Uji aktivitas protein buah paria (Momordica charantia L.) dengan menggunakan uji kematian larva udang dan alur sel secara in vitro
UJI AKTIVITAS PROTEIN BUAH PARIA
(Momordica charantia L.) DENGAN MENGGUNAKAN UJI
KEMATIAN LARVA UDANG DAN ALUR SEL SECARA
IN VITRO
AN1 KURNIAWATI
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
ABSTRAK
P,NI KURNIAWATI. Uji Aktivitas Protein Buah Paria (Momordica charantia L.)
dengan Menggunakan Uji Kematian Larva Udang dan Alur Sel Secara in Vitro.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari aktivitas ekstrak protein aktif
buah paria muda dan matang dari beberapa kultivar paria dengan uji kematian larva
udang dan alur sel. Buah muda adalah buah yang dipanen untuk sayur, buah matang
adalah buah paria yang telah berubah warna menjadi kuningorange. Bahan
timaman yang digunakan adalah buah paria Hijau, Putih, Kotok, dan Giok.
Ekstraksi protein buah paria menggunakan buffer pH, diendapkan dengan
amonium sulfat dan dirnurnikan dengan kolom sephadeks. Uji hayati yang
digunakan untuk menguji aktivitas ekstrak protein adalah uji kematian larva udang
d m uji menggunakan alur sel in vitro. Peubah yang diamati pada uji kematian larva
udang adalah LC50 (Lethal Consentration 50 %), sedangkan untuk uji menggunakan
a1ur sel adalah indeks penghambatan proliferasi.
Semua kultivar paria baik muda maupun matang menunjukkan aktivitas
dengan nilai LCs0 dibawah 100 pg/ml. Analisis ragam terhadap indeks
p~nghambatanproliferasi alur sel menunjukkan bahwa urnur buah, kultivar, dan
irlteraksinya nyata mempengaruhi indeks penghambatan proliferasi alur sel L929
d m KR4. Fraksi dan konsentrasi ekstrak protein nyata mempengaruhl indeks
p:nghambatan proliferasi alur sel L929 dan KR4 tetapi interaksinya tidak
b erpengaruh nyata terhadap indeks penghambatan proliferasi.
Buah paria giok muda menunjukkan penghambatan tertinggi terhadap
proliferasi alur sel L929 yaitu sebesar 26.19%. Buah matang paria hijau
rrlenunjukkan penghambatan tertinggi terhadap proliferasi alur sel KR4 (36.67%).
Sernua Graksi menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi, hanya M s i E clan
G tidak menunjukkan penghambatan terhadap alur sel KR4. Fraksi F menunjukkan
plenghambatan tertinggi terhadap alur sel L929 (21.48%) meskipun tidak berbeda
nyata dengan fiaksi B (13.66%) dan E (19.83%). Fraksi C (23.50%) menunjukkan
penghambatan tertinggi terhadap alur sel KR4 meskipun tidak berbeda nyata
dlzngan fraksi A (17.26%), B (21.16%), D (13.97%). Semakin tinggi konsentrasi uji
elcstrak protein semakin meningkat aktivitas penghambatan proliferasi. Konsentrasi
elcstrak protein 400 pg/ml dapat menghambat proliferasi alur sel L929 dan KR4
brzrturut-turut sebesar 15.97 % dan 2 1.96%.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
UJI AKTNITAS PROTEIN BUAH PARIA (Momordica charantia L.)
DENGAN MENGGUNAKAN LARVA UDANG DAN ALUR SEL
SECARA IN W R O
atlalah benar merupakan hasil karya sendiri dan belurn pernah dipublikasikan.
Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan
d 3pat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Juli 2002
Ani Kurniawati
A.GR 97043
UJI AKTIVITAS PROTEIN BUAH PARIA
(Momordicacharantia L.) DENGAN MENGGUNAKAN UJI
KEMATIAN LARVA UDANG DAN ALUR SEL SECARA
IN VITRO
AN1 KURNIAWATI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Agronomi
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
: Uji Aktivitas Protein Buah Paria (Momordicacharantia L.) dengan
Menggnakan Uji Kematian Larva Udang dm Alur sel
Secara in Vitro
Nilma
: Ani Kurniawati
Nrp.
. : 97043
Program Studi : Agronomi
Ji~dulTesis
Menyetujui,
1. Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Sugeng Sudiatso
Ketua
/I
Prof Dr Ir Latifah K. Darusman
fuxota
Tanggal Lulus : 26 Oktober 2001
Dr d&d Harran. MSc.
hggota
v
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Klaten 13 Nopember 1969, anak pertama dari tiga
bersaudara. Penulis menikah dengan Yurisman tahun 1995, saat ini dikaruniai dua
o~.anganak, Shavira A. Pravianti (5 tahun ) dan Gernilang A Prirnagasi (3 tahun).
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar d m menengah di Klaten. Tahun
1988 penulis diterima sebagai mahasiswa program sarjana di Institut Pertanian
Bogor dan memperoleh gelar Sarjana Pertanian dari Jurusan Budidaya Pertanian
pada tahun 1993.
Penulis diterima sebagai pengajar di Jurusan Budidaya Pertanian, mulai
tahun 1994 hingga sekarang. Pada tahun 1997 penulis melanjutkan studi S2 di
Program Pasca Sarjana - IPB, dengan beasiswa BPPS.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga
tulisan ini dapat diselesaikan. Tema yang penelitiaan ini adalah penggalian potensi
sayuran, yaitu beberapa kultivar paria, sebagai pangan fhgsional.
Thesis ini merupakan sebagian penelitian dari Graduate Team Research
Gpant, Batch IV yang semulai dipimpin oleh Alm. Prof Dr Ir Livy W. Gunawan
yang selanjutnya digantikan oleh Dr Ir Said Harran, MSc. Penulis mengucapkan
te-irnakasih kepada alm. Prof Dr Ir Livy Winata Gunawan yang telah memberikan
ke sempatan kepada penulis untuk bergabung dalam proyek penelitiannya, semoga
Tuhan menerima amal baiknya dan keluarga yang ditinggalkan diberi perlindungan
dan kekuatan.
Penulis menyampaikan ucapan terimaksih dan penghargaan kepada komisi
pembimbing; Prof Dr Ir Sugeng Sudiatso. Prof Dr Ir Latifah K. Darusman, dan Dr
Ir Said Harran, MSc. yang telah memberikan bantuan baik berupa saran maupun
faiilitas yang menunjang kelangsungan penelitian.
Penghargaan dan ucapan terimakasih kepada Drh Bambang Pontjo P., MS.,
Ph.D atas izin penggunaan laboratorium Patologi, FKH-IPB. Terimakasih kepada
Ibu Sutanty, Ibu Wiwi, Ibu Hilda atas penerimaan yang bak; Mbak Ati (Saraswati)
dan Mas Faisal atas bantuan dan persahabatannya di Laboratorium ImunologiNAMRU.
Penghargaan juga saya sampaikan kepada teman-teman di Jurusan Budidaya
Peltanian atas perhatian dan semangatnya Kepada Ir Evy Damayanti, MS staf
pengajar Jurusan GMSK dan teman sekeja di Laboratorium NAMRU-2 Jakarta;
terimakasih atas persahabatan dan kerjasamanya yang baik; Ir Herla R, MS. atas
waktuya di Laboratorium Patologi-FKH. Ucapan terimakasih untuk semua piha.
yang turut membantu kelancaran pekerjaan di Laboratorium Biokimia-FMIPA,
Laboratorium PSPT, Laboratorium Imunologi-NAMRU-2 Jakarta.
Rasa terimakasih yang dalam untuk keluargaku; anak-anak, suami, ibu dan
sanua keluarga; tanpa pengertian, bantuan dan dukungannya saya tidak munglun
dapat menyelesaikan semua ini.
Semoga tulisan ini bermanfaat bag penulis dalam melaksanakan tugas di
ternpat bekerja dan dapat menyumbangkan informasi untuk pengembangan
pemanfaatan sayuran, terutama paria.
Bogor, Juli 2002
Ani Kurniawati
DAFTAR IS1
Halaman
ix
DAFTAR TABEL .....................................................................
DAFTAR GAMBAR ................................................................'
X
D AFTAR LAMPIRAN ...............................................................
xi
PIZNDAHULUAN
Latar Belakang ..................................................................
Tujuan .........................................................................
Hipotesis .......................................................................
1
4
5
TlNJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Paria .......................................................
Manfaat Paria .................................................................
Ekstraksi Protein ...............................................................
Kanker ...........................................................................
Pangan dan Kanker .............................................................
Uji Hayati .......................................................................
Kultur Sel........................................................................
Uji Alur sel .....................................................................
B t W DAN METODE
Tempat Dan Waktu Penelitian................................................
Bahan dm Metode.............................................................
Ekstraksi Protein ...............................................................
Uji Kematian Larva Udang ................................................
Uji Menggunakan Alur Sel ...................................................
18
18
19
20
21
H.4SIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Protein ...............................................................
Uji Kematian Larva Udang ...................................................
Uji Aktivitas Menggunakan Alur Sel .......................................
26
28
33
DPSTAR PUSTAKA ..................................... :....................
43
LAMPIRAN ............................................................................
46
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Rendemen protein buah paria pada fiaksi amoniurn sulfat ............
2
Rekapitulasi Andisis Ragam terhadap peubah Indeks Penghambatan
Proliferasi .................................................................... 34
27
,
3 Interaksi Kultivar dan Umur Paria terhadap Indeks Penghambatan
Proliferasi Alur Sel L929 secara in Vitro .................................
35
4 Interaksi Kultivar dan Umur Paria terhadap Indeks Penghambatan
Proliferasi Alur Sel KR4 secara in Vitro .................................
35
5 Indeks Penghambatan Proliferasi Tiap Kelompok Fraksi ..............
37
6 Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Protein terhadap Indeks Penghambatan
Proliferasi Alur Sel secara in Vitro ....................................... 39
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Rendemen Protein Buah Paria pada Fraksi Amoniurn Sulfat ........... 27
-
2 Nilai LC 50 Ekstrak Protein Buah Paria pada Fraksi Amoriium Sulfat
Dengan Uji Kematian Larva Udang ... ................. ................ ...
3
28
Pola Pernisahan Ekstrak Protein Beberapa Kultivar Paria Muda
dengan Kolom Sephadeks ... .................. ... ............. ... ........... 30
4 Pola Pernisahan Ekstrak Protein Beberapa Kultivar Paria Matang
dengan KolomSephadeks .................................................. 30
5 Rendemen Fraksi Kolom Kultivar paria Muda ............... ..........
31
6 Rendemen Fraksi Kolom Kultivar paria Matang ......... ......... ...... 32
7 Indeks Penghambatan Proliferasi Kultivar Paria Muda terhadap
Alur Sel L929 ............ ... ...... ...... ...... ....... ........ . . .
36
8 Indeks Penghambatan Proliferasi Kultivar Paria Matang terhadap
AlurSelKR4 ...................................... .......................
36
9 Indeks Penghambatan Roliferasi Kelompok Fraksi ....................
38
1(1 Pengaruh Konsentrasi terhadap Indeks Penghambatan Proliferasi ...
39
,
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Iiagan Alur Penelitian . . . . . ..... .. ... ... .. . ..... . ............ . . . ...... .. . ... 46
2 Pangelompokan Frakai Hasil Fraksinasi Ekstrak Protein Buah
Paria . . . . ..... . .. . . . ... .. . . .. . . . .. . .. . .... . . ..... . . .. . .. ... .... .. .... . . . . . .. . .. . . 47
3 Hasil Freeze Drier Buffer Na3P04 50mM . . ... .. ... .. ..... . . . . . .. . . . . . . . .
47
4 Hasil Freeze Drier Fraksi Kolom . . . . .. .. . . ... . ............ . . .... . . . . . ... . . .. 47
5 Hasil Uji-t Pengaruh Buffer dan Pelarut terhadap Proliferasi
Alur sel L929 dan KR4... ......... . . . .. . .. ... .. . ... ............... . . . .. . . ... . . 48
6 Analisis Ragam Indeks Penghambatan Proliferasi Ekstrak Protein
terhadap Alur sel L929 .. . .. ... ... . . . ...... ... . . ... .. . ...... . .. .. . . . . ... . . . . ... 48
7 Analisis Ragam Indeks Penghambatan Proliferasi Ekstrak Protein
terhadap Alur Sel KR4 ...... ......... ... ... ... ... ............... ............ ... 48
8 Kultivar Paria yang Diuji Aktivitasnya ........ . ................... . .... .... 49
9 Uj:i Aktivitas Ekstrak Protein Paria dengan Alur Sel Menggunakan
Microtitter Plate96-well ........................ .......................... ... ... 50
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sayuran umumnya selalu ada dalam menu masyarakat Indonesia. Pada
awalrlya pemilihan jenis sayuran hanya didasarkan pada nilai nutrisi sayuran,
terutama dari kandungan vitamin dan mineralnya. Namun akhir-akhir ini sebagian
masyarakat mulai sadar akan kandungan non gizi yang bermanfaat dalam
pemeliharaan kesehatan, disamping komponen gizinya. Kesadaran masyarakat ini
tidak terlepas dari semakin meningkatnya tingkat pendidikan dan pengetahuan gizi
masyarakat serta kesadaran dalam pemeliharaan kesehatan. Sayuran dapat diartikan
sebagai produk atau komoditi yang didefinisikan sebagai tanaman atau bagian
tananian yang sukulen dari suatu tanaman, yang dikonsurnsi sebagai pelengkap
makanan pokok (Williams et. al., 1993; Siemonsma and Kasem Piluek, 1994).
Banyak penelitian terhadap sayuran yang ditujukan untuk mempelajari komponen
non gizinya. Beberapa penelitian membuktikan bahwa dalam bahan pangan
terkaildung senyawa kimia yang dapat berfungsi sebagai ~hemo~urevention
terhadap
kankcr. Clzemoprevention adalah istilah untuk intervensi bahan kimia atau bahan
pangan yang dapat mengurangi kerentanan karsinogen dengan cara menghalangi,
menghambat, atau mebalikkan kerentanan terhadap kanker (Block et. al., dalam
Fahey and Talalay, 1995).
Penelitian yang telah dilakukan membuktikan bahwa konsurnsi sayur dan
buah yang tinggi berasosiasi dengan pengurangan resiko terserang kanker.
Selanjutnya telah ditemukan pula bahwa dalam jenis sayuran tertentu, disarnping
kandungan seratnya, terkandung senyawa kimia lain non gizi untuk pencegahan
terhadap kanker. Contoh sayuran jenis ini adalah beberapa sayuran dalam famili
Cruciferae, Solanaceae, dan Liliaceae
Di
Arnerika,
penelitian
terhadap
spesies
Crucqerae
sebagai
chemoprevention, terutama brokoli, teiah meningkatkan secara drastis perrnintaan
jenis sayuran ini di pasaran. Beberapa spesies dalarn famili Cruclferae yang telah
diteliti sehubungan kandungan bahan kimia yang dapat mencegah kanker adalah
brussel sprout, kule, red cabbage, cuulrJlower,green cabbage.
Indonesia, dengan jenis sayuran yang sangat beragam, sangat berpotensi
mengembangkan makanan kesehatan. Untuk itu diperlukan serangkain penelitian
terhadap bahan makanan, misalnya sayuran, untuk mengetahui potensinya sebagai
makanan kesehatan. Bila ha1 ini berhasil dilakukan maka akan memberikan nilai
tamb(ahterhadap nilai sayuran tertentu dan sekaligus dapat meningkatkan deraiat
keseltatan penduduknya. Penelitian-penelitian ini semakin strategis untuk dilakukan
bila melihat perubahan pola penyakit di Indonesia.
Penyakit infeksi yang
merupakan masalah utama makin berkurang seiring dengan kemajuan ekonomi
yang memungkinkan pencegahan dan pengobatan yang lebih intensif. Sebaliknya
penyrikit degeneratif dan kanker semakin menonjol (Tjahjono. 1999).
Khusus untuk penyakit kanker, terjadi peningkatan yang sangat drastis.
Dalarn 10 tahun terakhir, terjadi peningkatan sebagai
penyebab kematian di
Indonesia, dari urutan ke-12 meniadi urutan ke-6. Walaupun penyebab pasti belum
diketiihui, tetapi telah teridentifikasi faktor resiko berbagai jenis kanker yaitu faktor
keturunan, lingkungan hidup, dan gaya hidup (Thahjono, 1999; Budiarso,l998).
Pengobatan terhadap penyakit ini umumnya mahal dan beresiko besar. Oleh karena
itu penggalian potensi bahan pangan, terutama sajurafi, untuk dikembangkan
sebagai makanan kesehatan seharusnya diprioritaskan.
Paria adalah salah satu jenis sayuran yang termasuk dalam farnili
Cucui*bitaceae. Selain sebagai sayuran, sebagian masyarakat memanfaatkannya
untuk pengobatan berbagai jenis penyakit. Dari berbagai bagian dari tanaman ini;
daging buah, biji, akar, daun, bunga; secara trahsional digunakan untuk pengobatan
rheuniatik, astma, artritis, diabetes, pencuci perut (Nguyen dan Sri Hayati Widodo,
1999). Di Arnerika, Jus dari buah paria segar banyak dimanfaatkan untuk terapi
pende:ritaHIV.
'
Indonesia mempunyai banyak kultivar paria, tetapi belurn ada klasifikasi
yang memadai. Secara tradisi, masyarakat mengelompokkan paria berdasarkan
warna. buah.
Demikian juga
klasifikasi menurut
Ochse (1931)
yang
mengelompokkan paria & Indonesia menjadi beberapa jenis yaitu paria bodas (sn.)
/ pare gajih (jw.), paria hejo (sn.) / pare belungan, paria kotok atau gengge (sn.) atau
pare a.yarn (jw.). Selain itu terdapat pana hibrida, baik produk lokal maupun irnpor,
yang mempunyai keunggulan dan banyak dibudidayakan petani serta digemari
masyarakat.
Dari beberapa penelitian di luar negeri, telah berhasil diisolasi suatu protein
aktif ,dari biji paria (Momordica charantia L.) yang b e h g s i sebagai inhibitor
sintesis protein. Kelompok protein ini disebut RIP atau Ribosom Inactivating
Protejn (Minami et. al., 1992). RIP juga dilaporkan terdapat pada anggota famili
Cucurbitaceae lainnya yaitu Lu#a cylindrica dan Trichosantes kirilowii ( Kondo et.
ul., 1995; di Topi et. al., 1996). RIP merupakan protein yang dapat dimanfaatkan
baik dalam bidang pertanian maupun kesehatan.
Dalam bidang pertanian
berpo1:ensi sebagai bahan pelindung terhadap serangan hama dan penyakit, dengan
keunggulan mudah terdegradasi sehingga aman terhadap lingkungan. Sedangkan
1
Kompas Minggu, 18 Februari 2001
dalann bidang kesehatan dapat dimanfaatkan sebagai immunotoksin untuk target sel
terterltu, seperti sel kanker, T-sel, dan macrophage yang diinfeksi virus HIV
(Min*amiet. al., 1993; Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999). Lin Huang et. al.
(1995)),melaporkan bahwa MAP 30 (Momordlne Active Protein, bobot molekul 30
kD) yang diisolasi dari biji paria adalah suatu protein bioaktif, dan secara aktif
dapat melawan HIV-1 dan sel tumor.
Dalam proses mengisolasi suatu bioaktif diperlukan uji hayati untuk
mengetahui efek farmakologinya. Untuk mendapatkan bioaktif sebagai anti kanker
digunakan kombinasi uji hayati antara lain uji kematian larva udang (brine slzrimp
lethar'lty test) dan uji menggunakan dua alur sel kanker secara in vitro. Kombinasi
kedm~uji ini digunakan untuk mendapatkan senyawa anti kanker dari buah muda
Persea americana dan cortex Taiwania ctyptomenoides (Oberlies et. al., 1998; He
et. al., 1997).
Dengan berbagai manfaat tersebut, penelitian untuk mempelajari protein
bioaktif dari kultivar paria yang ada di Indonesia diharapkan akan meningkatkan
manfiiat dan nilainya. Disamping itu bila akan diproduksi dalam skala luas, maka
akan semakin banyak pilihan kultivar apabila ternyata terdapat kendala pada salah
satu pilihan tersebut.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mempelaiari aktivitas protein bioaktif buah paria
dari beberapa kultivar paria dengan dua tingkat kematangan dengan menggunakan
uji kematian larva udang dan alur sel kanker in vitro. Dari hasil penelitian ini
diharapkan mendapatkan informasi mengenai potensi bioaktif buah paria dari
bebempa k~ltivarparia.
Hipotesis Penelitian
Hipotesi penelitian ini adalah (1) Terdapat ekstrak protein bioaktif dari
beberapa kultivar paria yang dapat dideteksi dengan uji kematian larva udang, (2)
Terdapat aktivitas ekstrak protein buah paria yang dapat dideteksi menggunakan
alur sel secara in vitro.
TINJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Paria (Momordica charantia L. )
Paria termasuk dalam divisi Spermatophyta, klas Dycotyledonae, famili
Cucu~bitaceae, genus Momordica. Dalam genus Momordica terdapat 45 spesies,
kebanyakan terdapat di Afrika dan hanya 5-7 spesies berada di Asia. Spesies utama
yang r.erdapat di Asia adalah Momordica charantiu L. atau Bitter gourd (En.), Pare
(Jv.); Momordica cochinchinensis (Loureiro Sprengel) atau Sweet gourd (En.),
Pupia.TorobukToropu (Ina.); dan Momordica subungulata Blume, Bijdr. atau
Kamas (1na.Malay.). Dari ketiga spesies tersebut Momordica charantiu L. adalah
spesies yang terpenting yang telah dibudidayakan (Reyes et. al., 1994).
Momordica charantia L. merupakan herba merambat, berurnur 1 tahun,
berumah satu, dengan tinggi hingga 5 m. Batang derrgan alat pembelit berupa sulur
(tendril). Daun berupa daun tunggal, bertangkai, dan tepi dam berlobi. Bunga
terletak aksilar, soliter, benvarna kuning, uniseksual, berumah satu. Buah berupa
buah buni, buah matang benvarna orange, buah muda bervariasi dalam warna,
bentuk, dan ukuran (Reyes et. al., 1994; Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999).
Di Indonesia terdapat berbagai kultivar paria yang beragam dalam bentuk
dan ulcuran buah, namun belum ada klasifikasi yang memadai. Menurut Ochse
(1 93 1:I paria dengan buah berukuran besar, benvarna keputihan, dinamakan paria
bodas (Sn.), atau paria gajih (Jw.); paria dengan ukuran lebih kecil, benvarna hijau
dinamakan paria hejo (Sn.) atau paria belungan (Jw.); paria dengan ukuran buah
terkecd disebut paria kotok/genge/hayam (Sn.). Di India klasifikasi kultivar paria
didasarkan ukuran buah, buah dengan diameter lebih kecil dari 5 cm
dikelompokkan varietas Minima Wiliam, dan buah dengan diameter lebih besar dari
5 cm dikelompokkan dalam varietas Maima William.
Saat ini telah banyak dibudidayakan paria hibrida oleh petani sehingga
dengaln mudah konsumen mendapatkannya di pasar-pasar tradisonal. Salah satu
varietas paria hibrida yang populer adalah paria Giok. Buah paria ini mempunyai
ciri-cijri: buah berukuran besar, daging buah tebal dan lemas, tidak terlalu pahit.
Karen,%sifatnya tersebut paria giok banyak disukai oleh konsumen meskipun
hargartya relatif lebih mahal.
Manfaat Pa ria (Momordica charantia L. )
Buah muda paria adalah bagian utama yang digunakan sebagai sayuran,
dengall berbagai cara penyajian. Bagian buah yang dapat dikonsumsi sekitar 95%.
Dari 100 g bagian buah yang dapat dikonsumsi mengandung 83-92 % air, 1.5-2 g
protei140.2-1 g lemak, 4-10.5 g karbohidrat, 0.8-1.7 % serat. Rasa pahit pada buah
paria clisebabkan momordisin yang tidak toksik (non-toxic alkaloid momordisine).
Selain digunakan sebagai sayur, paria juga dimanfatkan dalam pengobatan.
untuk berbagai macam penyembuhan penyakit. Di Indonesia, jus daun digunakan
sebaga.i pembersih perut pada bayi yang baru lahir; bagian buah digunakan sebagai
tonic, carminative, rheumatik, gout, pruritis, dermatitis, dan liver. Di India, bagian
buah, iikar, dan daun telah lama digunakan sebagai obat diabetes millitus (Reyes et.
al., 1994; Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999).
Penelitian paria semakin berkembang dengan telah ditemukannya beberapa
protein yang menunjukkan beberapa efek farmakologi. Protein a-momorclzarin dan
fimon;corch~rin yang diisolasi dari biji
M charantia
menunjukkan efek
hepatoksik pada tikus percobaan. Beberapa immunotoksin dapat dibentuk dengan
cara rnenghubungkan tipe 1 ribosom-inactivating protein dari momordin I dengan
antibc~dispesifik terhadap berbagai alur sel . Perlakuan dengan imunotoksin ini
mengkambat pertumbuhan sel tumor secarain vitro, dengan nilai ICso (Inhibition
Concontratlon) pada skala pikomolar. Perlakuan irnrnunotoksin ini secara sendiri
atau dikombinasikan dengan sitostatik secara nyata menghambat perkembangan
tumor secarain vivo (Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999).
Protein dengan fungsi serupa, juga berhasil diisolasi dari biji M
cochrizchinensw. Konjugasi antara momordin-folat secara selektif membunuh sel
HeLa dan KB, dua jenis sel kanker ganas manusia, pada ko-kultur dengan sel
normal. Ekstrak kasar buah paria dapat mengurangi insiden tumor kulit pada
mencit. Ekstrak dari daging buah, biji, dan buah utuh menunjukkan aktivitas anti
karsinogenik pada 100 pgthewan percobaan.
Lin Huang et. al. (1999) membuktikan bahwa fragment MAP 30
(Momlw-din-ActiveProtein, protein aktif paria berbobot molekul 30 kD, yang
diisolasi dari biji M charantia adalah suatu protein bioaktif. Fragmen ini aktif
melawan HIV-1 dan sel tumor dengan IC 50 pada skala nanomolar, 0.2-0.4 nM, dan
hanya kecil tingkat toksisitasnya pada sel normal. Dari penelitian ini juga
dibuktikan bahwa aktivitas anti tumor dan anti viral dari MAP 30 bebas dari
aktivitas RIP.
Penelitian lain dari ekstrak paria berhasil membuktikan adanya efek
penghambatan terhadap perkecambahan spora fungi patogenik, efek antimikrobial,
antim~itagenik,tetapi tidak menunjukkan efek antimalaria (Nguyen dan Sri Hayati
Widoclo, 1999).
Ekstraksi Protein
Ekstraksi adalah salah satu cara pemisahan yang paling banyak digunakan
untuk memisahkan komponen bioaktif tanarnan.
Pelarut yang dipilih hams
didasarkan pada kemampuannya melarutkan semaksimal mungkin zat yang
diinginkan dan seminimal mungkin zat yang tidak dikehendalu. Pada prinsipnya zat
yang akan diekstrak hanya dapat larut pada pelarut yang sesuai tingkat
kepol arannya (Nur dan Adijuwana, 1989).
Protein merupakan makromolekul dengan fungsi yang sangat beragam.
Prote~nsering tidak stabil jika tidak berada dalam lingkungan asalnya, misalnya
protein yang mempunyai fungsi katalitik atau sekedar befingsi secara struktural.
Setiap protein memerlukan lingkungan yang spesifik setelah Qekstraksi dan
asalnya. Jika ha1 ini tidak terpenuhi maka akan cepat kehilangan karakteristiknya
dan berkurang masa hidupnya dengan drastis (Edelstein, 1991).
Umumnya sebagian besar protein dapat diekstraksi dengan air, larutan asam
atau hasa. atau larutan garam sederhana. Namun, protein yang bersifat lipofilik
hams diekstraksi dengan alkohol 70-80%. Presipitasi dari ekstrak protein kasar
dapat dilakukan dengan penambahan aseton, ethanol, atau amonium sulfat.
Ekstraksi dan isolasi protein paria dari biji telah dilakukan oleh Lee Huang
dalam Gunallan, (1998). Pada prosedur ini pelarut yang digunakan adalah NaCl
dan FJa3P04. Presipitasi ekstrak kasar menggunakan amonium sulfat, dengan
pemisahan menggunakan khromatografi pertukaran ion.
Kanker
Kanker merupakan istilah untuk neoplasma ganas. Neoplasma adalah massa
jaringan abnormal, timbul sebagai akibat pertumbuhan sel secara otonom, tidak
terkendali dan tidak terkoordinasi, tidak mengikuti perturnbuhan normal, membelah
diri dan berproliferasi terus menerus walaupun rangsang pemicu pertumbuhan
berleb ihan telah hilang (Tjahjono, 1999).
Dalam keadaan normal, sel memperbanyak diri dengan cara membelah diri
menu~zltkaidah pembelahan sel normal. Proses ini merupakan siklus terkendali,
sehingga pertumbuhan berlangsung sesuai aturan pembelahan normal sehingga
manusia tumbuh normal dan proporsional. Selain untuk pertumbuhan, sel baru hasil
pembelahan berfungsi mengganti sel yang mati atu menyusun jaringan baru dalam
proses penyembuhan luka (Braunstein, 1987)
Siklus sel normal dikendalikan oleh suatu kelompok protein yang secara
umum disebut siklin. Siklus berlangsung melalui fase mitosis (M), gap1 (GI),
sintesis DNA (fase S), gap2 (G-2), mitosis (M) dan seterusnya. Bila sel membelah
diri tidhk terkendali maka akan menghasilkan benjolan yang disebut neoplasms atau
tumor (Braunstein, 1987; Di Palma and John Grigorio, 1990; Tjahjono, 1999).
Hingga saat ini belurn diketahui sacara pasti penyebab kanker, tetapi telah
terider~tifikasifaktor resiko penyebab berbagai kanker yaitu faktor keturunan dan
linghlgan hidup.
Faktor lingkungan hidup yang mempengaruhi perturnbuhan
kanker antara lain penyinaran, bahan kimia pada lingkungan pekerjaan atau
makanan, infeksi virus tertentu, dan gaya hidup.
Penyinaran yang mempengaruhi perturnbuhan kanker adalah radiasi sinar
pengion dan sinar ultraviolet dari sinar matahari. Berbagai bahan kimia yang
merupiikan faktor resiko kanker antara lain benzopyrene pada ter atau rokok, hasil
pembakaran batu bara, asbes, naftilin, aromatik arnin, khromium, arsen; sedangkan
yang herssal dari bahan makanan adalah aflatoksin, nitrosamin, serta makanan
berlemak (Budiarso, 1998; Tjahjono, 1999).
Proses pertumbuhan neoplasma melalui tiga fase yaitu fase inisiasi, promosi
dan progresi.
Setiap fase ini mengakibatkan perubahan baik pada tingkat sel
maupun subseluler. Perubahan pada tingkat sel meliputi perubahan morfologi
bentuk, ukuran, dan hubungan sel yang dapat diperiksa dengan pemeriksaan
sitologik. Perubahan subseluler atau molekuler berupa terjadinya perubahan
kromosom, perubahan jumlah kandungan DNA, urutan nukleotida DNA, perubahan
proto -0nkogen menjadi onkogen sehingga merubah ekspresi proteinnya, dan
aktiv~tas prolifarasi sel (Coltran et. al, 1994; Tjahjono, 1999)
Tahap inisiasi ini berlangsung cepat dan masih reversibel, dan pada tahap
ini pula karsinogenesis dapat diinterupsi dengan berbagai agen lumia
(chentopreventzon) yang beberapa diantaranya terdapat dalam pangan manusia
(Wattenberg dalam Fahey dan Talalay, 1995; Tjahjono, 1999).
Pangan dan Kanker
Perhatian peneliti terhadap hubungan antara pangan dan kanker bukanlah
sesua tu yang baru. Keterkaitan antara pangan dan kanker telah dilaporkan William
Lambe pada tahun 1809. Namun, aktivitas penelitian utama yang menghubungkan
pangan dan kanker baru dimulai sekitar tahun 1940 di Michael Reese Hospital
Clziccgo dun University of Wisconsin ( Kritchevsky, 1996).
Bahan pangan yang banyak diteliti yang dapat mengurangi resiko kanker
adalall sayuran dan buah. Konsumsi sayur dan buah yang tinggi berasosiasi dengan
penguuangan resiko terserang kanker. Sedangkan pangan yang mengandung banyak
lemak: dan kalori cenderung meningkatkan resiko terserang kanker (Graham, 1986)
Istilah 'sayuran' biasanya d i p a k a n untuk merujuk pada tunas, dam, buah,
dan akar yang lunak yang dapat dimakan secara utuh atau sebagian, segar atau
dimasak, sebagai pelengkap makanan berpati dan daging (William et. al., 1993).
Sayuran merupakan surnber vitamin, mineral, dan serat yang penting dalam diet.
Sejumlah penelitian telah membuktikan bahwa sayur dan buah mempunyai efek
perlindungan pada semua kejadian kanker manusia, karena kandungan nutrisi
m aupun komponen non nutrisinya (Block et. al. dalam Fahey and Talalay, 1995).
Selain serat, dalam sayuran dan buah terkandung berbagai fitokimia yang
juga menunjukkan efek perlindungan yaitu vitamin (A, C, dan E), mineral (Ca, Zn,
Sea) dan beberapa senyawa kimia seperti isotiosianat, sterol, fenol, kumarin,
inhibitor protease, indole, khlorofilin. Dari 170 studi epidemik disimpulkan bahwa
konsumsi empat dari enam sayur dan buah per hari membantu mengurang.1 resiko
pe rkembangan kanker pada berbagai organ hingga 50 % (Stoner, 1995).
Beberapa famili sayuran yang telah intensif diteliti sebagai agen
cht?moprevention adalah Liliaceae, Cruciferae, dan Solanaceae. Penelitian suatu
spesies dari tiap famili ini telah meningkatkan jumlah permintaan sayuran di
Anlerika serikat, khususnya brokoli dari famili Cruciferae.
Wattenberg dalam Stoner ( 1995) mengklasifikasikan agen chemoprevention
benhsarkan periode yang menunjukkan efek penghambatan pa& karsinogenesis.
Menurut klasifikasi ini terdapat tiga tipe utama dari agen chemoprevention yaitu
mertghambat pembentukan karsinogen, agen penghambat (bloking agent), agen
penekan (supressing agent). Sebagian besar senyawa kimia yang menghambat
pembentukan karsinogen kimia bekerja mencegah pembentukan nitrosamin,
termasuk didalamnya adalah asam askorbat, asam ferulat, dan beberapa senyawa
sulfi hidril. Kelompok agen penghambat bekej a menghambat fase inisiasi,
sedangkan agen penekan bekerja menghambat fase promosi atau progesi.
Paria yang merupakan salah satu spesies dari famili cucurbitaceae mulai
intensif diteliti karena mengandung protein bioaktif. Dari paria dan beberapa
spesies dari famili cucurbitaceae lainnya, telah berhasil diisolasi protein yang
berfungsi sebagai inhibitor. Kelornpok protein ini disebut Hibosom Inactivating
rotein ins (RIPS). RlPs adalah protein-protein yang dapat menghambat sintesis
protein melalui tindakannya pada ribosom. Protein ini mempunyai aktivitas RNA
PJ-glycos~du~~e
yang dapat rnemutus ikatan spesifik glikosida pada 28 S rRNA
('Natanabe et. ul., 1990; Minami et. al., 1992; Dong et. al., 1994; Savary and
Hector, 1995; di Toppi et. al., 1996).
Uji Hayati
Uji hayati diperlukan untuk penapisan material tanaman yang mengandung
bioaktif. Efek farmakologi dan biologi ditirnbulkan oleh interaksi antara ligantarget yang dapat dipelaiari dan dinilai secara spesifik dengan uii hayati. Uii hayati
yang dipilih haruslah tepat, dalam arti tidak hanya efektif tetapi juga selektif,
spesisfik: murah, cepat, reproduc~ble,dan valrd secara statistik. Dengan demikian
dapat dihasilkan pemahaman yang tepat dari efek farmakologi atau biologi dari
suatu senyawa (de Padua et. ul., 1999).
Pada tahap awal, pengujian secara in vitro seharusnya menjadi prioritas
dibanding pengujian in vivo dengan menggunakan hewan percobaan. Keputusan
pemilihan pengujiaan dapat didasarkan pada pertimbangan ilmiah disamping alasan
ekorlomi maupun etika. Pengujian secara in vivo merupakan jenis pengujiaan yang
dipe-rtimbangkan pada tahap selanjutnya. Pengujian yang ekstensif secara klinis
tetap hams dilakukan sebelum didaftarkan sebagai obat (de Padua et. al., 1999).
.#,
Salah satu metode penapisan efek farmakologi yang sederhana adalah brine
shrimp lethuliv test atau uji kematian larva udang. Metode ini dapat mendeteksi
aktivitas biologi pada kisaran luas dan dengan keragaman struktur kimia dari
senyawa bioaktif. Keuntungan uji ini adalah cepat, tidak mahal, sederhana, dapat
menggunakan organisme uji dalam jumlah relatif besar.
Telur udang mudah
diperoleh di toko pakan ikan dan dapat disimpan beberapa tahun di tempat yang
kering. Telur ini dengan cepat menetas, 48 jam, bila dimasukkan &lam air laut.
Penelitian yang dilakukan Anderson et. al. (1991) membuktikan bahwa uii
hajrati ini dapat mendeteksi dengan tepat enam dari tujuh senyawa antitumor tanpa
kesalahan positif w i s e positive). Pembuktian lain adalah terdapat korelasi sangat
kuat dengan uji P-377 murine leukimia (Mclaughlin et. al., 1991).
Kultur Sel
Kultur sel merupakan istilah yang merujuk pa& kultur in vitro yang berasal
dari sel terdispersi dari kultur primer, atau dari sel line atau sel strain. Sel line atau
sel strain atau alur sel adalah populasi sel dari kultur primer yang telah disubkultur.
Alur sel dapat diperbanyak sebagai monolayer atau &lam suspensi. Kultur
monoluyer adalah suatu kultur sel yang sel-selnya menempel pada substrat. Kultur
ini merupakan model kultur yang biasa dijnmpai pada sebagian besar sel normal
dengm pengecualian pada sel darah.
Kultur suspensi adalah kultur yang berasal dari sel yang dapat tumbuh dan
berproliferasi tanpa penempelan. Sel jenis ini umumnya adalah sel darah, sel hasil
transformasi atau sel dari tumor ganas (Freshney, 1994).
Alur sel dibedaksn menjadi.fi~titecell line dan continous cell line. Finite cell
line adalah kultur sel yang mempunyai masa hidup terbatas, umumya merupakan
-
kultur jaringan sel normal atau sel-sel yang tidak berubah dalam masa pengkulturan.
Alur sel ini memerlukan waktu penggandaan yang yang lebih panjang, 24-96 jam.
Ccntinous cell line adalah alur sel yang mempunyai masa hidup tidak terbatas
(inrmortul), umumnya sel tumor atau atau sel yang mengalami perubahan selarna
per~gkulturan. Waktu penggandaan untuk jenis sei ini adalah 12-24 jam (Freshney,
19?4).
Alur Sel KR-4. Alur sel ini diperbanyak dengan kultur suspensi. Sel KR4 dibentuk
dengan menggabungkan sel GM 1500 (sel repositor mutan genetik manusia) dan sel
RPMI 8226 (ATCC CCL 155). Sel-sel tersebut tahan terhadap 6-thioguanine dan
terhadap oubain. (U.S Pat. 4,693,975. Depositor: The wistar Institute of Anatomy
and Biology, Philadelpha, Pa).
Alu~rSel L 929. L929 ini berasal dari fibroblast tikus, diperbanyak dengan kultur
mon'oluyer. Alur sel ini merupakan klon dari L-Cell, aneuploid, dan merupakan
alur sel yang mempunyai masa hidup tidak terbatas (continous cell line) (Freshney,
1994).
Uji Menggunakan Alur Sel
Uji menggunakan alur sel
merupakan uji sitotoksitas yang banyak
digunakan dalam penelitian mendapatkan agen anti kanker. Uji sitotoksitas secara
In vuro banyak dilakukan untuk berbagai tujuan, misalnya untuk mengetahui
potensi sitotoksitas suatu senyawa, atau untuk menunjukkan ketidaktoksikan suatu
bahan obat atau kosmetik. Uji ini banyak dilakukan secara ekstensif untuk
mensyaFan suatu produk obat baru, kosmetik, bahan tambahan makanan, dan lainlain sebelum dipasarkan.
Sitotoksitas merupakan suatu keadaan yang kompleks, dimana ekspresinya
dapat berupa efek yang sangat luas. Efek sitotoksitas dapat berupa kematian sel
yang sederhana sampai aberasi metabolik yang komplek. Definisi sitotoksitas akan
cenderung bergantung pada tuiuan penggunaan. Freshney (1994), mendefinisikan
u j ~sitotoksitas lebih pada aspek-aspek yang mempengaruhi pertumbuhan atau
ketahanan hidup.
Perturnbuhan dapat diartikan secara sederhana sebagai
kemampuaan beregenerasi yang dapat diukur antara lain dengan perubahan ukuran
populasi. Ketahanan hidup dapat diukur secara cepat dengan parameter integritas
pie sma-membran atau dengan parameter perturnbuhan untuk mengetahui kapasitas
pe: tumbuhan yang mempengaruhi ketahanan hidup.
Kemampuaan sel untuk bertahan hidup pada keadaan toksik merupakan
daslardari uji sitotoksitas. Parameter yang diukur untuk uji ini adalah kemampuan
berproliferasi. Sel yang dapat bertahan hidup dalam suatu kultur sel dapat diketahui
der~ganberbagai metode, misalnya dengan metode peivarnaan (trypan blue) atau
pe1,lbelan dengan bahan radioaktif ( [3~-thymrdme,[3~-urrdlne).
Pada akhir-akhlr ini uji mikrotitrasi sitotoksitas didominasi oleh penggunaan
AnT-reduction untuk menentukan sel yang bertahan hidup. MTT merupakan
singkatan dari (3-{4,5-D1metl~lt/11u~ol-2-y1]-2,5-dp1?enl
tetrazolrumbromrde;
Thuzdy! blue). Metode ini salah satu metode penghitungan sel hidup dengan car8
kolorimetri yang didasarkan pada reduksi MTT oleh enzim suklnat dehrdrogenase
mitokondria dari sel hidup yang menghasilkan produk h s t a l formazan bewarna
biru yang dapat diukur densitas optiknya
(optzcal denslt;t'/OD) dengan
spektrofotometer (Oberlies, et. ul., 1998; Ozelu ct. al., 1998). Semakin besar OD
berarti semakin besar pula jumlah kristal .formazan yang dihasilkan dari reduksi
MY'. Karena enzim pereduksi hanya dihasilkan oleh sel hidup maka semakin
besar nilai absorban dapat dikatakan semakin besar pula sel yang bertahan hidup.
Indeks penghambatan (IP) proliferasi sel dapat diukur dengan membandingkan OD
sel yang mendapatkan perlakuan dengan OD sel kontrol.
Oberliies et.al. (1998) menggunakan kombinasi uji BSL dengan MTTreduction untuk rnenguji sitotoksitas buah muda Persea americana pada tujuh alur
sel tumor manusia. Dengan cara ini dapat ditunjukkan adanya selektivitas terhadap
suatu jenis sel tumor. Pada umumnya bila nilai IC
jo
dari suatu bahan aktif lebih
kecil dari 4 pg/ml maka dikatakan aktif secara nyata.
Hal yang sama juga
dilaporkan oleh Ozeh et. 01. ( 1998) yang rnenguji .ekstrak kayu dari S~maba
ceclron.
Dalam farnili cucurbitaceae, metode ini juga telah dgunakan untuk
mengukur sitotoksitas asam brionolat (bryonolic acid) yang diisolasi dari akar
Trichosanfes kirilowii var. japonica yang telah ditransformasi terhadap berbagai
jenis sel kanker secarain vitro ( Kondo et. al., 1995). Dari Penelitian didapatkan
nilai IC
jg
sangat bervariasi dengan kisaran 15-92 pgjml, dan sangat tergantung
pada sumber sel tumor yang dipergunakan baik dalam spesies, organ, maupun
jaringan.
Perbedaan sumber sel akan mernpengaruhi sensitifitasnya terhadap
sen;yaulabioaktif.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Pemuliaan Tanaman,
Jurusan Budidaya Pertanian, FAPERTA, IPB; Laboratorium Biokimia, FMIPA,
IPB; dan Laboratorium Immunology-Naval Army Medicine Resea~ch Unit-2
(NAMRU-2) Jakarta.
Penelitian dimulai bulan Desember 1999 hingga Mei 200 1. Buah paria yang
digunakan untuk sampel berasal dari petani di desa Bantar Kambing, kabupaten
Bogor.
Bahan dan Metode
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah daging buah paria muda dan matang
dari beberapa kultivar paria yaitu paria hijau, paria putih, paria kotok, dan paria
llibrida (Giok). Paria muda adalah paria yang biasa dipanen untuk dkonsumsi
sebagai sayur, sedangkan paria matang adalah paria yang telah mengalami
peinatangan buah yaitu terjadi perubd~an warna menjadi kuning atau oranye
(Lampiran Gambar 8).
Ballan untuk mengekshaksi protein adalah NaCI, (NH4)$304, Na3P04,
pzreaksi biuret, pereaksi nessler, sephadek G-75. Alat yang digunakan adalah pipet,
biender, neraca, wadah gelas, sentrifus, stirer, selopan, ruang dingin.
Bahan untuk kultur sel dan uji proliferasi adalah media RPMI 1640, serum,
NaHC03, Hepes, gl~~tamin,
aquabidest, antibiotik, pewarna trypan blue, M77:
Isopropanol, HCI, alkohol70 %, spirtus, tissuekain kassa.
Alat yang digunakan adalah flask kultur, pipet steril, scraper, filter steril
0.2 pm, pipet tips, neraca analitik, microtirter plate-96 well, lampu bunsen, laminar,
sentrifus, mikroskop, haemositometer, MTT-reader.
Ekstraksi Protein
Ekstraksi protein menggunakan prosedur Lee Huang et. al. (1996) dengan
beberapa modifikasi (Gambar Lampiran 1). Daging buah paria diblender dengan
NaCl 0.15M pada pH 3.6 dengan perbandingan 1 g buah 1 2rnl NaC1, diupayakan
agar suhu tetap dingin dengan mengatur waktu pemblenderan. Selanjutnya ekstrak
disentrifus pada kecepatan 10 000 rpm selama 30 menit pada suhu 4°C.
Supernatan yang didapatkan ditambah (NH4)2S04 sampai kejenuhan 80 % dengan
ldiaduk perlahan hingga semuanya terlarut, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan
10 000 rpm selama 30 menit pada suhu 4°C untuk mendapatkan pelet.
Pelet yang dillasilkan dilarutkan kembali dalam Na3P04 50 mM dan
ciidialisis menggunakan selopan pada larutan yang sama hingga terbebas dari
amonium sulfat.
Fraksi amonium sulfat ini selanjutnya di keringbekukan
rnengpnakan freeze drier suhu -80 "C selama 24 jam, setelah kering ditirnbang
untuk menghitung rendemen.
Sebagian fraksi amonium disuspensikan dalam Na3P04 50 mM pH 6.3 dan
dilalukan dalam kolom sephadeks G-75. Tinggi kolom yang digunakan 20 cm,
dengan diameter 1 cm. Setiap 3 ml fraksi dikumpulkan dalam tabung kecil hingga
seluruh protein dalam kolom habis, dengan uji menggunakan pereaksi biuret.
Selanjutnya tiap fi-aksi diukur absorbannya pada panjang gelombang 280 nm
menggunakan spektrofotometer-UV. . Fraksi-f?aksi dikelompokkan berdasarkan
absorbannya dan dikeringbekukan sehingga didapatkan kelomnpok-kelompok fiaksi.
Selama proses ekstraksi diupayakan kondisi lingkungan dalam keadaan dingin
(Tabel Lampiran 1).
Hasil pengeringan kelompok-kelompok fkaksi dapat dilihat dalam Tabel
Lampiran 3. Untuk memastikan keberadaan buffer dalam kelompok-kelompok
Fraksi hasil pengeringan, maka 5 ml buffer pengekstrak dikeringbekukan
~nenggunakanprosedur yang sama dengan tiga ulangan (Tabel Lampiran 2).
IUji Kematian Larva Udang (Brine Sizrimp Lethality Test)
Telur udang Arternia Salina L. ditetaskan dalam air laut. Air laut dibuat
tlengan cara melarutkan 38 gram garam laut dalam satu liter air dan disaring. Telur
ini akan menetas setelah 48 jam.
Sarnpel dari tiap fraksi amoniurn sulfat diuji pada konsentrasi 1000, 100, 10,
dan 0 ug rnl, setiap konsentrasi diulang tiga kali, setiap unit percobaan 10 hewan
uji. Konsentrasi lanltan sampel yang harm dibuat unhlk persiapan pengujian adalah
2000 yglml, dibuat dengan cara melarutkan 6 mg ekstrak protein dalam 3 rnl air
laut.
Selanjutnya dibuat konsentrasi sampel 200 dan 20 pglml dengan cara
pengenceran. Untuk memperoleh konsentrasi 200 pglml dilakukan dengan cara
ncengencerkan 1 ml ekstrak 2000 pgml dengan air laut hingga 10 ml. Konsentrasi
20 pg'ml didapatkan dengan cara mengencerkan 1 ml lanltan protein 200 p@ml
dt:ngan air laut hingga 10 ml.
Pengujian dilakukan dengan cara, 10 ekor udang dan 1 ml air laut
dimasukkan dalam wadah uji dan ditambah 1 rnl larutan ekstrak protein sesuai
dengan konsentrasi uji sehingga konsentrasi akhir dalam wadah uji 1000, 100, dan
10 p&/ml. Setelah 24 jam larva udang yang mati dan hiduip dihitung, data yang
diperoleh diolah dengan metode analisis probit (Finney) untuk mendapatkan nilai
LC
50.
Sarnpel dengan Nilai LC
50
diatas 100 diuji lanjut dengan alur sel secara in
vitro.
Uji Menggunakan Alur Sel
Alur Sel
Alur sel yang digunakan dua jenis yaitu sel suspensi (KR4) dan sel
monolayer (L929). Kedua sel tersebut merupakan koleksi US NAMRU-2 Jakarta.
Media Tumbuh
Media yang digunakan untuk pertumbuhan sel yaitu 1 unit RPMI 1640
ditambah 2 gr NaHC03, Hepes 2.38 gr, antibiotik penstrepe 0.1%, glutamin 0.1%,
dan serum 10 % per liter media. Pelarut yang digunakan adalah aquabidest.
Media yang dipakai sebagai pencuci adalah media tumbuh tanpa serum
(semm:free media). Kedua jenis media ini disterilkan menggunakan filter 0.2 pm,
d2n disimpan dalam lemari pendingin. Bila akan digunakan untuk media
pertumbuhan atau untuk pencucian direndam terlebih dahulu dalam water-bath
hingga mencapai suhu ruang.
Perbanyakan Alur Sel
Sel Suspensi. Sel KR4 dalam keadaan beku dari ruang penyimpan diinkubasi
pada suhu ruang hingga mencair, kemudian dicuci dengan media pencuci dua kali
Pencucian dilakukan dengan cara memindahkan sel yang telah cair ke dalam tabung
sentrifus yang dicampur dengan media pencuci 5 rnl dan disentrifus pada kecepatan
1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambah media pencuci
sambil dilakukan pengadukan menggunakan pipet hingga pelet terlarut. Selanjutnya
disentrifus lagi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Pelet yang dihasilkan
ditambah media turnbuh sambil diaduk menggunakan pipet hingga terlarut.
Selanjutnya suspensi sel dipindahkan dalam JIask kultur dan ditambah media
tumbuh 5 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C dengan COz 5%.
Pemeliharaan kultur dilakukan dengan cara mengganti media tumbuh dan
subkultur. Penggantian media tumbuh dilakukan bila media dalam $ask telah
berubah warna, dari merah menjadi kuning. Penggantian media dilakukan dengan
cara seperti pencucian.
Apabila sel telah memadati ruang tumbuh tetapi belum siap untuk perlakuan
maka dilakukan subkultur. Subkultur dilakukan dengan cara membagi suspensi sel
kedalam flask baru dengan media tumbuh baru sehingga didapatkan beberapaflask
kultur sel.
Sel Monolayer.
Perbanyakan sel monolayer dan pemeliharaannya dilakukan
llampir sama dengan sel suspensi. Karena sel ini menempel padapask maka untuk
lnelepaskan sel digunakan alat bantu berupa scraper. Setelah sel terlepas, prosedur
pencuciaan sama seperti sel suspensi. Sedangkan untuk penggantian media, dengan
cara memipet media sehingga tersisa sel yang lengket dalarn jlask dan ditambah
media tumbuh baru.
Penyiapan Ekstrak Protein
Setiap kelompok fiaksi dari masing-masing sampel disuspensikan dalam
media tumbuh. Konsentrasi uji ekstrak protein dari setiap kelompok h k s i sampel
adalah 0 pglml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, dan 400 yg/ml. Volume uji tiap well pada
setiap unit percobaan adalah 50 pl..
Penyiapan Sel
Kepadatan sel kanker untuk perlakuan adalah 5 x lo4 sel/ml. Penghitungan
jumlah sel dilakukan dengan metode trypan blue. Pengh~tungandilakukan dengan
cara mengambil satu bagian suspensi sel ditambah satu bagian trypan blue dan
dicarnpur hingga homogen. Suspensi sel yang telah diwarnai, diteteskan dalam
hearnositometer dan ditutup dengan cover glass. Pengamatan dilakukan dibawah
mkroskop perbesaran 100 X. Sel yang hidup terlihat berupa lingkaran tipis dan
bening. sedangkan sel yang mati terlihat berupa lingkaran dengan inti sel berwarna
biru. Penghitungan dilakukan terhadap empat kotak luar pada haemositometer.
Kepadatan sel dihitung dengan cara :
Kepadatan sel
=
X x 2 x 10
'
Keterangan :
X = rata-rata jumlah sel pada empat kotak pada dua bidang pandang
2 = faktor pengenceran oleh trypan blue
10 = volume kotak haemositometer
Sel yang telah dihitung kepadataannya diencekan dalarn media turnbuh
hingga jumlah sel sesuai dengan kepadatan sel yang diperlukan. Volume suspensi
sel yang dipergunakan untuk perlakuan adalah 100 p1.
Perlakuan
Pengujian dilakukan dengan menggunakan microtitter plate-96 well (costar)
(Lampiran Gambar 8).
Pada setiap well perlakuan diisi dengan suspensi sel
sebanyak 100 p1, kemudian ditambahkan 50 p1 ekstrak protein.
Sebagai kontrol adalah 50 p1 media tanpa serum (pelarut ekstrak protein )
ditambahkan pada 100 p1 suspensi sel.
Untuk mengetahui pengaruh Na3P04 yang kemungkinaan masih terdapat
dalam fraksi protein, diuji pula pengaruh buffer pengekstrak. Pengujiaan dilakukan
dengan cara menambahkan 50 pl larutan Na3P04 sebagai pengganti bioaktif ke
dalam 100 pl suspensi sel. Pengaruh buffer terhadap proliferasi sel kanker L 929
dan KR 4 dapat dilihat pada Lampiran Tabel 4.
Inkubasi dilakukan pada inkubator COz 5 % pada suhu 37°C selama 72 jam.
Setelah inkubasi selesai dilakukan pen&tungan
penghambatan proliferasi sel
dengan menggunakan metode MTT reduction.
Penghitungan Sel Hidup dengan Metode MTT
Setelah inkubasi selesai, microtitter plate dikeluarkan dari ruang inkubator.
Selanjutnya, dalarn setiap perlakuan maupun kontrol ditambahkan ,'MT;r sebanyak
100 pl dan diinkubasi kembali pada suhu dan kadar COz yang sama selama 5 jam.
[nkubasi ini bertujuan untuk menstirnulasi terjadinya reduksi MTT oleh enzirn
dehldrogenase, sehingga terjadl perubafian warna kuning menjadl blru. Setelah 5
jam inkubasi, setiap well ditambahkan 100 pl larutan 10 % isopropanol-0.004 N
HCI. 'I ujuan penambahan larutan In1 adalah untuk menghentikan reaksi reduksl
MIIT
Knstal tormazan yang dihasilkan dilarutkan dengan cara meinipet dengan
kuat berulang kali sampai semua knstal terlarut. helanjumya, mrcroritter plate
dimasukkan ke dalam M I 1-reader dan dibaca densitas optiklnya pada panjang
gelombang 570 nm. lndeks penghambatan dihtung dengan rumus : IP (%) = (1OD sel dengan perlakuan ekstrak protem 1 OD sel tanpa perlakuan ( kontrol)) X
IUV.
Nllal indeks pengnambatan prolirerasi aianalisis menggunakan
dengan L I J ~ lanjut UMK 1 .
Sialk
ragam
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Protein
Pada penelitian ini tidak seluruh tahapan ekstraksi sama seperti prosedur
ekstraksi menurut Lee Huang et. al. &lam Gunawan (1998). Pemisahan lemak dan
fialcsinasi menggunakan kromatografi pertukaran ion tidak dilakukan, fi-aksinasi
har~ya menggunakan sephadeks (Tabel Lampiran 1).
Dari hasil ekstraksi
did3patkan rendemen protein daging buah paria pada fraksi amonium suZfat
didaarkan berat 100 g daging buah basah.
Rendemen ekstrak protein dari daging buah pada fiaksi amonium sulfat
dapat dilihat pada Tabel 1. Dari Tabel tersebut terliha
(Momordica charantia L.) DENGAN MENGGUNAKAN UJI
KEMATIAN LARVA UDANG DAN ALUR SEL SECARA
IN VITRO
AN1 KURNIAWATI
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
ABSTRAK
P,NI KURNIAWATI. Uji Aktivitas Protein Buah Paria (Momordica charantia L.)
dengan Menggunakan Uji Kematian Larva Udang dan Alur Sel Secara in Vitro.
Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari aktivitas ekstrak protein aktif
buah paria muda dan matang dari beberapa kultivar paria dengan uji kematian larva
udang dan alur sel. Buah muda adalah buah yang dipanen untuk sayur, buah matang
adalah buah paria yang telah berubah warna menjadi kuningorange. Bahan
timaman yang digunakan adalah buah paria Hijau, Putih, Kotok, dan Giok.
Ekstraksi protein buah paria menggunakan buffer pH, diendapkan dengan
amonium sulfat dan dirnurnikan dengan kolom sephadeks. Uji hayati yang
digunakan untuk menguji aktivitas ekstrak protein adalah uji kematian larva udang
d m uji menggunakan alur sel in vitro. Peubah yang diamati pada uji kematian larva
udang adalah LC50 (Lethal Consentration 50 %), sedangkan untuk uji menggunakan
a1ur sel adalah indeks penghambatan proliferasi.
Semua kultivar paria baik muda maupun matang menunjukkan aktivitas
dengan nilai LCs0 dibawah 100 pg/ml. Analisis ragam terhadap indeks
p~nghambatanproliferasi alur sel menunjukkan bahwa urnur buah, kultivar, dan
irlteraksinya nyata mempengaruhi indeks penghambatan proliferasi alur sel L929
d m KR4. Fraksi dan konsentrasi ekstrak protein nyata mempengaruhl indeks
p:nghambatan proliferasi alur sel L929 dan KR4 tetapi interaksinya tidak
b erpengaruh nyata terhadap indeks penghambatan proliferasi.
Buah paria giok muda menunjukkan penghambatan tertinggi terhadap
proliferasi alur sel L929 yaitu sebesar 26.19%. Buah matang paria hijau
rrlenunjukkan penghambatan tertinggi terhadap proliferasi alur sel KR4 (36.67%).
Sernua Graksi menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi, hanya M s i E clan
G tidak menunjukkan penghambatan terhadap alur sel KR4. Fraksi F menunjukkan
plenghambatan tertinggi terhadap alur sel L929 (21.48%) meskipun tidak berbeda
nyata dengan fiaksi B (13.66%) dan E (19.83%). Fraksi C (23.50%) menunjukkan
penghambatan tertinggi terhadap alur sel KR4 meskipun tidak berbeda nyata
dlzngan fraksi A (17.26%), B (21.16%), D (13.97%). Semakin tinggi konsentrasi uji
elcstrak protein semakin meningkat aktivitas penghambatan proliferasi. Konsentrasi
elcstrak protein 400 pg/ml dapat menghambat proliferasi alur sel L929 dan KR4
brzrturut-turut sebesar 15.97 % dan 2 1.96%.
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
UJI AKTNITAS PROTEIN BUAH PARIA (Momordica charantia L.)
DENGAN MENGGUNAKAN LARVA UDANG DAN ALUR SEL
SECARA IN W R O
atlalah benar merupakan hasil karya sendiri dan belurn pernah dipublikasikan.
Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan
d 3pat diperiksa kebenarannya.
Bogor, Juli 2002
Ani Kurniawati
A.GR 97043
UJI AKTIVITAS PROTEIN BUAH PARIA
(Momordicacharantia L.) DENGAN MENGGUNAKAN UJI
KEMATIAN LARVA UDANG DAN ALUR SEL SECARA
IN VITRO
AN1 KURNIAWATI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Agronomi
PROGRAM PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2002
: Uji Aktivitas Protein Buah Paria (Momordicacharantia L.) dengan
Menggnakan Uji Kematian Larva Udang dm Alur sel
Secara in Vitro
Nilma
: Ani Kurniawati
Nrp.
. : 97043
Program Studi : Agronomi
Ji~dulTesis
Menyetujui,
1. Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Sugeng Sudiatso
Ketua
/I
Prof Dr Ir Latifah K. Darusman
fuxota
Tanggal Lulus : 26 Oktober 2001
Dr d&d Harran. MSc.
hggota
v
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Klaten 13 Nopember 1969, anak pertama dari tiga
bersaudara. Penulis menikah dengan Yurisman tahun 1995, saat ini dikaruniai dua
o~.anganak, Shavira A. Pravianti (5 tahun ) dan Gernilang A Prirnagasi (3 tahun).
Penulis menyelesaikan pendidikan dasar d m menengah di Klaten. Tahun
1988 penulis diterima sebagai mahasiswa program sarjana di Institut Pertanian
Bogor dan memperoleh gelar Sarjana Pertanian dari Jurusan Budidaya Pertanian
pada tahun 1993.
Penulis diterima sebagai pengajar di Jurusan Budidaya Pertanian, mulai
tahun 1994 hingga sekarang. Pada tahun 1997 penulis melanjutkan studi S2 di
Program Pasca Sarjana - IPB, dengan beasiswa BPPS.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga
tulisan ini dapat diselesaikan. Tema yang penelitiaan ini adalah penggalian potensi
sayuran, yaitu beberapa kultivar paria, sebagai pangan fhgsional.
Thesis ini merupakan sebagian penelitian dari Graduate Team Research
Gpant, Batch IV yang semulai dipimpin oleh Alm. Prof Dr Ir Livy W. Gunawan
yang selanjutnya digantikan oleh Dr Ir Said Harran, MSc. Penulis mengucapkan
te-irnakasih kepada alm. Prof Dr Ir Livy Winata Gunawan yang telah memberikan
ke sempatan kepada penulis untuk bergabung dalam proyek penelitiannya, semoga
Tuhan menerima amal baiknya dan keluarga yang ditinggalkan diberi perlindungan
dan kekuatan.
Penulis menyampaikan ucapan terimaksih dan penghargaan kepada komisi
pembimbing; Prof Dr Ir Sugeng Sudiatso. Prof Dr Ir Latifah K. Darusman, dan Dr
Ir Said Harran, MSc. yang telah memberikan bantuan baik berupa saran maupun
faiilitas yang menunjang kelangsungan penelitian.
Penghargaan dan ucapan terimakasih kepada Drh Bambang Pontjo P., MS.,
Ph.D atas izin penggunaan laboratorium Patologi, FKH-IPB. Terimakasih kepada
Ibu Sutanty, Ibu Wiwi, Ibu Hilda atas penerimaan yang bak; Mbak Ati (Saraswati)
dan Mas Faisal atas bantuan dan persahabatannya di Laboratorium ImunologiNAMRU.
Penghargaan juga saya sampaikan kepada teman-teman di Jurusan Budidaya
Peltanian atas perhatian dan semangatnya Kepada Ir Evy Damayanti, MS staf
pengajar Jurusan GMSK dan teman sekeja di Laboratorium NAMRU-2 Jakarta;
terimakasih atas persahabatan dan kerjasamanya yang baik; Ir Herla R, MS. atas
waktuya di Laboratorium Patologi-FKH. Ucapan terimakasih untuk semua piha.
yang turut membantu kelancaran pekerjaan di Laboratorium Biokimia-FMIPA,
Laboratorium PSPT, Laboratorium Imunologi-NAMRU-2 Jakarta.
Rasa terimakasih yang dalam untuk keluargaku; anak-anak, suami, ibu dan
sanua keluarga; tanpa pengertian, bantuan dan dukungannya saya tidak munglun
dapat menyelesaikan semua ini.
Semoga tulisan ini bermanfaat bag penulis dalam melaksanakan tugas di
ternpat bekerja dan dapat menyumbangkan informasi untuk pengembangan
pemanfaatan sayuran, terutama paria.
Bogor, Juli 2002
Ani Kurniawati
DAFTAR IS1
Halaman
ix
DAFTAR TABEL .....................................................................
DAFTAR GAMBAR ................................................................'
X
D AFTAR LAMPIRAN ...............................................................
xi
PIZNDAHULUAN
Latar Belakang ..................................................................
Tujuan .........................................................................
Hipotesis .......................................................................
1
4
5
TlNJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Paria .......................................................
Manfaat Paria .................................................................
Ekstraksi Protein ...............................................................
Kanker ...........................................................................
Pangan dan Kanker .............................................................
Uji Hayati .......................................................................
Kultur Sel........................................................................
Uji Alur sel .....................................................................
B t W DAN METODE
Tempat Dan Waktu Penelitian................................................
Bahan dm Metode.............................................................
Ekstraksi Protein ...............................................................
Uji Kematian Larva Udang ................................................
Uji Menggunakan Alur Sel ...................................................
18
18
19
20
21
H.4SIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Protein ...............................................................
Uji Kematian Larva Udang ...................................................
Uji Aktivitas Menggunakan Alur Sel .......................................
26
28
33
DPSTAR PUSTAKA ..................................... :....................
43
LAMPIRAN ............................................................................
46
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Rendemen protein buah paria pada fiaksi amoniurn sulfat ............
2
Rekapitulasi Andisis Ragam terhadap peubah Indeks Penghambatan
Proliferasi .................................................................... 34
27
,
3 Interaksi Kultivar dan Umur Paria terhadap Indeks Penghambatan
Proliferasi Alur Sel L929 secara in Vitro .................................
35
4 Interaksi Kultivar dan Umur Paria terhadap Indeks Penghambatan
Proliferasi Alur Sel KR4 secara in Vitro .................................
35
5 Indeks Penghambatan Proliferasi Tiap Kelompok Fraksi ..............
37
6 Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Protein terhadap Indeks Penghambatan
Proliferasi Alur Sel secara in Vitro ....................................... 39
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Rendemen Protein Buah Paria pada Fraksi Amoniurn Sulfat ........... 27
-
2 Nilai LC 50 Ekstrak Protein Buah Paria pada Fraksi Amoriium Sulfat
Dengan Uji Kematian Larva Udang ... ................. ................ ...
3
28
Pola Pernisahan Ekstrak Protein Beberapa Kultivar Paria Muda
dengan Kolom Sephadeks ... .................. ... ............. ... ........... 30
4 Pola Pernisahan Ekstrak Protein Beberapa Kultivar Paria Matang
dengan KolomSephadeks .................................................. 30
5 Rendemen Fraksi Kolom Kultivar paria Muda ............... ..........
31
6 Rendemen Fraksi Kolom Kultivar paria Matang ......... ......... ...... 32
7 Indeks Penghambatan Proliferasi Kultivar Paria Muda terhadap
Alur Sel L929 ............ ... ...... ...... ...... ....... ........ . . .
36
8 Indeks Penghambatan Proliferasi Kultivar Paria Matang terhadap
AlurSelKR4 ...................................... .......................
36
9 Indeks Penghambatan Roliferasi Kelompok Fraksi ....................
38
1(1 Pengaruh Konsentrasi terhadap Indeks Penghambatan Proliferasi ...
39
,
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Iiagan Alur Penelitian . . . . . ..... .. ... ... .. . ..... . ............ . . . ...... .. . ... 46
2 Pangelompokan Frakai Hasil Fraksinasi Ekstrak Protein Buah
Paria . . . . ..... . .. . . . ... .. . . .. . . . .. . .. . .... . . ..... . . .. . .. ... .... .. .... . . . . . .. . .. . . 47
3 Hasil Freeze Drier Buffer Na3P04 50mM . . ... .. ... .. ..... . . . . . .. . . . . . . . .
47
4 Hasil Freeze Drier Fraksi Kolom . . . . .. .. . . ... . ............ . . .... . . . . . ... . . .. 47
5 Hasil Uji-t Pengaruh Buffer dan Pelarut terhadap Proliferasi
Alur sel L929 dan KR4... ......... . . . .. . .. ... .. . ... ............... . . . .. . . ... . . 48
6 Analisis Ragam Indeks Penghambatan Proliferasi Ekstrak Protein
terhadap Alur sel L929 .. . .. ... ... . . . ...... ... . . ... .. . ...... . .. .. . . . . ... . . . . ... 48
7 Analisis Ragam Indeks Penghambatan Proliferasi Ekstrak Protein
terhadap Alur Sel KR4 ...... ......... ... ... ... ... ............... ............ ... 48
8 Kultivar Paria yang Diuji Aktivitasnya ........ . ................... . .... .... 49
9 Uj:i Aktivitas Ekstrak Protein Paria dengan Alur Sel Menggunakan
Microtitter Plate96-well ........................ .......................... ... ... 50
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Sayuran umumnya selalu ada dalam menu masyarakat Indonesia. Pada
awalrlya pemilihan jenis sayuran hanya didasarkan pada nilai nutrisi sayuran,
terutama dari kandungan vitamin dan mineralnya. Namun akhir-akhir ini sebagian
masyarakat mulai sadar akan kandungan non gizi yang bermanfaat dalam
pemeliharaan kesehatan, disamping komponen gizinya. Kesadaran masyarakat ini
tidak terlepas dari semakin meningkatnya tingkat pendidikan dan pengetahuan gizi
masyarakat serta kesadaran dalam pemeliharaan kesehatan. Sayuran dapat diartikan
sebagai produk atau komoditi yang didefinisikan sebagai tanaman atau bagian
tananian yang sukulen dari suatu tanaman, yang dikonsurnsi sebagai pelengkap
makanan pokok (Williams et. al., 1993; Siemonsma and Kasem Piluek, 1994).
Banyak penelitian terhadap sayuran yang ditujukan untuk mempelajari komponen
non gizinya. Beberapa penelitian membuktikan bahwa dalam bahan pangan
terkaildung senyawa kimia yang dapat berfungsi sebagai ~hemo~urevention
terhadap
kankcr. Clzemoprevention adalah istilah untuk intervensi bahan kimia atau bahan
pangan yang dapat mengurangi kerentanan karsinogen dengan cara menghalangi,
menghambat, atau mebalikkan kerentanan terhadap kanker (Block et. al., dalam
Fahey and Talalay, 1995).
Penelitian yang telah dilakukan membuktikan bahwa konsurnsi sayur dan
buah yang tinggi berasosiasi dengan pengurangan resiko terserang kanker.
Selanjutnya telah ditemukan pula bahwa dalam jenis sayuran tertentu, disarnping
kandungan seratnya, terkandung senyawa kimia lain non gizi untuk pencegahan
terhadap kanker. Contoh sayuran jenis ini adalah beberapa sayuran dalam famili
Cruciferae, Solanaceae, dan Liliaceae
Di
Arnerika,
penelitian
terhadap
spesies
Crucqerae
sebagai
chemoprevention, terutama brokoli, teiah meningkatkan secara drastis perrnintaan
jenis sayuran ini di pasaran. Beberapa spesies dalarn famili Cruclferae yang telah
diteliti sehubungan kandungan bahan kimia yang dapat mencegah kanker adalah
brussel sprout, kule, red cabbage, cuulrJlower,green cabbage.
Indonesia, dengan jenis sayuran yang sangat beragam, sangat berpotensi
mengembangkan makanan kesehatan. Untuk itu diperlukan serangkain penelitian
terhadap bahan makanan, misalnya sayuran, untuk mengetahui potensinya sebagai
makanan kesehatan. Bila ha1 ini berhasil dilakukan maka akan memberikan nilai
tamb(ahterhadap nilai sayuran tertentu dan sekaligus dapat meningkatkan deraiat
keseltatan penduduknya. Penelitian-penelitian ini semakin strategis untuk dilakukan
bila melihat perubahan pola penyakit di Indonesia.
Penyakit infeksi yang
merupakan masalah utama makin berkurang seiring dengan kemajuan ekonomi
yang memungkinkan pencegahan dan pengobatan yang lebih intensif. Sebaliknya
penyrikit degeneratif dan kanker semakin menonjol (Tjahjono. 1999).
Khusus untuk penyakit kanker, terjadi peningkatan yang sangat drastis.
Dalarn 10 tahun terakhir, terjadi peningkatan sebagai
penyebab kematian di
Indonesia, dari urutan ke-12 meniadi urutan ke-6. Walaupun penyebab pasti belum
diketiihui, tetapi telah teridentifikasi faktor resiko berbagai jenis kanker yaitu faktor
keturunan, lingkungan hidup, dan gaya hidup (Thahjono, 1999; Budiarso,l998).
Pengobatan terhadap penyakit ini umumnya mahal dan beresiko besar. Oleh karena
itu penggalian potensi bahan pangan, terutama sajurafi, untuk dikembangkan
sebagai makanan kesehatan seharusnya diprioritaskan.
Paria adalah salah satu jenis sayuran yang termasuk dalam farnili
Cucui*bitaceae. Selain sebagai sayuran, sebagian masyarakat memanfaatkannya
untuk pengobatan berbagai jenis penyakit. Dari berbagai bagian dari tanaman ini;
daging buah, biji, akar, daun, bunga; secara trahsional digunakan untuk pengobatan
rheuniatik, astma, artritis, diabetes, pencuci perut (Nguyen dan Sri Hayati Widodo,
1999). Di Arnerika, Jus dari buah paria segar banyak dimanfaatkan untuk terapi
pende:ritaHIV.
'
Indonesia mempunyai banyak kultivar paria, tetapi belurn ada klasifikasi
yang memadai. Secara tradisi, masyarakat mengelompokkan paria berdasarkan
warna. buah.
Demikian juga
klasifikasi menurut
Ochse (1931)
yang
mengelompokkan paria & Indonesia menjadi beberapa jenis yaitu paria bodas (sn.)
/ pare gajih (jw.), paria hejo (sn.) / pare belungan, paria kotok atau gengge (sn.) atau
pare a.yarn (jw.). Selain itu terdapat pana hibrida, baik produk lokal maupun irnpor,
yang mempunyai keunggulan dan banyak dibudidayakan petani serta digemari
masyarakat.
Dari beberapa penelitian di luar negeri, telah berhasil diisolasi suatu protein
aktif ,dari biji paria (Momordica charantia L.) yang b e h g s i sebagai inhibitor
sintesis protein. Kelompok protein ini disebut RIP atau Ribosom Inactivating
Protejn (Minami et. al., 1992). RIP juga dilaporkan terdapat pada anggota famili
Cucurbitaceae lainnya yaitu Lu#a cylindrica dan Trichosantes kirilowii ( Kondo et.
ul., 1995; di Topi et. al., 1996). RIP merupakan protein yang dapat dimanfaatkan
baik dalam bidang pertanian maupun kesehatan.
Dalam bidang pertanian
berpo1:ensi sebagai bahan pelindung terhadap serangan hama dan penyakit, dengan
keunggulan mudah terdegradasi sehingga aman terhadap lingkungan. Sedangkan
1
Kompas Minggu, 18 Februari 2001
dalann bidang kesehatan dapat dimanfaatkan sebagai immunotoksin untuk target sel
terterltu, seperti sel kanker, T-sel, dan macrophage yang diinfeksi virus HIV
(Min*amiet. al., 1993; Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999). Lin Huang et. al.
(1995)),melaporkan bahwa MAP 30 (Momordlne Active Protein, bobot molekul 30
kD) yang diisolasi dari biji paria adalah suatu protein bioaktif, dan secara aktif
dapat melawan HIV-1 dan sel tumor.
Dalam proses mengisolasi suatu bioaktif diperlukan uji hayati untuk
mengetahui efek farmakologinya. Untuk mendapatkan bioaktif sebagai anti kanker
digunakan kombinasi uji hayati antara lain uji kematian larva udang (brine slzrimp
lethar'lty test) dan uji menggunakan dua alur sel kanker secara in vitro. Kombinasi
kedm~uji ini digunakan untuk mendapatkan senyawa anti kanker dari buah muda
Persea americana dan cortex Taiwania ctyptomenoides (Oberlies et. al., 1998; He
et. al., 1997).
Dengan berbagai manfaat tersebut, penelitian untuk mempelajari protein
bioaktif dari kultivar paria yang ada di Indonesia diharapkan akan meningkatkan
manfiiat dan nilainya. Disamping itu bila akan diproduksi dalam skala luas, maka
akan semakin banyak pilihan kultivar apabila ternyata terdapat kendala pada salah
satu pilihan tersebut.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mempelaiari aktivitas protein bioaktif buah paria
dari beberapa kultivar paria dengan dua tingkat kematangan dengan menggunakan
uji kematian larva udang dan alur sel kanker in vitro. Dari hasil penelitian ini
diharapkan mendapatkan informasi mengenai potensi bioaktif buah paria dari
bebempa k~ltivarparia.
Hipotesis Penelitian
Hipotesi penelitian ini adalah (1) Terdapat ekstrak protein bioaktif dari
beberapa kultivar paria yang dapat dideteksi dengan uji kematian larva udang, (2)
Terdapat aktivitas ekstrak protein buah paria yang dapat dideteksi menggunakan
alur sel secara in vitro.
TINJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Paria (Momordica charantia L. )
Paria termasuk dalam divisi Spermatophyta, klas Dycotyledonae, famili
Cucu~bitaceae, genus Momordica. Dalam genus Momordica terdapat 45 spesies,
kebanyakan terdapat di Afrika dan hanya 5-7 spesies berada di Asia. Spesies utama
yang r.erdapat di Asia adalah Momordica charantiu L. atau Bitter gourd (En.), Pare
(Jv.); Momordica cochinchinensis (Loureiro Sprengel) atau Sweet gourd (En.),
Pupia.TorobukToropu (Ina.); dan Momordica subungulata Blume, Bijdr. atau
Kamas (1na.Malay.). Dari ketiga spesies tersebut Momordica charantiu L. adalah
spesies yang terpenting yang telah dibudidayakan (Reyes et. al., 1994).
Momordica charantia L. merupakan herba merambat, berurnur 1 tahun,
berumah satu, dengan tinggi hingga 5 m. Batang derrgan alat pembelit berupa sulur
(tendril). Daun berupa daun tunggal, bertangkai, dan tepi dam berlobi. Bunga
terletak aksilar, soliter, benvarna kuning, uniseksual, berumah satu. Buah berupa
buah buni, buah matang benvarna orange, buah muda bervariasi dalam warna,
bentuk, dan ukuran (Reyes et. al., 1994; Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999).
Di Indonesia terdapat berbagai kultivar paria yang beragam dalam bentuk
dan ulcuran buah, namun belum ada klasifikasi yang memadai. Menurut Ochse
(1 93 1:I paria dengan buah berukuran besar, benvarna keputihan, dinamakan paria
bodas (Sn.), atau paria gajih (Jw.); paria dengan ukuran lebih kecil, benvarna hijau
dinamakan paria hejo (Sn.) atau paria belungan (Jw.); paria dengan ukuran buah
terkecd disebut paria kotok/genge/hayam (Sn.). Di India klasifikasi kultivar paria
didasarkan ukuran buah, buah dengan diameter lebih kecil dari 5 cm
dikelompokkan varietas Minima Wiliam, dan buah dengan diameter lebih besar dari
5 cm dikelompokkan dalam varietas Maima William.
Saat ini telah banyak dibudidayakan paria hibrida oleh petani sehingga
dengaln mudah konsumen mendapatkannya di pasar-pasar tradisonal. Salah satu
varietas paria hibrida yang populer adalah paria Giok. Buah paria ini mempunyai
ciri-cijri: buah berukuran besar, daging buah tebal dan lemas, tidak terlalu pahit.
Karen,%sifatnya tersebut paria giok banyak disukai oleh konsumen meskipun
hargartya relatif lebih mahal.
Manfaat Pa ria (Momordica charantia L. )
Buah muda paria adalah bagian utama yang digunakan sebagai sayuran,
dengall berbagai cara penyajian. Bagian buah yang dapat dikonsumsi sekitar 95%.
Dari 100 g bagian buah yang dapat dikonsumsi mengandung 83-92 % air, 1.5-2 g
protei140.2-1 g lemak, 4-10.5 g karbohidrat, 0.8-1.7 % serat. Rasa pahit pada buah
paria clisebabkan momordisin yang tidak toksik (non-toxic alkaloid momordisine).
Selain digunakan sebagai sayur, paria juga dimanfatkan dalam pengobatan.
untuk berbagai macam penyembuhan penyakit. Di Indonesia, jus daun digunakan
sebaga.i pembersih perut pada bayi yang baru lahir; bagian buah digunakan sebagai
tonic, carminative, rheumatik, gout, pruritis, dermatitis, dan liver. Di India, bagian
buah, iikar, dan daun telah lama digunakan sebagai obat diabetes millitus (Reyes et.
al., 1994; Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999).
Penelitian paria semakin berkembang dengan telah ditemukannya beberapa
protein yang menunjukkan beberapa efek farmakologi. Protein a-momorclzarin dan
fimon;corch~rin yang diisolasi dari biji
M charantia
menunjukkan efek
hepatoksik pada tikus percobaan. Beberapa immunotoksin dapat dibentuk dengan
cara rnenghubungkan tipe 1 ribosom-inactivating protein dari momordin I dengan
antibc~dispesifik terhadap berbagai alur sel . Perlakuan dengan imunotoksin ini
mengkambat pertumbuhan sel tumor secarain vitro, dengan nilai ICso (Inhibition
Concontratlon) pada skala pikomolar. Perlakuan irnrnunotoksin ini secara sendiri
atau dikombinasikan dengan sitostatik secara nyata menghambat perkembangan
tumor secarain vivo (Nguyen dan Sri Hayati Widodo, 1999).
Protein dengan fungsi serupa, juga berhasil diisolasi dari biji M
cochrizchinensw. Konjugasi antara momordin-folat secara selektif membunuh sel
HeLa dan KB, dua jenis sel kanker ganas manusia, pada ko-kultur dengan sel
normal. Ekstrak kasar buah paria dapat mengurangi insiden tumor kulit pada
mencit. Ekstrak dari daging buah, biji, dan buah utuh menunjukkan aktivitas anti
karsinogenik pada 100 pgthewan percobaan.
Lin Huang et. al. (1999) membuktikan bahwa fragment MAP 30
(Momlw-din-ActiveProtein, protein aktif paria berbobot molekul 30 kD, yang
diisolasi dari biji M charantia adalah suatu protein bioaktif. Fragmen ini aktif
melawan HIV-1 dan sel tumor dengan IC 50 pada skala nanomolar, 0.2-0.4 nM, dan
hanya kecil tingkat toksisitasnya pada sel normal. Dari penelitian ini juga
dibuktikan bahwa aktivitas anti tumor dan anti viral dari MAP 30 bebas dari
aktivitas RIP.
Penelitian lain dari ekstrak paria berhasil membuktikan adanya efek
penghambatan terhadap perkecambahan spora fungi patogenik, efek antimikrobial,
antim~itagenik,tetapi tidak menunjukkan efek antimalaria (Nguyen dan Sri Hayati
Widoclo, 1999).
Ekstraksi Protein
Ekstraksi adalah salah satu cara pemisahan yang paling banyak digunakan
untuk memisahkan komponen bioaktif tanarnan.
Pelarut yang dipilih hams
didasarkan pada kemampuannya melarutkan semaksimal mungkin zat yang
diinginkan dan seminimal mungkin zat yang tidak dikehendalu. Pada prinsipnya zat
yang akan diekstrak hanya dapat larut pada pelarut yang sesuai tingkat
kepol arannya (Nur dan Adijuwana, 1989).
Protein merupakan makromolekul dengan fungsi yang sangat beragam.
Prote~nsering tidak stabil jika tidak berada dalam lingkungan asalnya, misalnya
protein yang mempunyai fungsi katalitik atau sekedar befingsi secara struktural.
Setiap protein memerlukan lingkungan yang spesifik setelah Qekstraksi dan
asalnya. Jika ha1 ini tidak terpenuhi maka akan cepat kehilangan karakteristiknya
dan berkurang masa hidupnya dengan drastis (Edelstein, 1991).
Umumnya sebagian besar protein dapat diekstraksi dengan air, larutan asam
atau hasa. atau larutan garam sederhana. Namun, protein yang bersifat lipofilik
hams diekstraksi dengan alkohol 70-80%. Presipitasi dari ekstrak protein kasar
dapat dilakukan dengan penambahan aseton, ethanol, atau amonium sulfat.
Ekstraksi dan isolasi protein paria dari biji telah dilakukan oleh Lee Huang
dalam Gunallan, (1998). Pada prosedur ini pelarut yang digunakan adalah NaCl
dan FJa3P04. Presipitasi ekstrak kasar menggunakan amonium sulfat, dengan
pemisahan menggunakan khromatografi pertukaran ion.
Kanker
Kanker merupakan istilah untuk neoplasma ganas. Neoplasma adalah massa
jaringan abnormal, timbul sebagai akibat pertumbuhan sel secara otonom, tidak
terkendali dan tidak terkoordinasi, tidak mengikuti perturnbuhan normal, membelah
diri dan berproliferasi terus menerus walaupun rangsang pemicu pertumbuhan
berleb ihan telah hilang (Tjahjono, 1999).
Dalam keadaan normal, sel memperbanyak diri dengan cara membelah diri
menu~zltkaidah pembelahan sel normal. Proses ini merupakan siklus terkendali,
sehingga pertumbuhan berlangsung sesuai aturan pembelahan normal sehingga
manusia tumbuh normal dan proporsional. Selain untuk pertumbuhan, sel baru hasil
pembelahan berfungsi mengganti sel yang mati atu menyusun jaringan baru dalam
proses penyembuhan luka (Braunstein, 1987)
Siklus sel normal dikendalikan oleh suatu kelompok protein yang secara
umum disebut siklin. Siklus berlangsung melalui fase mitosis (M), gap1 (GI),
sintesis DNA (fase S), gap2 (G-2), mitosis (M) dan seterusnya. Bila sel membelah
diri tidhk terkendali maka akan menghasilkan benjolan yang disebut neoplasms atau
tumor (Braunstein, 1987; Di Palma and John Grigorio, 1990; Tjahjono, 1999).
Hingga saat ini belurn diketahui sacara pasti penyebab kanker, tetapi telah
terider~tifikasifaktor resiko penyebab berbagai kanker yaitu faktor keturunan dan
linghlgan hidup.
Faktor lingkungan hidup yang mempengaruhi perturnbuhan
kanker antara lain penyinaran, bahan kimia pada lingkungan pekerjaan atau
makanan, infeksi virus tertentu, dan gaya hidup.
Penyinaran yang mempengaruhi perturnbuhan kanker adalah radiasi sinar
pengion dan sinar ultraviolet dari sinar matahari. Berbagai bahan kimia yang
merupiikan faktor resiko kanker antara lain benzopyrene pada ter atau rokok, hasil
pembakaran batu bara, asbes, naftilin, aromatik arnin, khromium, arsen; sedangkan
yang herssal dari bahan makanan adalah aflatoksin, nitrosamin, serta makanan
berlemak (Budiarso, 1998; Tjahjono, 1999).
Proses pertumbuhan neoplasma melalui tiga fase yaitu fase inisiasi, promosi
dan progresi.
Setiap fase ini mengakibatkan perubahan baik pada tingkat sel
maupun subseluler. Perubahan pada tingkat sel meliputi perubahan morfologi
bentuk, ukuran, dan hubungan sel yang dapat diperiksa dengan pemeriksaan
sitologik. Perubahan subseluler atau molekuler berupa terjadinya perubahan
kromosom, perubahan jumlah kandungan DNA, urutan nukleotida DNA, perubahan
proto -0nkogen menjadi onkogen sehingga merubah ekspresi proteinnya, dan
aktiv~tas prolifarasi sel (Coltran et. al, 1994; Tjahjono, 1999)
Tahap inisiasi ini berlangsung cepat dan masih reversibel, dan pada tahap
ini pula karsinogenesis dapat diinterupsi dengan berbagai agen lumia
(chentopreventzon) yang beberapa diantaranya terdapat dalam pangan manusia
(Wattenberg dalam Fahey dan Talalay, 1995; Tjahjono, 1999).
Pangan dan Kanker
Perhatian peneliti terhadap hubungan antara pangan dan kanker bukanlah
sesua tu yang baru. Keterkaitan antara pangan dan kanker telah dilaporkan William
Lambe pada tahun 1809. Namun, aktivitas penelitian utama yang menghubungkan
pangan dan kanker baru dimulai sekitar tahun 1940 di Michael Reese Hospital
Clziccgo dun University of Wisconsin ( Kritchevsky, 1996).
Bahan pangan yang banyak diteliti yang dapat mengurangi resiko kanker
adalall sayuran dan buah. Konsumsi sayur dan buah yang tinggi berasosiasi dengan
penguuangan resiko terserang kanker. Sedangkan pangan yang mengandung banyak
lemak: dan kalori cenderung meningkatkan resiko terserang kanker (Graham, 1986)
Istilah 'sayuran' biasanya d i p a k a n untuk merujuk pada tunas, dam, buah,
dan akar yang lunak yang dapat dimakan secara utuh atau sebagian, segar atau
dimasak, sebagai pelengkap makanan berpati dan daging (William et. al., 1993).
Sayuran merupakan surnber vitamin, mineral, dan serat yang penting dalam diet.
Sejumlah penelitian telah membuktikan bahwa sayur dan buah mempunyai efek
perlindungan pada semua kejadian kanker manusia, karena kandungan nutrisi
m aupun komponen non nutrisinya (Block et. al. dalam Fahey and Talalay, 1995).
Selain serat, dalam sayuran dan buah terkandung berbagai fitokimia yang
juga menunjukkan efek perlindungan yaitu vitamin (A, C, dan E), mineral (Ca, Zn,
Sea) dan beberapa senyawa kimia seperti isotiosianat, sterol, fenol, kumarin,
inhibitor protease, indole, khlorofilin. Dari 170 studi epidemik disimpulkan bahwa
konsumsi empat dari enam sayur dan buah per hari membantu mengurang.1 resiko
pe rkembangan kanker pada berbagai organ hingga 50 % (Stoner, 1995).
Beberapa famili sayuran yang telah intensif diteliti sebagai agen
cht?moprevention adalah Liliaceae, Cruciferae, dan Solanaceae. Penelitian suatu
spesies dari tiap famili ini telah meningkatkan jumlah permintaan sayuran di
Anlerika serikat, khususnya brokoli dari famili Cruciferae.
Wattenberg dalam Stoner ( 1995) mengklasifikasikan agen chemoprevention
benhsarkan periode yang menunjukkan efek penghambatan pa& karsinogenesis.
Menurut klasifikasi ini terdapat tiga tipe utama dari agen chemoprevention yaitu
mertghambat pembentukan karsinogen, agen penghambat (bloking agent), agen
penekan (supressing agent). Sebagian besar senyawa kimia yang menghambat
pembentukan karsinogen kimia bekerja mencegah pembentukan nitrosamin,
termasuk didalamnya adalah asam askorbat, asam ferulat, dan beberapa senyawa
sulfi hidril. Kelompok agen penghambat bekej a menghambat fase inisiasi,
sedangkan agen penekan bekerja menghambat fase promosi atau progesi.
Paria yang merupakan salah satu spesies dari famili cucurbitaceae mulai
intensif diteliti karena mengandung protein bioaktif. Dari paria dan beberapa
spesies dari famili cucurbitaceae lainnya, telah berhasil diisolasi protein yang
berfungsi sebagai inhibitor. Kelornpok protein ini disebut Hibosom Inactivating
rotein ins (RIPS). RlPs adalah protein-protein yang dapat menghambat sintesis
protein melalui tindakannya pada ribosom. Protein ini mempunyai aktivitas RNA
PJ-glycos~du~~e
yang dapat rnemutus ikatan spesifik glikosida pada 28 S rRNA
('Natanabe et. ul., 1990; Minami et. al., 1992; Dong et. al., 1994; Savary and
Hector, 1995; di Toppi et. al., 1996).
Uji Hayati
Uji hayati diperlukan untuk penapisan material tanaman yang mengandung
bioaktif. Efek farmakologi dan biologi ditirnbulkan oleh interaksi antara ligantarget yang dapat dipelaiari dan dinilai secara spesifik dengan uii hayati. Uii hayati
yang dipilih haruslah tepat, dalam arti tidak hanya efektif tetapi juga selektif,
spesisfik: murah, cepat, reproduc~ble,dan valrd secara statistik. Dengan demikian
dapat dihasilkan pemahaman yang tepat dari efek farmakologi atau biologi dari
suatu senyawa (de Padua et. ul., 1999).
Pada tahap awal, pengujian secara in vitro seharusnya menjadi prioritas
dibanding pengujian in vivo dengan menggunakan hewan percobaan. Keputusan
pemilihan pengujiaan dapat didasarkan pada pertimbangan ilmiah disamping alasan
ekorlomi maupun etika. Pengujian secara in vivo merupakan jenis pengujiaan yang
dipe-rtimbangkan pada tahap selanjutnya. Pengujian yang ekstensif secara klinis
tetap hams dilakukan sebelum didaftarkan sebagai obat (de Padua et. al., 1999).
.#,
Salah satu metode penapisan efek farmakologi yang sederhana adalah brine
shrimp lethuliv test atau uji kematian larva udang. Metode ini dapat mendeteksi
aktivitas biologi pada kisaran luas dan dengan keragaman struktur kimia dari
senyawa bioaktif. Keuntungan uji ini adalah cepat, tidak mahal, sederhana, dapat
menggunakan organisme uji dalam jumlah relatif besar.
Telur udang mudah
diperoleh di toko pakan ikan dan dapat disimpan beberapa tahun di tempat yang
kering. Telur ini dengan cepat menetas, 48 jam, bila dimasukkan &lam air laut.
Penelitian yang dilakukan Anderson et. al. (1991) membuktikan bahwa uii
hajrati ini dapat mendeteksi dengan tepat enam dari tujuh senyawa antitumor tanpa
kesalahan positif w i s e positive). Pembuktian lain adalah terdapat korelasi sangat
kuat dengan uji P-377 murine leukimia (Mclaughlin et. al., 1991).
Kultur Sel
Kultur sel merupakan istilah yang merujuk pa& kultur in vitro yang berasal
dari sel terdispersi dari kultur primer, atau dari sel line atau sel strain. Sel line atau
sel strain atau alur sel adalah populasi sel dari kultur primer yang telah disubkultur.
Alur sel dapat diperbanyak sebagai monolayer atau &lam suspensi. Kultur
monoluyer adalah suatu kultur sel yang sel-selnya menempel pada substrat. Kultur
ini merupakan model kultur yang biasa dijnmpai pada sebagian besar sel normal
dengm pengecualian pada sel darah.
Kultur suspensi adalah kultur yang berasal dari sel yang dapat tumbuh dan
berproliferasi tanpa penempelan. Sel jenis ini umumnya adalah sel darah, sel hasil
transformasi atau sel dari tumor ganas (Freshney, 1994).
Alur sel dibedaksn menjadi.fi~titecell line dan continous cell line. Finite cell
line adalah kultur sel yang mempunyai masa hidup terbatas, umumya merupakan
-
kultur jaringan sel normal atau sel-sel yang tidak berubah dalam masa pengkulturan.
Alur sel ini memerlukan waktu penggandaan yang yang lebih panjang, 24-96 jam.
Ccntinous cell line adalah alur sel yang mempunyai masa hidup tidak terbatas
(inrmortul), umumnya sel tumor atau atau sel yang mengalami perubahan selarna
per~gkulturan. Waktu penggandaan untuk jenis sei ini adalah 12-24 jam (Freshney,
19?4).
Alur Sel KR-4. Alur sel ini diperbanyak dengan kultur suspensi. Sel KR4 dibentuk
dengan menggabungkan sel GM 1500 (sel repositor mutan genetik manusia) dan sel
RPMI 8226 (ATCC CCL 155). Sel-sel tersebut tahan terhadap 6-thioguanine dan
terhadap oubain. (U.S Pat. 4,693,975. Depositor: The wistar Institute of Anatomy
and Biology, Philadelpha, Pa).
Alu~rSel L 929. L929 ini berasal dari fibroblast tikus, diperbanyak dengan kultur
mon'oluyer. Alur sel ini merupakan klon dari L-Cell, aneuploid, dan merupakan
alur sel yang mempunyai masa hidup tidak terbatas (continous cell line) (Freshney,
1994).
Uji Menggunakan Alur Sel
Uji menggunakan alur sel
merupakan uji sitotoksitas yang banyak
digunakan dalam penelitian mendapatkan agen anti kanker. Uji sitotoksitas secara
In vuro banyak dilakukan untuk berbagai tujuan, misalnya untuk mengetahui
potensi sitotoksitas suatu senyawa, atau untuk menunjukkan ketidaktoksikan suatu
bahan obat atau kosmetik. Uji ini banyak dilakukan secara ekstensif untuk
mensyaFan suatu produk obat baru, kosmetik, bahan tambahan makanan, dan lainlain sebelum dipasarkan.
Sitotoksitas merupakan suatu keadaan yang kompleks, dimana ekspresinya
dapat berupa efek yang sangat luas. Efek sitotoksitas dapat berupa kematian sel
yang sederhana sampai aberasi metabolik yang komplek. Definisi sitotoksitas akan
cenderung bergantung pada tuiuan penggunaan. Freshney (1994), mendefinisikan
u j ~sitotoksitas lebih pada aspek-aspek yang mempengaruhi pertumbuhan atau
ketahanan hidup.
Perturnbuhan dapat diartikan secara sederhana sebagai
kemampuaan beregenerasi yang dapat diukur antara lain dengan perubahan ukuran
populasi. Ketahanan hidup dapat diukur secara cepat dengan parameter integritas
pie sma-membran atau dengan parameter perturnbuhan untuk mengetahui kapasitas
pe: tumbuhan yang mempengaruhi ketahanan hidup.
Kemampuaan sel untuk bertahan hidup pada keadaan toksik merupakan
daslardari uji sitotoksitas. Parameter yang diukur untuk uji ini adalah kemampuan
berproliferasi. Sel yang dapat bertahan hidup dalam suatu kultur sel dapat diketahui
der~ganberbagai metode, misalnya dengan metode peivarnaan (trypan blue) atau
pe1,lbelan dengan bahan radioaktif ( [3~-thymrdme,[3~-urrdlne).
Pada akhir-akhlr ini uji mikrotitrasi sitotoksitas didominasi oleh penggunaan
AnT-reduction untuk menentukan sel yang bertahan hidup. MTT merupakan
singkatan dari (3-{4,5-D1metl~lt/11u~ol-2-y1]-2,5-dp1?enl
tetrazolrumbromrde;
Thuzdy! blue). Metode ini salah satu metode penghitungan sel hidup dengan car8
kolorimetri yang didasarkan pada reduksi MTT oleh enzim suklnat dehrdrogenase
mitokondria dari sel hidup yang menghasilkan produk h s t a l formazan bewarna
biru yang dapat diukur densitas optiknya
(optzcal denslt;t'/OD) dengan
spektrofotometer (Oberlies, et. ul., 1998; Ozelu ct. al., 1998). Semakin besar OD
berarti semakin besar pula jumlah kristal .formazan yang dihasilkan dari reduksi
MY'. Karena enzim pereduksi hanya dihasilkan oleh sel hidup maka semakin
besar nilai absorban dapat dikatakan semakin besar pula sel yang bertahan hidup.
Indeks penghambatan (IP) proliferasi sel dapat diukur dengan membandingkan OD
sel yang mendapatkan perlakuan dengan OD sel kontrol.
Oberliies et.al. (1998) menggunakan kombinasi uji BSL dengan MTTreduction untuk rnenguji sitotoksitas buah muda Persea americana pada tujuh alur
sel tumor manusia. Dengan cara ini dapat ditunjukkan adanya selektivitas terhadap
suatu jenis sel tumor. Pada umumnya bila nilai IC
jo
dari suatu bahan aktif lebih
kecil dari 4 pg/ml maka dikatakan aktif secara nyata.
Hal yang sama juga
dilaporkan oleh Ozeh et. 01. ( 1998) yang rnenguji .ekstrak kayu dari S~maba
ceclron.
Dalam farnili cucurbitaceae, metode ini juga telah dgunakan untuk
mengukur sitotoksitas asam brionolat (bryonolic acid) yang diisolasi dari akar
Trichosanfes kirilowii var. japonica yang telah ditransformasi terhadap berbagai
jenis sel kanker secarain vitro ( Kondo et. al., 1995). Dari Penelitian didapatkan
nilai IC
jg
sangat bervariasi dengan kisaran 15-92 pgjml, dan sangat tergantung
pada sumber sel tumor yang dipergunakan baik dalam spesies, organ, maupun
jaringan.
Perbedaan sumber sel akan mernpengaruhi sensitifitasnya terhadap
sen;yaulabioaktif.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Pemuliaan Tanaman,
Jurusan Budidaya Pertanian, FAPERTA, IPB; Laboratorium Biokimia, FMIPA,
IPB; dan Laboratorium Immunology-Naval Army Medicine Resea~ch Unit-2
(NAMRU-2) Jakarta.
Penelitian dimulai bulan Desember 1999 hingga Mei 200 1. Buah paria yang
digunakan untuk sampel berasal dari petani di desa Bantar Kambing, kabupaten
Bogor.
Bahan dan Metode
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah daging buah paria muda dan matang
dari beberapa kultivar paria yaitu paria hijau, paria putih, paria kotok, dan paria
llibrida (Giok). Paria muda adalah paria yang biasa dipanen untuk dkonsumsi
sebagai sayur, sedangkan paria matang adalah paria yang telah mengalami
peinatangan buah yaitu terjadi perubd~an warna menjadi kuning atau oranye
(Lampiran Gambar 8).
Ballan untuk mengekshaksi protein adalah NaCI, (NH4)$304, Na3P04,
pzreaksi biuret, pereaksi nessler, sephadek G-75. Alat yang digunakan adalah pipet,
biender, neraca, wadah gelas, sentrifus, stirer, selopan, ruang dingin.
Bahan untuk kultur sel dan uji proliferasi adalah media RPMI 1640, serum,
NaHC03, Hepes, gl~~tamin,
aquabidest, antibiotik, pewarna trypan blue, M77:
Isopropanol, HCI, alkohol70 %, spirtus, tissuekain kassa.
Alat yang digunakan adalah flask kultur, pipet steril, scraper, filter steril
0.2 pm, pipet tips, neraca analitik, microtirter plate-96 well, lampu bunsen, laminar,
sentrifus, mikroskop, haemositometer, MTT-reader.
Ekstraksi Protein
Ekstraksi protein menggunakan prosedur Lee Huang et. al. (1996) dengan
beberapa modifikasi (Gambar Lampiran 1). Daging buah paria diblender dengan
NaCl 0.15M pada pH 3.6 dengan perbandingan 1 g buah 1 2rnl NaC1, diupayakan
agar suhu tetap dingin dengan mengatur waktu pemblenderan. Selanjutnya ekstrak
disentrifus pada kecepatan 10 000 rpm selama 30 menit pada suhu 4°C.
Supernatan yang didapatkan ditambah (NH4)2S04 sampai kejenuhan 80 % dengan
ldiaduk perlahan hingga semuanya terlarut, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan
10 000 rpm selama 30 menit pada suhu 4°C untuk mendapatkan pelet.
Pelet yang dillasilkan dilarutkan kembali dalam Na3P04 50 mM dan
ciidialisis menggunakan selopan pada larutan yang sama hingga terbebas dari
amonium sulfat.
Fraksi amonium sulfat ini selanjutnya di keringbekukan
rnengpnakan freeze drier suhu -80 "C selama 24 jam, setelah kering ditirnbang
untuk menghitung rendemen.
Sebagian fraksi amonium disuspensikan dalam Na3P04 50 mM pH 6.3 dan
dilalukan dalam kolom sephadeks G-75. Tinggi kolom yang digunakan 20 cm,
dengan diameter 1 cm. Setiap 3 ml fraksi dikumpulkan dalam tabung kecil hingga
seluruh protein dalam kolom habis, dengan uji menggunakan pereaksi biuret.
Selanjutnya tiap fi-aksi diukur absorbannya pada panjang gelombang 280 nm
menggunakan spektrofotometer-UV. . Fraksi-f?aksi dikelompokkan berdasarkan
absorbannya dan dikeringbekukan sehingga didapatkan kelomnpok-kelompok fiaksi.
Selama proses ekstraksi diupayakan kondisi lingkungan dalam keadaan dingin
(Tabel Lampiran 1).
Hasil pengeringan kelompok-kelompok fkaksi dapat dilihat dalam Tabel
Lampiran 3. Untuk memastikan keberadaan buffer dalam kelompok-kelompok
Fraksi hasil pengeringan, maka 5 ml buffer pengekstrak dikeringbekukan
~nenggunakanprosedur yang sama dengan tiga ulangan (Tabel Lampiran 2).
IUji Kematian Larva Udang (Brine Sizrimp Lethality Test)
Telur udang Arternia Salina L. ditetaskan dalam air laut. Air laut dibuat
tlengan cara melarutkan 38 gram garam laut dalam satu liter air dan disaring. Telur
ini akan menetas setelah 48 jam.
Sarnpel dari tiap fraksi amoniurn sulfat diuji pada konsentrasi 1000, 100, 10,
dan 0 ug rnl, setiap konsentrasi diulang tiga kali, setiap unit percobaan 10 hewan
uji. Konsentrasi lanltan sampel yang harm dibuat unhlk persiapan pengujian adalah
2000 yglml, dibuat dengan cara melarutkan 6 mg ekstrak protein dalam 3 rnl air
laut.
Selanjutnya dibuat konsentrasi sampel 200 dan 20 pglml dengan cara
pengenceran. Untuk memperoleh konsentrasi 200 pglml dilakukan dengan cara
ncengencerkan 1 ml ekstrak 2000 pgml dengan air laut hingga 10 ml. Konsentrasi
20 pg'ml didapatkan dengan cara mengencerkan 1 ml lanltan protein 200 p@ml
dt:ngan air laut hingga 10 ml.
Pengujian dilakukan dengan cara, 10 ekor udang dan 1 ml air laut
dimasukkan dalam wadah uji dan ditambah 1 rnl larutan ekstrak protein sesuai
dengan konsentrasi uji sehingga konsentrasi akhir dalam wadah uji 1000, 100, dan
10 p&/ml. Setelah 24 jam larva udang yang mati dan hiduip dihitung, data yang
diperoleh diolah dengan metode analisis probit (Finney) untuk mendapatkan nilai
LC
50.
Sarnpel dengan Nilai LC
50
diatas 100 diuji lanjut dengan alur sel secara in
vitro.
Uji Menggunakan Alur Sel
Alur Sel
Alur sel yang digunakan dua jenis yaitu sel suspensi (KR4) dan sel
monolayer (L929). Kedua sel tersebut merupakan koleksi US NAMRU-2 Jakarta.
Media Tumbuh
Media yang digunakan untuk pertumbuhan sel yaitu 1 unit RPMI 1640
ditambah 2 gr NaHC03, Hepes 2.38 gr, antibiotik penstrepe 0.1%, glutamin 0.1%,
dan serum 10 % per liter media. Pelarut yang digunakan adalah aquabidest.
Media yang dipakai sebagai pencuci adalah media tumbuh tanpa serum
(semm:free media). Kedua jenis media ini disterilkan menggunakan filter 0.2 pm,
d2n disimpan dalam lemari pendingin. Bila akan digunakan untuk media
pertumbuhan atau untuk pencucian direndam terlebih dahulu dalam water-bath
hingga mencapai suhu ruang.
Perbanyakan Alur Sel
Sel Suspensi. Sel KR4 dalam keadaan beku dari ruang penyimpan diinkubasi
pada suhu ruang hingga mencair, kemudian dicuci dengan media pencuci dua kali
Pencucian dilakukan dengan cara memindahkan sel yang telah cair ke dalam tabung
sentrifus yang dicampur dengan media pencuci 5 rnl dan disentrifus pada kecepatan
1000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambah media pencuci
sambil dilakukan pengadukan menggunakan pipet hingga pelet terlarut. Selanjutnya
disentrifus lagi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Pelet yang dihasilkan
ditambah media turnbuh sambil diaduk menggunakan pipet hingga terlarut.
Selanjutnya suspensi sel dipindahkan dalam JIask kultur dan ditambah media
tumbuh 5 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C dengan COz 5%.
Pemeliharaan kultur dilakukan dengan cara mengganti media tumbuh dan
subkultur. Penggantian media tumbuh dilakukan bila media dalam $ask telah
berubah warna, dari merah menjadi kuning. Penggantian media dilakukan dengan
cara seperti pencucian.
Apabila sel telah memadati ruang tumbuh tetapi belum siap untuk perlakuan
maka dilakukan subkultur. Subkultur dilakukan dengan cara membagi suspensi sel
kedalam flask baru dengan media tumbuh baru sehingga didapatkan beberapaflask
kultur sel.
Sel Monolayer.
Perbanyakan sel monolayer dan pemeliharaannya dilakukan
llampir sama dengan sel suspensi. Karena sel ini menempel padapask maka untuk
lnelepaskan sel digunakan alat bantu berupa scraper. Setelah sel terlepas, prosedur
pencuciaan sama seperti sel suspensi. Sedangkan untuk penggantian media, dengan
cara memipet media sehingga tersisa sel yang lengket dalarn jlask dan ditambah
media tumbuh baru.
Penyiapan Ekstrak Protein
Setiap kelompok fiaksi dari masing-masing sampel disuspensikan dalam
media tumbuh. Konsentrasi uji ekstrak protein dari setiap kelompok h k s i sampel
adalah 0 pglml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, dan 400 yg/ml. Volume uji tiap well pada
setiap unit percobaan adalah 50 pl..
Penyiapan Sel
Kepadatan sel kanker untuk perlakuan adalah 5 x lo4 sel/ml. Penghitungan
jumlah sel dilakukan dengan metode trypan blue. Pengh~tungandilakukan dengan
cara mengambil satu bagian suspensi sel ditambah satu bagian trypan blue dan
dicarnpur hingga homogen. Suspensi sel yang telah diwarnai, diteteskan dalam
hearnositometer dan ditutup dengan cover glass. Pengamatan dilakukan dibawah
mkroskop perbesaran 100 X. Sel yang hidup terlihat berupa lingkaran tipis dan
bening. sedangkan sel yang mati terlihat berupa lingkaran dengan inti sel berwarna
biru. Penghitungan dilakukan terhadap empat kotak luar pada haemositometer.
Kepadatan sel dihitung dengan cara :
Kepadatan sel
=
X x 2 x 10
'
Keterangan :
X = rata-rata jumlah sel pada empat kotak pada dua bidang pandang
2 = faktor pengenceran oleh trypan blue
10 = volume kotak haemositometer
Sel yang telah dihitung kepadataannya diencekan dalarn media turnbuh
hingga jumlah sel sesuai dengan kepadatan sel yang diperlukan. Volume suspensi
sel yang dipergunakan untuk perlakuan adalah 100 p1.
Perlakuan
Pengujian dilakukan dengan menggunakan microtitter plate-96 well (costar)
(Lampiran Gambar 8).
Pada setiap well perlakuan diisi dengan suspensi sel
sebanyak 100 p1, kemudian ditambahkan 50 p1 ekstrak protein.
Sebagai kontrol adalah 50 p1 media tanpa serum (pelarut ekstrak protein )
ditambahkan pada 100 p1 suspensi sel.
Untuk mengetahui pengaruh Na3P04 yang kemungkinaan masih terdapat
dalam fraksi protein, diuji pula pengaruh buffer pengekstrak. Pengujiaan dilakukan
dengan cara menambahkan 50 pl larutan Na3P04 sebagai pengganti bioaktif ke
dalam 100 pl suspensi sel. Pengaruh buffer terhadap proliferasi sel kanker L 929
dan KR 4 dapat dilihat pada Lampiran Tabel 4.
Inkubasi dilakukan pada inkubator COz 5 % pada suhu 37°C selama 72 jam.
Setelah inkubasi selesai dilakukan pen&tungan
penghambatan proliferasi sel
dengan menggunakan metode MTT reduction.
Penghitungan Sel Hidup dengan Metode MTT
Setelah inkubasi selesai, microtitter plate dikeluarkan dari ruang inkubator.
Selanjutnya, dalarn setiap perlakuan maupun kontrol ditambahkan ,'MT;r sebanyak
100 pl dan diinkubasi kembali pada suhu dan kadar COz yang sama selama 5 jam.
[nkubasi ini bertujuan untuk menstirnulasi terjadinya reduksi MTT oleh enzirn
dehldrogenase, sehingga terjadl perubafian warna kuning menjadl blru. Setelah 5
jam inkubasi, setiap well ditambahkan 100 pl larutan 10 % isopropanol-0.004 N
HCI. 'I ujuan penambahan larutan In1 adalah untuk menghentikan reaksi reduksl
MIIT
Knstal tormazan yang dihasilkan dilarutkan dengan cara meinipet dengan
kuat berulang kali sampai semua knstal terlarut. helanjumya, mrcroritter plate
dimasukkan ke dalam M I 1-reader dan dibaca densitas optiklnya pada panjang
gelombang 570 nm. lndeks penghambatan dihtung dengan rumus : IP (%) = (1OD sel dengan perlakuan ekstrak protem 1 OD sel tanpa perlakuan ( kontrol)) X
IUV.
Nllal indeks pengnambatan prolirerasi aianalisis menggunakan
dengan L I J ~ lanjut UMK 1 .
Sialk
ragam
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Protein
Pada penelitian ini tidak seluruh tahapan ekstraksi sama seperti prosedur
ekstraksi menurut Lee Huang et. al. &lam Gunawan (1998). Pemisahan lemak dan
fialcsinasi menggunakan kromatografi pertukaran ion tidak dilakukan, fi-aksinasi
har~ya menggunakan sephadeks (Tabel Lampiran 1).
Dari hasil ekstraksi
did3patkan rendemen protein daging buah paria pada fraksi amonium suZfat
didaarkan berat 100 g daging buah basah.
Rendemen ekstrak protein dari daging buah pada fiaksi amonium sulfat
dapat dilihat pada Tabel 1. Dari Tabel tersebut terliha