Sequences analysis of gene encoding extracellular xylanase in Streptomyces costaricanus 45I-3

ANALISIS SEKUENS GEN PENYANDI ENZIM XILANASE
EKSTRASELULAR PADA Streptomyces costaricanus 45I-3

SIPRIYADI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Sekuens Gen Penyandi
Enzim Xilanase Ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3 adalah karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada Perguruan Tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir tesis ini.

Bogor,

Desember 2012

Sipriyadi
G351100041

ABSTRACT
SIPRIYADI. Sequences analysis of gene encoding extracellular xylanase in
Streptomyces costaricanus 45I-3. Supervised by ANJA MERYANDINI and
ARIS TRI WAHYUDI.
Streptomyces costaricanus 45I-3 isolated from peat soil is a bacterial
strain in the group of actinomycetes. This bacterium is known to produce
extracellular xylanase. The objectives of this study were to analyze sequence of
gene involved in the synthesis of extracellular xylanase. Complete gene encoding
xylanase was isolated from the bacterial genome by Inverse Polymerase Chain
Reaction (i-PCR). The resulted gene sequence in a total alignment of 1664 bp
amplicons, which consisted of two open reading frame (ORF) with opposite
direction. ORF1 consisted of 1029 bp and ORF2 (Partial sequence) consisted of
309 bp. BLASTX analysis showed ORF1 homology with xylanase of bacterium
enrichment culture clone Xyl8B8 (GenBank accession No. AFH35005.1) that had
95% identity and 99% similarity. ORF2 homolog with glyoxalase bacterium
enrichment culture clone Xyl8B8 (GenBank accession No. AFH35007.1) that had
95% identity and 98% similarity. Upstream of the ORF1 sequence was found
Ribosome Binding Site (RBS) 7 bp from the start codon and putative promotor
sequence at 100 bp (-35) and 77 bp (-10) from the start codon. Analysis of
protein sequence deduced from ORF1 showed that there were 2 domains, i.e
Glyco_hydrolase 11 (GH11) and Carbohydrate Binding Type 2 (CBM2). Active
sites found on the 130 amino acid on GH11 domain. Visualization of 3 dimension
structure showed that 1664 bp fragment had 19 area.

Keywords: Xilanase, Inverse-PCR, Sequence Analysis, S. costaricanus 45I-3

RINGKASAN
SIPRIYADI. Analisis sekuens gen penyandi enzim xilanase ekstraselular pada
Streptomyces costaricanus 45I-3. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan
ARIS TRI WAHYUDI.
Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang tersusun
atas rantai utama berupa unit β-xilopironosa dengan ikatan β-1,4-glikosidik dari
rantai cabang berupa gugus glukoronopironosil, 4-O-metil-D-glukoronopironosil,
α-L-arabinofuranosil, asetil, ataupun furulil dan p-coumaril. Endo-β-1,4-xilanase
merupakan salah satu enzim yang penting dalam menghidrolisis xilan secara
sempurna menjadi xilosa.
Enzim Endo-β-1,4-xilanase dapat dihasilkan oleh beberapa organisme
seperti bakteri, alga, jamur dan aktinomisetes, ragi, protozoa, gastropoda, dan
artropoda. Salah satu bakteri yang menghasilkan Enzim Endo-β-1,4-xilanase ialah
Streptomyces costaricanus 45I-3. Bakteri ini menghasilkan xilanase ekstraselular
pada suhu optimum 50ºC dan pH 5 sehingga berpotensi untuk diaplikasikan di
bidang industri. Produksi endoxilanase S. costaricanus 45I-3 secara komersil
kurang efisien dan ekonomis karena pertumbuhannya yang lambat dibandingkan
dengan bakteri pada umumnya Pendekatan teknik rekombinan DNA melalui
kloning gen merupakan suatu alternatif untuk memaksimalkan potensi xilanase
dari S. costaricanus 45I-3 dalam bidang industri. Langkah awal yang perlu
dilakukan sebelum melakukan kloning gen adalah mengisolasi dan
mengkarakterisasi gen yang terlibat dalam menghasilkan xilanase ekstraselular.
Fragmen gen endoxilanase famili 11 yang telah berhasil teramplifikasi baru
mencakup 40% dari keseluruhan gen utuhnya. Untuk itu perlu dilakukan
penelitian lanjutan menggunakan primer yang arah perpanjangannya keluar dari
DNA yang telah diketahui sekuennya yang dikenal dengan inverse-PCR (i-PCR).
Penelitian ini bertujuan menganalisis sekuen DNA yang berperan dalam sintesis
enzim xilanase ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3.
Isolat S. costaricanus 45I-3 diremajakan pada media agar-agar xilan dan
media Yeast Malt Agar (YMA). Biakan diinkubasi pada suhu ruangan selama 4
hari. pada penelitian ini dilakukan analisis gen endoxilanase pada S. costaricanus
45I-3. Primer disusun berdasarkan data parsial gen endoxilanase yang dilaporkan
Aziz (2010). Karakterisasi gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3 dilakukan
melalui tahapan ekstraksi DNA, Inverse PCR (pemotongan genom, ligasi dan
amplifikasi), elektroforesis, serta proses sekuen.
Proses sekuensing DNA menggunakan jasa sekuensing PT. Genetika
Science Indonesia. Sekuen produk i-PCR diedit menggunakan program Genetyx
Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment menggunakan ClustalX dan Mega
5.0. Analisis deduksi Asam amino dilakukan dengan menggunakan program
BLASTX. Analisis Open Reading Frame (ORF) menggunakan program ORF
Finder di situs NCBI, sedangkan analisis promoter dan Ribosome Binding Site
(RBS) menggunakan piranti lunak dari softberry. Analisis Domain dan situs aktif
enzim dilakukan dengan menggunakan program Conserved Domain Database
(CDD) site yang tersedia di NCBI (http://prosite. expasy.org/), visualisasi struktur
3 dimensi dengan menggunakan program Cn3D, sedangkan penentuan massa

molekul relatif dan titik isoleketrik menggunakan program yang tersedia pada
situs (http://web.expasy.org/ compute_pi/).
Urutan DNA lengkap yang diisolasi dari genom bakteri dengan metode
Inverse Polymerase Chain Reaction (I-PCR) diprediksi mengkodekan gen
endoxilanase. Pensejajaran produk I-PCR dengan parsial gen yang dilaporkan
Aziz (2010) menghasilkan total amplikon sebesar 1664 bp, yang terdiri dari dua
kerangka baca terbuka (ORF) dengan arah yang berlawanan. ORF1 terdiri dari
1.029 bp dan ORF2 (Parsial) terdiri dari 309 bp. Analisis BlastX maupun BlastP
menunjukkan ORF1 homologi dengan xylanase bacterium enrichment culture
clone Xyl8B8 (GenBank No akses AFH35005.1) yang memiliki identitas 95%
dan kesamaan 99%. ORF2 homolog dengan glyoxalase bacterium enrichment
culture clone Xyl8B8 (GenBank No akses AFH35007.1) dengan identitas sebesar
95% dan kesamaan 98%.
Sekuen hulu ORF1 ditemukan Ribosom Binding Site (RBS) 16 bp dari
start kodon. Sekuen penyandi putatif promotor ditemukan pada 100 bp (-35) dan
77 bp (-10) dari start kodon. Analisis sekuen protein dari ORF1 menunjukkan
bahwa ada 2 domain Glyco_hydrolase 11 (GH11) dan Carbohidrate Binding
Module (CBM2). Situs aktif ditemukan pada asam amino 130 pada domain
GH11. Visualisasi struktur 3 dimensi menunjukkan bahwa fragmen 1.664 bp
memiliki 19 wilayah.
Kata Kunci: Xilanase, Inverse-PCR, Analisis Sekuens, S. costaricanus 45I-3

Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

ANALISIS SEKUENS GEN PENYANDI ENZIM XILANASE
EKSTRASELULAR PADA Streptomyces costaricanus 45I-3

SIPRIYADI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Giyanto, M.Si

Judul
Nama
NRP

: Analisis Sekuens Gen Penyandi Enzim Xilanase Ekstraseluler
pada Streptomyces costaricanus 45I-3
: Sipriyadi
: G351100041

Disetujui,
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.
Ketua

Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Mikrobiologi

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Prof. Dr. Anja Meryandini, M.S.

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr

Tanggal Ujian: 12 November 2012

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penelitian dan penulisan karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Karya ilmiah ini merupakan syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains di
Institut Pertanian Bogor. Judul yang dipilih dalam penelitian ini ialah Analisis
Sekuens Gen Penyandi Enzim Xilanase Ekstraseluler pada Streptomyces
costaricanus 45I-3.
Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya tesis ini, penulis
banyak mendapatkan bantuan moral maupun material dari berbagai pihak. Oleh
karena itu dengan ketulusan hati, penulis mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada: Prof. Dr. Anja Meryandini dan Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi
selaku pembimbing yang telah sabar, setia dan tulus dalam memberikan
bimbingan, arahan, nasehat, dorongan semangat serta rela mengorbankan waktu
selama penelitian, proses pembimbingan sampai akhir penulisan tesis.
Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada Departemen Pendidikan
Tinggi Republik Indonesia atas beasiswa BPPS Tahun 2010. Kepada Rektor dan
Jajaran Pimpinan Universitas Bengkulu yang telah memberikan kesempatan dan
izin kepada penulis untuk melanjutkan studi S2 di Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada Dr. Ir. Giyanto, M.Si atas
kesediaannya sebagai penguji luar komisi yang telah memberikan saran dan
masukan dalam menyempurnakan penulis tesis ini. Kepada staf laboratorium
Mikrobiologi Bapak Jaka, Ibu Rika Indri Astuti, dan Ibu Henni atas bantuannya
selama kegiatan penelitian di laboratorium. Terimakasih juga disampaikan kepada
Eryk Andreas, S.Pt, M.Si, Bapak Saefuddin Aziz, S.Si, M.Si, dan Bapak Dr. Sri
Pujianto, M.Si yang telah bersedia berbagi dan sharing dalam banyak hal untuk
menunjang kelancaran selama proses penelitian sampai penulisan tesis ini.
Terimakasih kepada teman-teman Mikrobiologi 2010 serta teman-teman Baristar
atas dukungan semangat, kebersamaan, bantuan, dan do’anya. Serta pihak-pihak
lain yang terlibat dan membantu dalam penyelesaian tesis ini yang tidak dapat
saya sebutkan satu-persatu.

Akhirnya dengan penuh ketulusan ucapan terima kasih disampaikan kepada
Ayahanda dan Ibunda tercinta, Bapak dan Ibu Mertua, dan terkhusus untuk Istriku
Henny Johan Priyadi, S.Si, M.Pd dan anak ku tersayang (M. Naufal Priyadi) yang
telah berkorban dan merelakan untuk berpisah selama penulis menyelesaikan
studi S2 di IPB. Saudara ku Yuyin, Rinto, Nopi, Ana dan Septi atas dukungan,
doa, cinta, dan kasih sayang yang sangat besar yang telah diberikan kepada
penulis.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan memberikan informasi untuk
kepentingan dan perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor,

Desember 2012
Sipriyadi

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Tanjung Karang pada tanggal 22 September 1984
sebagai putra ketiga dari lima bersaudara pasangan Arman dan Harmi. Tahun
2010 penulis menikah dengan Henny Johan, S.Si, M.Pd dan dikaruniai satu orang
putra yang bernama Muhammad Naufal Priyadi (15 Bulan).
Tahun 2003 penulis lulus dari SMA Negeri 04 Manna pada tahun yang
sama lulus seleksi masuk Universitas Bengkulu melalui jalur Penelusuran Potensi
Akademik (PPA). Penulis memilih jurusan Biologi, Fakultas MIPA dan selesai
pada Tahun 2007. Penulis pernah bekerja di PT. Survindolink (Konsultan
AMDAL) dari Tahun 2007 hingga tahun 2009 dan pada Tahun 2008 penulis
diterima sebagai staf pengajar di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Bengkulu
hingga saat ini.
Pada tahun 2010 penulis melanjutkan perkuliahan di Sekolah Pascasarjana
IPB, Mayor Mikrobiologi. Pada masa perkuliahan penulis berkesempatan menjadi
asisten untuk mata kuliah “Praktikum Mikrobiologi Lanjut” Tahun ajaran
2012/2013.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ......................................................................................

xiv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xv

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xvi

PENDAHULUAN
Latar Belakang ........................................................................................
Tujuan Penelitian ....................................................................................
Manfaat Penelitian ..................................................................................

1
2
2

TINJAUAN PUSTAKA
Xilan .......................................................................................................
Enzim Xilanase .......................................................................................
Regulasi Biosintesis Xilan dari Mikrob ...................................................
Pengelompokan Endoxilanase .................................................................
Mikrob Penghasil Xilanase .....................................................................
Isolasi dan Karakterisasi Gen Endoxilanase ............................................
Inverse Polymerase Chain Reaction (I-PCR) ...........................................

3
4
5
5
7
8
9

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................
Bahan dan Alat Penelitian .......................................................................
Peremajaan Isolat S. costaricanus 45I-3 ..................................................
Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3 ..............................................
Amplifikasi Gen Endoxilanase dengan Metode Inverse-PCR ..................
Elektroforesis Pada Gel Agarosa 1% .......................................................
Analisis Nukleotida, Asam Amino, Open Reading Frame (ORF),
Ribosomal Binding Site (RBS), Situs Aktif, dan Struktur 3 Dimensi ........

11
11
11
11
12
13
15

HASIL
Peremajaan S. costaricanus 45I-3 ............................................................
Isolasi Genom S. costaricanus 45I-3 .......................................................
Analisis Gen Penyandi Enzim Xilanase S. costaricanus 45I-3 .................
Analisis Asam Amino Menggunakan BLASTX ......................................
Analisis Struktur Gen ..............................................................................
Analisis Domain, Situs Aktif dan Struktur 3 Dimensi ..............................
Analisis Berat Molekul dan Titik Isoelektrik ...........................................

17
17
18
19
21
24
25

PEMBAHASAN .........................................................................................

27

SIMPULAN ...............................................................................................

34

SARAN ......................................................................................................

34

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................

37

LAMPIRAN ...............................................................................................

41

DAFTAR TABEL
Halaman
1

Hemiselulase dan jenis substrat yang dihidrolisis ................................

4

2

Data kuantitas genom hasil isolasi (spektrofotometer) ..........................

18

3

Analisis homologi asam amino penyusun gen endoxilanase
S. costaricanus 45I-3 menggunakan program BLASTX .......................

19

DAFTAR GAMBAR
Halaman

1

Strategi yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase
pada S. costaricanus 45I-3 .................................................................

14

2

Morfologi isolat S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada
media agar-agar xilan .................................................................... .

17

3

Amplifikasi I-PCR terhadap gen endoxilanase famili 11 dengan
primer I (F-Sc1) dan primer II (R-Sc1) ..............................................

18

4

Deduksi asam amino antara S.costaricanus 45I-3 terhadap sekuen
asam amino pengkode xilanase pada 3 spesies lainnya ........................

20

5

Filogenetik berdasarkan sekuen asam amino yang dibandingkan
dengan beberapa galur Streptomyces penghasil endoxilanase .............

21

6

Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk Glyco_hydro_11
Superfamili ........................................................................................

22

7

Hasil analisis open reading frame (ORF) untuk Glo_EDI_BRP
_Like Superfamily .............................................................................

22

8

Skema hasil penggabungan ORF Gly-Hydro (GH11) dan
Glyoxalase dengan arah berlawanan ..................................................

23

9

Analisis domain menggunakan program scan prosite. ...................... .

24

10

Prediksi struktur tiga dimensi enzim endoxilanase S. costaricanus
45I-3 menggunakan program Cn3D ................................................. .

25

11

Hasil Input data untuk analsis berat molekul dan titik isoelektrik
enzim endoxilanase S. costaricanus 45I-3 .........................................

26

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1

Sekuen primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen
endoxilanase S. costaricanus 45I-3 menggunakan metode
Inverse-PCR ……….. .........................................................................

43

2

Hasil sekuensing produk inverse PCR (1500 pb) bagian forward ...... .

44

3

Hasil sekuensing produk inverse PCR (1500 pb) bagian reverse ........

46

4

Hasil pensejajaran urutan nukleotida produk inverse-PCR dengan
database di GenBank menggunakan program BLASTX .....................

48

5

Hasil pensejajaran urutan nukleotida produk inverse-PCR dengan 5
database di GenBank menggunakan program BLASTX .....................

49

6

Analisis promoter dan open reading frame (ORF) ..............................

52

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang tersusun
atas rantai utama berupa unit β-xilopironosa dengan ikatan β-1,4-glikosidik dari
rantai cabang berupa gugus glukoronopironosil, 4-O-metil-D-glukoronopironosil,
α-L-arabinofuranosil, asetil, ataupun furulil dan p-coumaril (Kulkarni et al. 1999;
Liet al. 2000). Endo-β-1,4-xilanase merupakan salah satu enzim yang penting
dalam menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi xilosa (Esteves et al. 2004).
Enzim ini dapat dihasilkan oleh beberapa organisme seperti bakteri, alga, jamur
dan aktinomisetes (Beg et al. 2001), ragi, protozoa, gastropoda, dan artropoda
(Collins et al. 2005).
Endoxilanase memiliki aplikasi yang luas dalam industri, diantaranya
digunakan untuk meningkatkan ekstraksi lignin dan melepaskan kromofor pada
tahapan awal pemutihan pulp. Penggunaan enzim xilanase pada industri pulp dan
kertas meningkat seiring dengan meningkatnya penemuan mikrob yang mampu
menghasilkan xilanase serta aplikasinya pada bidang industri (Beg et al. 2001).
Aplikasi lainnya termasuk konversi xilan pada industri pertanian dan makanan,
produksi bahan baku pada industri bahan bakar dan kimia (Sunnah &
Antranikian1997). Enzim ini juga dapat digunakan untuk biobleaching pada
industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus dan anggur,
meningkatkan kualitas roti, dan pakan ternak.
Streptomyces costaricanus 45I-3 koleksi Dr. Yulin Lestari, Bagian
Mikrobiologi,

Departemen Biologi IPB, mampu

menghasilkan xilanase

ekstraselular. Ekstrak kasar xilanase menunjukkan aktivitas xilanase yang
dominan pada suhu optimum 50ºC dan pH 5 (Meryandini et al. 2007), sehingga
isolat ini berpotensi untuk diaplikasikan di bidang industri. Namun produksi
endoxilanase S. costaricanus 45I-3 secara komersil kurang efisien dan ekonomis
karena pertumbuhannya yang lambat dibandingkan dengan bakteri pada umumnya
(Paul & Chlark 1996). Pendekatan teknik rekombinan DNA melalui kloning gen
merupakan suatu alternatif untuk memaksimalkan potensi xilanase dari

2
S. costaricanus 45I-3 dalam bidang industri. Langkah awal yang perlu dilakukan
sebelum melakukan kloning gen adalah mengisolasi dan mengkarakterisasi gen
yang terlibat dalam menghasilkan xilanase ekstraseluler.
Tahapan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi
endoxilanaseS. costaricanus 45I-3 melalui pendekatan pustaka genom telah
dilakukan Satria (2008). Koloni rekombinan yang membawa gen xilanase
dideteksi dengan adanya zona bening pada media xilan, namun ketika diverifikasi
lebih lanjut DNA sisipan tidak bisa bertahan lama. Upaya lain dilakukan oleh
Aziz (2010) melalui pendekatan Polymerase Chain Reaction (PCR). Fragmen gen
endoxilanase famili 11 berhasil teramplifikasi, namun baru mencakup 40% dari
keseluruhan gen utuhnya. Atas dasar tersebut perlu dilakukan penelitian lanjutan
menggunakan primer yang arah perpanjangannya keluar, metode ini lebih dikenal
dengan inverse-PCR (i-PCR). Pada metode i-PCR fragmen gen yang telah
dilaporkan Aziz (2010) dijadikan sebagai cetakan untuk perpanjangan primer ke
arah hulu dan hilir parsial gen endoxilanase secara bersamaan, sehingga bisa
didapat gen endoxilanase pada S. costaricanus 45I-3 secara keseluruhan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis sekuens gen penyandi enzim xilanase
ekstraselular pada Streptomyces costaricanus 45I-3.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah diperolehnya
informasi mengenai karakteristik gen yang menyandikan enzim xilanase
ekstraselular pada S. costaricanus 45I-3 sebagai dasar pengembangan isolat lokal
yang potensial bagi keperluan industri.

TINJAUAN PUSTAKA
Xilan
Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang banyak
ditemukan pada dinding sel tumbuhan dengan konsentrasi berkisar antara 25-30%
dari berat kering total (Perez et al. 2002). Komponen terbesar hemiselulosa yaitu
xilan, merupakan jenis polisakarida paling melimpah kedua di alam setelah
selulosa. Xilan terdapat hampir pada semua tanaman, kebanyakan dijumpai pada
tanaman tahunan dan limbah–limbah pertanian seperti tongkol jagung, bagas tebu,
jerami padi, dedak gandum dan biji kapas (Subramiyan & Prema 2002).
Xilan tersusun atas rantai utama berupa unit β-xilopironosa dengan ikatan
β-1,4-glikosidik dari rantai cabang berupa gugus glukoronopironosil, 4-O-metilD-glukoronopironosil, α-L-arabinofuranosil, asetil, ataupun furulil dan p-coumaril
(Kulkarni et al. 1999; Lie et al. 2000). Komposisi rantai cabang xilan jumlahnya
sangat beragam tergantung pada sumber xilan. Xilan pada kayu keras dari
golongan Angiospermae tersusun terutama oleh O-asetil-4-O metilglukoronoxilan.
Xilan pada kayu lunak dari golongan Gimnospermae tersusun terutama oleh
arabino-4-O-metilglukoronoxilan. Xilan pada tumbuhan semusim dan rumputrumputan tersusun terutama oleh arabinoxilan (Kulkarni et al. 1999).
Xilan pada kayu keras minimal tersusun oleh 70 residu β-xilopironosa
dengan derajat polimerisasi antara 150 hingga 200. Setiap residu xilosa terdapat
sebuah rantai cabang asam 4-O-metil glukuronat. Pada posisi C-3 dari unit xilosa
banyak mengalami asetilasi hingga mencapai lebih dari 0.5 mol asam asetat per 1
mol xilosa. Xilan dari kayu keras misalnya Birchwood xylan tersusun atas 89.3%
xilosa, 1 % arabinosa, 1.4 glukosa dan 8.3 asam anhidrouronik. Xilan pada kayu
lunak memiliki residu xilosa yang lebih pendek dan percabangan yang lebih
sedikit dari xilan kayu keras dengan derajat polimerisasi antara 70 hingga 130.
Rasio komposisi β-D-xilopironosa, asam 4-O-metil-α-D-glukuronat dan Larabinofuranosa adalah 100: 20 : 13 (Beg et al. 2001). Xilan pada tumbuhan
semusim dan rerumputan sedikit mengalami percabangan. Umumnya pada posisi
C3 mengalami asetilisasi dimana grup asetilnya dihubungkan olh ikatan α-1,3
glikosidik dengan gugus α-L- arabinofuranosa (Saha 2003).

4
Enzim xilanase
Xilanase adalah suatu enzim hidrolase yang akan menghidrolisis xilan
menjadi xilooligosakarida. Untuk menghidrolisis xilan secara sempurna menjadi
monomernya yaitu xilosa dibutuhkan suatu sistem enzim. Endo-β-1,4-xilanase
akan

mendepolarisasi

xilan

secara

acak

pada

rangka

β-1,4

menjadi

xilooligosakarida dengan melepas xilosa. β-xilosidase menghidrolisis xilooligosakarida menjadi oligosakarida dan melepas xilosa. Gugus-gugus substituen akan
dihidrolisis oleh α-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galaktosidase dan
asetil xilan esterase (Subraminyan & Prema 2002). Sistem enzim ini banyak
ditemukan pada fungi dan bakteri (Beg et al. 2001). Hidrolisis hemiselulosa juga
membutuhkan enzim pelengkap yang berkerja secara sinergis dalam menguraikan
xilan dan manan (Tabel 1).
Tabel 1 Hemiselulase dan jenis substrat yang dihidrolisis (Howard et al. 2003)
Enzim
Exo- β-1,4-xylosidase
Endo- β-1,4-xylanase
Endoβ-1,4mannosidase
Endo- β-1,4-mananase
Endo- a-1,5-arabinase
a-Larabinofuranosidase
a-glucoronidase

Substrat
β-1,4-xilooligomers xylobiose
β-1,4-xylan
β-1,4-mannooligomers mannobiose

β-1,4-manan
a-1,5-arabinan
a-L-arabinofuranosyl (1 2) atau
(13) xylooligomers a-1,5-arabinan
4-O-metyl-a-glucuronic acid (12)
xilooligomers
a-galactosidase
a-galactopyranose
(16)
mannooligomers
Endo-galactanase
β-1,4-galactan
Β-glucosidase
Glucopyranose (1,6) mannopyronose
Acetyl xilan esterases
2- atau 3-O Acetyl xilan
Acetyl manan esterases 2- atau 3-O Acetyl manan
Ferulic and p-cumaric 2- atau 3-O Acetyl manan
acid esterase

Nomor EC
3.2.1.3.7
3.2.1.8
3.2.1.25
3.2.1.78
3.2.1.99
3.2.1.55
3.2.1.39
3.2.1.22
3.2.1.89
3.2.1.21
3.2.1.72
3.1.1.6

Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis,
yaitu β-xilosidase, eksoxilanase dan endoxilanase. Enzim β-xilosidase mampu
menghidrolisis xilooligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Eksoxilanase
memutus rantai polimer xilosa (xilan) pada ujung pereduksi, sehingga
menghasilkan xilosa sebagai produk utama dan sejumlah oligosakarida rantai
pendek. Endoxilanase mampu memutus ikatan β-1-4 pada bagian dalam rantai

5
xilan secara teratur. Xilanase pada umumnya merupakan protein kecil dengan
berat molekul 15 kDa – 40 kDa, aktif pada suhu 55ºC dengan pH 9 (Yang et al.
1998; Yu et al. 1991). Xilanase yang dihasilkan oleh Streptomyces
thermoviolaceus OPC-520 bersifat lebih stabil pada suhu 60ºC dan pH netral,
(Tsujibo et al. 1992). Xilanase dari bakteri Streptomyces sp. (galur Lb 24D)
mempunyai aktifitas tinggi pada kisaran pH 5-8, dengan pH optimal 6.5
(Rawashdeh et al. 2005).
Regulasi Biosintesis Xilanase dari Mikrob
Enzim xilanase banyak dihasilkan dari mikroba terutama fungi dan
bakteri. Faktor penting yang harus diperhatikan dalam produksi enzim dari
mikroba adalah pemilihan penginduksi yang tepat dan komposisi media yang
optimum. Hal ini berhubungan dengan regulasi sintesis enzim xilanase dari
mikroba.
Xilan merupakan molekul besar sehingga dalam kondisi utuh tidak dapat
masuk ke dalam sel. Fragmen xilan yang lebih kecil seperti xilosa, xilobiosa,
xilooligosakarida dan heterodisakarida dari xilosa dan glukosa memegang peranan
penting dalam biosintesis xilanase. Xilanase dapat dihasilkan secara konstitutif
maupun induktif. Xilanase yang dihasilkan secara konstitutif mendegradasi xilan
menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa, sehingga molekul ini bisa diangkut ke
dalam sel untuk menginduksi gen xilanase lainnya. β-xilosidase yang diproduksi
baik secara konstitutif maupun induktif mengubah xilobiosa menjadi xilosa dan
selanjutnya diikuti proses transglikosilasi menjadi XyIB1-2XyI dan GLcB1-2XyI.
Senyawa ini akan dimasukkan ke dalam sel dan bertindak sebagai penginduksi
tambahan bagi gen penyandi xilanolitik (Kulkarni et al. 1999).
Pengelompokan Endoxilanase
Enzim endoxilanase menurut Wang et al. (1997) dikelompokkan ke dalam
glikosida hidrolase famili 10 dan 11 (disebut juga famili F dan famili G)
berdasarkan komponen psikokimianya yang meliputi massa molekul relatif dan
titik isoelektrik. Famili 10 merupakan kelompok endoxilanase dengan massa
molekul yang relatif tinggi (>40 kDa) dengan nilai pH yang rendah (asam).
Sebaliknya famili 11 merupakan kelompok endoxilanase yang relatif rendah ( 12 kpb= kilo pasang basa) atau
berukuran lebih besar sering akan terpotong-potong menjadi beberapa fragmen
oleh enzim restriksi yang digunakan dalam pengklonan. Hal ini akan memakan

10
waktu yang cukup lama untuk mengamplifikasinya dengan prosedur kloning
secara konvensional. Dengan demikian, metode inverse PCR akan menjadi
altematif solusi yang baik untuk mengatasi masalah tersebut (Martin & Mohn
1999).
Inverse-polymerase chain reaction (I-PCR) adalah variasi dari reaksi
berantai polimerase yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA dengan hanya
satu urutan diketahui. Salah satu keterbatasan PCR konvensional adalah
memerlukan primer untuk kedua utas DNA target, tetapi metode ini
memungkinkan PCR dapat dilakukan meskipun hanya satu urutan yang tersedia
dan primer dapat dirancang. Metode inverse PCR melibatkan serangkaian reaksi
yang meliputi pemotongan utas dan ligasi, menghasilkan fragmen melingkar yang
dapat dikenali oleh primer dari satu bagian urutan diketahui. Kemudian, seperti
proses PCR lain, DNA diamplifikasi oleh DNA polimerase pada temperatur
tertentu (Martin & Mohn 1999).

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2011 sampai dengan Juni
2012. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium
Terpadu Departemen Biologi, FMIPA IPB.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan ialah bakteri S.costaricanus45I-3 yang berasal dari
Kalimantan (koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Bagian Mikrobiologi Departemen
Biologi, FMIPA IPB) digunakan sebagai sumber gen endoxilanase.
Bahan dan alat untuk ekstraksi DNA terdiri atas STE (0.3 M sukrosa; 25
mM Tris-HCL; 25 mM EDTA.2Na pH 8), proteinase K (5 mg/ml), enzim lisozim
(20 mg/ml), PCI(Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1), CIAA
(Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1), fenol, isopropanol, etanol 70% (v/v),
Tris-HCl EDTA ((TE) (10 mM Tris-HCl-EDTA pH 8; 1 mM EDTA)), dan tabung
mikro1.5 ml. Bahan untuk campuran PCR yaitu akuades steril, primer I, primer II,
dan TAKARATaq DNA Polymerase (bufer dengan 1.5 mM Mg2+, dNTP 0.4 mM,
0.5 U/µl TAKARATaq DNA polymerase). Bahan yang digunakan untuk
elektroforesis adalah medium agarosa 1%, bufer 1xTAE (Tris 0.5 M, asam asetat
0.65 M, EDTA 0.02M), penanda 1kb DNA ladder (Fermentas), dan 6x loading
dye (Promega). Visualisasi DNA menggunakan UV Transluminator.
Peremajaan Isolat S. costaricanus45I-3
Media yang digunakan untuk meremajakan isolat S. costaricanus 45I-3
adalah media agar-agar xilan (0.5% ekstrak khamir; 10.3% sukrosa; 0.5% NaCl;
0.5% xilan Birchwood; 2% agar) dan media Yeast Malt Agar (YMA). Biakan
diinkubasi pada suhu ruangan selama 4 hari.
Isolasi DNA Genom S. costaricanus 45I-3
Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri dimasukkan ke tabung mikro mikro1.5 ml
lalu disentrifugasi pada kecepatan 800 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang
dan pelet yang terbentuk dicuci dengan bufer STE (komposisi: 0.3 M sukrosa; 25

12

mM Tris-HCL; 25 mM EDTA·2Na pH 8), kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Pelet dicuci sebanyak 3 kali secara
berulang. Selanjutnya supernatan dibuang dan pada pelet yang didapat
ditambahkan 200 µl bufer STE dan 45 µl lisozim (20 mg/ml), tabung dibolakbalik secara pelan lalu diinkubasi pada suhu 55ºC selama 1 jam sehingga
terbentuk protoplas. Sebanyak 20 µl proteinase-K (20 mg/ml) ditambahkan pada
campuran tersebut dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama 60 menit lalu
ditambahkan 400µl 10% CTAB dalam larutan 0.7 M NaCl, dan diinkubasi pada
suhu 65ºC selama 30 menit. Ke dalam larutan ditambahkan 1 kali volume
fenol:kloroform (25:24) dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama
10 menit. Fase bening dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 0.6 kali
volume isopropanol dan 20 µl natrium asetat, dinkubasi pada suhu -20ºC selama
semalam. Disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit, bagian sepernatan dibuang
sedangkan pada pelet dicuci menggunakan alkohol 70% sebanyak 1 ml. DNA
dikeringanginkan selama 1 jam untuk membuang alkohol lalu dilarutkan

ke

dalam 50 µl ddH2O steril selanjutnya disimpan pada 4 ºC atau -20ºC.
Amplifikasi Gen Endoxilanase dengan Metode Inverse PCR
Pemotongan DNA Genom. Untuk mengamplifikasi DNA yang mengapit
fragmen bagian hulu dan hilir sekaligus, DNA genom dipotong dengan
menggunakan enzim restriksi yang tidak memotong fragmen tersebut, yaitu HinfI,
HindIII, EcoR1, EcoRV, BamHI, dan NdeI. Sebanyak 10 µl DNA genom
ditambahkan dengan 2 µl 10x buffer RE, 1 µl enzim restriksi dan 6 µl akuades
steril lalu diresuspensi dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama semalam.
Selanjutnya DNA diekstrak dengan fenol-kloroform kemudian diendapkan dengan
etanol 100% dan dicuci dengan etanol 70%. Selanjutnya pelet dikering anginkan
pada suhu ruang selanjutnya disuspensikan ke dalam 5 µl akuades steril.
Sirkularisasi DNA Hasil Pemotongan. Potongan genom hasil restriksi
disirkularisasi atau diligasikan dengan menggunakan enzim ligase (DNA ligase
T4, ligation kit ver.2 solution I). Ligasi dilakukan semalaman pada suhu 15ºC.
Sampel DNA yang telah disirkularisasi kemudian diendapkan menggunakan

13

etanol 100%. Pelet DNA dikering anginkan selanjutnya diresuspensikan ke dalam
5 µl akuades steril.
Amplifikasi Gen Penyandi Xilanase Ekstraselular. Amplifikasi fragmen
gen penyandi enzim xilanase ekstraselular dengan inverse-PCR dilakukan
menurut Wahyudi et al. (2001). Primer didesain berdasarkan pada sekuen parsial
gen endoxilanase yang dilaporkan Aziz (2010). Primer yang digunakan yaitu
primer I (Sc-F1-3’ATCAC CACCGGCAACCACTTCG-5’): dan primer II (Sc-R1
3’-TGCCCCAGTTGTCGACGATGTAG-5’), i-S1-i-S2, dan Sc-F1-Sc-R1 (Lampiran 1). DNA diamplifikasi dengan menggunakan Gene Amp System 2400,
thermocycler (Perkin Elmer). Reaksi inverse-PCR meliputi : 25 µl 2x Buffer
(Reaction With GC), primer masing-masing 1 µl (10 µM), 1 µl LA Taq
polymerase, 3 µl sampel DNA, dan akuades steril hingga volume 50 µl. Program
i-PCR sebagai berikut; denaturasi awal (94°C, 5 menit), diikuti denaturasi (94°C,
2 menit). Penempelan primer (61°C, 1 menit), pemanjangan (72°C, 1 menit) dan
pemanjangan akhir (72°C, 7 menit). Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 sikIus.
Elektroforesis pada Gel Agarosa 1%
DNA hasil PCR divisualisasi dengan teknik elektroforesis menggunakan
Agarose biologi meolekuler (Biorad) 1%. 1 gram agarosa dilarutkan ke dalam 100
ml bufer TAE 1x kemudian dididihkan. Selanjutnya dicetak dan dibiarkan sampai
membeku dan dimasukkan ke bak elektroforesis (Biored) yang telah diisi larutan
bufer TAE 1x. DNA produk PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan 2 µl loading
dye, kemudian dimasukkan ke dalam sumur pada agarosa. Kondisi elektroforesis
diatur pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Selanjutnya agarosa diwarnai
dalam larutan ethidium bromida (0.5 µl/ml) selama 15 menit, diamati pada UV
transluminator (UV luminescence).

14

1500
1000
750
500
250

Gambar 1

Strategi yang digunakan untuk mengamplifikasi gen endoxilanase
pada S. costaricanus 45I-3. Mula-mula genom dipotong secara acak
menggunakan enzim restriksi yang tidak memotong sekuens 408 pb
yang dilaporkan aziz, salah satunya Hinf1. Selanjutnya dilakukan
sirkularisasi dan amplifikasi menggunakan primer yang arah
pemanjangannya
keluar.
Poduk inverse-PCR selanjutnya
disekuensing dan disejajarkan pada parsial gen yang dilaporkan Aziz
(2010), sehingga akan didapat total amplikon yang dapat dianalsis
lebih lanjut.

15

Analisis Nukleotida, Asam Amino, ORF, RBS, Situs Aktif, dan Struktur 3
Dimensi
Proses sekuensing DNA menggunakan jasa sekuensing PT. Genetika
Science Indonesia. Sekuen produk inverse-PCR diedit menggunakan program
Genetyx Win versi 4.0, kemudian dilakukan alignment menggunakan ClustalX,
Mega 4.0 (Tamura et al. 2007) dan Mega 5.0. Analisis deduksi asam amino
dilakukan dengan menggunakan program BLASTX. Analisis open reading frame
(ORF) menggunakan program ORF Finder di situs National Center for
Biotechnology Information (NCBI), sedangkan analisis promoter dan ribosome
binding site (RBS) menggunakan piranti lunak dari softberry (www.
softberry.com). Analisis Domain dan situs aktif enzim dilakukan dengan
menggunakan program conserved domain database (CDD) site yang tersedia di
NCBI (http://prosite. expasy.org/) (Falquet et al. 2002). Visualisasi struktur
3 dimensi menggunakan program Cn3D. Penentuan berat molekul (BM) dan titik
isoelektrik (pI) menggunakan program yang tersedia pada situs (http://web.expasy
.org/ compute_pi/).

17

HASIL
Peremajaan S. costaricanus 45I-3
Pada penelitian ini isolat S. costaricanus 45I-3 diremajakan pada media
agar-agar xilan dan YMA. Hasil yang didapat menunjukkan bahwa pertumbuhan
diawali dengan perkecambahan spora menjadi hifa substrat berwarna putih pada
media agar-agar xilan. Hifa substrat dan hifa aerial berwarna abu-abu pada media
YMA (Gambar 2).

(b)

(a)

(c)
Gambar 2 Morfologi isolat S. costaricanus 45I-3 yang ditumbuhkan pada media
agar-agar xilan (a) tampak depan, (b) tampak belakang, dan (c) pada
media YMA. Pada (b) terlihat media xilan berubah warna menjadi
kuning tua.
Isolasi Genom S. costaricanus 45I-3
Kuantitas DNA hasil isolasi genom menggunakan spektrofotometer
disajikan pada Tabel 2.

18
Tabel 2 Kuantitas genom hasil isolasi
No
1

OD (Optical Density)
λ 260
λ 280 nm
λ 230 nm
nm
0.188
0.076
0.039

Kemurnian

Konsentrasi DNA

λ260/ λ280)

μg/ml

μg/μl

1.94

760

0.76

2

0.216

0.624

0.314

1.99

1090

1.92

3

0.009

0.025

0.014

1.79

438

0.44

4

0.204

0.398

0.199

2.00

696

0.697

5

0.219

0.197

0.099

1.99

344

0.345

6

0.215

0.438

0.223

1.96

766

0.767

7

0.183

0.460

0.233

1.97

805

0.805

8

0.199

0.540

0.271

1.99

9450

9.45

9

0.294

0.839

0.435

1.93

146

0.46

Kuantitas DNA (konsentrasi) hasil pengukuran dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 260 nm ialah terendah pada sampel nomor 3 yaitu 438
µg/ml sedangkan yang tertinggi pada sampel nomor 8 yaitu 9450 µg/ml (Tabel 2).
Kemurnian DNA yang didapat berdasarkan nilai rasio OD260/OD280 rata-rata
adalah 1.9 yang artinya DNA yang diperoleh mempunyai kemurnian yang sangat
tinggi dan tidak terkontaminasi oleh protein.
Analisis Gen Penyandi Enzim Xilanase S. costaricanus 45I-3
Amplifikasi menggunakan metode inverse-PCR menghasilkan fragmen
DNA yang berukuran sekitar 1500 pb (Gambar 4).
M

1500
1000
750
500
250

1

2

1.500 pb

Gambar 3 Amplifikasi i-PCR terhadap gen endoxilanase famili 11 dengan primer
I (F-Sc1) dan primer II (R-ScI) yang arah perpanjangannya ke luar. M
= marker 1 Kb ; 1 dan 2 = produk i-PCR setelah dipotong dengan
enzim restriksi HinfI.

19
Produk inverse-PCR selanjutnya di sekuen dan disejajarkan untuk
menentukan panjang amplikon yang dihasilkan. Data hasil sekuensing disajikan
pada Lampiran 2 dan 3. Hasil pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa enzim
restriksi HinfI memotong pada nukleotida ke 694 ke arah downstream dan
nukleotida ke 564 pada arah upstream. Hal ini tergambar dengan adanya daerah
tumpang tindih (overlaping) pada urutan nuleotida tersebut. Dari hasil ini didapat
panjang amplikon yang teramplifikasi secara keseluruhan yaitu sebesar 1664 pb.
Analisis Asam Amino Menggunakan BLASTX
Total amplikon sebesar 1664 pb selanjutnya dilakukan BLASTX dengan
tujuan untuk menentukan homologi antara sekuen asam amino hasil penelitian
dengan sekuen asam amino GenBank yang ada di situs NCBI. Hasil perbandingan
sekuen asam amino menggunakan program BLASTX dapat dilihat pada Tabel 3
dan Lampiran 4 dan 5.
Tabel 3 Analisis homologi menggunakan BLASTX
No. Akses
AFH35005.1
ZP06710529.1
CCK28706.1
EHN73405.1
ZP06710529.1

Discription
Xylanase [bacterium
enrich-ment culture clone
Xyl8B8]
Endo-1,4-beta-xylanase B
[Streptomyces sp. e14]
Endo-1,4-beta-xylanase B
[Streptomyces
davawensis JCM 4913]
Endo-1,4-beta-xylanase
[Streptomyces
coelicoflavus ZG0656]
Endo-1,4-beta-xylanase
[Streptomyces sp.
SirexAA-E]

Max Total
Score Score

Q.C
(%)

E.
value

509

509

61

4e-175

Max
Ident
(%)
95

433

433

54

2e-145

81

423

423

54

2e-141

77

409

409

54

4e-136

77

423

423

54

2e-141

77

Keterangan : No. Akses = nomor akses;max score = nilai maksimal; Total Score
= keseluruhan skor yang dibandingkan; Q.C = Quary Coverage; E.
value = nilai kepercayaan; dan iden = identitas/ kesamaan;

20
Deduksi asam amino penyandi gen xylanase galur S. costaricanus 45I-3
dengan gen xilanase keluarga 11 lainnya ditunjukkan pada Gambar 4. Daerah
yang ditandai dengan latar berwarna hitam menunjukkan kesamaan dari lima
asam amino yang dibandingkan, daerah dengan latar abu-abu menunjukkan
minimal ada 3 sekuen asam amino yang sama sedangkan huruf yang tidak
memiliki latar menunjukkan sekuen asam amino yang berbeda sama sekali dengan
sekuen asam amino lainnya. Sekuen asam amino yang digaris bawah
menunjukkan tingkat kesamaan tinggi.
S._c

MKI------- --GPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY
MKIRSRRERR PRGPLTSLFR GVCAVVLLAV GALTLPGAGI AGADTVITSN QTGTDNGYYY
---------- ---------- ------MLAL AVLAMPG--A ASADTVITSN QTGTNNGYYY
AHADT

Dokumen yang terkait

Dokumen baru

Sequences analysis of gene encoding extracellular xylanase in Streptomyces costaricanus 45I-3