, annealing pada suhu 56°C dan 59°C selama 1 menit,
elongation pada suhu 72°C selama 1 menit, post-elongation selama 2 menit
Tabel 1 Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Spodoptera exigua (No. Akses
GenBank NC019622) ) (Nagoshi et al. 2010)
No
Primer
1
COI-45F
COI-914R
2
COI-47F
COI-916R
Urutan basa (5’-3’)
Primer sebelum di modifikasi
TTCGAGCTGAATTAGGAACTC
TTATAGTTGCAGATGTAAAGTA
Primer setelah di modifikasi
TTCGAGCTGAATTAGGAACTCCA
GCAGATGTAAAGTATGCTCGTGT
Posisi primer pada
mtDNA S. exigua
1558-1578
2358-2379
1558-1580
2349-2371
4
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA kemudian dimigrasikan sebanyak 1 µl dengan
poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) 6% menggunakan buffer 1x TBE (Tris 0.5 M,
asam borat 0.65 M, EDTA 0.002 M). Visualisasi DNA dengan metode pewarnaan perak
nitrat (Byun et al. 2009).
Alignment DNA dan Analisis Filogeni
Hasil Hasil amplifikasi DNA disekuen dengan dikirim kepada perusahaan
jasa sekuen. Runutan nukleotida yang diperoleh diedit secara manual
berdasarkan kromatogram menggunakan software BioEdit Sequence Alignment
dan Genetyx Vs 4.01. Runutan – runutan nukleotida yang telah diedit lalu di
alignment menggunakan program Clustal X. Analisis variasi nukleotida dan
analisis filogeni menggunakan program MEGA versi 5 (Tamura et al. 2011).
Proses pengeditan diawali dengan proses menghilangkan basa yang menumpuk
pada hasil kromatogram primer forward dan reverse pada ujung 5’ dan ujung
3’ (Lampiran 1,2). Kemudian dilakukan alignment basa hasil kromatogram
primer forward dan reverse per individu. Hasil DNA yang telah sejajar
kemudian disejajarkan dan dibandingkan dengan database DNA gen COI dari
complete genome mitochondria S. exigua
dari
Cina
(NC019622),
Jepang (AB733674), Thailand (FN908004), Canada (GU094753) dan Florida.
Sebagai outgroup dalam analisis filogeni digunakan S. litura (HM756093) dan S.
littoralis (HM756074). Analisis filogeni gen COI dilakukan dengan metode
Neighbour Joining (NJ) dengan bootstrap 1000 x.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Koleksi Sampel Ngengat Bawang S. exigua
Sampel ngengat bawang S. exigua dikoleksi berdasarkan ketinggian yaitu pada
daerah dataran rendah (Cirebon dan Brebes) dan dataran tinggi di Jawa (Bandung dan
Cipanas) (Tabel 2). Sampel dikoleksi dengan menggunakan perangkap berferomon exi
Tabel 2 Data hasil koleksi S. exigua yang digunakan dalam penelitian ini
No
Lokasi
Titik Kordinat
1
Bandung
2
Cipanas
3
Cirebon
4
Brebes
07°06.991’ LU
107°25.352’ BT
06°45.589’ LU
107°01.652’ BT
06°49.858’ LU
108°45.427’ BT
06°52.039’ LU
109°01.339’ BT
1390 m
Kode
sampel
SpxBdg
25-8-2013
Jumlah
Sampel
11
1280 m
SpxCps
6-7-2013
15
12 m
SpxCrb
28-2-2013
6
13 m
SpxBrb
11-3-2013
2
Ketinggian
Waktu
5
Sampel dewasa S. exigua yang dikoleksi dengan perangkap berferomon exi adalah
pada fase ngengat (imago). Spodoptera exigua mempunyai siklus hidup yang terdiri
atas fase telur, larva, pupa, dan imago (Kalshoven 1981). Telur tersusun atas kelompok
telur yang berjumlah 300-600 telur per kelompok. Telur biasanya diletakkan oleh
imago betina pada bagian bawah daun di tanaman bawang. Fase telur terjadi selama
2-3 hari. Larva merupakan fase terjadinya infestasi S. exigua pada tanaman bawang.
Pada kondisi normal larva terdiri atas 5 instar, perbedaan instar dapat terlihat pada garis
yang terdapat dibagian tubuh dorsal larva. Semakin gelap garis yang terbentuk
menunjukan larva berada pada instar akhir. Fase larva terjadi selama 11-16 hari.
Setelah larva mencapai instar akhir, larva kemudian akan memasuki fase pupa.
Pembentukan pupa terjadi di tanah. Lapisan pupa terbentuk dari partikel pasir dan
tanah yang disekresikan dengan kelenjar ludah sehingga akan mengeras. Fase
pupa terjadi selama 6-7 hari. Imago (ngengat) merupakan fase terakhir dalam
siklus hidup S. exigua. Ngengat S. exigua mempunyai ukuran tubuh yang cukup
besar dengan ukuran bentang sayap 25 sampai 30 mm. Sayap berwarna coklat dan
abu-abu. Fase ngengat terjadi selama 3-7 hari (Capinera 2001).
Berdasarkan morfologi ngengat S. exigua yang menginfestasi tanaman
bawang, populasi ngengat S. exiguapada dataran tinggi mempunyai ukuran
morfologi lebih besar dibandingkan dengan dataran rendah (Samudra 29 November
2012, komunikasi pribadi). Kemudian dilakukan pengukuran morfologi pada
panjang sayap ngengat S. exigua pada satu individu di dataran tinggi dan dataran
rendah. Hasil dari pengukuran panjang sayap ngengat S. exigua menunjukan
bahwa di dataran tinggi mempunyai ukuran morfologi lebih besar dibandingkan
dengan dataran rendah dengan ukuran panjang sayap 1.4 cm dan 0.7 cm pada
ngengat S. exigua di dataran rendah (Gambar 1). Namun hasil pengukuran tersebut
masih data awal dan diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai ukuran tubuh dari
morfologi ngengat S. exigua di dataran tinggi dan dataran rendah.
(a)
(b)
Gambar 1 Ngengat S. exigua (a) di dataran tinggi dan ngengat S. exigua (b) di dataran
rendah
Amplifikasi dan Alignment Sekuen DNA Gen COI
Amplikon gen COI pada ke-empat sampel yaitu, S. exigua Cirebon,
Brebes, Bandung dan Cipanas memperlihatkan ukuran pita DNA yang sama
panjang. Hasil amplifikasi gen COI dengan primer forward COI-47 F dan
reverse COI-916 R menunjukan pita DNA ± 900 pb (Gambar 2). Kemudian
alignment sekuen dilakukan antara sekuen gen COI ingroup (SpxCrb, Spx2Brb,
6
Spx1Bdg, Spx1Cps, Spx haplotipe Florida, Spx Cina, Spx Jepang, Spx Thailand
serta Spx Canada) dan outgroup (S. litura dan S. littoralis) (Tabel 3). Hasil dari
alignment antara sekuen gen COI ingroup dan outgroup dihasilkan panjang
sekuen sebesar 530 pb. Terdapat pemotongan sekuen gen COI dari 900 pb
menjadi 530 pb. Pemotongan sekuen dilakukan untuk menyesuaikan dengan
panjang sekuen gen COI dari Jepang yaitu 530 pb agar didapatkan daerah yang
conserve.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 M pb
900
60
800
700
60
600
500
Gambar 2 Amplikon pita DNA gen COI ngengat S. exigua ; 1,2 = SpxCrb, 3,4 =
Spx2Brb, 5,6 = Spx1Bdg, 7,8= Spx1Cps, 11= kontrol negatif, 12 = kontrol
positif (gen cyt b A. melifera)
Tabel 3 Data sampel ingroup (S. exigua) dan outgroup (S. litura dan S. littoralis) yang
digunakan untuk analisis gen COI pada penelitian ini
No
Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Ingroup
S. exigua
S. exigua
S. exigua
S. exigua
S. exigua haplotipe 1
S. exigua haplotipe 2
S. exigua haplotipe 3
S. exigua haplotipe 4
S. exigua
S. exigua
11
12
S. exigua
S. exigua
13
14
Outgroup
S. litura
S. littoralis
Lokasi/ Asal
No. Akses
GenBank
Kode
sampel
Tanggal
Cirebon
Brebes
Bandung
Cipanas
Florida
Florida
Florida
Florida
Cina
Jepang
(Kagoshima)
Thailand
Canada
(Wellington)
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
HM756077
HM756078
HM756079
HM756080
NC019622
AB733674
SpxCrb
Spx2Brb
Spx1Bdg
Spx1Cps
Spx_hap1
Spx_hap2
Spx_hap3
Spx_hap4
SpxCna
SpxJpn
29-02-2013
29-02-2013
29-02-2013
29-02-2013
22-01-2013
02-03-2013
FN908004
GU094753
SpxTln
SpxCda
01-12-2010
05-03-2012
Taiwan
Portugal
HM756093
HM756074
S_litu
S_litto
29-02-2013
29-02-2013
7
Berdasarkan hasil alignment sampel S. exigua di Jawa dari penelitian ini baik
antara sampel di dataran rendah dan dataran tinggi tidak memperlihatkan adanya variasi
nukleotida. Dengan demikian, data gen COI S. exigua dari hasil penelitian ini dapat
menjadi ciri gen COI untuk S. exigua asal Jawa. Penggunaan gen COI pada penelitian
ini merupakan gen yang digunakan pada analisis dengan DNA Barkode. DNA barkode
merupakan suatu cara untuk mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan
menggunakan DNA pendek yang distandardisasi (Hebert et al. 2005). Pemilihan gen
COI di dalam analisis menggunakan DNA barkode karena gen COI yang digunakan
relatif pendek yaitu 648 pb, bersifat conserve, relatif stabil tidak mudah mengalami
perubahan-perubahan dengan gen-gen mitokondria yang lainnya, dan gen COI terdapat
dalam jumlah kopi yang banyak (Hebert et al. 2003). Beberapa penelitian lain
menunjukan bahwa gen COI dapat mengidentifikasi spesies kompleks. Pada contoh
lain, Hausman et al. (2011) menggunakan DNA barkode untuk monitoring keragaman
dan identifikasi spesies kupu-kupu dan ngengat (Lepidoptera) di German. Hampir
(99%) dari 957 spesies diidentifikasi dengan menggunakan sekuen DNA barkode.
Gen COI diturunkan secara meternal, sehingga tidak adanya variasi
nukleotida pada gen COI pada populasi S. exigua yang terdapat di Jawa disebabkan
karena masih satu keturunan dengan nenek moyang S. exigua asal Asia
Tenggara. Terdapat perubahan pada nukleotida menyebabkan terjadinya mutasi
titik pada gen tersebut. Adanya mutasi dapat menyebabkan asam amino menjadi
berubah atau tidak berubah (silent mutation). Silent mutation terjadi apabila
perubahan nukleotida DNA tidak menyebabkan asam amino berubah. Perubahan
asam amino biasanya terjadi pada perubahan nukleotida pada posisi kodon pertama
dan kedua, sedangkan posisi ketiga jarang menyebabkan terjadinya perubahan.
Peluang terjadinya mutasi sinonim pada nukleotida kodon pertama 5%, pada kodon
ketiga sebesar 72% dan pada kodon kedua selalu menyebabkan asam amino berubah
(Nei 1987).
Selanjutnya, berdasarkan alignment antara sekuen gen COI hasil penelitian
ini dengan sekuen gen COI asal negara Asia lain seperti Thailand, Jepang, dan Cina
juga tidak memperlihatkan adanya variasi nukleotida, kecuali satu pada populasi Cina
(data tidak dipublikasikan). Hasil alignment antara sekuen Asia dengan sekuen
Florida dan Canada menunjukan variasi nukleotida gen COI yang tinggi
(Gambar 3). Variasi nukleotida yang tinggi banyak terdapat pada sekuen gen COI
asal Florida dan Canada. Variasi nukleotida terdapat pada basa ke 95, 117, 284, 459
dan 464. Pada basa ke 95 terjadi mutasi titik C–T pada kodon ke-2 sehingga
mengubah asam amino serina menjadi leusina, basa ke-117 mutasi titik G–A pada
kodon ke 3 tidak menyebabkan asam amino berubah yaitu leusina, nukleotida ke-284
terjadi mutasi titik C–T mengubah asam amino treonina menjadi metionina,
nukleotida ke-459 terjadi mutasi titik T–C pada kodon ke-3 menyebabkan asam
amino tidak berubah yaitu tirosina dan pada basa ke-464 mutasi titik A–G pada kodon
ke-2 yaitu histidin menjadi arginin.
Adanya mutasi pada nukleotida menunjukkan bahwa S. exigua telah mengalami
suatu proses evolusi dan adaptasi terhadap seleksi alam yang tersebar dari tempat
asalnya (Asia Tenggara) ke Amerika Selatan dan Amerika Utara dengan waktu
yang sangat lama. Spodoptera exigua mempunyai persebaran yang sangat luas
dan hampir ditemukan di berbagai belahan bumi. Strategi dalam cara bertahan hidup
menjadi salah satu faktor yang sangat penting bagi persebaran S. exigua di berbagai
belahan bumi. Hibernasi dan migrasi adalah dua strategi adaptasi utama untuk
kelangsungan hidup serangga di musim dingin (Tauber et al. 1986). Dengan adanya
strategi ini berpengaruh terhadap peningkatan proses distribusi S. exigua.
8
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
CATGCTTTTA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TTATAATTTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CTTTATAGTA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
T........T
T........T
ATACCTATTA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TAATCGGAGG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
....T.....
..........
..........
..........
....T.....
....T.....
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
ATTTGGAAAT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TGACTTGTCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......A...
..........
..........
........A.
........A.
CATTAATATT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.T........
.T........
AGGAGCCCCA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......T..T
.........T
GATATAGCTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
AGTTTACCCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CCACTCTCCT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..C.......
..C.......
CTAATATTGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CCACGGTGGA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
...T......
...T......
...T......
...T......
...T......
T..T......
T..T......
AGATCTGTAG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.....A....
.....A....
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
TATTATTATT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........C.
........C.
........C.
........C.
........C.
..........
..........
ATCACTACCT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
...G......
..........
..........
...G......
...TT.....
...TT.....
GTTTTAGCAG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........T.
........T.
GAGCTATTAC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TATATTACTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.......T.A
.......T.A
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
Gambar 3 Alignment DNA gen COI S. exigua. Simbol . = kesamaan basa dalam kolom
yang sama. variasi ditunjukan dengan nukleotida yang berbeda pada tiap
kolom
9
Berdasarkan distribusi sebaran S. exigua secara geografis di dunia, daerah
distribusi S. exigua meningkat sebanyak 34 negara dari 67 negara sejak tahun
1972 (Zheng 2011). Meningkatnya distribusi S. exigua dipengaruhi oleh adanya
strategi adaptasi terhadap musim dan juga tanaman inang yang beragam.
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni Sekuen DNA Gen COI
Analisis jarak genetik dilakukan berdasarkan sekuen DNA gen COI ingroup (S.
exigua) dan outgroup (S. littura dan S. littoralis). Jarak genetik tertinggi dihasilkan dari
sekuen gen COI intraspesies antara S. exigua haplotipe 1 Florida dengan S. exigua asal
Asia sebesar 0.008 (0.8%) dan jarak genetik terendah dihasilkan dari sekuen DNA gen
COI kelompok asia sebesar 0.000 (0%) (Tabel 4). Kemudian, jarak genetik gen COI
spesies S. exigua pada penelitian ini yang dikoleksi dari populasi dataran rendah dan
dataran tinggi di Jawa tidak menunjukan jarak genetik yang berbeda yaitu 0.000 (0%).
Hasil konstruksi filogeni berdasarkan gen COI (Gambar 4) menunjukan terdapat
tiga kelompok utama S. exigua yaitu, pertama kelompok S. exigua di Jawa
mengelompok dengan S. exigua asal Jepang, Cina, dan Thailand dengan nilai bootstrap
82 %. Kelompok kedua adalah dua haplotipe (haplotipe 2 dan 3) S. exigua asal Florida
dan Canada dengan nilai bootstrap 50%. Kelompok ketiga adalah dua haplotipe lain
dari sampel S. exigua dari Florida (haplotipe 1 dan 4) dengan nilai bootstrap 48%.
Konstruksi filogeni berdasarkan sekuen DNA gen COI memperlihatkan
pengelompokkan yang terpisah dengan nilai bootstrap 100 % antara sekuen ingroup (S.
exigua dari berbagai lokasi) serta outgroup yaitu S. littura dan S. littoralis (Nagoshi et
al. 2010).
Tabel 4 Jarak genetik berdasarkan sekuen DNA gen COI ingroup dan outgroup
[
[ 1]
[ 2]
[ 3]
[ 4]
[ 5]
[ 6]
[ 7]
[ 8]
[ 9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.004
0.002
0.000
0.002
0.068
0.062
0.006
0.004
0.002
0.066
0.060
10
11
12
13
14 ]
0.002
0.004 0.002
0.070 0.068 0.068
0.064 0.062 0.062 0.017
Keterangan:
[1] Spx_1_Bdg, [2] Spx_1_Cps, [3] Spx_2_Brb, [4] Spx_Crb, [5] Spx_Cina, [6] Spx_Jepang
[7] Spx_Thailand, [8] Spx_Canada, [9] Spx_hap1_Florida, [10] Spx_hap2_Florida[11]
Spx_hap3_Florida, [12] Spx_hap4_Florida[13] S_litura, [14] S_littora
10
Spx Jepang
Spx Thailand
Spx Cina
82
Spx Crb
Kelompok 1
Spx 2 Brb
Spx 1 Bdg
45
Spx 1 Cps
Spx Canada
100
Spx hap2 Florida
Kelompok 2
50
Spx hap3 Florida
Spx hap1 Florida
Kelompok 3
48 Spx hap4 Florida
S litura
S littora
Outgroup
0.005
Gambar 4 Konstruksi pohon filogeni S. exigua berdasarkan sekuen DNA gen COI
menggunakan metode Neighbour Joining (NJ). Angka pada nodus
menyatakan nilai
hasil bootstrapDAN
1000 SARAN
x, singkatan mengacu pada Tabel 3
SIMPULAN
Simpulan
Alignment DNA antara populasi S. exigua pada empat lokasi di dataran rendah
(Cirebon dan Brebes) dan dataran tinggi (Bandung dan Cipanas) di Jawa
memperlihatkan tidak adanya variasi nukleotida pada gen COI. Amplifikasi dan sekuen
gen COI secara parsial menghasilkan 530 pb. Dengan demikian didapatkan satu
haplotipe gen COI S. exigua di Jawa. Hasil ini dapat digunakan sebagai DNA Barkode
yang mencirikan S. exigua asal Jawa. Pada konstruksi filogeni berdasarkan gen COI
terdapat tiga kelompok utama S. exigua yaitu, pertama kelompok S. exigua di Jawa
mengelompok dengan S. exigua asal Jepang, Cina dan Thailand, kelompok kedua dan
ketiga adalah empat haplotipe S. exigua asal Florida dan Canada. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa perbedaan haplotipe ini dapat berfungsi sebagai barkode untuk
membedakan variasi di dalam spesies S. exigua di berbagai belahan dunia.
Saran
Perlu diadakannya penelitian lanjutan pada gen lain untuk melihat adanya variasi
genetik tingkat intraspesies pada spesies Spodoptera exigua di Indonesia.
11
DAFTAR PUSTAKA
Brown ES, Drewhurst CF. 1975. The genus Spodoptera (Lepidoptera, Noctuidae)
in Africa and the Near East. Bull of Entomol Res. 65: 221-262
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An efeective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem. 385: 174175.
Capinera JL. 2001. Handbook of Vegetable Pests. San Diego (US): Academic press.
[Ditjen Hortikultura] Direktorat Jenderal Hortikultura. 2010. Statistik Produksi
Hortikultura Tahun 2009. Jakarta (ID): Dirjen Hortikultura Pasar Minggu.
Hajibabaei M, Janzen DH, Burns JM, Hallwachs W, Hebert PDN. 2006.DNA barkode
distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: 968-971.
Harrison RG. 1989. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and
evolutionary biology. Tre Ecol Evol. 4: 6-11.
Hebert PDN, Cywin SA, Ball SL, Ward JR. 2003. Biological idntifications through
DNA barcodes. Proc R Soc. 270: 313-321.
Hausmann A, Haszprunar G, Segerer AH, Speidel W, Behounek G, Hebert PDN. 2011.
Now DNA Barcoded : the butterflies dan large moths of Germany. Spixiana 34:
47-58.
Hebert PDN, Gregory TR. 2005. The promise of DNA barcoding for taxonomy. Syst
Biol. 54: 852-859.
Kalshoven LGE. 1981. The Pests of Crops In Indonesia. Jakarta (ID): PT. Ichtiar Baru.
Lahaye R, Michelle VDB, Bogarin D, Warner J, Pupulin F, Gigot G, Maurin O,
Duthoit S, Barraclough TG, Savolainen V. DNA barcoding the floras of
biodiversity hotspots. PNAS 105: 2923-2928.
Nagoshi RN, Brambila J, Meager RL. 2010. Use of DNA barcodes to identify invasive
armyworm Spodoptera spesies in Florida. J Ins Sci. 11: 1536-2442.
Nei M. 1987. Molecular evolutionary genetics. New York (US): Columbia University
Press.
Raffiudin R, Crozier. 2007. Phylogenetic analysis of honeybee behavioural evolution.
Mol Phylogen Evol 48: 543-552.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratorium
ManualSecond Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood,
evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol.
28:2731-2739.
Tauber MJ, Tauber CA, Masaki S.1986. Seasonal adaptations of insect. New York
(US):Oxford University Press.
12
Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, Last PR, Hebert PDN. 2005. DNA barcoding
Australia fish spesies. Phil Trans R Soc B 360: 1847- 1857.
Zheng XL, Cong XP, Wang XP, Lei CL. 2011. A Review of Geographic Distribution,
Overwintering and Migration in Spodoptera exigua Hübner (Lepidoptera:
Noctuidae). J Ento Mol Res Soc.13: 39-48.
.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Kromatogram sekuen gen COI DNA Mitokondria ngengat S. exigua menggunakan primer forward COI-47F
14
Lampiran 2 Kromatogram sekuen gen COI DNA Mitokondria ngengat S. exigua menggunakan primer reverse COI-916R
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Karawang tanggal 27 Desember 1990 dari pasangan Suprawadi
dan Aan Rohani. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersudara. Penulis menyelesaikan
pendidikan menengah atas di SMAN 1 Karawang pada tahun 2009. Pada tahun yang sama
penulis diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor melalui jalur Usmi. Penulis memiliki pengalaman sebagai asisten
praktikum pada mata kuliah Fungsi Hayati Hewan (2011/2012), Genetika Molekuler
(2011/2012), Anatomi dan Morfologi Tumbuhan (2012/2013) serta Perkembangan dan
Pertumbuhan Tumbuhan (2012/2013). Selama menempuh studi di Departemen Biologi,
penulis melakukan penelitian dalam studi lapang mengenai Ragam Ektomikoriza Pada Pinus
dan Meranti di Gunung Walat tahun 2011 dan praktik lapang di PT. ABC President mengenai
Mekanisme Produksi dan Proses Pengolahan Produk Mi ABC Goreng CUP di PT. ABC
President Indonesia.
DATARAN RENDAH DAN DATARAN TINGGI DI JAWA
ANDI TRISNANDI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul DNA Barkode Spodoptera
exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah dan Dataran Tinggi di Jawa adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2014
Andi Trisnandi
NIM G34090046
ABSTRAK
ANDI TRISNANDI. DNA Barkode Spodoptera exigua Hubn. Populasi Dataran
Rendah dan Dataran Tinggi di Jawa. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan I MADE
SAMUDRA.
Spodoptera exigua menginfestasi tanaman bawang merah pada dataran rendah
dan bawang daun pada dataran tinggi di Jawa. Berdasarkan morfologi ngengat S.
exigua yang menginfestasi tanaman bawang pada dataran tinggi mempunyai ukuran
morfologi lebih besar dibandingkan dataran rendah. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mempelajari variasi genetik pada perbedaan morfologi ngengat S. exigua berdasarkan
analisis gen cythocrhome oxydase subunit 1 (COI) sebagai DNA Barkode. Sampel
DNA S. exigua dikoleksi dari populasi dataran rendah (Cirebon dan Brebes) dan
dataran tinggi (Bandung dan Cipanas) di Jawa dengan menggunakan perangkap
berferomon dan kemudian dilakukan proses analisis DNA. Database sekuen gen COI
ngengat S. exigua dibandingkan dengan S. exigua sekuen gen COI yang berasal dari
Jepang, Cina, Thailand, Canada, dan Florida. Amplifikasi dan sekuen gen COI secara
parsial menghasilkan 530 pb nukleotida. Hasil alignment DNA antara sampel di
empat lokasi di Jawa memperlihatkan tidak adanya variasi nukleotida pada gen
COI. Pada konstruksi filogeni berdasarkan gen COI terdapat tiga kelompok utama S.
exigua yaitu kelompok pertama S. exigua di Jawa membentuk clade dengan S. exigua
asal Jepang, Thailand dan China, kelompok kedua dan ketiga adalah empat haplotipe
S. exigua asal Florida dan Canada. Perbedaan haplotipe ini dapat berfungsi sebagai
barkode untuk membedakan variasi di dalam spesies S. exigua di berbagai belahan
dunia
Kata kunci: Gen COI, mitokondria, haplotipe, Spodoptera exigua, bawang merah
ABSTRACT
ANDI TRISNANDI. DNA Barcodes of Spodoptera exigua Hubn. in Lowlands
and Highlands in Java. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and I MADE SAMUDRA.
Spodoptera exigua infests shallot in lowlands and leek in highlands n Java.
Based on the morphology of body size, moth of S. exigua that infests onion plants in
highland has bigger than in the lowland S. exigua. This research was aimed to study
genetic variations COI gene of moth S. exigua as the DNA Barcode for this species.
DNA sample of moth S. exigua was collected from populations in lowlands
(Cirebon and Brebes) and higlands (Bandung and Cipanas) in Java by using baited
with pheromone lure and then performed process of DNA analysis. The moth S.
exigua COI gene sequences from this study were aligned with COI gene
sequences of moth S. exigua from Japan, China, Thailand, Florida-USA, and Canada.
This study obtained a total of 530 bp nucleotides of partial COI gene. Alignment of
four DNA sequences of partial COI gene from four locations in Java showed no
nucleotide variation in COI gene among samples from Java. The phylogenetic tree
of COI gene revealed three major clades. The first clade S. exigua from Java
grouped in the same clade with that of S. exigua from Japan, Thailand, and China.
The second and third clades were haplotype clades of S. exigua from Florida-USA
and Canada, respectively. These different haplotypes could be used as the DNA
barcode to differentiate the intraspesific variations of S. exigua in the world
Keywords: COI gene, mitochondria, haploptype, Spodoptera exigua, shallot
DNA BARKODE Spodoptera exigua Hubn. POPULASI
DATARAN RENDAH DAN DATARAN TINGGI DI JAWA
ANDI TRISNANDI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : DNA Barkode Spodoptera exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah
dan Dataran Tinggi di Jawa
Nama
: Andi Trisnandi
NIM
: G34090046
Disetujui oleh
Dr Ir Rika Raffiudin, MSi
Pembimbing I
Dr Ir I Made Samudra, MSc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
Judul Skripsi: DNA Barkode Spodoplera exigua Hubn. Populasi Dataran Rendah
dan Dataran Tinggi i Jawa
Nama
: Andi Trisnandi
: 034090046
NIM
Disetujui oleh
_ J;VfWW'
Dr Ir Rika Raffiudin, MSi
Pembimbing I
Tanggal Lulus:
Ｎｾ＠
Dr Ir I Made Samudra, MSc
Pembimbing II
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari hingga juni 2013 ini ialah DNA
barkode, dengan judul DNA barkode Spodoptera exigua di dataran rendah dan dataran
tinggi di Jawa.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Rika Raffiudin, MSi dan Bapak Dr
Ir I Made Samudra, MSc selaku pembimbing. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Bapak Suwito dan Bapak Jusuf (staf Balai Besar Bioteknologi dan
Pengembangan Sumberdaya Genetik Pertanian) yang telah membantu pelaksanaan
penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh
keluarga atas segala doa, serta teman – teman Biologi 46, Ical, Kak Gina, Kak Eni, Kak
Uce, dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan seluruhnya atas segala bantuan dan
dukungan kepada penulis
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2013
Andi Trisnandi
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
ABSTRAK
ii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE PENELITIAN
2
Bahan
2
Ekstraksi dan Presipitasi DNA
2
Amplifikasi DNA
3
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
4
Alignment DNA dan analisis filogeni
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Koleksi Sampel Ngengat Bawang S. exigua
4
Amplifikasi dan Alignment Sekuen DNA Gen COI
5
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni Sekuen DNA Gen COI
9
SIMPULAN DAN SARAN
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
15
DAFTAR TABEL
1 Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Spodoptera exigua (No.
Akses GenBank NC019622)............................................................................. 3
2 Data hasil koleksi S. exigua yang digunakan dalam penelitian ........................ 4
3 Data sampel ingroup (S. exigua) dan outgroup (S. litura dan S. littoralis)
yang digunakan untuk analisis gen COI pada penelitian ini
6
4 Jarak genetik berdasarkan sekuen DNA gen COI ingroup dan outgroup ......... 9
DAFTAR GAMBAR
1 Ngengat S. exigua di dataran tinggi dan ngengat S. exigua di dataran
rendah………………………………………………………………………... 5
2 Amplikon pita DNA gen COI S. exigua..…………………………………….6
3 Alignment DNA gen COI S. exigua……………………………………… 8
4 Konstruksi pohon filogeni
10
DAFTAR LAMPIRAN
1 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria ngengat S. exigua
menggunakan primer forward COI-47F
2 Kromatogram sekuen gen COI DNA mitokondria ngengat S. exigua
menggunakan primer reverse COI-916R
12
13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ulat bawang Spodoptera exigua Hubn. (Lepidoptera: Noctuidae), merupakan
salah satu spesies dari genus Spodoptera yang bersifat kosmopolit, dan polifag yang
berasal dari Asia Tenggara. Persebaran S. exigua hampir berada diseluruh belahan bumi
kecuali Amerika Selatan (Brown dan Drewhurst 1975). Ulat ini ditemukan di
Amerika Utara pada tahun 1876, ketika itu ditemukan di Oregon dan Florida (Capinera
2001).
Persebaran S. exigua diberbagai belahan bumi dibantu oleh sifatnya yang
dapat hidup di lebih dari satu tanaman inang. Beberapa tanaman yang menjadi inang
dari ulat S. exigua adalah asparagus, kacang, brokoli, cabai, kembang kol,
seledri, jagung, bawang, tomat, dan tembakau (Capinera 2001). Ulat S. exigua
banyak menginfestasi tanaman bawang di Jawa, antara lain bawang merah dan
bawang daun (Kalshoven 1981). Infestasi dari S. exigua dapat menyebabkan
kehilangan hasil hingga 57% (Ditjen Hortikultura 2010). Infestasi ulat bawang ditandai
dengan bercak putih transparan pada bagian epidermis daun karena daun bagian
epidermis dalamnya dimakan.
Pada dataran tinggi, tanaman bawang yang dapat tumbuh dengan baik
adalah bawang daun dan pada dataran rendah adalah bawang merah. Berdasarkan
morfologi populasi ngengat S. exigua yang menginfestasi tanaman bawang pada
dataran tinggi mempunyai ukuran morfologi lebih besar dibandingkan dataran
rendah (Samudra 29 November 2012, komunikasi pribadi). Pada penelitian ini
digunakan DNA barkode untuk melihat secara molekuler variasi genetik ulat
bawang S. exigua Hubn. berdasarkan gen cytochrome oxydase subunit 1 (COI)
dengan pengambilan sampel pada empat populasi berdasarkan ketinggian yaitu dua
lokasi di dataran rendah (Cirebon dan Berebes) dan dua lokasi di dataran tinggi
(Bandung dan Cipanas).
DNA barkode adalah suatu sistem baru yang menjadi salah satu
alternatif pelengkap atau komplemen yang dapat memperkuat identifikasi morfologi
secara cepat dan akurat (Lahaye et al. 2008). DNA barkode dirancang untuk
mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan menggunakan DNA
pendek yang distandardisasi (Hebert dan Gregory 2005). Teknik ini dapat
menyediakan sebuah “barkode biologi” dari
urutan
pendek
DNA
yang
distandardisasi untuk mengenali suatu spesies (Hajibabaei et al. 2006). Pada
teknik DNA barkode digunakan gen DNA mitokondria gen COI karena dapat
digunakan untuk mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Hebert et al. 2003).
DNA mitokondria bersifat haploid, tidak ada rekombinan, memiliki jumlah kopi
yang banyak, dan diturunkan secara maternal (maternal inherited) (Harrison 1989).
Nagoshi et. al (2010) menggunakan DNA barkode untuk mengidentifikasi
spesies serangga yang invasif dari genus Spodoptera di Florida. Spesies lokal
Spodoptera yang terdapat di Florida adalah S. eridania, S. exigua, dan S. frugiperda.
Berdasarkan gen COI didapatkan spesies invasif Spodoptera di Florida yaitu S.
litura dan S. littoralis. Identifikasi spesies invasif dilakukan perbandingan analisis
sekuen gen COI S. litura (HM756093) asal Taiwan dan S. littoralis (HM756074) asal
Portugal dengan sekuen S. litura dan S. littoralis yang terdapat di Florida
2
.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari variasi genetik gen COI Spodoptera
exigua Hubn. pada empat populasi di dataran rendah (Brebes dan Cirebon) dan dataran
tinggi (Bandung dan Cipanas) di Jawa untuk digunakan sebagai database DNA barkode.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat untuk digunakan sebagai database dan sebagai penciri
molekuler dari spesies Spodoptera exigua asal Jawa.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai dengan Juni 2013 bagian
Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ialah DNA yang diekstraksi pada bagian
toraks ngengat S. exigua. Sampel diambil dari daerah dataran rendah (Brebes dan
Cirebon) dan dataran tinggi (Bandung dan Cipanas). Pengambilan sampel dilakukan
dengan menggunakan perangkap berferomon. Feromon exi (yang diperoleh dari BB
Biogen), yaitu feromon analog S. exigua betina yang berguna untuk menarik S.
exigua jantan. Sampel yang didapatkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml
yang berisi alkohol absolut.
Ekstraksi dan Presipitasi DNA
Sumber DNA yang digunakan berasal dari bagian toraks ngengat S. exigua.
DNA diekstraksi dengan menggunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide) (CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0, 3 ml 0.5 M
NaEDTA pH 8.0, 6.135 g NaCl, 1.5 g CTAB, air hingga 75 ml) dan presipitasi
etanol berdasarkan metode Sambrook et al. (1989) dengan modifikasi (Raffiudin
dan Crozier 2007). Toraks yang disimpan dalam alkohol absolut kemudian
dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi larutan Tris-HCL EDTA (TE) (2
M Tris HCl-EDTA pH 8, 2 M EDTA) 500 µl untuk menggantikan alkohol absolut
dalam jaringan dengan pergantian TE dilakukan sebanyak 3 kali.
Bagian toraks dipotong menggunakan pisau scalpel steril dan dimasukkan dalam
tabung 1.5 ml lalu tabung direndam dalam nitrogen cair agar jaringan
mengeras. Kemudian ditambahkan CTAB 500 µl (CTAB 0.2 % (b/v) dan ProteinaseK 10 µl (5 g/ml) untuk melisis protein, lalu diinkubasi pada suhu 55 °C selama 2
jam. Setelah itu tabung disentrifugasi 11 300 g (10 menit), supernatan dipindahkan
ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 250 µl PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl
alcohol = 25:24:1) dan diputar membentuk angka 8 (1 menit). Tabung yang sudah
3
diputar kemudian disentrifugasi kembali 11 300 g (5 menit) dan akan membentuk
dua lapisan larutan yaitu lapisan PCI pada bagian bawah tabung dibuang dan lapisan
atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru. Selanjutnya
tabung yang berisi DNA ditambahkan 400 µl larutan CIAA (Chloroform :
Isoamyl alkohol = 24:1), diputar kembali (1 menit) dan disentrifugasi 11 300 g (1
menit). Tahapan CIAA dilakukan sebanyak dua kali, dan didapatkan DNA pada
lapisan bagian atas dipindahkan pada tabung baru 1.5 ml, kemudian ditambahkan
isopropanol 600 µl dan disimpan semalam pada suhu -4 °C.
Tahapan berikutnya ialah presipitasi DNA dilakukan dengan sentrifugasi 11 300
g (30 menit) pada suhu 4 °C untuk mendapatkan endapan DNA. Isopropanol
kemudian dibuang dan ditambahkan alkohol 70% (v/v) lalu disentrifugasi 11 300 g
(10 menit) pada suhu 4 °C. Setelah itu alkohol 70% dibuang dan pelet DNA
dikeringkan dengan cara divakum 650 mm/Hg (30 menit) sampai kandungan alkohol
hilang. Selanjutnya endapan DNA murni hasil ekstraksi ditambahkan 20 µl TE
(0.5 mM) kemudian disimpan dalam suhu -4 °C untuk dilanjutkan ke tahapan analisis
berikutnya.
Amplifikasi DNA
DNA diamplifikasi secara in vitro dengan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR) menggunakan mesin thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC1).
Gen target yang diamplifikasi adalah gen COI, dengan menggunakan primer forward
COI-47F dan reverse-916R (Tabel 1). Sekuen kedua primer ini adalah hasil
modifikasi dari primer forward COI-45F dan reverse-914R (Nagoshi et al. 2010),
yaitu dengan penambahan dua basa pada ujung 3’ (Tabel 1). Modifikasi primer
dilakukan karena hasil pita DNA dari gen target yang dihasilkan dengan
menggunakan primer dari Nagoshi menghasilkan pita yang tipis dan dengan suhu
annealing yang rendah yaitu 48 °C Primer tersebut mengamplifikasi sekuen
sebesar ± 800 pb.
Total pereaksi yang digunakan dalam proses PCR adalah 20 µl terdiri atas
akuades steril 7.4 µl, primer forward 0.8 µl, primer reverse 0.8 µl, Kapa Taq
ReadyMix DNA Polymerase 10 µl (buffer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4
mM, KapaTaq DNA Polymerase 0.05 U/ µl) dan cetakan DNA 1µl. Proses
amplifkasi pada mesin PCR terdiri atas lima tahap, yaitu pradenaturation pada
suhu 94°C selama 2 menit. Kemudian sebanyak 30 siklus dilakukan pada proses
denaturation 1 menit, annealing pada suhu 56°C dan 59°C selama 1 menit,
elongation pada suhu 72°C selama 1 menit, post-elongation selama 2 menit
Tabel 1 Urutan primer untuk amplifikasi gen COI Spodoptera exigua (No. Akses
GenBank NC019622) ) (Nagoshi et al. 2010)
No
Primer
1
COI-45F
COI-914R
2
COI-47F
COI-916R
Urutan basa (5’-3’)
Primer sebelum di modifikasi
TTCGAGCTGAATTAGGAACTC
TTATAGTTGCAGATGTAAAGTA
Primer setelah di modifikasi
TTCGAGCTGAATTAGGAACTCCA
GCAGATGTAAAGTATGCTCGTGT
Posisi primer pada
mtDNA S. exigua
1558-1578
2358-2379
1558-1580
2349-2371
4
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA kemudian dimigrasikan sebanyak 1 µl dengan
poliakrilamid gel elektroforesis (PAGE) 6% menggunakan buffer 1x TBE (Tris 0.5 M,
asam borat 0.65 M, EDTA 0.002 M). Visualisasi DNA dengan metode pewarnaan perak
nitrat (Byun et al. 2009).
Alignment DNA dan Analisis Filogeni
Hasil Hasil amplifikasi DNA disekuen dengan dikirim kepada perusahaan
jasa sekuen. Runutan nukleotida yang diperoleh diedit secara manual
berdasarkan kromatogram menggunakan software BioEdit Sequence Alignment
dan Genetyx Vs 4.01. Runutan – runutan nukleotida yang telah diedit lalu di
alignment menggunakan program Clustal X. Analisis variasi nukleotida dan
analisis filogeni menggunakan program MEGA versi 5 (Tamura et al. 2011).
Proses pengeditan diawali dengan proses menghilangkan basa yang menumpuk
pada hasil kromatogram primer forward dan reverse pada ujung 5’ dan ujung
3’ (Lampiran 1,2). Kemudian dilakukan alignment basa hasil kromatogram
primer forward dan reverse per individu. Hasil DNA yang telah sejajar
kemudian disejajarkan dan dibandingkan dengan database DNA gen COI dari
complete genome mitochondria S. exigua
dari
Cina
(NC019622),
Jepang (AB733674), Thailand (FN908004), Canada (GU094753) dan Florida.
Sebagai outgroup dalam analisis filogeni digunakan S. litura (HM756093) dan S.
littoralis (HM756074). Analisis filogeni gen COI dilakukan dengan metode
Neighbour Joining (NJ) dengan bootstrap 1000 x.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Koleksi Sampel Ngengat Bawang S. exigua
Sampel ngengat bawang S. exigua dikoleksi berdasarkan ketinggian yaitu pada
daerah dataran rendah (Cirebon dan Brebes) dan dataran tinggi di Jawa (Bandung dan
Cipanas) (Tabel 2). Sampel dikoleksi dengan menggunakan perangkap berferomon exi
Tabel 2 Data hasil koleksi S. exigua yang digunakan dalam penelitian ini
No
Lokasi
Titik Kordinat
1
Bandung
2
Cipanas
3
Cirebon
4
Brebes
07°06.991’ LU
107°25.352’ BT
06°45.589’ LU
107°01.652’ BT
06°49.858’ LU
108°45.427’ BT
06°52.039’ LU
109°01.339’ BT
1390 m
Kode
sampel
SpxBdg
25-8-2013
Jumlah
Sampel
11
1280 m
SpxCps
6-7-2013
15
12 m
SpxCrb
28-2-2013
6
13 m
SpxBrb
11-3-2013
2
Ketinggian
Waktu
5
Sampel dewasa S. exigua yang dikoleksi dengan perangkap berferomon exi adalah
pada fase ngengat (imago). Spodoptera exigua mempunyai siklus hidup yang terdiri
atas fase telur, larva, pupa, dan imago (Kalshoven 1981). Telur tersusun atas kelompok
telur yang berjumlah 300-600 telur per kelompok. Telur biasanya diletakkan oleh
imago betina pada bagian bawah daun di tanaman bawang. Fase telur terjadi selama
2-3 hari. Larva merupakan fase terjadinya infestasi S. exigua pada tanaman bawang.
Pada kondisi normal larva terdiri atas 5 instar, perbedaan instar dapat terlihat pada garis
yang terdapat dibagian tubuh dorsal larva. Semakin gelap garis yang terbentuk
menunjukan larva berada pada instar akhir. Fase larva terjadi selama 11-16 hari.
Setelah larva mencapai instar akhir, larva kemudian akan memasuki fase pupa.
Pembentukan pupa terjadi di tanah. Lapisan pupa terbentuk dari partikel pasir dan
tanah yang disekresikan dengan kelenjar ludah sehingga akan mengeras. Fase
pupa terjadi selama 6-7 hari. Imago (ngengat) merupakan fase terakhir dalam
siklus hidup S. exigua. Ngengat S. exigua mempunyai ukuran tubuh yang cukup
besar dengan ukuran bentang sayap 25 sampai 30 mm. Sayap berwarna coklat dan
abu-abu. Fase ngengat terjadi selama 3-7 hari (Capinera 2001).
Berdasarkan morfologi ngengat S. exigua yang menginfestasi tanaman
bawang, populasi ngengat S. exiguapada dataran tinggi mempunyai ukuran
morfologi lebih besar dibandingkan dengan dataran rendah (Samudra 29 November
2012, komunikasi pribadi). Kemudian dilakukan pengukuran morfologi pada
panjang sayap ngengat S. exigua pada satu individu di dataran tinggi dan dataran
rendah. Hasil dari pengukuran panjang sayap ngengat S. exigua menunjukan
bahwa di dataran tinggi mempunyai ukuran morfologi lebih besar dibandingkan
dengan dataran rendah dengan ukuran panjang sayap 1.4 cm dan 0.7 cm pada
ngengat S. exigua di dataran rendah (Gambar 1). Namun hasil pengukuran tersebut
masih data awal dan diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai ukuran tubuh dari
morfologi ngengat S. exigua di dataran tinggi dan dataran rendah.
(a)
(b)
Gambar 1 Ngengat S. exigua (a) di dataran tinggi dan ngengat S. exigua (b) di dataran
rendah
Amplifikasi dan Alignment Sekuen DNA Gen COI
Amplikon gen COI pada ke-empat sampel yaitu, S. exigua Cirebon,
Brebes, Bandung dan Cipanas memperlihatkan ukuran pita DNA yang sama
panjang. Hasil amplifikasi gen COI dengan primer forward COI-47 F dan
reverse COI-916 R menunjukan pita DNA ± 900 pb (Gambar 2). Kemudian
alignment sekuen dilakukan antara sekuen gen COI ingroup (SpxCrb, Spx2Brb,
6
Spx1Bdg, Spx1Cps, Spx haplotipe Florida, Spx Cina, Spx Jepang, Spx Thailand
serta Spx Canada) dan outgroup (S. litura dan S. littoralis) (Tabel 3). Hasil dari
alignment antara sekuen gen COI ingroup dan outgroup dihasilkan panjang
sekuen sebesar 530 pb. Terdapat pemotongan sekuen gen COI dari 900 pb
menjadi 530 pb. Pemotongan sekuen dilakukan untuk menyesuaikan dengan
panjang sekuen gen COI dari Jepang yaitu 530 pb agar didapatkan daerah yang
conserve.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 M pb
900
60
800
700
60
600
500
Gambar 2 Amplikon pita DNA gen COI ngengat S. exigua ; 1,2 = SpxCrb, 3,4 =
Spx2Brb, 5,6 = Spx1Bdg, 7,8= Spx1Cps, 11= kontrol negatif, 12 = kontrol
positif (gen cyt b A. melifera)
Tabel 3 Data sampel ingroup (S. exigua) dan outgroup (S. litura dan S. littoralis) yang
digunakan untuk analisis gen COI pada penelitian ini
No
Sampel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Ingroup
S. exigua
S. exigua
S. exigua
S. exigua
S. exigua haplotipe 1
S. exigua haplotipe 2
S. exigua haplotipe 3
S. exigua haplotipe 4
S. exigua
S. exigua
11
12
S. exigua
S. exigua
13
14
Outgroup
S. litura
S. littoralis
Lokasi/ Asal
No. Akses
GenBank
Kode
sampel
Tanggal
Cirebon
Brebes
Bandung
Cipanas
Florida
Florida
Florida
Florida
Cina
Jepang
(Kagoshima)
Thailand
Canada
(Wellington)
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
Penelitian ini
HM756077
HM756078
HM756079
HM756080
NC019622
AB733674
SpxCrb
Spx2Brb
Spx1Bdg
Spx1Cps
Spx_hap1
Spx_hap2
Spx_hap3
Spx_hap4
SpxCna
SpxJpn
29-02-2013
29-02-2013
29-02-2013
29-02-2013
22-01-2013
02-03-2013
FN908004
GU094753
SpxTln
SpxCda
01-12-2010
05-03-2012
Taiwan
Portugal
HM756093
HM756074
S_litu
S_litto
29-02-2013
29-02-2013
7
Berdasarkan hasil alignment sampel S. exigua di Jawa dari penelitian ini baik
antara sampel di dataran rendah dan dataran tinggi tidak memperlihatkan adanya variasi
nukleotida. Dengan demikian, data gen COI S. exigua dari hasil penelitian ini dapat
menjadi ciri gen COI untuk S. exigua asal Jawa. Penggunaan gen COI pada penelitian
ini merupakan gen yang digunakan pada analisis dengan DNA Barkode. DNA barkode
merupakan suatu cara untuk mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat dengan
menggunakan DNA pendek yang distandardisasi (Hebert et al. 2005). Pemilihan gen
COI di dalam analisis menggunakan DNA barkode karena gen COI yang digunakan
relatif pendek yaitu 648 pb, bersifat conserve, relatif stabil tidak mudah mengalami
perubahan-perubahan dengan gen-gen mitokondria yang lainnya, dan gen COI terdapat
dalam jumlah kopi yang banyak (Hebert et al. 2003). Beberapa penelitian lain
menunjukan bahwa gen COI dapat mengidentifikasi spesies kompleks. Pada contoh
lain, Hausman et al. (2011) menggunakan DNA barkode untuk monitoring keragaman
dan identifikasi spesies kupu-kupu dan ngengat (Lepidoptera) di German. Hampir
(99%) dari 957 spesies diidentifikasi dengan menggunakan sekuen DNA barkode.
Gen COI diturunkan secara meternal, sehingga tidak adanya variasi
nukleotida pada gen COI pada populasi S. exigua yang terdapat di Jawa disebabkan
karena masih satu keturunan dengan nenek moyang S. exigua asal Asia
Tenggara. Terdapat perubahan pada nukleotida menyebabkan terjadinya mutasi
titik pada gen tersebut. Adanya mutasi dapat menyebabkan asam amino menjadi
berubah atau tidak berubah (silent mutation). Silent mutation terjadi apabila
perubahan nukleotida DNA tidak menyebabkan asam amino berubah. Perubahan
asam amino biasanya terjadi pada perubahan nukleotida pada posisi kodon pertama
dan kedua, sedangkan posisi ketiga jarang menyebabkan terjadinya perubahan.
Peluang terjadinya mutasi sinonim pada nukleotida kodon pertama 5%, pada kodon
ketiga sebesar 72% dan pada kodon kedua selalu menyebabkan asam amino berubah
(Nei 1987).
Selanjutnya, berdasarkan alignment antara sekuen gen COI hasil penelitian
ini dengan sekuen gen COI asal negara Asia lain seperti Thailand, Jepang, dan Cina
juga tidak memperlihatkan adanya variasi nukleotida, kecuali satu pada populasi Cina
(data tidak dipublikasikan). Hasil alignment antara sekuen Asia dengan sekuen
Florida dan Canada menunjukan variasi nukleotida gen COI yang tinggi
(Gambar 3). Variasi nukleotida yang tinggi banyak terdapat pada sekuen gen COI
asal Florida dan Canada. Variasi nukleotida terdapat pada basa ke 95, 117, 284, 459
dan 464. Pada basa ke 95 terjadi mutasi titik C–T pada kodon ke-2 sehingga
mengubah asam amino serina menjadi leusina, basa ke-117 mutasi titik G–A pada
kodon ke 3 tidak menyebabkan asam amino berubah yaitu leusina, nukleotida ke-284
terjadi mutasi titik C–T mengubah asam amino treonina menjadi metionina,
nukleotida ke-459 terjadi mutasi titik T–C pada kodon ke-3 menyebabkan asam
amino tidak berubah yaitu tirosina dan pada basa ke-464 mutasi titik A–G pada kodon
ke-2 yaitu histidin menjadi arginin.
Adanya mutasi pada nukleotida menunjukkan bahwa S. exigua telah mengalami
suatu proses evolusi dan adaptasi terhadap seleksi alam yang tersebar dari tempat
asalnya (Asia Tenggara) ke Amerika Selatan dan Amerika Utara dengan waktu
yang sangat lama. Spodoptera exigua mempunyai persebaran yang sangat luas
dan hampir ditemukan di berbagai belahan bumi. Strategi dalam cara bertahan hidup
menjadi salah satu faktor yang sangat penting bagi persebaran S. exigua di berbagai
belahan bumi. Hibernasi dan migrasi adalah dua strategi adaptasi utama untuk
kelangsungan hidup serangga di musim dingin (Tauber et al. 1986). Dengan adanya
strategi ini berpengaruh terhadap peningkatan proses distribusi S. exigua.
8
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
CATGCTTTTA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TTATAATTTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CTTTATAGTA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
T........T
T........T
ATACCTATTA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TAATCGGAGG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
....T.....
..........
..........
..........
....T.....
....T.....
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
[100]
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
ATTTGGAAAT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TGACTTGTCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......A...
..........
..........
........A.
........A.
CATTAATATT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.T........
.T........
AGGAGCCCCA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
......T..T
.........T
GATATAGCTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
[150]
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
AGTTTACCCC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CCACTCTCCT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..C.......
..C.......
CTAATATTGC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
CCACGGTGGA
..........
..........
..........
..........
..........
..........
...T......
...T......
...T......
...T......
...T......
T..T......
T..T......
AGATCTGTAG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.....A....
.....A....
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
[300]
Spx_1_Bdg
Spx_1_Cps
Spx_2_Brb
Spx_Crb
Spx_Cina
Spx_Jepang
Spx_Thailand
Spx_Canada
Spx_hap1_Florida
Spx_hap2_Florida
Spx_hap3_Florida
Spx_hap4_Florida
S_litura
S_littora
TATTATTATT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........C.
........C.
........C.
........C.
........C.
..........
..........
ATCACTACCT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
...G......
..........
..........
...G......
...TT.....
...TT.....
GTTTTAGCAG
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
........T.
........T.
GAGCTATTAC
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
TATATTACTT
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
..........
.......T.A
.......T.A
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
[500]
Gambar 3 Alignment DNA gen COI S. exigua. Simbol . = kesamaan basa dalam kolom
yang sama. variasi ditunjukan dengan nukleotida yang berbeda pada tiap
kolom
9
Berdasarkan distribusi sebaran S. exigua secara geografis di dunia, daerah
distribusi S. exigua meningkat sebanyak 34 negara dari 67 negara sejak tahun
1972 (Zheng 2011). Meningkatnya distribusi S. exigua dipengaruhi oleh adanya
strategi adaptasi terhadap musim dan juga tanaman inang yang beragam.
Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni Sekuen DNA Gen COI
Analisis jarak genetik dilakukan berdasarkan sekuen DNA gen COI ingroup (S.
exigua) dan outgroup (S. littura dan S. littoralis). Jarak genetik tertinggi dihasilkan dari
sekuen gen COI intraspesies antara S. exigua haplotipe 1 Florida dengan S. exigua asal
Asia sebesar 0.008 (0.8%) dan jarak genetik terendah dihasilkan dari sekuen DNA gen
COI kelompok asia sebesar 0.000 (0%) (Tabel 4). Kemudian, jarak genetik gen COI
spesies S. exigua pada penelitian ini yang dikoleksi dari populasi dataran rendah dan
dataran tinggi di Jawa tidak menunjukan jarak genetik yang berbeda yaitu 0.000 (0%).
Hasil konstruksi filogeni berdasarkan gen COI (Gambar 4) menunjukan terdapat
tiga kelompok utama S. exigua yaitu, pertama kelompok S. exigua di Jawa
mengelompok dengan S. exigua asal Jepang, Cina, dan Thailand dengan nilai bootstrap
82 %. Kelompok kedua adalah dua haplotipe (haplotipe 2 dan 3) S. exigua asal Florida
dan Canada dengan nilai bootstrap 50%. Kelompok ketiga adalah dua haplotipe lain
dari sampel S. exigua dari Florida (haplotipe 1 dan 4) dengan nilai bootstrap 48%.
Konstruksi filogeni berdasarkan sekuen DNA gen COI memperlihatkan
pengelompokkan yang terpisah dengan nilai bootstrap 100 % antara sekuen ingroup (S.
exigua dari berbagai lokasi) serta outgroup yaitu S. littura dan S. littoralis (Nagoshi et
al. 2010).
Tabel 4 Jarak genetik berdasarkan sekuen DNA gen COI ingroup dan outgroup
[
[ 1]
[ 2]
[ 3]
[ 4]
[ 5]
[ 6]
[ 7]
[ 8]
[ 9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.000
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.004
0.008
0.006
0.004
0.006
0.068
0.062
0.004
0.002
0.000
0.002
0.068
0.062
0.006
0.004
0.002
0.066
0.060
10
11
12
13
14 ]
0.002
0.004 0.002
0.070 0.068 0.068
0.064 0.062 0.062 0.017
Keterangan:
[1] Spx_1_Bdg, [2] Spx_1_Cps, [3] Spx_2_Brb, [4] Spx_Crb, [5] Spx_Cina, [6] Spx_Jepang
[7] Spx_Thailand, [8] Spx_Canada, [9] Spx_hap1_Florida, [10] Spx_hap2_Florida[11]
Spx_hap3_Florida, [12] Spx_hap4_Florida[13] S_litura, [14] S_littora
10
Spx Jepang
Spx Thailand
Spx Cina
82
Spx Crb
Kelompok 1
Spx 2 Brb
Spx 1 Bdg
45
Spx 1 Cps
Spx Canada
100
Spx hap2 Florida
Kelompok 2
50
Spx hap3 Florida
Spx hap1 Florida
Kelompok 3
48 Spx hap4 Florida
S litura
S littora
Outgroup
0.005
Gambar 4 Konstruksi pohon filogeni S. exigua berdasarkan sekuen DNA gen COI
menggunakan metode Neighbour Joining (NJ). Angka pada nodus
menyatakan nilai
hasil bootstrapDAN
1000 SARAN
x, singkatan mengacu pada Tabel 3
SIMPULAN
Simpulan
Alignment DNA antara populasi S. exigua pada empat lokasi di dataran rendah
(Cirebon dan Brebes) dan dataran tinggi (Bandung dan Cipanas) di Jawa
memperlihatkan tidak adanya variasi nukleotida pada gen COI. Amplifikasi dan sekuen
gen COI secara parsial menghasilkan 530 pb. Dengan demikian didapatkan satu
haplotipe gen COI S. exigua di Jawa. Hasil ini dapat digunakan sebagai DNA Barkode
yang mencirikan S. exigua asal Jawa. Pada konstruksi filogeni berdasarkan gen COI
terdapat tiga kelompok utama S. exigua yaitu, pertama kelompok S. exigua di Jawa
mengelompok dengan S. exigua asal Jepang, Cina dan Thailand, kelompok kedua dan
ketiga adalah empat haplotipe S. exigua asal Florida dan Canada. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa perbedaan haplotipe ini dapat berfungsi sebagai barkode untuk
membedakan variasi di dalam spesies S. exigua di berbagai belahan dunia.
Saran
Perlu diadakannya penelitian lanjutan pada gen lain untuk melihat adanya variasi
genetik tingkat intraspesies pada spesies Spodoptera exigua di Indonesia.
11
DAFTAR PUSTAKA
Brown ES, Drewhurst CF. 1975. The genus Spodoptera (Lepidoptera, Noctuidae)
in Africa and the Near East. Bull of Entomol Res. 65: 221-262
Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An efeective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem. 385: 174175.
Capinera JL. 2001. Handbook of Vegetable Pests. San Diego (US): Academic press.
[Ditjen Hortikultura] Direktorat Jenderal Hortikultura. 2010. Statistik Produksi
Hortikultura Tahun 2009. Jakarta (ID): Dirjen Hortikultura Pasar Minggu.
Hajibabaei M, Janzen DH, Burns JM, Hallwachs W, Hebert PDN. 2006.DNA barkode
distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: 968-971.
Harrison RG. 1989. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and
evolutionary biology. Tre Ecol Evol. 4: 6-11.
Hebert PDN, Cywin SA, Ball SL, Ward JR. 2003. Biological idntifications through
DNA barcodes. Proc R Soc. 270: 313-321.
Hausmann A, Haszprunar G, Segerer AH, Speidel W, Behounek G, Hebert PDN. 2011.
Now DNA Barcoded : the butterflies dan large moths of Germany. Spixiana 34:
47-58.
Hebert PDN, Gregory TR. 2005. The promise of DNA barcoding for taxonomy. Syst
Biol. 54: 852-859.
Kalshoven LGE. 1981. The Pests of Crops In Indonesia. Jakarta (ID): PT. Ichtiar Baru.
Lahaye R, Michelle VDB, Bogarin D, Warner J, Pupulin F, Gigot G, Maurin O,
Duthoit S, Barraclough TG, Savolainen V. DNA barcoding the floras of
biodiversity hotspots. PNAS 105: 2923-2928.
Nagoshi RN, Brambila J, Meager RL. 2010. Use of DNA barcodes to identify invasive
armyworm Spodoptera spesies in Florida. J Ins Sci. 11: 1536-2442.
Nei M. 1987. Molecular evolutionary genetics. New York (US): Columbia University
Press.
Raffiudin R, Crozier. 2007. Phylogenetic analysis of honeybee behavioural evolution.
Mol Phylogen Evol 48: 543-552.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratorium
ManualSecond Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood,
evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol.
28:2731-2739.
Tauber MJ, Tauber CA, Masaki S.1986. Seasonal adaptations of insect. New York
(US):Oxford University Press.
12
Ward RD, Zemlak TS, Innes BH, Last PR, Hebert PDN. 2005. DNA barcoding
Australia fish spesies. Phil Trans R Soc B 360: 1847- 1857.
Zheng XL, Cong XP, Wang XP, Lei CL. 2011. A Review of Geographic Distribution,
Overwintering and Migration in Spodoptera exigua Hübner (Lepidoptera:
Noctuidae). J Ento Mol Res Soc.13: 39-48.
.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Kromatogram sekuen gen COI DNA Mitokondria ngengat S. exigua menggunakan primer forward COI-47F
14
Lampiran 2 Kromatogram sekuen gen COI DNA Mitokondria ngengat S. exigua menggunakan primer reverse COI-916R
15
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Karawang tanggal 27 Desember 1990 dari pasangan Suprawadi
dan Aan Rohani. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersudara. Penulis menyelesaikan
pendidikan menengah atas di SMAN 1 Karawang pada tahun 2009. Pada tahun yang sama
penulis diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor melalui jalur Usmi. Penulis memiliki pengalaman sebagai asisten
praktikum pada mata kuliah Fungsi Hayati Hewan (2011/2012), Genetika Molekuler
(2011/2012), Anatomi dan Morfologi Tumbuhan (2012/2013) serta Perkembangan dan
Pertumbuhan Tumbuhan (2012/2013). Selama menempuh studi di Departemen Biologi,
penulis melakukan penelitian dalam studi lapang mengenai Ragam Ektomikoriza Pada Pinus
dan Meranti di Gunung Walat tahun 2011 dan praktik lapang di PT. ABC President mengenai
Mekanisme Produksi dan Proses Pengolahan Produk Mi ABC Goreng CUP di PT. ABC
President Indonesia.