Amobilisasi xilanase ekstraseluler dari Streptomyces sp. 45I-3

(1)

AMOBILISASI XILANASE EKSTRASELULER

DARI Streptomyces sp. 45I-3

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

(2)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Amobilisasi Xilanase Ekstraseluler dari Streptomyces sp. 45I-3 adalah karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Februari 2008

Niken Financia Gusmawati

(3)

ABSTRACT

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI. Immobilization of Extracellular Xylanase from Streptomyces sp. 45I-3. Under direction of ANJA MERYANDINI and TITI CANDRA SUNARTI.

Xylanases catalyze the hydrolysis of 1,4-β glycosidic bond from xylan into oligomers and xylose residues. Complete hydrolysis of xylan involves synergistic actions of endo-1,4-β-D-xylanase, 1,4-β-D-xylosidase, Exo-1,4-β-D-xylosidase,

α-D-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase, asetil xylan esterase, feroryl also p -coumaroyl esterases. Xylanolytic enzymes have potential applications in various industrial processes. Advantages of immobilized enzyme compared to free enzyme are: improving enzyme stability, reducing enzyme cost, easily for enzyme separation from the product, rapid to stop the reaction (or vice versa), reducing effluent disposal problems, and allowing development of a multienzymes reaction system. Purpose of this research was to immobilize and characterize the immobilized Streptomyces sp. 45I-3 xylanase from Kalimantan, using EudragitTM S100. Immobilization of xylanase was performed using 1 % EudragitTM S100 solution (w/v), with 5:1 volume ratio of xylanase and 1 % EudragitTM S100 (w/v). Characterization of immobilized xylanase were performed by determining pH optimum between 3.0–7.0, determining optimum temperature between 30–70 oC, determining termal stability at 30–70 oC for an hour, determining stability in birchwood xylan and corncob xylan for 7 hours, determining stability at temperature 40 oC and pH 5.0, hydrolisis of birchwood xylan and corncob xylan, also reusability of immobilized xylanase. The result indicated that activity of the immobilized xylanase decreased to 23.97%. Immobilized xylanase have optimum pH and temperature at 6.0 and 40 oC, also have termal stability at 30–40 oC for an hour, stabil in birchwood xylan and corncob xylan for 6 hours, have better stability in birchwood xylan than corncob xylan. Immobilized xylanase was stabil for 5 hours at 40 oC and pH 5.0. Specificity of immobilized xylanase on birchwood xylan yielded DP between 37–7, and on corncob xylan between 122 – 26. Immobilized xylanase could be reused, but its activity decreased to 52.38 % after 3 times application. Immobilized xylanase is suitable to produce various xylooligosaccharides. Keyword: xylanase, Streptomyces sp., immobilization and characterization

(4)

RINGKASAN

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI. Amobilisasi Xilanase Ekstraseluler Dari

Streptomyces sp. 45I-3. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TITI CANDRA

SUNARTI

Xilanase mengkatalisis hidrolisis ikatan β-1,4 glikosidik pada xilan menjadi oligomer dan xilosa. Pemecahan sempurna xilan memerlukan aktivitas sinergis dari endo-1,4-β-D-xilanase, 1,4-β-D-xilosidase, Ekso-1,4-β-D-xilosidase, α -D-glukuronidase, α-L-arabinofuranosidase, asetil xilan esterase, ferulil serta kumaroil esterase. Enzim xilanolitik memiliki potensi yang besar untuk diaplikasikan pada berbagai proses industri. Amobilisasi enzim memiliki kelebihan dibandingkan dengan enzim bebas yaitu dapat meningkatkan stabilitas enzim, mengurangi biaya pemakaian enzim, memudahkan pemisahan enzim dari produk dan larutan reaksi sehingga dapat menghentikan reaksi dengan cepat (atau vice versa), mengurangi masalah effluen, dapat digunakan berulang, dapat digunakan dalam proses sinambung, serta dapat digunakan dalam pengembangan sistem reaksi multienzim. Tujuan penelitian ini adalah untuk amobilisasi dan karakterisasi xilanase amobil yang dihasilkan oleh Streptomyces

sp. 45I-3 asal Kalimantan. Amobilisasi xilanase dilakukan dengan menggunakan matriks larutan EudragitTM S100 1 % (b/v) dengan rasio volume antara xilanase dan EudragitTM S100 1 % (b/v) adalah 5:1. Karakterisasi xilanase amobil dilakukan dengan menentukan pH optimum pada kisaran 3.0–7.0 dan suhu optimum pada kisaran 30–70 oC, mengukur stabilitas termal pada suhu 30–70 oC selama 1 jam, mengukur stabilitas pada xilan birchwood dan xilan tongkol jagung selama 7 jam, mengukur stabilitas pada suhu 40 oC dan pH 5.0, hidrolisis xilan birchwood dan xilan tongkol jagung, serta penggunaan berulang xilanase amobil. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa xilanase amobil mengalami penurunan aktivitas menjadi 23.97%, memiliki pH dan suhu optimum pada 6.0 dan 40 oC, memiliki stabilitas pada suhu 30–40 oC, pH 6.0 selama 1 jam, stabil pada xilan birchwood dan xilan tongkol jagung selama 6 jam pada pH 6.0 dan suhu 40 oC, serta lebih stabil pada xilan birchwood dibandingkan xilan tongkol jagung. Xilanase amobil stabil selama 5 jam pada suhu 40 oC dan pH 5.0. Spesifitas xilanase amobil terhadap xilan birchwood menghasilkan DP antara 37 – 7, dan pada xilan tongkol jagung antara 122 – 26. Xilanase amobil dapat digunakan berulang, namun terjadi penurunan aktivitas menjadi 52.38% setelah 3 kali penggunaan. Xilanase amobil memiliki potensi untuk diaplikasikan pada pembuatan beragam xilooligosakarida

(5)

Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008

Hak cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber.

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.

(6)

AMOBILISASI XILANASE EKSTRASELULER

DARI Streptomyces sp. 45I-3

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI

Tesis

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

(7)

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Tesis : Amobilisasi Xilanase Ekstraseluler Dari Streptomyces sp. 45I-3

Nama : Niken Financia Gusmawati

NIM : P055040121

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Anja Meryandini, MS. Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si.

Ketua Anggota

Diketahui Ketua Program Studi

Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.

(8)

(9)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini ialah “Amobilisasi Xilanase Ekstraseluler Dari

Streptomyces sp. 45I-3”.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Anja Meryandini, MS. dan Ibu Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si. selaku pembimbing, atas segala arahan, bimbingan dan fasilitas selama penelitian melalui Program Hibah Bersaing serta kepercayaan dan kesabaran dalam memberikan bimbingan selama penyelesaian penelitian ini, serta Bapak Dr. Ir. Khaswar Syamsu selaku penguji luar komisi, atas masukan dan saran-sarannya kepada penulis untuk kesempurnaan penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih yang tak terhingga kepada Ayahanda H. Gunadi dan Ibunda Hj. Subartini, Bapak Mustafa K.H. dan Ibu Nurduaya, suamiku M. Khairudin Zakky, anak-anakku Akbar Muazzam Zakky dan Alya Munawwarah Zakky beserta keluarga besar atas segala dukungan, motivasi dan do’anya kepada penulis.

Terima kasih penulis ucapkan kepada teman-teman PS Bioteknologi khususnya angkatan 2004, atas semua kerjasama dan persahabatannya semasa studi, teman-teman seperjuangan Mbak Ela, Bu Nunuk, Prima, Ozy, Bu It Jamilah, Wahyu, Besty, Tri dan Hasrul, serta teknisi di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi FMIPA IPB dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis PPSHB IPB, atas semua fasilitas laboratorium, kerjasama dan bantuannya selama penelitian. Semoga amal baik mereka mendapat pahala dari Allah SWT.

Akhir kata penulis harapkan bahwa tesis ini dapat bermanfaat.

Bogor, Februari 2008

(10)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Maret 1978 dari Ayah H. Gunadi, BE. dan Ibu Hj. Subartini, MM. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara.

Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMA Negeri 70 Jakarta Selatan pada tahun 1995. Pada tahun yang sama penulis diterima di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta melalui Jalur UMPTN. Penulis menyelesaikan studi strata satu pada tahun 2001.

Selama mengikuti perkuliahan jenjang S1, penulis menjadi asisten Laboratorium pada Laboratorium Mikrobiologi, Parasitologi, Taksonomi Tumbuhan, serta pada Laboratorium Taksonomi, Anatomi, Embriologi dan Histologi Hewan.

Tahun 2002 penulis diterima sebagai penyelia pada laboratorium budidaya rajungan PT. Phillips Seafoods Indonesia yang bekerjasama dengan Balai Besar Riset Budidaya Laut Gondol, Singaraja, Bali. Tahun 2003 penulis menjadi kepala laboratorium di PT. Phillips Seafoods Indonesia - Plant Pasuruan. Tahun 2004 melanjutkan pendidikan S2 pada Program Studi Bioteknologi (BTK) IPB. Tahun 2008 penulis menjadi cpns pada Pusat Riset Teknologi Kelautan, BRKP, Departemen Kelautan dan Perikanan RI.

(11)

AMOBILISASI XILANASE EKSTRASELULER

DARI Streptomyces sp. 45I-3

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

(12)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Bogor, Februari 2008

Niken Financia Gusmawati

(13)

ABSTRACT

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI. Immobilization of Extracellular Xylanase from Streptomyces sp. 45I-3. Under direction of ANJA MERYANDINI and TITI CANDRA SUNARTI.

(14)

RINGKASAN

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI. Amobilisasi Xilanase Ekstraseluler Dari

Streptomyces sp. 45I-3. Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan TITI CANDRA

SUNARTI

(15)

Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2008

Hak cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber.

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah.

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin Institut Pertanian Bogor.

(16)

AMOBILISASI XILANASE EKSTRASELULER

DARI Streptomyces sp. 45I-3

NIKEN FINANCIA GUSMAWATI

Tesis

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

(17)

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Tesis : Amobilisasi Xilanase Ekstraseluler Dari Streptomyces sp. 45I-3

Nama : Niken Financia Gusmawati

NIM : P055040121

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Anja Meryandini, MS. Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si.

Ketua Anggota

Diketahui Ketua Program Studi

Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.

(18)

(19)

PRAKATA

Streptomyces sp. 45I-3”.

Akhir kata penulis harapkan bahwa tesis ini dapat bermanfaat.

Bogor, Februari 2008

(20)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 Maret 1978 dari Ayah H. Gunadi, BE. dan Ibu Hj. Subartini, MM. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara.

(21)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ………..………...… xi

DAFTAR GAMBAR ………..……….. xii

DAFTAR LAMPIRAN ………..………... xiii

I. PENDAHULUAN ………...……….. 1

1.1. Latar Belakang ………...……... 1

1.2. Tujuan ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

2.1. Xilan ... 4

2.2. Enzim Xilanolitik ... 6

2.3. Streptomyces ... 8

2.4. Amobilisasi Xilanase ... 10

III. BAHAN DAN METODE ... 15

3.1 Waktu dan Tempat ... ... 15

3.2. Alat dan Bahan ... 15

3.3. Metode Penelitian ... 15

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22

4.1. Persiapan Ekstrak Kasar Xilanase ... 22

4.2. Penentuan Konsentrasi Larutan EudragitTM S100 ... 23

4.3. Penentuan Rasio Volume Xilanase dengan EudragitTM S100 1 % (b/v) ... 25 4.4. Pengujian pH Optimum ... 27

4.5. Pengujian Suhu Optimum ... 30

4.6. Pengujian Stabilitas Suhu ... 30

4.7. Stabilitas Xilanase Amobil pada Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung ... 31

(22)

4.9. Spesifitas Xilanase Amobil terhadap Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung ... 35 4.10. Penggunaan Berulang Xilanase Amobil ... 37 V. SIMPULAN DAN SARAN ... 39 5.1. Simpulan ... 39 5.2. Saran ... 39 DAFTAR PUSTAKA ... 40 LAMPIRAN ... 46

(23)

DAFTAR TABEL

Halaman 1. Amobilisasi Berbagai Xilanase dengan EudragitTM ……..…... 13 2. Komposisi Media Agar-Agar Xilan ... 16 3. Bahan yang digunakan dalam Penentuan Aktivitas Xilanase ... 51

(24)

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Struktur Kompleks Xilan pada Tanaman ……….. 5 2. Metode Amobilisasi Enzim ……….. 10 3. Struktur Kimia EudragitTM ...……… 13 4. Regulasi Biosintesis Xilanase ……… 22 5. Pengaruh Konsentrasi Larutan EudragitTM S100 terhadap Efektivitas

Imobilisasi ... 24 6. Proses Ionisasi Polimer Anionik EudragitTM S100 ... 25 7. Pengaruh Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar dengan Larutan

EudragitTM S100 1 % (b/v) terhadap Efektivitas Imobilisasi ... 26 8. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase Amobil dan Xilanase Bebas

Menggunakan Bufer Sitrat Fosfat 0.02 M dan Bufer Fosfat 0.02 M .... 28 9. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase ... 30 10. Pengaruh Suhu terhadap Stabilitas Xilanase Setelah Penyimpanan

1 Jam ... 31 11. Stabilitas Xilanase Amobil dan Xilanase Bebas pada Substrat Xilan

Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung ... 32 12. Mekanisme Pengikatan Enzim-Substrat Model Induced Fit ... 34 13. Stabilitas Xilanase Amobil pada Suhu 40 oC dan pH 5.0 ……….. 35 14. Gula Pereduksi dan Derajat Polimerisasi yang Dihasilkan Xilanase

Amobil dan Xilanase Bebas dengan Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung 1 % (b/v) ...

(25)

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Komposisi Bufer Pencuci pada Pembuatan Xilanase Amobil ... 47 2. Prosedur Pengujian Aktivitas Xilanase ... 48 3. Prosedur Pengujian Kadar Protein ... 52 4. Prosedur Penentuan Total Gula ... 54 5. Morfologi Streptomyces sp. 45I-3 ... 56 6. Data Pengaruh Konsentrasi Larutan EudragitTM S100 terhadap

Efektivitas Imobilisasi ... 57 7. Data Pengaruh Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar dengan

Larutan EudragitTM S100 1 % (b/v) terhadap Efektivitas Imobilisasi 58 8. Data Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase Amobil dan Xilanase

Bebas Menggunakan Bufer Sitrat Fosfat 0.02 M dan Bufer Fosfat 0.02 M ...

9. Data Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase ... 60 10. Data Pengaruh Suhu terhadap Stabilitas Xilanase Setelah

Penyimpanan 1 Jam ... 61 11. Data Total Gula, Gula Pereduksi dan Derajat Polimerisasi Hasil

Hidrolisis Xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 terhadap Substrat Xilan Oat Spelt 0.5 % (b/v) ………..

12. Data Stabilitas Xilanase Amobil dan Xilanase Bebas pada Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung ... 63 13. Data Stabilitas Xilanase Amobil pada Suhu 40 oC dan pH 5.0 ... 64 14. Data Spesifitas Xilanase Amobil terhadap Substrat Xilan Birchwood

dan Xilan Tongkol Jagung ... 65 15. Data Total Gula, Gula Pereduksi dan Derajat Polimerisasi Hasil

Hidrolisis Xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 terhadap Substrat Xilan Tongkol Jagung 1.0 % (b/v) ………..

16. Data Penggunaan Berulang Xilanase Amobil ... 67

(26)

I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Hemiselulosa adalah heteropolimer polisakarida yang keberadaaannya di alam kedua terbanyak setelah selulosa. Kandungan hemiselulosa pada tanaman berkisar antara 20–30 % berat kering kayu (Kulkarni et al. 1999, Perez et al. 2002), sedangkan pada daun kadarnya dapat mencapai 80–85 % (Howard et al. 2003). Kadar xilan pada tanaman tahunan mencapai 30 %, pada kayu keras 15–30 % dan pada kayu lunak 7–10 % dari berat kering (Subramaniyan dan Prema 2002).

Xilan, sebagai komponen utama dari hemiselulosa, memiliki rantai utama berupa D-xilopiranosa dengan ikatan glikosidik β-1,4. Residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukuronat terikat pada rantai utama xilan. Xilan sering kali berada dalam bentuk terasilasi yang berakibat sulit untuk didegradasi oleh xilanase. Degradasi lengkap dari struktur xilan yang kompleks menjadi monomernya memerlukan kerja sinergi dari beberapa enzim xilanolitik (Subramaniyan dan Prema 2002).

Xilanase merupakan golongan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan β-1,4 glikosidik dari xilan menjadi berbagai monomer-monomer gula penyusunnya. Enzim-enzim xilanolitik meliputi endo-β-1,4-xilanase, β-xilosidase dan beberapa enzim pemutus rantai cabang xilan yaitu α-L-arabinofuranosidase,

α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam fenolat (asam ferulat dan asam kumarat) esterase.

Xilanase bermanfaat untuk berbagai aplikasi industri terutama untuk meningkatkan kualitas kertas dan mengurangi penggunaan klorin yang dapat mencemari lingkungan(biobleaching) dalam industri pulp dan kertas, biokonversi berbagai limbah pertanian, peningkatan daya cerna makanan ternak, ekstraksi kopi dan minyak nabati serta kombinasinya bersama selulase dan pektinase dapat digunakan untuk penjernihan sari buah dan likuifikasi buah atau sayuran (Kansoh dan Nagieb 2004, Subramaniyan dan Prema 2002).

Xilanase dihasilkan oleh bakteri, cendawan, aktinomiset dan khamir.

Bacillus, Trichoderma, Aspergillus serta Streptomyces diketahui merupakan penghasil xilanase yang potensial (Kulkarni et al. 1999, Subramaniyan dan Prema 2002). Streptomyces adalah bakteri Gram positif yang terutama hidup di tanah, memiliki kandungan G+C tinggi dan morfologinya menyerupai jamur.

(27)

Streptomyces berperan penting dalam proses daur ulang senyawa organik di alam dan diketahui dapat menghasilkan berbagai macam enzim seperti selulase, xilanase, kitinase, amilase dan protease (Hayakawa 2003).

Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian program hibah bersaing, dimana pada tahun pertama telah dikarakterisasi empat xilanase yang dihasilkan bakteri Aktinomiset asal Indonesia yang diduga memiliki potensi untuk dikomersialkan, salah satunya yang digunakan pada penelitian ini yaitu isolat

Streptomyces sp. 45I-3, yang merupakan isolat bakteri asal Kalimantan. Hasil zimogram menunjukkan bahwa isolat ini memiliki tiga pita protein aktif, yaitu 16.37 kDa, 14.39 kDa dan 12.65 kDa. Pengukuran hasil hidrolisis mengunakan HPLC menunjukkan produk dominan xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 adalah xilosa. Selain itu, aktivitas optimum xilanase dicapai pada pH 5.0 dan suhu 50 oC, stabil pada kisaran pH luas, relatif stabil pada suhu yang tinggi dan tahan pada penyimpanan suhu 4 oC selama 1 bulan.

Dengan dukungan dana dari DIP SEAMEO BIOTROP dilakukan penelitian untuk produksi xilooligosakarisa dari xilan tongkol jagung sebagai dietary fiber

menggunakan xilanase tersebut. Xilooligosakarida dapat dihasilkan oleh xilanase isolat Streptomyces sp. 45I-3 dengan menggunakan konsentrasi substrat xilan jagung 1 % (b/v) dengan waktu hidrolisis empat jam. Nilai derajat polimerisasi menunjukkan bahwa xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 adalah endo-1,4-β -xilanase. Hal ini sesuai dengan hasil pemurnian xilanase yang dilakukan pada tahun kedua dengan menggunakan substrat spesifik.

Pada penelitian ini, yang merupakan penelitian tahun ketiga, dilakukan amobilisasi dari xilanase isolat Streptomyces sp. 45I-3 yang potensial tersebut. Hal ini dilakukan karena enzim amobil memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan enzim bebas yaitu mengurangi biaya pemakaian enzim, memudahkan pemisahan enzim dari produk dan larutan reaksi sehingga dapat menghentikan reaksi dengan cepat (atau vice versa), mengurangi masalah effluen, serta dapat digunakan berulang, dapat digunakan dalam proses sinambung, dapat digunakan dalam pengembangan sistem reaksi multienzim, dan pada beberapa kasus, dapat meningkatkan stabilitas (Shuler dan Kargi 2002).

(28)

1.2. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan amobilisasi dan karakterisasi enzim xilanase amobil yang dihasilkan oleh Streptomyces sp. 45I-3 asal Kalimantan. Amobilisasi xilanase dilakukan dengan menggunakan matriks EudragitTM S 100.

(29)

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Xilan

Lignoselulosa merupakan komponen utama biomassa yang mencakup sekitar setengah dari bahan hasil fotosintesis. Lignoselulosa mengandung tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin yang tersusun secara kuat dan secara kimia berikatan melalui ikatan non-kovalen dan ikatan silang kovalen. Selulosa dan hemiselulosa merupakan molekul makro dari gula yang berbeda dan lignin adalah polimer aromatik yang disintesis dari prekursor fenilpropanoid. Komposisi dan persentase masing-masing polimer ini bervariasi antara berbagai jenis tanaman. Komposisinya pada suatu tanaman bergantung pada umur tanaman, fase pertumbuhan tanaman dan kondisi lainnya (Perez et al. 2002).

Hemiselulosa merupakan komplek polimer karbohidrat yang menyusun sekitar 25–30 % berat kering total kayu. Hemiselulosa termasuk suatu polisakarida dengan berat molekul yang lebih rendah dari selulosa. Hemiselulosa terdiri atas monomer-monomer gula, antara lain: xilosa, manosa, D-galaktosa, D-glukosa, L-arabinosa, asam 4-O-metil glukuronat, asam D-galakturonat dan asam D-glukuronat. Monomer-monomer gula tersebut dihubungkan melalui ikatan β-1,4-glikosidik dan ikatan β-1,3-glikosidik. Komponen utama hemiselulosa kayu keras adalah glukuronoxilan dan pada hemiselulosa kayu lunak komponen utamanya adalah galaktomanan. Perbedaan utama hemiselulosa dengan selulosa adalah hemiselulosa memiliki percabangan dengan rantai lateral pendek yang terdiri atas gula yang berbeda. Berbeda dengan selulosa, hemiselulosa merupakan polimer yang mudah dihidrolisis, tidak membentuk agregat meskipun hemiselulosa diko-kristalisasi dengan rantai selulosa (Perez et al. 2002).

Xilan pada tanaman terletak antara lignin dan kumpulan serat-serat selulosa di bagian bawah. Konsisten dengan struktur kimia dan substitusi rantai sampingnya, xilan terlihat berselang-seling, tersusun dan terikat secara kovalen pada berbagai titik dengan lapisan ‘sarung’ lignin, serta membentuk mantel yang menyelubungi rantai-rantai selulosa melalui ikatan hidrogen. Lapisan xilan dengan ikatan kovalennya pada lignin dan interaksi non-kovalennya dengan selulosa penting dalam pemeliharaan integritas selulosa in situ dan membantu melindungi serat-serat tersebut dari degradasi oleh selulase (Beg et al. 2001).

(30)

Cincin-α-O -metil-D-asam glukuronat

Ac : gugus asetil R-H : asam p-kumarat R-OCH3 : asam ferulat Cincin D-xilopiranosa

ENDOXILANASE

α- L- ARABINO-

FURANOSIDASE

β-XILOSIDASE

Ikatan β-1,4-D-xilopiranosa

ASETIL-XILAN ESTERASE

Ikatan α -1,3-L-arabinofuranosa

FERULIL dan

p-KUMAROIL

ESTERASE

Ikatan _α-1,2-4-O -metil-D-asam glukuronat

α-GLUKURONIDASE

Gambar 1. Struktur Kompleks Xilan pada Tanaman (Beg et al. 2001)

Xilan merupakan suatu komplek heteropolisakarida yang terdiri atas rantai utama β-xilopiranosa yang tersusun oleh gugus xilosa dan dihubungkan oleh ikatan β-1,4-glikosidik. Xilan dapat dibedakan menjadi linier homoxilan, arabinoxilan, glukuronoxilan dan glukuronoarabinoxilan. Selain xilosa, xilan juga tersusun dari arabinosa, asam glukuronat atau 4-β-metil ester, asam asetat, asam ferulat, dan asam ρ-kumarat, seperti tersaji pada Gambar 1. Frekuensi dan komposisi percabangan xilan tergantung pada sumber xilannya (Beg et al. 2001, Saha 2003)

Xilan berbeda komposisinya tergantung sumber tanamannya seperti dari rumput-rumputan, sereal, kayu lunak maupun kayu keras. Rice bran neutral xylan

mengandung 46 % xilosa, 44.9 % arabinosa, 6.1 % galaktosa, 1.9 % glukosa dan 1.1 % asam anhidronik. Wheat arabinoxylan mengandung 65.8 % xilosa, 33.5 % arabinosa, 0.1 % manosa, 0.1 % galaktosa dan 0.3 % glukosa. Corn fiber xilan adalah salah satu komplek heteroxilan yang terdiri atas gugus xilosa dengan ikatan β-1,4 yang memiliki komposisi 48–58 % xilosa, 33–35 % arabinosa, 5–11 % galaktosa dan 3–6 % asam glukuronat (Saha 2003).

(31)

Potensi aplikasi bioteknologi xilan dan xilanase menarik perhatian para peneliti. Produk akhir utama dari xilan yang dianggap penting saat ini adalah furfural dan xilitol. Xilan yang terhidrolisis akan menjadi xilosa, yang apabila mengalami dehidrasi akan menjadi furfural, sedangkan proses hidrogenasi menyebabkan pembentukan xilitol. Produksi furfural utamanya diperoleh dari limbah pertanian sedangkan xilitol dihasilkan dari limbah kayu. Produk hasil hidrolisis xilan (xilosa dan xilooligosakarida) banyak diaplikasikan dalam industri makanan sebagai bahan pengental dan sebagai substitusi lemak serta sebagai bahan tambahan pangan untuk anti beku. Xilan dalam industri farmasi digunakan sebagai agen ‘direct tabletting’ dan dalam kombinasi dengan komponen lain dapat digunakan untuk menunda peluruhan tablet. Produk hasil hidrolisis xilan dapat juga dikonversi secara bertahap menjadi bahan bakar cair, protein sel tunggal, pelarut dan pemanis buatan rendah kalori (Kulkarni et al. 1999).

2.2. Enzim Xilanolitik

Berdasarkan heterogenitas dan struktur kompleksnya, hidrolisis xilan secara lengkap memerlukan berbagai golongan enzim xilanolitik yang berbeda. Jadi tidak mengherankan jika sel pendegradasi xilan menghasilkan suatu komplek protein pendegradasi polimer. Sistem enzim xilanolitik menghidrolisis xilan, yaitu: endo-1,4-β-xilanase, β-xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, asetil xilan esterase, α-glukuronidase, dan asam fenolat (asam ferulat dan asam

ρ-kumarat) esterase. Seluruh enzim-enzim ini berperan secara bersama-sama untuk mengkonversi xilan menjadi berbagai konstituen gula (Beg et al. 2003).

Endo-1,4-β-xilanase (1,4-β-D-xilan xilanohidrolase E.C. 3.2.1.8) mendepolimerisasi xilan melalui hidrolisis rantai utama xilan secara acak. Endoxilanase dilaporkan membebaskan xilosa selama hidrolisis xilan tetapi tidak

memiliki aktifitas untuk xilobiosa yang dengan mudah dihidrolisis oleh

β-xilosidase. Endoxilanase terutama dihasilkan oleh mikroorganisme yaitu bakteri dan fungi (Subramaniyan dan Prema 2002).

1,4-β-D-xilosidase (1,4,β-D-xilan xilohidrolase E.C. 3.2.1.37) menghidrolisis rantai utama xilan dan membaginya menjadi beberapa oligosakarida. Beberapa

kajian melaporkan bahwa Bacillus sp. dan beberapa fungi menghasilkan

(32)

Ekso-1,4-β-xilosidase (1,4-β-D-xilan xilohidrolase, EC 3.2.1.37) mengkatalisis hidrolisis 1,4-β-D-xilo-oligosakarida melalui pelepasan secara berturut-turut gugus D-xilosa dari bagian ujung non reduksinya.

Kelompok rantai samping dibebaskan melalui hidrolisis xilan oleh

α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, galaktosidase, dan asetil xilan esterase (Gambar 1). α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) menghidrolisis bagian terminal dan non pereduksi gugus α-L-arabinofuranosil pada arabinan, arabinoxilan dan arabinogalaktan. Sejumlah mikroorganisme termasuk fungi,

aktinomiset dan bakteri yang lainnya dapat menghasilkan

α-L-arabinofuranosidase (Subramaniyan dan Prema 2002).

Enzim α-D-glukuronidase (EC 3.2.1.1) dibutuhkan untuk menghidrolisis ikatan 1,2-α-glikosidik antara xilosa dengan asam D-glukuronat atau ikatan 4-O-metil eter (Gambar 1). Hidrolisis ikatan 1,2-α merupakan rantai utama dalam hidrolisis enzimatik xilan dan dilaporkan α-D-glukuronidase memiliki kebutuhan substrat yang berbeda. Serupa dengan ikatan lignin karbohidrat, ikatan 4-O-metil asam glukuronat membentuk suatu penghalang dalam degradasi kayu. Sejumlah mikroorganisme dilaporkan dapat menghasilkan α-D-glukuronidase (Subramaniyan dan Prema 2002).

Hidrolisis secara lengkap glukuronoxilan memerlukan esterase untuk melepaskan ikatan asam asetat dan asam fenolat (Gambar 1). Esterase memutuskan ikatan xilosa dengan asam asetat (asetil xilan esterase EC 3.1.1.6), gugus rantai samping arabinosa dengan asam ferulat (feruloil esterase) dan gugus rantai samping arabinosa dengan asam ρ-kumarat (ρ-kumaroil esterase). Pemecahan grup asetil, feruloil dan ρ-kumaroil dari xilan sangat membantu dalam menghilangkan lignin, yaitu dengan memutuskan ikatan ester antara lignin dan hemiselulosa sehingga meningkatkan kelarutan lignin. Esterase bersama dengan xilanase dan enzim pendegradasi xilan yang lain pada biobleaching pulp, dapat secara sebagian mengganggu dan melonggarkan struktur dinding sel (Subramaniyan dan Prema 2002).

Menurut Beg et al. (2001), saat ini enzim xilanolitik mendapat perhatian terutama karena memiliki potensi yang besar untuk diaplikasikan pada berbagai industri. Beberapa aplikasi xilanase diantaranya adalah :

1. Xilanase digunakan untuk konversi xilan menjadi xilosa pada air limbah pada industri makanan dan hasil pertanian, serta memberikan prospek baru dalam penanganan limbah hemiselulosik.

(33)

2. Xilanase bersama dengan selulase dan pektinase dimanfaatkan untuk menjernihkan sari buah, ekstraksi kopi, minyak nabati dan pati, likuifikasi buah dan sayuran.

3. α-L-Arabinosidase dan β-D-glukopiranosidase digunakan untuk memberikan aroma pada jus anggur yang belum difermentasi (must), minuman anggur (wine) dan jus buah.

4. Xilanase bersama dengan enzim lain, seperti mananase, ligninase, xilosidase, glukanase, glukosidase dan lain-lain, dapat digunakan untuk menghasilkan bahan bakar nabati (biofuel) seperti etanol, serta xilitol dari bahan berlignoselulosa. Proses produksi bahan bakar etanol memerlukan delignifikasi lignoselulosa untuk melepaskan selulosa dan hemiselulosa dari kompleks lignoselulosa yang diikuti dengan depolimerisasi polimer karbohidrat (selulosa dan hemiselulosa) untuk menghasilkan gula, kemudian dilanjutkan dengan proses fermentasi campuran pentosa dan heksosa untuk menghasilkan etanol.

2.3. Streptomyces

Berbagai macam mikroba, baik bakteri, cendawan, aktinomiset dan khamir dilaporkan mampu menghasilkan xilanase. Bakteri dari genus Bacillus, cendawan dari genus Trichoderma dan Aspergillus, aktinomiset dari genus Streptomyces

diketahui merupakan mikroba berpotensi penghasil xilanase. Pada mikroba patogen tanaman, β-xilanase bersama dengan selulase diketahui berperan penting pada proses invasi awal.

Aktinomiset diklasifikasikan dalam domain Bacteria, phylum Actinobacteria, kelas Schizomycetes dan Ordo Actinomycetales dengan genus Streptomycetes

saat ini sebagai satu-satunya anggota famili Streptomycetaceae. Aktinomiset merupakan mikroba uniseluler yang dikelompokkan ke dalam bakteri Gram positif dengan DNA yang kaya kandungan basa G dan C sekitar 57–75 %. Aktinomiset, terutama genus Streptomycetes, banyak mendapat perhatian untuk diteliti karena kemampuannya dalam menghasilkan berbagai senyawa metabolit antara lain: antibiotik, enzim, inhibitor enzim, biopigmen dan immunomodifier (Hayakawa 2003, Lo et al. 2002).

Aktinomiset memiliki diferensiasi morfologi yang unik dalam siklus hidupnya dimulai dengan spora berkecambah membentuk miselium vegetatif diikuti

(34)

pembentukan hifa yang masuk ke dalam medium. Hifa aerial terbentuk pada permukaan medium dan mengalami fragmentasi menghasilkan spora. Diferensiasi rantai spora nampak seperti pada hifa aerial yang berhubungan dengan produksi metabolit sekunder dan tidak berfungsi langsung bagi pertumbuhan Aktinomiset. Morfologi Aktinomiset (kelompok prokariot) dan cendawan (kelompok eukariot) mirip dalam hal bentuk koloni, tumbuhnya miselium dan adanya spora tetapi miselium cendawan lebih tebal daripada miselium Aktinomiset (Miyado 2003).

Aktinomiset mudah dibedakan dari bakteri lain dilihat dari bentuk koloninya di medium padat. Koloni Aktinomiset keras seperti tumbuh akar dalam medium agar-agar sedangkan bakteri lain koloninya lunak. Koloni Aktinomiset bentuknya bulat cembung dengan tepian rata dan tidak beraturan dengan permukaan bertepung, licin, kasar atau keriput. Keistimewaannya berupa hifanya yang bersifat hidrofobik tetapi miselium vegetatifnya bersifat hidrofilik (Miyado 2003).

Identifikasi Aktinomiset dapat dikelompokkan menjadi Streptomyces dan non-Streptomyces dengan cara membedakan morfologi dan analisis komponen dinding sel asam diaminopimelat (A2pm atau DAP). Pengamatannya meliputi ada tidaknya hifa, miselium, spora, rantai spora atau sporangium. Genus

Streptomyces umumnya tumbuh subur, membentuk banyak sekali hifa bercabang, miselium substrat jarang yang bersekat, miselium aerial cepat matang membentuk spora dari pucuk belahannya dan membentuk rantai spora panjang (> 50 spora) yang menggulung. Selain itu kondisi biakan yang bervariasi, warna hifa dan miselium yang bermacam-macam, penggunaan berbagai karbohidrat, model sporulasi (vertisilata atau tidak), morfologi rantai spora (lurus sampai lentur, melengkung, berputar atau spiral) dan permukaan spora (halus, berbintil-bintil, berduri, berambut, rugose atau knobby) juga dapat digunakan untuk standar taksonomi sampai tingkat spesies (Miyado 2003).

Genus Streptomyces banyak ditemukan pada berbagai habitat seperti tanah, laut, sungai dan udara, tetapi ada beberapa isolat berperan sebagai patogen pada manusia, hewan dan tanaman. Populasi Aktinomiset pada tanah rizosfer (sekitar perakaran) rumput mendekati 40 % dari total mikroflora tanah. Keberadaan Aktinomiset tergantung kondisi tanahnya terutama kandungan bahan organik dan pH tanahnya sebagai habitat hidupnya. Aktinomiset terutama hidup pada lingkungan dengan pH cukup tinggi (6.5 – 8.0) dengan kondisi tanah setengah kering sampai kering. Pertumbuhan optimum Aktinomiset tercapai pada

(35)

kondisi pH netral dengan suhu 25–35 oC, tetapi ada juga yang dapat tumbuh pada kisaran suhu 45–55 oC. Aktinomiset umumnya tergolong bakteri aerob yang bersifat saprofit, dorman dalam bentuk spora yang akan berkembang menjadi miselium apabila nutrisi, suhu, kelembaban dan kondisi lainnya sesuai dengan syarat tumbuhnya (Alexander 1961; Hasim 2003; Miyado 2003).

Meskipun terdapat perbedaan pada kondisi pertumbuhan mikroba (seperti pH, agitasi, aerasi) dan kondisi aktivitas optimum xilanase, namun terdapat beberapa kesamaan pada biologi molekuler dan biokimia xilanase mikroba prokariotik dan eukariotik (Subramaniyan dan Prema 2002).

2.4. Amobilisasi Xilanase

Amobilisasi enzim merupakan suatu metode untuk menempatkan atau melokalisasi enzim dalam suatu ruang tertentu tanpa kehilangan aktivitas katalitiknya.

Mikroenkapsulasi Di antara membran

makroskopik

Dengan matriks Dengan enzim

Pengikatan secara kovalen Penjerapan

dalam matriks

Adsorbsi

(fisik atau ionik)

Penjerapan dengan membran

Penjerapan Pengikatan

Enzim Bebas

(36)

Metode amobilisasi yang digunakan dapat diklasifikasi menurut Worsfold (1995), sebagai berikut:

1. Penjerapan (entrapment)

Penjerapan enzim di dalam matriks (tipe lattice) maupun membran, yaitu tipe mikroenkapsulasiatau penjerapan diantara membran makroskopik.

2. Pengikatan (bounding)

Pengikatan enzim dengan ikatan kovalen, yaitu pengikatan enzim dengan matriks serta pengikatan silang antar enzim (cross linking), maupun pengikatan enzim dengan matriks secara adsorpsi (ikatan fisik atau ionik).

Pada metode amobilisasi dengan penjerapan tipe lattice, enzim tetap bebas dalam larutan tetapi dibatasi pergerakannya di dalam struktur berpori dari suatu matriks polimer yang berikatan silang dan tidak larut dalam air. Berbeda dengan penjerapan di dalam matriks, penjerapan dengan membran membatasi pergerakan enzim di antara membran makroskopik atau di dalam membran polimer semi permeabel. Kedua struktur ini tetap memungkinkan aliran substrat, kofaktor dan produk. Kelemahan utama dari metode ini adalah adanya kemungkinan keluarnya enzim dari struktur secara lambat selama pemakaian sinambung, serta adanya pembatasan difusional dan hambatan sterik terutama ketika menggunakan substrat protein dan pati. Enzim dapat dijerap dalam polimer alami seperti agar, agarose, gelatin, alginat dan karagenan, polimer sintetik seperti gel poliakrilamid, resin photo-crosslinkable, prepolimer poliuretan dan polimer akrilik, ataupun hidrogel albumin-poli etilen glikol (Rosevear et al.

2005b).

Pada amobilisasi enzim dengan adsorpsi, enzim terikat pada matriks melalui interaksi antar permukaan dengan gaya elektrostatik seperti gaya van der Waals, interaksi ionik dan ikatan H serta gaya hidrofobik, yang umumnya lemah tetapi memberikan banyak kemungkinan terjadinya pengikatan pada permukaan. Metode ini mudah, murah, reversibel dan amobilisasi dapat dilakukan dengan cepat. Oleh karena adsorpsi memanfaatkan interaksi permukaan antara enzim dan matriks, maka metode ini tidak membutuhkan aktivasi atau modifikasi dengan bahan kimia sehingga tidak menyebabkan perubahan kimia terhadap enzim maupun matriks. Kelemahan dari metode adsorpsi adalah kemungkinan terjadinya desorpsi atau lepasnya enzim dari matriks, terjadinya pembatasan

(37)

difusional dan transfer massa akibat dari pengikatan non-spesifik substrat, kofaktor atau kontaminan pada matriks, kemungkinan berlebihnya kapasitas enzim yang teradsorpsi pada matriks, serta penghambatan sterik oleh bahan penyusun matriks. (Rosevear et al. 2005a).

Metode amobilisasi dengan pengikatan kovalen berdasar pada pembentukan ikatan kovalen antara gugus fungsional pada matriks dan enzim. Gugus fungsional pada enzim tersebut adalah gugus amino (NH2) pada lisin dan

arginin, gugus karboksil (COOH) pada aspartat dan glutamat, cincin fenol pada tirosin, gugus tiol pada sistein, gugus hidroksil (OH) pada serin dan treonin, gugus imidazil pada histidin, serta gugus indol pada triptofan (Goel 1994). Kelebihan metode ini adalah bersifat stabil yang mencegah elusi enzim ke dalam cairan reaksi, serta memiliki berbagai pilihan matriks dan metode ikatan yang memberikan fleksibilitas dalam mendisain enzim amobil dengan karakteristik fisik dan kimia yang spesifik. Metode pengikatan kovalen merupakan metode yang relatif mahal dan memiliki prosedur yang rumit. Situs aktif dapat mengalami modifikasi akibat reaksi kimia yang digunakan untuk membentuk ikatan kovalen. Aktivitas enzimatis dapat menurun karena enzim terpapar lingkungan yang buruk dan bahan kimia (Kim 2005).

Amobilisasi enzim dapat dilakukan dengan ikatan silang antar molekul enzim (cross linking) membentuk struktur 3-D yang besar tanpa matriks, secara kimia (ikatan kovalen) atau fisik (flokulasi). Metode ini mahal dan tidak efisien karena beberapa molekul enzim dijadikan sebagai matriks/support sehingga aktivitas enzimatisnya relatif rendah. Umumnya, metode ini digunakan bersama dengan metode amobilisasi enzim yang lain, misalnya untuk mencegah hilangnya enzim dari gel poliakrilamid atau menstabilkan enzim teradsorbsi (Rosevear et al. 2005a).

Dibandingkan dengan enzim bebas, enzim amobil memiliki kelebihan yaitu peningkatan stabilitas, pemanenan dan purifikasi produk yang lebih mudah, dapat dipakai berulang dan dapat digunakan dalam proses teknologi yang sinambung (Zubriene et al. 2003). Penggunaan kembali enzim dapat mengurangi biaya dan menyederhanakan proses secara global (Ai et al. 2005). Pemisahan enzim dari produk dan larutan reaksi lebih mudah sehingga dapat menghentikan reaksi dengan cepat (atau vice versa), mengurangi masalah effluen, dan dapat digunakan dalam pengembangan sistem reaksi multienzim (Kim 2005). Enzim

(38)

amobil banyak dimanfaatkan pada produksi industrial, pengolahan limbah dan pengobatan penyakit, dengan berbagai aplikasi (Cano et al. 2006).

Amobilisasi xilanase dengan metode kovalen telah dilakukan sebelumnya pada matriks polimer, seperti polivinil alkohol (PVA) (Rao dan Misra 1984) atau membran polisulfon (Cano et al. 2006), dan secara non kovalen menggunakan manik-manik silika serta hidrogel (Dumitriu dan Chornet 1997), polyurethane foam (Haapala 1994), manik-manik gelas berpori (Simpson et al. 1991) atau kain nilon (Gawande dan Kamat 1998a). Amobilisasi xilanase dapat pula dilakukan pada polimer terlarut-tidak terlarut secara reversibel, seperti EudragitTM S100 (Sardar et al. 2000, Gawande dan Kamat 1998b).

Tabel 1. Amobilisasi berbagai Xilanase dengan EudragitTM

Xilanase dari Matriks

Amobilisasi Referensi

Xilanase komersial PectinexTM 3XL (Novo Nordisk Ferment. Ltd. Switzerland)

EudragitTMS 100 Tyagi et al. 1998

Aspergillus sp. 5 dan

Aspergillus sp. 44 Eudragit

S 100 Gawande dan Kamat 1998b

Aspergillus niger EudragitTM L 100 Sardar et al. 2000

Thermomyces lanuginosus SSBP EudragitTM S 100 Edward et al. 2002

Melanocarpus albomyces IIS 68 EudragitTM L 100 Roy et al. 2003

Scytalidium thermophilum EudragitTM L 100 Gaur et al. 2005

Streptomyces olivaceoviridis E-86 EudragitTM S 100 Ai et al. 2005

EudragitTM S100 adalah produk polimer enterik dari Rohm Pharma GmbH (Weiterstadt, Jerman) dan merupakan kopolimer anionik yang tersusun oleh metil metakrilat dan asam metakrilat, dengan berat molekul 135 kDa yang kelarutannya tergantung pada pH. Rasio gugus karboksil terhadap gugus ester pada polimer adalah 1:2 (Anonim 2004).

(39)

EudragitTM S100 memiliki karakter yang menarik sebagai matriks amobilisasi protein, yaitu harganya relatif murah, mudah didapatkan, tidak bersifat toksik (biasa digunakan untuk salut tablet dan pil pada industri farmasi) serta larut dalam air. Polimer ini menunjukkan interaksi non spesifik yang minimal, dan pengikatan yang disebabkan oleh interaksi afinitas (Gawande dan Kamat 1998b).

Matriks EudragitTM S100 dapat digunakan dalam bentuk terlarut pada reaksi yang diinginkan, sehingga dapat mengurangi hambatan transfer massa dan hambatan sterik seperti yang terjadi pada matriks yang tidak larut (Gawande dan Kamat 1998b). Dengan sifat ketidak larutannya pada pH dibawah 4.0, enzim mudah di-recovery dari proses katalisis dengan menurunkan pH (Roy et al.

2003), sehingga dapat memfasilitasi hidrolisis dengan lebih baik pada substrat yang tidak larut (Ai et al. 2005).

Polimer EudragitTM S100 merupakan polimer yang cerdas atau responsif terhadap stimulus, yang memberikan respon terhadap perubahan lingkungannya dengan perubahan dramatis pada karakter fisiknya. Polimer EudragitTM S100 bersifat larut-tidak larut secara reversibel pada media cair dan membentuk hidrogel. Hidrogel merupakan jaringan polimer hidrofilik yang meluas atau mengembang dengan menyerap 10 – 20 % sampai ribuan kali berat keringnya di dalam air. Hidrogel ini terikat dengan gaya non kovalen dan memiliki struktur yang tidak homogen, yaitu memiliki domain hidrofilik dan hidrofobik. Ketika penyerapan air, hidrasi terjadi pertama pada bagian hidrofilik (air terikat primer), kemudian pada situs hidrofobik (air terikat sekunder) dan pada ruang antara rantai dan pori-pori (air bebas) (Roy dan Gupta 2003).

(40)

III. BAHAN DAN METODE

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan dari bulan November 2006 sampai dengan Januari 2008. Penelitian bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas MIPA dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, PPSHB, Institut Pertanian Bogor.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu spektrofotometer (Metertek), inkubator bergoyang (Certomat WR), sentrifus (Beckman GPR), stirer magnetik (RCH-3 Eyela), timbangan analitik (Ohaus AS200), vortex (VWR K-550-G), pipet mikro (Finnpipette), penangas air (TZ4ST Autonics), pH meter (HANNA), laminar air flow (Gelaire BSB4A), autoklaf (TOMY SS-245), pengaduk bermagnet, dan alat-alat gelas.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu isolat

Streptomyces sp. 45I-3 asal Kalimantan (koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Departemen Biologi, FMIPA IPB), Substrat Xilan Birchwood (Sigma), Sukrosa, Ekstrak Khamir, Agar-agar, DNS (3,5–Asam Dinitrosalisilat), K-Na-Tartrat, NaOH, Na2SO3, Coomassie Brilliant Blue G-250, Etanol 95 %, Asam Fosfor 85 %,

Na2HPO4, NaH2PO4, Asam Sitrat, NaCl, Xilosa, BSA (Bovine Serum Albumine),

Matriks Amobilisasi EudragitTM S100 (Rohm Pharma) dan Akuades. Bahan kimia tersebut dari MerckTM (kecuali yang disebutkan) dan berkualitas pro analisa.

3.3. Metode Penelitian

3.3.1. Preparasi Ekstrak Kasar Xilanase

Isolat Streptomyces sp. 45I-3 diremajakan pada cawan petri berisi media agar-agar xilan (Tabel 2), diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari sampai terbentuk spora. Produksi enzim xilanase dilakukan dengan cara menginokulasikan sebanyak 2 loop (diameter 1 cm) kultur agar cawan hasil peremajaan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair xilan (Tabel 2, tanpa agar). Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang di dalam inkubator bergoyang kecepatan 150 rpm selama 8 hari. Enzim ekstrak kasar dipanen dengan cara sentrifugasi kultur pada 4500 x g selama 15 menit pada suhu 4 oC.

(41)

Supernatan merupakan ekstrak kasar xilanase yang digunakan dalam tahap amobilisasi.

Tabel 2. Komposisi Media Agar-Agar Xilan

Bahan Jumlah (%)

Agar-Agar 1.5 Xilan Birchwood 0.75

Sukrosa 10.3 Ekstrak Khamir 1.0

Sumber: Prihandono (2007)

3.3.2. Amobilisasi Enzim Xilanase

Ekstrak kasar xilanase diamobilisasi dengan EudragitTM S100 berdasarkan modifikasi metode Sardar et al. (2000), yang terdiri atas:

1. Pembuatan Larutan EudragitTM S100 2 % (b/v)

Larutan EudragitTM S100 untuk amobilisasi xilanase ekstraseluler dibuat dengan melarutkan 1 g EudragitTM S100 ke dalam 40 ml akuades. Dengan pengadukan konstan, diteteskan larutan 3 M NaOH hingga mencapai pH 11.0. Setelah matriks terlarut sempurna, pH larutan diturunkan menjadi 7.0 dengan penambahan larutan 3 M HCl. Volume larutan ditera sampai 100 ml dengan akuades. Larutan disimpan pada 4 oC sampai akan digunakan.

2. Penentuan Konsentrasi Larutan EudragitTM S100

Tahapan ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi larutan EudragitTM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase, dengan menggunakan enam taraf konsentrasi larutan, yaitu 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 dan 3.0 % (b/v).

Larutan EudragitTM S100 masing-masing konsentrasi sebanyak 4 ml ditambahkan dengan 1 ml ekstrak kasar xilanase secara terpisah. Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 30 oC, matriks diendapkan dengan mengatur pH menjadi 4.5 menggunakan larutan 0.1 M asam asetat. Setelah 30 menit, suspensi disentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit dan supernatan dipisahkan. Endapan dicuci dengan 4 ml 0.01 M bufer asetat pH 4.0 (Lampiran 1), kemudian suspensi disentrifugasi kembali. Endapan yang

(42)

terbentuk (xilanase yang teramobilkan) dilarutkan dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0 sehingga volume akhir menjadi 5 ml.

Aktivitas xilanase dihitung dengan menentukan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) yang tersaji pada Lampiran 2 dan kadar protein dihitung menggunakan metode Bradford (1976) pada Lampiran 3. Aktivitas xilanase pada supernatan dan hasil pencucian dihitung untuk menentukan aktivitas yang tidak terikat, sedangkan aktivitas xilanase pada suspensi xilanase amobil dihitung sebagai aktivitas xilanase amobil. Konsentrasi larutan EudragitTM S100 yang menghasilkan efektivitas amobilisasi yang optimum dipilih untuk digunakan pada tahap selanjutnya.

Aktivitas xilanase amobil (nkat/ml)

Efektivitas Amobilisasi (%) = x 100 % Aktivitas tidak terikat (nkat/ml)

Dimana:

Aktivitas tidak terikat = Aktivitas Enzim Bebas – (Aktivitas pada supernatan + Aktivitas pada hasil pencucian)

3. Penentuan Rasio Konsentrasi Xilanase dengan EudragitTM S100

Langkah selanjutnya yaitu dengan menentukan rasio konsentrasi xilanase dengan larutan EudragitTM S100 dari penelitian tahap sebelumnya, dengan menggunakan sebelas kombinasi rasio konsentrasi xilanase dan larutan EudragitTM S100, yaitu 6 : 1, 5 : 1, 4 : 1, 3 : 2, 3 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 2 : 3 dan 1 : 4.

Xilanase ekstrak kasar ditambahkan ke dalam larutan EudragitTM S100 dengan rasio tertentu dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 30 oC. Matriks diendapkan dengan mengatur pH menjadi 4.5 menggunakan 0.1 M asam asetat. Setelah 30 menit, suspensi disentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit. Endapan dicuci dengan 0.01 M bufer asetat pH 4.0 (Lampiran 1), kemudian suspensi disentrifugasi kembali. Endapan yang terbentuk (xilanase yang teramobilkan) dilarutkan dalam 0,02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0.

Aktivitas xilanase dan kadar protein dihitung seperti yang tersaji pada Lampiran 2 dan 3. Aktivitas xilanase pada supernatan dan hasil pencucian dihitung untuk menentukan aktivitas yang tidak terikat, sedangkan aktivitas xilanase pada suspensi xilanase amobil dihitung sebagai aktivitas xilanase amobil. Rasio konsentrasi xilanase dengan larutan EudragitTM S100 yang

(43)

menghasilkan efektivitas amobilisasi yang optimum dipilih untuk digunakan pada tahap karakterisasi.

3.3.3. Karakterisasi Enzim Xilanase Amobil 1. Pengujian pH optimum

Pengujian pH optimum xilanase amobil dilakukan dengan mereaksikan xilanase amobil dengan substrat xilan birchwood0.5 % (b/v) pada suhu 50 oC selama 30 menit pada berbagai kondisi pH larutan bufer dengan selang pH 0.5 unit, yaitu menggunakan bufer sitrat fosfat 0.02 M untuk pH 3.0 – 6.0 dan bufer fosfat 0.02 M untuk pH 6.0 – 7.0. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2.

2. Pengujian suhu optimum

Pengujian suhu optimum xilanase amobil dilakukan dengan mereaksikan xilanase amobil dengan substrat xilan birchwood 0.5 % (b/v) selama 30 menit pada suhu 30 – 70 oC, dengan selang suhu 10 oC. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2.

3. Pengujian Stabilitas Suhu

Pengujian stabilitas xilanase amobil terhadap suhu dilakukan dengan menginkubasikan enzim amobil pada berbagai suhu (30 – 70 oC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es bersuhu 4 oC. Aktivitas enzim yang tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis xilanase. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan).

4. Stabilitas Xilanase Amobil dalam Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung

Pengujian stabilitas xilanase amobil dalam substrat dilakukan dengan menginkubasikan xilanase amobil dengan xilan birchwood dan xilan tongkol

(44)

jagung 1 % (b/v) dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pada kondisi optimum xilanase amobil (suhu 40 oC dan pH 6.0) selama 7 jam. Pengambilan sampel xilanase amobil dilakukan setiap 2 jam. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2.

5. Stabilitas Xilanase Amobil pada suhu 40 oC dan pH 5.0

Pengujian stabilitas xilanase amobil ini dilakukan dengan menginkubasikan xilanase amobil dalam 0.02 M bufer sitrat fosfat pH 5.0 pada suhu 40 oC selama 10 jam. Pengambilan sampel xilanase amobil dilakukan setiap 1 jam. Aktivitas xilanase dihitung berdasarkan gula pereduksi yang terbentuk menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2.

3.3.4. Spesifitas Xilanase Amobil terhadap Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung

Pengujian spesifitas xilanase amobil terhadap xilan birchwood dan xilan tongkol jagung dilakukan untuk mengetahui kemampuan xilanase amobil untuk mendegradasi substrat xilan menjadi xilan rantai pendek, xilooligosakarida dan xilosa. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan 1 ml xilanase amobil (0.32 nkat/ml), 10 ml larutan bufer substrat xilan birchwood atau xilan tongkol jagung 1 % (b/v) dan 9 ml larutan bufer sitrat fosfat 0.02 M. Hasil pencampuran tersebut ditempatkan pada Erlenmeyer dan diinkubasikan pada suhu optimumnya. Hasil inkubasi diambil sebanyak 1 ml setiap jamnya selama 5 jam inkubasi dan dididihkan untuk inaktivasi enzim.

Hasil pengujian dihitung dengan menentukan Kadar Gula Pereduksi dengan metode DNS (Miller 1959) pada Lampiran 2 dan Total Gula dengan metode fenol sulfat (Dubois 1956) seperti tersaji pada Lampiran 4, untuk mendapatkan perhitungan Derajat Polimerisasi (DP).

3.3.5. Penggunaan Berulang Xilanase Amobil

Pengujian penggunaan berulang terhadap enzim amobil dilakukan berdasarkan modifikasi metode Roy et al. (2003) untuk mengetahui kemampuan xilanase amobil untuk dipakai berulang tanpa kehilangan aktivitasnya. Penggunaan berulang ini dilakukan dengan melakukan hidrolisis 18 ml substrat

(45)

xilan birchwood 1 % (b/v) dalam bufer sitrat fosfat 0.02 M pH 5.0 dengan 2 ml xilanase amobil (16.88 nkat/ml) pada suhu 40 oC selama 1 jam. Setelah setiap siklus hidrolisis, xilan yang tidak terdegradasi dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2000 x g selama 10 menit. pH supernatan diturunkan menjadi 4.5 dengan penambahan 0.1 M asam asetat sehingga enzim amobil terendapkan dan dipisahkan dengan sentrifugasi pada 12000 x g selama 20 menit. pH supernatan diatur kembali menjadi pH 5.0. Untuk melakukan percobaan siklus kedua, enzim amobil dilarutkan kembali dalam bufer baru dan ditambahkan dengan xilan yang tidak terdegradasi, selanjutnya diproses dengan cara yang sama. Jumlah gula pereduksi pada supernatan diuji menggunakan metode Miller (1959) seperti tersaji pada Lampiran 2.

3.3.6. Prosedur Analisis

1. Pengujian Aktivitas Enzim Xilanase

Pengujian aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan menghitung gula pereduksi yang terbentuk sebagai hasil aktivitas xilanase terhadap substratnya dengan metode Miller (1959). Satu unit aktivitas xilanase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol gula xilosa dari substrat birchwood per menit pada kondisi optimal reaksi enzimatis. Prosedur pengujian aktivitas xilanase dan kurva standar xilosa disajikan pada Lampiran 2.

2. Pengujian Kadar Protein

Pengujian kadar protein enzim dilakukan dengan metode Bradford (1976). Prosedur pengujian kadar protein dan kurva standar Bovine Serum Albumine (BSA) disajikan pada Lampiran 3.

3. Pengujian Total Gula

Total gula hasil hidrolisis xilanase ditetapkan berdasarkan metode fenol asam sulfat (Dubois 1956) dengan prinsip bahwa gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat menghasilkan warna jingga yang stabil. Penetapan total gula dan kurva standar total gula disajikan pada Lampiran 4.

(46)

4. Derajat Polimerisasi

Derajat Polimerisasi menyatakan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi dengan rumus hitung sebagai berikut:

Total Gula (mg/ml) Derajat Polimerisasi (DP) =

Gula Pereduksi (mg/ml)

(47)

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Preparasi Ekstrak Kasar Xilanase

Produksi xilanase ekstrak kasar dari isolat bakteri Streptomyces sp. 45I-3, dengan morfologi seperti pada Lampiran 5, yang menggunakan media cair xilan birchwood 0.75 % (b/v) mampu menghasilkan aktivitas xilanase sebesar 16.28 nkat/ml pada waktu optimumnya. Menurut Kulkarni et al. (1999), xilan sebagai polimer dengan berat molekul besar tidak dapat masuk ke dalam sel dan berfungsi sebagai induser langsung. Oleh karena itu, produksi xilanase oleh mikroba dalam media yang mengandung xilan diinduksi oleh adanya fragmen xilan dengan berat molekul kecil seperti xilosa, xilobiosa serta xilooligosakarida yang dapat memasuki sel dan berfungsi sebagai induser untuk sintesa xilanase dalam jumlah besar. Proses tersebut tampak pada Gambar 4.

Gambar 4. Regulasi Biosintesis Xilanase (Thomson 1993 dalam Kulkarni et al. 1999)

Xilanase konstitutif mendegradasi xilan menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa, yang akan memasuki sel dan menginduksi gen xilanase yang lain (induksi xilanase primer). Xilanase yang terinduksi akan mendegradasi xilan, untuk selanjutnya menjadi xilooligosakarida dan xilobiosa. L-xilosidase yang

(48)

diproduksi secara konstitutif maupun induktif, mengubah xilobiosa menjadi xilosa dan secara bertahap mengalami transglikosilasi menjadi XylB1-2Xyl and GlcB1-2Xyl. Senyawa ini memasuki sel dan berperan sebagai induser tambahan terhadap gen yang mengkode enzim xilanolitik (menghasilkan induksi xilanase tahap kedua) (Gambar 4).

Menurut Beg et al. (2001), L-sorbosa dan residu lignoselulosa dapat menginduksi dihasilkannya xilanase. Kansoh dan Nagieb (2004) menyebutkan adanya ekstrak khamir pada media produksi sebagai sumber karbon dan nitrogen organik dapat menunjang pertumbuhan sel Streptomyces galbus NR, sehingga dapat meningkatkan produksi xilanase walaupun tidak secara langsung menginduksi sintesis xilanase. Keberadaan beberapa jenis gula yang dapat langsung digunakan seperti glukosa dan xilosa dalam jumlah banyak sebagai sumber karbon untuk proses metabolisme dilaporkan dapat menekan sintesis xilanase (Beg et al. 2001).

Aktivitas xilanase yang dihasilkan Streptomyces sp. isolat 45I-3 pada penelitian ini lebih kecil dibandingkan dengan aktivitas xilanase jamur, misalnya xilanase Trichoderma reesei (6668 nkat/ml) dan Schizophillum commune (16003 nkat/ml) (Subramaniyan dan Prema 2002), tetapi tidak jauh berbeda dengan xilanase Bacillus subtilis galur PAP115 (13.34 nkat/ml) (Bernier et al. 1983). Namun demikian, xilanase ekstrak kasar yang dihasilkan oleh jamur dan bakteri pendegradasi hemiselulosa, pada umumnya terdeteksi adanya aktivitas selulase (Subramaniyan dan Prema 2002). Menurut Meryandini (2005), xilanase ekstrak kasar dari Streptomyces sp. isolat 45I-3 tidak memiliki aktivitas terhadap CMC. Hal ini juga dilaporkan pada Streptomyces galbus NR (Kansoh dan Nagieb 2004), Streptomyces sp. S38 (Georis et al. 2000), Streptomyces halstedii JM8 (Ruiz-Arribas et al. 1995), Streptomyces viridosporus T7a (Magnuson dan Crawford 1997). Ketidakberadaan selulase pada aplikasi xilanase untuk industri pulp kertas sangatlah diharapkan agar struktur selulosa kertas dapat dipertahankan.

4.2. Penentuan Konsentrasi Larutan Eudragit

S100

Penentuan konsentrasi larutan EudragitTM S100 dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi EudragitTM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase. Pada percobaan ini larutan xilanase ditambahkan ke dalam berbagai

(49)

konsentrasi EudragitTM S100, yaitu 0.1 %, 0.5 %, 1.0 %, 2.0 % dan 3.0 % (b/v). Berdasarkan percobaan ini (Gambar 5), konsentrasi 1.0 % (b/v) merupakan konsentrasi EudragitTM S100 yang optimum untuk mengikat xilanase ekstrak kasar, karena memiliki persentase efektivitas amobilisasi yang tertinggi, yaitu 15.51 % (Lampiran 6).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0

Konsentrasi Larutan EudragitTM S100 (%)

fekt

ivi

tas A

isas

i (

)

Hasil yang diperoleh tersebut lebih rendah dibandingkan dengan hasil-hasil penelitian sebelumnya. Gawande dan Kamat (1999) melaporkan penggunaan polimer anionik EudragitTM S100 dengan konsentrasi 1 % (b/v) berhasil mengikat xilanase dari Aspergillus sp. Galur 5 dan Galur 44 sebesar 70 dan 80 %. Bahkan Ai et al. (2005) mendapatkan efektivitas amobilisasi mencapai 92 % dengan menggunakan xilanase dari Streptomyces olivaceoviridis E-86 yang ditumbuhkan

Gambar 5. Pengaruh Konsentrasi L Amobilisasi

dalam media xilan tongkol jagung.

arutan EudragitTM S100 terhadap Efektivitas

Keberhasilan pengikatan xilanase pada polimer anionik EudragitTM S100 dipengaruhi oleh titik isoelektrik (pI) xilanase dengan sifat polimer anionik EudragitTM S100. Apabila nilai pI enzim = nilai pH larutan polimer maka protein enzim menjadi tidak bermuatan. Protein enzim akan bermuatan positif jika nilai pH larutan polimer < nilai pI enzim, dan sebaliknya akan bermuatan negatif jika nilai pH larutan polimer > nilai pI enzim. EudragitTM S100 merupakan polimer asam metakrilat dan metilmetakrilat yang bersifat mudah larut dalam larutan dengan pH > 5.5 sehingga polimer akan mengalami ionisasi dimana gugus

(50)

karboksil akan melepaskan ion Hidrogen sehingga menjadi bermuatan negatif (COO-) (Roy et al. 2004), seperti tersaji pada Gambar 6. Proses pengikatan xilanase pada polimer anionik EudragitTM pada kondisi polimer

berikatan d gitTM S100. Hal ini disebabkan muatan protein xilanase akan bermuatan netral atau negatif (sama dengan muatan EudragitTM S100).

/v)

mobilisasi xilanase ekstrak kasar dengan EudragitTM S100 konsentrasi 1 % (b/v) menggunakan beberapa kombinasi volume xilanase ekstrak kasar dengan EudragitTM S100 1 % (b/v), yaitu kombinasi 6 : 1, 5 : 1, 4 : 1, 3 : 2, 3 : 1, 2 : 1, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 2 mobilisasi pada penelitian ini (Gambar 7) menunjukkan variasi pengikatan enzim dengan jumlah enzim yang teradsorpsi pada polimer. Kombinasi 5 : 1 tampaknya memberikan kesempatan lebih banyak bagi enzim untuk teradsorpsi pada polimer EudragitTM S100.

ariasi konsentrasi xilanase yang melekat pada matriks mempengaruhi aktivitas xilanase amobil. Rasio xilanase dan EudragitTM S100 1 % (b/v) sebesar 5 : 1 menunjukkan kombina mpatan penggabungan antara substrat dan enzim amobil menjadi lebih banyak, karena densitas enzim pada polimer me

fluorescens dan spektroskopi UV terhadap xilanase amobil menunjukkan s

(load)

S100 berlangsung

terionisasi (pH > 5.5) sehingga apabila nilai pI enzim ≤ 5.5 maka akan sulit engan Eudra

Gambar 6 . Proses Ionisasi Polimer Anionik EudragitTM S100 (Roy et al. 2004)

4.3. Penentuan Rasio Volume Xilanase dengan Eudragit

S100 1 % (b

Bentuk Tidak terlarut

Bentuk Terlarut

: 3 dan 1 : 4. Hasil a

si dimana kese

ningkat. Sardar et al. (2000) memperlihatkan hasil spektroskopi

perubahan struktural yang signifikan, sebagai hasil amobilisa i dengan muatan protein yang berbeda terhadap matriksnya. Menurut Bosley dan Peilow

(51)

26 0 5 10 15 20 25

1 : 4 1 : 3 1 : 2 2 : 3 1 : 1 3 : 2 2 : 1 3 : 1 4 : 1 5 : 1 6 : 1

Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar : Larutan EudragitTM S100 1% (b/v)

E fe k tiv it a s A m o b il is eraksi yang

Gambar 7. Pengaruh Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar dengan Larutan EudragitTM S100 1 % (b/v) terhadap Efektivitas Amobilisasi

Peningkatan pada volume enzim (6 : 1) menurunkan efektivitas amobilisasi karena enzim yang mengumpul (crowding) mengurangi kesempatan bagi substrat molekul makro untuk menempel pada sisi aktif enzim. Fenomena sterik

t dan fluks produk. Laju transfer massa pada substrat dan produk menuju dan dari (2000) dalam Roy et al. (2004), pada muatan enzim yang sedikit, terdapat banyak permukaan matriks yang tersedia. Molekul enzim cenderung untuk memaksimalkan kontak dengan permukaan dan menyebabkan distorsi konformasi pada proses ini. Pada awalnya, molekul enzim akan menempati area dengan afinitas tinggi pada permukaan matriks, sehingga menimbulkan int

30 35 40 a s i ( % )

mendorong terjadinya kehilangan aktivitas yang lebih besar. Faktor-faktor ini selanjutnya akan berkurang sejalan dengan peningkatan konsentrasi enzim.

crowding di sekeliling situs aktif ini telah banyak dikaji dan umumnya memang banyak terjadi pada substrat molekuler makro seperti pada xilan (Sardar et al

2000). Hasil serupa pernah dilaporkan pada enzim amobil lain, yaitu papain (Hyndman et al. 1992), siklodekstrin glukositransferase (Abdel-Naby 1999) dan kitinase (Wang dan Chio 1998).

Berdasarkan hasil penentuan kondisi imobilisasi yang optimum pada matriks EudragitTM S100 (Lampiran 6 dan 7), diketahui bahwa xilanase amobil memiliki aktivitas yang lebih rendah dibandingkan xilanase bebas. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh limitasi/penghambatan difusional pada substra

(52)

matriks amobilisasi bukanlah suatu masalah bagi enzim bebas. Agar substrat dapat bereaksi dengan enzim amobil, substrat harus berdifusi masuk ke dalam matriks dan produk harus berdifusi keluar. Proses difusional pada enzim amobil ini seringkali menyebabkan konsentrasi substrat yang lebih rendah dan konsentrasi produk yang lebih tinggi pada situs aktif enzim dibandingkan pada larutan enzim bebas. Masalah difusional ini menjadi lebih signifikan pada substrat molekul makro, seperti xilan (Siso et al Meskipun aktivitas lebih rendah, tapi pengikatan matriks dengan enzim menggunakan EudragitTM S100 menunjukkan stabilitas enzim amobil terhadap pemaparan berulang dari beberapa siklus perubahan pH (Gambar 15).

Proses amobilisasi menyebabkan penurunan aktivitas xilanase menjadi

xilanase amobil. Dalam Sardar et al. (2000), data spektroskopi CD (Circular Dichr

ejauh ini dilaporkan lebih rendah dibandingkan denga

rubahan keadaan ion enzim dapat terjadi pada gugus asam amino yang berfungsi katalitik

. 1990).

23.97 %. Hal ini kemungkinan akibat terjadinya perubahan konformasi pada

oism) pada panjang gelombang 272 nm menunjukkan perubahan absorbansi yang drastis pada xilanase amobil dibandingkan xilanase bebas. Absorbansi sekitar 272 nm merefleksikan lingkungan mikro sekitar gugus asam amino pada protein dan mengkorelasikan faktor struktural dengan faktor efektivitas amobilisasi. Oleh karena itu, perubahan absorbansi tersebut menunjukkan perubahan konformasi yang disebabkan oleh proses adsorpsi pada amobilisasi.

Aktivitas xilanase amobil s

n enzim amobil lain (Roy et al. 1984, Abdel Naby 1993, Tyagi dan Gupta 1995).

4.4. Pengujian pH Optimum

Pengaruh pH terhadap aktivitas xilanase amobil diuji menggunakan dua jenis bufer dengan konsentrasi 0.02 M , yaitu bufer sitrat fosfat (pH 3.0 – 6.0) dan bufer fosfat (pH 6.0 – 7.0). Xilanase bebas menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 5.0 (0.861 nkat/ml) sedangkan pada xilanase amobil aktivitas tertinggi terjadi pada pH 6.0 (0.122 nkat/ml) dan selanjutnya menurun dengan meningkatnya pH (Lampiran 8).

Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH yang tidak terlalu besar (sedikit dibawah atau diatas pH optimumnya) disebabkan oleh perubahan keadaan ion enzim, dan seringkali juga keadaan ion substrat. Pe

(53)

0 20 40

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

ivi

s X

lat

er enzim yang aktif. Penurunan aktivi

mengikat substrat, maupun pada gugus asam amino yang berfungsi mempertahankan struktur tersier dan kuarten

tas enzim dapat dipulihkan kembali dengan mengubah kondisi reaksi enzimatis pada pH optimumnya. Pada pH tertentu, perubahan muatan ion pada rantai samping dari gugus asam amino enzim yang dapat terionisasi menjadi terlalu besar sehingga mengakibatkan terjadinya denaturasi enzim yang disertai dengan hilangnya aktivitas katalitik enzim. Perubahan struktur tersier dapat menyebabkan kelompok hidrofobik (yang pada awalnya tersembunyi pada bagian dalam molekul enzim) mengalami kontak dengan air sehingga solubilitas enzim menjadi berkurang. Solubilitas enzim yang berkurang dapat mengakibatkan penurunan aktivitas enzim secara bertahap (Palmer 1981, Harper

et al. 1984).

100

(

)

ase

Gambar 8. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase Amobil (simbol terbuka) dan Xilanase Bebas (simbol solid) Menggunakan Bufer Sitrat Fosfat 0.02 M (□) dan Bufer Fosfat 0.02 M (∆)

Xilanase Streptomyces sp. isolat 45I-3 menunjukkan aktivitas relatif yang berbeda pada pH 6.0 dalam larutan bufer sitrat fosfat dan bufer fosfat, yaitu masing-masing sebesar 82.04 % dan 71.59 % pada xilanase bebas sedangkan pada xilanase amobil sebesar 100 % dan 63.33 %, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8. Hal ini menunjukkan bahwa jenis bufer berpengaruh terhadap aktivitas xilanase. Pengaruh jenis bufer pada pH yang sama terhadap aktivitas xilanase juga dijumpai pada xilanase Cellulomonas flavigena dan Thermotoga

(54)

asetat meningkat sekitar tujuh kali lipat dibandingkan aktivitas xilanase dalam bufer MES, namun pada pH 5.5 aktivitas relatifnya hanya 20 % lebih tinggi. Aktivitas relatif xilanase dalam tiga jenis bufer (fosfat, Tris-HCl dan CHES) menunjukkan nilai yang berbeda (Zhengqiang 2001).

Perbedaan aktivitas dalam jenis bufer yang berbeda disebabkan perbedaan pK bufer, jenis dan jumlah muatan ion penyusun bufer. Setiap jenis bufer memiliki rentang pH tertentu dan kapasitas bufer dipengaruhi oleh pK-nya. Bufer akan bekerja baik pada daerah pH yang dekat dengan pK-nya sehingga semakin jauh dari p

erpengaruh pada konstanta dielektrik larutan dan jumlah muatan ion erpengaruh terhadap besarnya kekuatan ion larutan. Konstanta dielektrik dan ekuatan ion berpengaruh terhadap kecepatan reaksi enzimatis (Suhartono 989).

Amobilisasi xilanase tampaknya menyebabkan terjadinya perubahan pH optimum, yaitu pada xilanase bebas adalah pH 5.0, sedangkan pada xilanase amobil adalah pH 6.0 dengan menggunakan bufer sitrat fosfat 0.02 M. Hal ini diduga merupakan suatu efek dari amobilisasi yang dilakukan menggunakan matriks anionik. Penelitian Krajewska et al. (1990) menunjukkan bahwa perubahan pH optimum menjadi lebih asam untuk aktivitas katalitik dibandingkan enzim bebas (pH 6.5 menjadi 6.0) disebabkan oleh penggunaan matriks kationik yang bermuatan positif, sehingga akan mengubah pH optimum menjadi lebih

Naby 1993

sama, didu nelitian ini, yaitu pada matriks anionik yang bermuatan negatif akan mengubah kurva pH-aktivitas menjadi nilai pH y

maritima. Aktivitas xilanase Cellulomonas flavigena pada pH optimum 6.5 dalam bufer sitrat fosfat lebih tinggi 45 % dibandingkan dalam bufer Tris-HCl (Martinez-Trujilo et al. 2003). Aktivitas relatif xilanase Thermotoga maritima pada pH 5.0 dalam bufer

K maka kapasitas bufer-nya akan semakin menurun. Muatan ion b

b k 1

rendah. Observasi serupa juga telah dilaporkan untuk xilanase amobil lain (Abdel , Gouda dan Abdel-Naby 2002). Oleh karena itu, dengan prinsip yang ga hal yang sebaliknya terjadi pada pe

ang lebih tinggi. Selain itu, laporan Engasser dan Horvath (1976) menyebutkan bahwa amobilisasi enzim menyebabkan terjadinya efek partisi sehingga mengakibatkan perbedaan nilai pH optimum dan atau Km enzim amobil dibandingkan enzim bebas. Efek partisi ini disebabkan adanya interaksi elektrostatik atau interaksi lain antara matriks dengan enzim disebabkan konsentrasinya pada lingkungan mikro berbeda pada larutan reaksi.

(55)

4.5. Pengujian Suhu Optimum

Pengaruh suhu terhadap aktivitas xilanase diperlihatkan pada Gambar 9. Aktivitas xilanase bebas meningkat sejalan dengan meningkatnya suhu sampai mencapai 50 oC, selanjutnya semakin menurun pada 60 oC dan hampir kehilangan seluruh aktivitasnya pada suhu 70 oC. Aktivitas xilanase amobil menunjukkan perubahan marginal pada suhu optimum dibandingkan xilanase bebas. Xilanase bebas menunjukkan aktivitas tertinggi pada

0 20

30 40 50 60 70

Suhu (oC)

tiv

i 40

60 80 100

tif (%

)

Xilanase Amobil Xilanase Bebas

Gambar 9. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Xilanase

Hal yang serupa terjadi pada penelitian Gaur et al. (2005), xilanase amobil memiliki suhu optimum pada 55 – 65

suhu 50 oC, yaitu sebes

asnya pada uhu 70 oC. Pada xilanase bebas, aktivitas xilanase menurun secara gradual ar 3,01 nkat/ml, sedangkan pada xilanase amobil aktivitas pada suhu 40 oC adalah 1.58 nkat/ml dan suhu 50 oC adalah 1.55 nkat/ml (Lampiran 9). Oleh karena itu suhu optimum xilanase amobil melebar menjadi 40 – 50 oC.

C. Efek ini pun telah dikaji sebelumnya pada xilanase dari Aspergillus sp. (Rogalski et al. 1985; Abdel-Naby 1993) dan

Trichoderma sp. (Dumitriu dan Chornet 1997).

4.6. Pengujian Stabilitas Suhu

Xilanase amobil relatif stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada suhu 30 oC, meningkatkan aktivitasnya pada suhu 40 oC, menyisakan 29.36 % aktivitasnya pada suhu 50 oC dan hampir kehilangan seluruh aktivit

(1)

ilanase Amobil dan Xilanase Bebas pada Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung

Aktivitas pada Xilan Tongkol Jagung + Xilanase (nkat/ml)

Aktivitas pada Xilan Birchwood + Xilanase

(nkat/ml)

Aktivitas Relatif pada Xilan Tongkol Jagung

+ Xilanase )

Aktivitas Relatif pada Xilan Birchwood +

e )

(% Xilanas (%

Waktu (Jam ke-)

Xilanase Amobil

Xilanase Bebas

Xilanase Amobil

Xilanase Bebas

Xilanase

Amobil as Amobil

n Bebas Xilanase

Beb

Xilanase Xila ase

0 0.238 0.362 0.606 0,408 59.85 79.77 41.50 44.14 2 0.279 0.390 1.078 0,777 70.08 86.07 73.89 84.07

4 0.376 0.449 1.393 0,924 94.45 99.05 95 46 1 0 . 0 6 0.398 0.454 1.459 0,871 100 100 100 94.28 Lampiran 12. Data Stabilitas X

7 0.388 0.432 1.357 0,823 97.61 95.23 93.00 89.13

(2)

Aktivitas Aktivitas Aktivitas R

Aktivitas Relatif Xilanase Bebas (%) Lampiran 13. Stabilitas Xilanase Amobil pada Suhu 40 oC dan pH 5.0

Waktu am ke-)

Xilanase Amobil (nkat/ml)

Xilanase Bebas (nkat/ml)

elatif ilanase Amobil (%)

0 0.228 0.939 60.57 100 1 0.313 0.842 83.22 89.76 2 0.335 0.438 88.97 46.68 3 0.341 0.321 90.64 34.23 4 0.348 0.268 92.45 28.51 5 0.377 0.268 100 28.51 6 0.362 0.193 96.21 20.57 8 0.348 0.094 92.41 9.96

10 0.346 0.062 91.95 6.64

(3)

Lampiran 14. Spesifitas Xilanase Amobil terhadap Substrat Xilan Birchwood dan Xilan Tongkol Jagung

Keterangan Waktu

(Jam ke-) Total Gula (mg/ml) Gula Pereduksi (mg/ml) Derajat Polimerisasi (DP)

0 5.418 0.145 37.3 1 5.418 0.323 16.8 2 5.418 0.501 10.8 3 5.418 0.607 8.9 4 5.418

0.652 8.3

ilanase Amobil + X n Birchw

5 5.418 0.790 6.9

ila (b/v) ood 1 %

0 0.977 0.008 122.1 1 0.977 0.012 81.4 2 0.977 0.016 61.1 3 0.977 0.017 56.4 4 0.977 0.028 34.8 X

ilanas +

ngkol )

5 0.977 0.037 26.1 e Amobil

Jagung 1

Xilan % (b/v

0 1.128 0.027 42.3 1 1.128 0.043 26.5 2 1.128 0.043 26.2 3 1.128 0.063 18.0 4 1.128 0.069 16.4 Xilanas +

Birchw %

5 1.128 .077 14.7 e Bebas

ood 1

Xilan (b/v)

0 1.108 .010 110.8 0 1 1.108 .011 100.8 0 2 .1 108 .015 76.4 0 3 1.108 .015 74.0 0 4 1.108 .024 46.9 X

0 ilanas +

ngkol )

5 1.108 .045 24.8 e Bebas

Jagung 1

Xilan % (b/v

0 Aktivitas awal xilanase = 0.83 nkat/ml

(4)

Lampiran 15. Data Total Gula, Gula Pereduksi dan Derajat Polimerisasi Hasil Hidrolisis Xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 terhadap Substrat Xilan Tongkol Jagung 1.0 % (b/v)

T (

Gu si

Polimerisasi Waktu

(Jam ke-)

otal Gula mg/ml)

la Pereduk (mg/ml)

Derajat

0 151.47 8.90 17.02

1 151.47 25.30 5.99

2 151.47 32.80 4.62

3 151.47 37.60 4.03

4 151.47 39.30 3.86

5 151.47 40.30 3.76

(5)

Lampiran 16. Penggunaan Berulang Xilanase Amobil

Pengg

ke- Xilosa

(mg/ml)

Pro

g/ R

unaan Kadar Kadar (m

tein ml)

Aktivitas elatif (%)

1 0.491 0.050 100

2 0.444 0.044 90.48

3 0.257 0.042 52.38

Aktivitas awal xilanase = 16.88 nkat/ml

(6)

ada suhu 40 oC dan pH 5.0. Spesifitas xilanase mobil terhadap xilan birchwood menghasilkan DP antara 37–7, dan pada xilan apat digunakan berulang, namu

V. SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

Amobilisasi xilanase dari Streptomyces sp. isolat 45I-3 dilakukan menggunakan larutan Eudragit S100 konsentrasi 1 % (b/v). Rasio volume Xilanase Ekstrak Kasar dengan Larutan Eudragit S100 1 % (b/v) yang digunakan adalah 5:1.

Amobilisasi menyebabkan penurunan aktivitas xilanase menjadi 23.97 %, serta perubahan pH dan suhu optimum. Xilanase amobil memiliki aktivitas optimum pada pH 6.0 dan suhu 40 oC. Xilanase amobil stabil selama 1 jam pada suhu 30–40 oC, pH 6.0, serta stabil pada substrat xilan birchwood dan xilan tongkol jagung selama 6 jam pada pH 6.0 dan suhu 40 oC. Xilanase amobil lebih stabil pada substrat xilan birchwood dibandingkan xilan tongkol jagung. Xilanase amobil juga stabil selama 5 jam p

tongkol jagung antara 122–26. Xilanase amobil d

n terjadi penurunan aktivitas menjadi 52.38 % setelah 3 kali penggunaan. Xilanase amobil memiliki potensi untuk diaplikasikan pada pembuatan beragam xilooligosakarida, terutama karena keleluasaan dalam pengendalian prosesnya.

5.2. Saran

Amobilisasi xilanase dari Streptomyces sp. 45I-3 memiliki efektivitas amobilisasi yang rendah sehingga perlu dikombinasikan dengan metode pengikatan kovalen sehingga dapat meningkatkan efektivitas amobilisasi dan meningkatkan stabilitasnya.