UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Etil P-Metoksisinamat EPMS
Etil p-metoksisinamat EPMS adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang kencur Kaempferia Galanga L. yang merupakan bahan dasar senyawa
tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. EPMS termasuk dalam golongan senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus
metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-
pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air, dan heksana Firdausi, 2009.
Gambar 1. etil p-metoksi sinamat Marvin Sketch EPMS telah dilaporkan memiliki aktifitas larvicidal, nematicidal, antifungi,
dan antikarsinogenik, serta menghambat aktifitas enzim monoaminoksidase. Lakshmanan et al, menyebutkan bahwa EPMS juga dapat menghambat virulensi
M. tuberculosis . Sehingga menjadi pedoman untuk merancang senyawa baru
dengan senyawa penuntun EPMS sebagai antituberkulosis yang potensial Lakshmanan et al, 2011.
2.2 Mycobacterium tuberculosis
2.2.1 Karakteristik Bakteri
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit melengkung,
tidak berspora, dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran lebar 0,3 – 0,6 μm dan
panjang 1 – 4 μm. Dinding Mycobacterium tuberculosis sangat kompleks, terdiri
dari lapisan lemak cukup tinggi 60. Penyusun utama dinding sel
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Mycobacterium tuberculosis ialah asam mikolat, lilin kompleks, dan trehalosa
dimikolat yang disebut cord factor. Bakteri ini dibedakan dari sebagian besar bakteri dan mikobakteri lainnya
karena bersifat patogen, dan dapat berkembang biak dalam sel fagosit hewan dan manusia. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis relatif lambat dibandingkan
Mycobacterium lainnya. Mycobacterium tuberculosis tidak menghasilkan endotoksin maupun eksotoksin. Bagian selubung Mycobacterium tuberculosis
mempunyai sifat pertahanan khusus terhadap proses mikobakterisidal sel hospes. Dinding sel yang kaya lipid akan melindungi mikobakteri dari proses
fagolisosom, hal ini dapat menerangkan mengapa mikobakteri dapat hidup pada makrofag normal yang tidak teraktivasi Handayani, 2008.
Gambar 2. Mycobacterium tuberculosis Sumber:
http:globalbiodefense.com20141114 Mycobacterium tuberculosis bersifat obligat aerob, sehingga hanya bisa hidup
pada keadaan kandungan oksigen tinggi. Dalam es atau keadaan dingin, bakteri ini dapat bertahan selama bertahun-tahun, berada dalam keadaan dormant tidak
aktif. Pertumbuhannya dalam suatu medium pertumbuhan juga dalam hewan sangat lambat. Diperlukan waktu paling cepat dua belas jam bagi bakteri ini untuk
menggandakan dirinya didalam medium kaya nutrisi. Konsentrasi lemak yang tinggi menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat-sifat khusus, yaitu hidrofobik,
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tahan asam, impermeabel bila diwarnai, tahan serangan antibodi dan pertumbuhannya lambat Pfyffer, G.B., 2003.
Komponen antigen ditemukan di dinding sel dan sitoplasma, yaitu komponen lipid, polisakarida dan protein. Karakteristik antigen Mycobacterium tuberculosis
dapat diidentifikasi dengan menggunakan antibodi monoklonal. Bakteribasil ini cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lainnya karena sifat
hidrofobik permukaan selnya. Basil tuberkel resisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup dalam waktu yang lama dalam sputum yang kering Jawetz et al.,
2005 . 2.2.2
Asam mikolat Asam mikolat merupakan asam lemak berantai panjang yang dihubungkan
dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid, dan dengan peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada dinding sel bakteri adalah
polisakarida sepereti arabinogalaktan dan arabinomanan. Struktur dinding sel yang kompleks tersebut menyebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis
bersifat tahan asam, yaitu apabila sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya penghilangan zat warna tersebut dengan larutan asam
– alkohol Poeloengan et al, 2007.
Asam mikolat merupakan konstituen utama dari dinding sel mikobakteri. Biosintesis asam mikolat dicapai melalui sintesis asam lemak Mycobacterium
tuberculosis . Tidak seperti bakteri lain, Mycobacterium tuberculosis unik karena
memiliki kedua tipe I dan tipe II lemak jalur biosintesis asam. Sisntesis asam lemak tipe I pada Mycobacterium tuberculosis bertanggung jawab untuk generasi
asam lemak rantai alkil pendek jenuh, termasuk asam mikolat R-C24. Beberapa produk dari sisntesis asam lemak tipe I, seperti produk asam lemak C16-C26,
kemudian dipindahkan ke jalur sisntesis asam lemak tipe II, di mana mereka diperpanjang hingga menjadi C56, membentuk rantai meromikolat yang berfungsi
sebagai prekursor untuk asam mikolat akhir Kumar et al, 2011. 2.2.3
inhA InhA, adalah enoil reduktase dari Mycobacterium tuberculosis dan bagian dari
keluarga rantai pendek dehidrogenase reduktase SDR, mengkatalisis reduksi NADH-dependent dari rantai panjang Asam lemak trans-2-enoyl ACP pada jalur
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis. NADH- Dependen enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium telah
divalidasi sebagai target molekul utama dari garis depan isoniazid obat antituberkular INH.
Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk obat antituberkular lini kedua, etionamid ETA. InhA mengkatalisis reduksi rantai panjang trans-2-
enoil-ACP di tipe II asam lemak jalur biosintesis dari Mycobacterium tuberculosis
. Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat sehingga mengganggu struktur dinding sel mikobakteri Kumar et al, 2011.
2.3 Tuberkulosis
2.3.1 Definisi
Tuberculosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh kuman TB Mycobacterium tuberculosis. Sebagian kuman TB menyerang paru, tetapi
dapat juga menyerang organ tubuh lainnya Depkes RI, 2007. 2.3.2
Patofisiologi Paru merupakan jalan utama masuknya Mycobacterium tuberculosis melalui
udara, yaitu dengan inhalasi droplet. Hanya droplet ukuran 1-5 mikron yang dapat melewati sistem mukosiliar saluran nafas, sehingga dapat mencapai dan bersarang
di bronkiolus serta alveoli. Tuberkulosis primer terjadi pada individu yang terpapar pertama kali dengan basil tuberkulosis, sedangkan tuberkulosis paru
kronik reaktivasi atau pasca primer, adalah hasil reaktivasi infeksi tuberkulosis pada suatu fokus dorman yang terjadi beberapa tahun lalu. Faktor-faktor yang
berpengaruh terhadap reaktivasi belum dipahami secara keseluruhan Handayani, S., 2008.
Organ tubuh yang paling banyak diserang tuberkulosis adalah paru, beberapa penelitian menunjukkan adanya kenaikan limfosit alveolar, netrofil pada sel
bronkoalveolar dan HLA-DR pada pasien tuberkulosis paru. Respon imunologik terhadap infeksi TB berupa imunitas seluler dan
hipersensitiviti tipe lambat delayed-type hypersensitivity. Apabila respons imun lemah atau gagal maka terjadi TB aktif pada individu yang terinfeksi. Imunitas
seluler menyebabkan proliferasi limfosit T-cluster of differentition CD4, dan memproduksi sitokin lokal sebagai respons terhadap antigen yang dikeluarkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Mycobacterium tuberculosis limfosit T helper 1 Th1, yang mengaktifkan
makrofag sedangkan limfosit T helper 2 Th2 menambah sistesis antibodi humoral dan kemudian memproduksi sitokin lokal, tumor necrosing factor alfa
TNFa dan interferon gamma INFg. Sitokin akan menarik monosit darah ke lesi TB dan mengaktifkannya. Monosit aktif atau makrofag danlimfosit
– TCD4 memproduksi enzim lisosim, oksigen radikal, nitrogen intermediate dan
interleukin-2 Ulrichs, at al, 2003. 2.3.3
Gambaran klinis TB paru primer biasanya terjadi pada usia muda. TB tersebut sering
asimtomatik tanpa tanda-tanda klinis dan dapat menyebabkan penyakit demam ringan, eritema nodosum lesi nyeri, garas berindurasi, dan sedikit efusi pleura.
Kompresi bronkus oleh limfadenopati dapat menyebabkan mengi dan kadang- kadang kolaps lobar diikuti bronkiektasis lanjut.
TB pasca primer terjadi berbulan-bulang, dengan malaise, anoreksia, penurunan berat badan, keringat malam, dan batuk produktif. Sulit bernapas,
nyeri dada, hemoptysis, dan limfadenopati servikal dapat terjadi. Tanda klinis pneumonia dan efusi pleura dapat terjadi Ward JPT, 2007.
2.4 Isoniazid
Pengobatan terhadap TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu lini pertama
dan lini kedua. Kelompok lini pertama, yaitu isoniazid, rifampisin, etambutol, streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok lini pertama ini
efektifitasnya tinggi, dan toksisitas dapat ditolerir. Kelompok lini kedua, adalah antibiotika golongan fluorokuinolon, sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin,
kapreomisin, dan para aminosalisilat Niemann, S. and Gerdes, S.R., 2003. Isoniazid, diperkenalkan pada tahun 1952, merupakan obat yang paling aktif
untuk mengobati tuberkulosis yang disebabkan oleh strain-strain yang rentan. Isoniazid merupakan hidrazida dari asam isonikotinat, yang merupakan suatu
molekul kecil, sederhana MW 137 yang mudah larut dalam air. Secara invitro, isoniazid menghambat sebagian besar basil tuberkel pada
konsentrasi 0,2 mpmL atau kurang dan merupakan bakterisid untuk basil tuberkel
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang berkembang secara aktif melawan organisme-organisme yang berada ekstrasel maupun intrasel Katzung, 2004.
2.4.1 Efek Antibakteri
Isoniazid secara in vitro bersifat tuberkulostatik dan tuberkulosid dengan KHM Kadar Hambat Minimun sekitar 0,025-0,05 mcgmL. Pembelahan kuman
masih berlangsung 2 sampai 3 kali sebelum dihambat sama sekali. Efek bakterisidnya hanya terlihat pada kuman yang sedang tumbuh aktif.
Mikroorganisme yang sedang ‖istirahat‖ mulai lagi dengan pembelahan biasa bila kontaknya dengan obat dihentikan. Pada uji hewan, ternyata aktifitas isoniazid
lebih kuat dibandingkan streptomisin. Isoniazid dapat menembus sel dengan mudah Katzung, 2004.
2.4.2 Mekanisme Kerja
Dependen-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium telah divalidasi sebagai molekul target utama dari obat
antituberkulosis lini pertama isoniazid INH. Studi terbaru menunjukkan bahwa InhA juga target untuk lini kedua obat antituberkulosis etionamid ETA. InhA
mengkatalisis reduksi rantai panjang trans-2-enoil-ACP pada jalur biosintesis asam lemak tipe II dari Mycobacterium tuberculosis.
Penghambatan InhA mengganggu biosintesis asam mikolat, yaitu konstituen utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai sebuah prodrug, INH harus
diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase KatG terbeih dahulu ke dalam bentuk aktif radikal asil nya. Produk tambahan yang dihasilkan dari ikatan
kovalen dari INH aktif dengan InhA kosubstrat NADH, atau produk oksidasi NAD +, berfungsi sebagai InhA inhibitor poten. INH telah banyak diterapkan
sebagai agen lini pertama untuk pengobatan tuberkulosis selama 40 tahun terakhir Kumar, et al, 2011 .
2.4.3 Resistensi
Resistensi terhadap isoniazid telah diasosiasikan dengan mutasi yang menghasilkan over-ekspresi dari inhA, yang mengkode suatu pembawa acyl
protein reductase dependent-NADH, mutasi atau delesi dari katG, mutasi promotor menghasilkan over-ekspresi dari ahpC, sebuah gen virulence dugaan
yang terlibat dalam proteksi sel dari stres oksidatif, dan mutasi kasA. Organisme
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang secara berlebihan memproduksi inhA menunjukan resistensi tingkat rendah dan resistensi-silang terhadap ethionamide. Mutan-mutan katG menunjukan
resistensi tingkat tinggi isoniazid dan tidak menyebabkan resistensi-silang terhadap ethionamide Katzung, 2004.
2.5 Hubungan Kuantitatif Struktur dan Aktifitas HKSA
Pendekatan hubungan struktur dan aktifitas biologis mulai berkembang dengan pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh Corwin Hansch dan
kawan-kawan, yang menghubungkan struktur kimia dan aktifitas biologis obat melalui sifat-sifat kimia fisika umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat
ionisasi, atau ukuran molekul. Setelah itu, hubungan kuantitatif antara aktifitas biologis dan parameter yang menggambarkan perubahan sifat kimia fisika, yaitu
parameter hidrofobik, elektronik dan sterik, pada suatu seri molekul, mulai dikembangkan secara lebih intensif. Hubungan atau korelasi yang baik digunakan
untuk menunjang model interaksi obat-reseptor dan meramalkan jalur sintesis obat yang lebih menguntungkan Siswandono, 2008.
Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktifitas biologis obat HKSA merupakan bagian penting rancangan obat, dalam usaha mendapatkan obat baru
dengan aktifikas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu
dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang
dikehendaki, factor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek Siswandono, 2008.
2.6 Model Pendekatan HKSA Hansch
Hansch 1963, mengemukakan suatu konsep bahwa hubungan struktur kimia dengan aktifitas biologis log 1C suatu turunan senyawa dapat dinyatakan secara
kuantitatif melalui parameter-parameter sifat fisika kimia dari subsituen yaitu parameter hidrofobik π, elektronik σ, dan sterik E
s
yang terdapat pada molekul, yang dapat dinyatakan secara matematis sebagai persamaan berikut:
Log A = aΣπ + bΣ σ + cΣ Es + d
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Model pendekatan ini disebut juga model energi bebas linier linier free energy relationship
= LFER atau pendekatan ekstratermodinamik. Siswandono, 2008
2.6.1 Parameter Sifat Kimia Fisika dalam HKSA Model Hansch
Parameter sifat kimia fisika yang sering digunakan dalam HKSA model Hansch adalah parameter hidrofobik, elektronik dan sterik. Pada proses distribusi
atau pengangkutan obat, penembusan membran biologis sangat dipengaruhi oleh kelarutan obat dalam lemakair, suasana pH dan derajat ionisasi pKa sehingga
dalam hubungan kuantitatif struktur dan aktifitas, parameter kimia fisika yang sering dilibatkan adalah parameter hidrofobik dan elektronik. Pada proses
distribusi obat pengaruh sifat hidrofobik pada umumnya lebih besar dibanding sifat elektronik.
a. Parameter hidofobik
Parameter hidrofobik lipofilik yang sering digunakan dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi log P, tetapan π Hansch, tetapan
fragmentasi f Rekker-Manhold dan tetapan kromatogram Rm.
b. Parameter elektronik
Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam HKSA model Hansch, yaitu: pengaruh berbagai substituen terhadap reaktifitas bagian molekul yang
tidak mengalami perubahan, sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan ionisasi pKa dan berhubungan dengan bentuk terionkan dan tak terionkan
dari suatu senyawa pada pH tertentu, dan sifat oksidasi-reduksi atau reaktifitas senyawa.
c. Parameter sterik
Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat meruah gugus-gugus dan efek gugus pada ontak obat dengan sisi reseptor yang berdekatan Siswandono,
2008. 2.6.2
Analisis Statistik dalam HKSA Model Hansch Perhitungan statistik yang sering digunakan dalam hubungan struktur dan
aktifitas melalui parameter-parameter kimia fisika adalah analisis regresi linier dan non linier. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan
aktifitas biologi melalui parameter kimia fisika, dapat dilakukan perhitungan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
statistic dengan bantuan computer, menggunakan program MICROSAT, ABSTAT, QSAR, STATGRAPHIC, STATISTIKA, SIGMASTAT, SPSS atau
program statistic yang lain Siswandono, 2008. 2.7
Penambatan Molekul Molecular docking
atau penambatan molekul adalah prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksi ikatan nonkovalen makromolekul, lebih
sering, sebuah molekul besar reseptor dan sebuah molekul kecil ligan secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang
ditemukandari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dan lain-lain. Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksi konformasi ikatan dan
afinitas pengikatan Yanuar, 2012. Pediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting karena data tersebut
digunakna untuk screening database virtual molekul mirip obat untuk menentukan senyawa penuntun untuk pengembangan obat selanjutnya. Docking
dapat juga digunakan untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari pengikat yang diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia Yanuar,
2012. 2.8
Interaksi Ikatan Pada umunya, ikatan obat-reseptor bersifat reversibel sehingga obat segera
meninggalkan reseptor bila kadar obat dalam cairan luar sel menurun. Untuk ini ikatan yang terlibat pada interaksi obat reseptor harus relative lemah, tetapi masih
cukup kuat untuk berkopetensi dengan lain-lain ikatan dengan tempat kehilangan site of loss Siswandono, 2008.
Pada interaksi obat dengan reseptor, senyawa dapat menggabungkan beberapa ikatan yang lemah, seperti ikatan hidrogen, ion, dipol-dipol, transfer muatan,
hidrofob, dan ikatan van der Waal ‘s, sehingga secara total menghasilkan ikatan
yang cukup kuat dan stabil. Untuk suatu tujuan tertentu, missal diinginkan efek berlangsung lama dan ireversibel, seperti pada obat antibakteri dan antikanker,
diperlukan ikatan yang lebih kuat yaitu ikatan kovalen Siswandono, 2008.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.8.1 Ikatan Ion
Ikatan ion adalah ikatan yang dihasilkan oleh daya tarik menarik elektrostatik antara ion=ion yang muatannya berlawanan. Kekuatan tarik menarik akan
semakin berkuran bila jarak antara ion-ion bermuatan semakin jauh dan pengurangan tersebut berbanding terbalik dengan jaraknya Siswandono, 2008.
Makromolekul dalam sistem biologis yang berfungsi sebagai komponen reseptor mengandung gugus protein dan asam nukleat yang bervariasi,
mempunyai gugus kation dan anion potensial tetapi hanya beberapa saja yang dapat terionisasi pada pH fisiologis. Gugus kation protein berupa gugus amino
yang terdapat pada asam-asam amino, seperti lisin, glutamin dan asparagine. Gugus anion protein berupa gugus karboksilat, misal pada asam aspartate dan
asam glutamate, gugus sulfhidril, missal pada sistein dan metionin dan gugus fosforil, missal pada asam nukleat Siswandono, 2008.
2.8.2 Ikatan Hidrogen
Ikatan hidrogen adalah sutau ikatan antara atom H yang mempunyai muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan dan mempunyai
sepasang elektron bebas dengan oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Atom yang bermuatan positif parsial dapat berinteraksi dengan atom negatif parsial dari
molekul atau atom lain yang berbeda ikatan kovalennya dalam satu molekul. Ikatan hidrogen pada umumnya terjadi pada senyawa yang mempunyai gugus-
gugus seperti OH…O, NH…O, NH…N, NH…F, dan OH…F Siswandono, 2008.
Ikatan hidrogen ada dua, yaitu ikatan hidrogen intramolekul, ikatan hidrogen yang terjadi dalam satu molekul, dan ikatan hidrogen intermolekul, ikatan
hidrogen yang terjadi antara molekul-molekul. Kekuatan hidrogen intermolekul lebih lama dibanding ikatan hidrogen intramolekul. Ikatan hydrogen dapat
mempengaruhi sifat-sifat kimia fisika senyawa, seperti titik didih, titik lebur, kelarutan dalam air, kemampuan pembentukan kelat, dan keasaman. Perubahan
sifat-sifat tersebut dapat berpengaruh terhadap aktifitas biologis senyawa Siswandono, 2008.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.8.3 Interaksi Van Der Waal‘s
Ikatan van der Waal‘s merupakan kekuatan tarik-menarik antar molekul atau atom yang tidak bermuatan, dan letaknya berdekatan atau jaraknya ±4-6 A. Ikatan
ini terjadi karena sifat kepolarisasian molekul atau atom. Meskipun secara individu lemah tetapi hasil penjumlahan ikatan van der Wa
al‘s merupakan faktor pengikat yang cukup bermakna, terutama untuk senyawa-senyawa yang
mempunyai berat molekul tinggi. Ikatan van der Waal‘s terlibat pada interaksi cincin benzen dengan daerah bidang datar reseptor dan pada interaksi rantai
hidrokarbon dengan makromolekul protein atau reseptor Siswandono, 2008. 2.8.4
Interaksi Dipol-Dipol Adanya perbedaan keelektronegatifan atom C dengan atom yang lain, seperti
O dan N, akan membentuk distribusi elektron tidak simetrik atau dipol, yang mampu membentuk ikatan dengan ion atau dipol lain, baik yang mempunyai
daerah kerapatan elektron tinggi maupun yang rendah. Gugus-gugus yang mempunyai fungsi dipolar antara lain adalah gugus karbonil, ester, amida, eter,
dan nitril. Gugus-gugus tersebut sering didapatkan pada senyawa berstruktur spesifik Siswandono, 2008.
2.8.5 Ikatan Kovalen
Ikatan kovaeln terbentuk bila ada dua atom saling menggunakan sepasang elektron secara bersama-sama. Ikatan kovalen merupakan ikatan kimia yang
paling kuat dengan rata-rata kekuatan 100 kkalmol. Dengan kekuatan ikatan yang tinggi ini, pada suhu normal ikatan bersifat ireversibel dan hanya pecah bila
adapengaruh katalisator enzim tertentu. Interaksi obat-reseptor melalui ikatan kovalen menghasilkan kompleks yang cukup stabil, dan sifat ini dapat digunakan
untuk tujuan pengobaan tertentu Siswandono, 2008.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODE PENELITIAN
