Pemurnian dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler Isolat Prokariot Termofilik Ekstrim dari Tangkuban Perahu
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEASE
EKSTRASELULER iSOLAT PROKARIOT TERMOFlLlK
EKSTRIM DARl TANGKUBAN PERAHU
Oleh:
BUDIASIH WAHYUNTARI
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2001
ABSTRACT
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF EXTRACELLULAR
PROTEASE OF AN EXTREME THERMOPHILIC PROCARYOTE
ISOLATE FROM TANGKUBAN PERAHU
Supervised by MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO (Chair of
Advisors), ANTONlUS SUWANTO, DEDl FARDIAZ and DJUMALI
MANGUNWIDJAJA (Co advisors)
Six thermophilic procaryote isolates, which produce extracellular
protease, were collected from soil of Kawah Domas, Tangkuban Perahu,
West Java, Indonesia. The objectives of this work were to screen for an
extreme thermophilic isolate and to study biochemical characteristics of
the extracellular protease that will be useful for further biotechnological or
industrial application.
An extreme thermophilic isolate TPS2d was selected. The isolate is
gram positive with rod like cell, capable of growing aerobically at 70°C.
Based on ~ a r t i a seauence
l
of 16s-rRNA gene. the isolate belongs to
genus of tiacillus with approximately 90% Tdentky. hil lo genetically the
isolate related to Bacillus caldotenax with 67% level of confidence.
The crude enzyme is thermostable with optimal temperature and pH
observed at 75OC and 7.0 respectively. The D value and half-life of the
enzyme at 75OC were 595 minutes and 179 minutes respectively with z
value of 20,85OC.
The crude enzyme activity was enhanced by addition of 2mM calcium,
zinc and manganese chloride.
SDSIPAGE-casein co polymerization analysis of the enzyme revealed
three protein bands possessing proteolytic activity; the molecular weights
of the major proteases were 65kD, 53kD and 42kD. The three proteases
might be different kinds of enzymes.
All of the proteases are
metalloproteases but the 65kD molecule was found as a PMSF sensitive
protease. The 42kD molecule is the most therrnostable and the enzyme
is also stable in the present of l%(w/v) urea, Sh(w1v) dithiotreitol and
2.5%(v/v) p-mercaptoethanol. The activity of all proteases were slightly
decreased by addition of I%(wlv) SDS, however, the supplementation of
5%(vlv) Triton X-100 increased the activity.
Keywords: therrnostable enzyme, neutral metalloproteases.
SUMMARY
BUDlASlH
WAHYUNTARI.
Purification
and
characterization
of
extracellular protease of an extreme thermophilic procaryote isolate from
Tangkuban
Perahu.
SUHARTONO (Chair
Supervised
of
Advisors),
by
MAGGY
ANTONIUS
THENAWIDJAJA
SUWANTO,
DEDl
FARDIAZ and DJUMALI MANGUNWIDJAJA (Co advisors).
Thermostable enzymes have attracted much attention of scientists and
industrial practitioners due to their superior properties as compared to the
mesophilic counterparts. The enzymes are also more stable at ambient
temperature and thus, show longer shelf life. Most thermostable enzymes
are
produced by thermophilic microorganisms.
The
habitats of
thermophilic microorganisms are usually areas related to geothermal
activity such as volcanoes, sea hydrothermal vents, hot springs etc.
The objectives of this experiment were to select an extreme
therrnophilic procaryote isolate with protease activity from Kawah Domas,
Tangkuban Perahu and to characterize the biochemical properties of the
enzyme.
Six protease producing thermophilic isolates (procaryote) designated
as 03, 05, 7.2, SA.1 I , TPS2 and TPS7 were selected for an extreme
thermophile.
The experiment was divided into several steps included
selection and identification of the isolate, characterization of crude
protease, purification of enzyme and characterization of the purified
enzyme.
Identification of selected isolate was
conducted by means of
morphological appearance, biochemical reaction as well as 16s rRNA
analysis.
Study on biochemical properties of the crude enzyme included type of
protease, type of substrate, molecutar weight, thermal stability, and
stability of the enzyme in the presence of detergent substances.
Enzyme purification step included precipitation using ammonium
sulfate, membrane ultrafiltration dialysis using 10kD molecular weight cut
off membrane, and fractionation of the enzyme using anion exchange
(DEAE
Sepharose
Fast
Flow)
and
gel
filtration
(Superdex 75)
chromatography.
Biochemical characterization of the purified enzyme was conducted
qualitatively by means of zymographic analysis method with 0.1% (w/v)
casein copolymerized in 80/0(w/v) PAGE.
Among six isolates selected, only one isolate (TPS2) belongs to
extreme thermophile.
However, it was discovered that TPS2 culture
contained more than one cell shape.
Upon purifcatiin, four individual
colony of the TPS2 spread on solid media were taken for further selection.
The four isolates designated as TPS2a, TPS2b, TPS2c and TPS2d.
TPS2d was chosen for further experiment based on the ability of protease
production and easiness of chromosomal DNA isolation.
The study
indicated that TPS2d is gram positive, rod like shape cell, non-spore
forming microorganism and capable of growing aerobically at 70°C.
Cluster analysis using FASTA3 program, a program from web site of
European Bioinformatics Institute (http:/hnrww/ebi.ac.uk), based on partial
sequence of 16s rRNA gene revealed that TPS2d has *90% identity to
Bacillus spp.
The dendrogram, which was constructed using "Tree Con"
program based on the cluster analysis, indicated that philogenetically the
isolate is related to 13.caldotenax with 67% level of confidence.
Using casein as a substrate, the optimum activity of the crude
extracellular protease was obsewed at 75OC and neutral pH. The enzyme
is also able to hydrolyze bovine serum albumin, gelatin, collagen and a
specific substrate for
(FAGLA).
thermolysin
N-[3-(2-Furyl)acryloil]-Gly-Leu-NH2
The presence of 1,0% (wlv) SDS decreased the enzyme
activity down to 88.79%, however, addition of 2.5%(vlv) Triton X-100
increased the activity up to 169%.
PMSF a specific serine protease
inhibitor at concentration of 2mM slightly decreased the enzyme activity
down to 84.94%. but EDTA a specific metalloprotease inhibitor at 2mM
almost totally inactivated the enzyme, with the remaining activity of
2.35%. This indicated that the crude extracellular proteases might consist
of serine and metalloproteases.
Observation on effect of cations on
enzyme activity showed that the activity was enhanced by 2mM calcium.
zinc and manganese chloride.
Thermal stability study of the enzyme showed that D value of the
enzyme at 75OC, 82OC, 85OC and 90°C were 595, 274, 197, and 113
minutes respectively with z value of 20.85OC. The half-life of the enzyme
at 75OC, 82OC, 85OC and 90°C were 179, 82, 59 and 34 minutes
respectivefy.
Zymographic analysis revealed that the crude enzyme solution
contains three kinds of proteases with approximate molecular weight of
65kD, 53kD and 42kD.
Heat treatment of the enzyrne in 50mM Tris/CI buffer containing 5mM
CaCI2 at pH 7.0 at 75OC for 30 minutes slightly decreased the threeprotease activity, however, heating the enzyme solution for 90 minutes
almost inactivated the 65kD and 53kD molecules but the 42kD stiW
showed its activity. When the enzyme solution was incubated at 85OC for
90 minutes the 65kD and 53kD molecules were almost inactivated, the
42kD enzyme remained active, even after heating for 30 minutes.
Incubation of the enzyme solution at 95OC for 5 minutes resulted in
inactivation of all the three protease-fractions
Study on effect of a serine protease inhibitor 2mM PMSF and a
metalloprotease inhibitcr 2mM EDTA showed that both inhibitors
inactivated the 65kD molecule, which indicated the molecule is a
metalloprotease with serine residue in its active site. However, PMSF did
not affect the 53kD and 42kD molecules but EDTA inactivated both
molecules which indicated that the two fractions being metalloproteases
with no serine residue in their active sites.
The presence of 1% SDS in enzyme solution decreased the three
proteases but 5% Triton X-100 enhanced the activity of the three
enzymes.
Study on the effect of denaturing agent on extracellular protease of
TPS2d showed that the 65kD protease was not stable in the presence of
1% (wlv) urea and 0.5°1,
(wlv) dithiotreitol, but the enzyme could stand
2.5%(v/v) p-rnercaptoethanol.
The 53kD and 42kD proteases could
tolerate the presence of l.O%(w/v) urea, 0.5°/00 (wlv) dithiotreitol and
2.5%(v/v) p-mercaptoethanol.
The above experiments concluded that all the three proteases could
be considered as thermostable proteases. Among the three proteases,
the 42kD molecule is the most thermostable.
BUDlASlH WAHYUNTARI.
Pemurnian dan
karakterisasi protease
ekstraseluler isolat prokariot thermofilik ekstrim dari Tangkuban Perahu.
Dibimbing oleh MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO (Ketua Komisi
Pembimbing), ANTONIUS SUWANTO, DEDl FARDIAZ and DJUMALI
MANGUNWIDJAJA (Anggota Komisi Pembimbing).
Enzim termostabil telah lama menarik perhatian ilmuan dan para
industriawan karena sifat-sifatnya yang lebih unggul dibandingkan dengan
enzim mesofilik. Enzim tersebut lebih stabil pada suhu ruang sehingga
mempunyai umur simpan lebih lama.
dihasilkan oleh mikroba termofilik.
Kebanyakan enzim termostabil
Habitat mikroba termofilik biasanya
adalah tempat-tempat yang berhubungan dengan kegiatan geotermal
seperti gunung berapi, sumber air panas dilaut maupun didarat dan
sebagainya.
Tujuan penelitian ini adalah memilih satu isorat prokariot termofilik
ekstrim yang memproduksi protease ekstraseluler dari Kawah Domas,
Tangkuban Perahu dan mengkarakterisasi sifat biokimia protease
tersebut.
Enam isolate prokariot temofilik penghasil protease ekstraseluler yang
diberi kode 03, 05. 7.2, TPS2 dan TPS7 dipilah untuk mendapatkan isolat
termofilik ekstrim. Percobaan yang dilakukan dibagi menjadi beberapa
tahap yaitu pemilahan dan identifikasi isolat, karakterisasi protease kasar,
pemurnian enzim dan karakterisasi enzim rnurni.
viii
Karakterisasi isolat terpilih meliputi pengamatan morfologi isolat,
reaksi biokimia dan analisis gen penyandi 76s rRNA.
Sifat protease yang diamati adalah jenis protease, jenis substrat,
bobot molekul, kestabilan panas, dan kestabilan enzim terhadap bahan
deterjen. Tahap pernurnian enzim yang dilakukan adalah pengendapan
protein enzim rnenggunakan amonium sulfat, dialisis dengan membran
ultrafiltrasi dengan membran 10kD MWCO, kromatografi penukar anion
DEAE Sepharose Fast Flow dan filtrasi gel dengan Superdex 75.
Karakterisasi sifat biokimia enzim murni dilakukan secara kualitatif
menggunakan metode zimografik dengan kopolimerisasi kasein 0 , l%(b/v)
kedalam PAGE 8%(b/v).
Diantara enarn isolat yang dipilah, hanya ada satu isolat yang
tergolong isolat prokariot termofilik ekstrim yaitu TPS2.
Akan tetapi
pengamatan selanjutnya menunjukkan bahwa dalam kultur TPS2 terdapat
lebih dari satu bentuk sel. Dari kultur sebar TPS2 pada media padat yang
mengandung skim milk diambil empat koloni terpisah yang masingmasing diberi kode sebagai TPS2a, TPSZb, TPS2c dan TPSZd. TPS2d
dipilih untuk digunakan dalarn penelitian selanjutnya berdasarkan
kemampuannya memproduksi protease ekstraseluler dalarn media cair
dan kernudahan untuk mengisolasi DNA kromosom.
Hasil pengamatan rnenunjukkan bahwa set TPS2d berbentuk batang.
bersifat gram positif dan tidak memproduksi spora serta mampu tumbuh
secara aerob pada suhu 70°C.
Analisis cluster menggunakan program FASTA3, dari web site
European Bioinformatics Institute (http:llwww/ebi.ac.uk),
berdasarkan
sebagian sekuen gen penyandi 16s rRNA menunjukkan bahwa isolat
TPS2d
memiliki kemiripan *90%
dengan
Bacillus
spp.
Dalam
dendrogram yang dikonstruksi menggunakan program "Tree Con"
berdasarkan analisis cluster sebelumnya, dalarn fifogeni bakteri isolat
TPS2d mempunyai hubungan terdekat dengan
B. caldotenax
pada
tingkat kepercayaan 67%.
Menggunakan kasein sebagai substrat, aktivitas optimum larutan
protease ekstraseluler kasar ditemukan pada suhu 75OC dan pH sekitar
netral.
Protease tersebut juga mampu menghidrolisis serum albumin
bovin, gelatin, kolagen dan substrat spesifik untuk termolisin N-[3-(2Furyl)acryloiI]-Gly-Leu-NH2
(FAGLA).
Penambahan
SDS
7%(blv)
menyebabkan penurunan aktivitas enzim menjadi 88,79% tetapi adanya
Triton X-100 2,5%(v/v) meningkatkan aktivitas enzim hingga 169%.
Penghambat
spesifik
menurunkan aktivitas
protease
enzim
serin
PMSF
2mM
menjadi 84,9496 tetapi
hanya
sedikit
penambahan
penghambat spesifik protease logam EDTA 2mM hampir menginaktifkan
enzirn secara total dengan sisa aktivitas hanya 2'15%.
Hal tersebut
menandakan bahwa dalam larutan kasar enzim ekstraseluler TPS2d
terdapat protease logam dan serin.
Pengarnatan pengaruh kation
menunjukkan bahwa aktivitas enzim ditingkatkan oleh kalsium, seng dan
mangan klorida 2mM.
Studi kestabilan panas enzim mendapatkan bahwa nilai D pada suhu
75OC, 82OC, 85OC dan 90% masing-masing berturut-turut adalah 595,
274, 197, dan 113 menit dengan nilai z 20.85OC. Sedangkan umur paruh
enzim pada 75OC, 82OC, 85OC dan 90°C masing-masing berturut-turut
adalah 179, 82, 59 and 34 menit.
Analisis zimografik rnenyatakan bahwa dalam larutan protease
ekstraseluler TPSPd terdapat sedikitnya tiga jenis protease yang berbeda
dengan berat molekul masing-masing 65kD, 53kD dan 42kD.
Pemanasan enzim dalam larutan penyangga TrisICI 50mM yang
mengandung CaC12 5mM, pH 7,O pada 75OC selama 30 menit hanya
sedikit menurunkan aktivitas ketiga protease.
Pemanasan pada suhu
yang sarna selama 90 menit menginaktivkan protease 65kD dan 53kD
tetapi tidak mempengaruhi aktivitas protease 42kD. Pemanasan larutan
enzim pada 85OC selama 10 rnenit rnenginaktivkan molekul 65kD dan
53kD tetapi molekul 42kD masih menunjukkan aktivitas walaupun telah
dipanaskan selama 30 rnenit. lnkubasi larutan enzirn pada 95OC selama
5 menit menginaktivkan semua protease.
Studi pengaruh penghambat protease serin PMSF dan protease
logam EDTA menunjukkan bahwa protease 65kD diinaktivkan oleh kedua
jenis penghambat tersebut.
Hal ini menunjukkan bahwa protease
tersebut adalah protease logarn yang mengandung residu serin pada sisi
aktifnya.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa protease 53kD dan
42kD tidak dipengaruhi oleh PMSF 2mM tetapi diinaktivkan oleh EDTA
2mM yang rnengindikasikan bahwa kedua protease tersebut adalah
protease logarn.
Penarnbahan SDS 1°h(blv) dalarn larutan enzirn menurunkan aktivitas
ketiga jenis protease tetapi adanya 5Oh(v/v) Triton X-100 meningkatkan
aktivitas ketiganya.
Studi pengaruh senyawa pendenaturasi terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d menunjukkan bahwa rnolekut 65kD tidak tahan
terhadap urea 1%(b/v) dan ditiotreitol 0,5O/,
mercaptoethanol 2,5%(v/v).
(blv) tetapi tahan terhadap p-
Protease 53kD dan 42kD toleran terhadap
urea ?%(bhr),ditiotreitol 0,5°10, (blv) dan p-rnercaptoethanol2,5%(vIv).
Berdasarkan percobaan diatas dapat disirnpulkan bahwa ketiga
protease ekstraseluler TPS2d adalah protease terrnostabil.
Diantara
ketiga protese tersebut. rnolekul 42kD adalah protease logarn yang paling
stabil terhadap panas.
xii
PEMURNIAN DAN KARAKTERlSASl PROTEASE
EKSTRASELULER ISOLAT PROKARIOT TERMOFlLlK
EKSTRIM DARl TANGKUBAN PERAHU
Oleh:
BUDlASfH WAHYUNTARI
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
dalam bidang llmu Pangan
pada
Program Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2001
xiii
Judul
: Pemurnian
dan
karakterisasi
protease
ekstraseluler isolat prokariot termofilik ekstrim
dari Tangkuban Perahu
Nama mahasiswa : Budiasih Wahyuntari
Nomor pokok
: 9453111LMU PANGAN
Menyetujui:
I.
Kornisi Pembimbing
,
'
Prof. Dr. Ir. ~ d q T.v Suhartono
Ketua Komisi
Dr. Ir. Antonius Suwanto. M Sc
Anggota Kornisi
Anggota Komisi
/-.Anggota Komisi
2. Ketua Program Studi
-
uq&&:
-
Prof.Dr.lr.B.Sm-i Laksrni Jenie,M
Tanggal Lulus
: Kamis, 22 Februari 2001
Manuwoto, MSc
UCAPAN TERJMA KASlH
Alhamdulillah hi
Robil Alarnin
hanya
berkat rakhmat Allah
subhanallahu wa taala, akhirnya penulis dapat menyelesaikan program
Doktor pada Pascasarjana di lnstititut Pertanian Bogor.
Program ini tidak mungkin selesai tanpa bantuan dari banyak fihak.
oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih
dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada:
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawijaya Suhartono atas kesabarannya
rnemberikan bimbingan dari saat penulis rnemulai program Pascasarjana,
penelitian hingga penulisan disertasi serta perhatian yang besar dan
dorongan semangat saat penulis mengalami kesulitan dan hambatan
dalam melaksanakan penelitian.
Juga terirnakasih atas kepercayaan
yang diberikan kepada penulis untuk turut bergabung dalam mengerjakan
Proyek Kerjasarna antara Pusat Antar Universitas Bioteknologi, lnstitut
Pertanian Bogor dengan Bioproduct Research Center, Yonsey University,
Korea dengan segala fasilitas yang diberikan kepada penulis.
Prof. Dr. Ir. Srikandi Fardiaz, MSG(Alm) yang telah memperkenalkan
penulis dengan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono atas pemberian saran
yang sangat berharga dalarn penyusunan usulan peneiitian.
Dr. ir. Antonius Suwanto, MSc atas kesediaannya mernberikan jalan
keluar
atas
masalah-masalah selama
penulis
mengikuti
program
Pascasarjana dan dalam penelitian maupun saran dasam penulisan
disertasi.
Prof. Dr. Ir. Dedi Fardiaz, MSc atas saran dan rnasukan yang
diberikan selama diskusi dalam penyusunan usulan penelitian dan
penulisan disertasi.
Prof. Dr. Djumali Mangunwidjaja atas arahan dan koreksi yang teliti
pada penulisan disertasi ini.
Dr. Dahrul Syah dan Dr. Mahyudin Abdul Rachman selaku penguji luar
Komisi Pernbimbing, atas saran-sarannya untuk kesernpurnaan penulisan
disertasi ini.
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi atas kesempatan dan
beasiswa yang diberikan untuk mengikuti program Pascasarjana di IPB.
Dr. Ir. lrawadi Jamaran mantan Deputi Ketua Bidang Teknologi
Agroindustri dan Bioteknologi, BPP Teknologi yang memberi kesernpatan
kepada penulis untuk bertugas di Laboratorium Teknologi Agroindustri
dan Bioteknologi, Ciampea, Bogor sehingga penulis bisa rnenyelesaikan
penelitian.
Dr. Suyanto Pawiroharsono selaku Direktur dan segenap temanternan
di
Direktorat
Teknologi
Bioindustri.
BPP
Teknologi
atas
pengertiannya karena penulis tidak banyak terlibat dalam tugas kantor
selama melakukan penelitian hingga penulisan disertasi ini.
Tami Idiyanti, MSc selaku Kepala Laboratoriurn Mikrobiologi, Pusat
Penelitian dan
Pengembangan
Kimia Terapan,
LIP1 di
Serpong,
Tangerang atas ijin, saran, bantuan dan dorongan semangat yang
diberikan selama penelitian.
Juga Ai, dan teman-teman lain di P3KT,
terimakasih atas persahabatan dan bantuannya.
Wenu,
lndri
dan
Yaya,
terimakasih
atas
persahabatan
dan
kesediaannya menyediakan waktu diantara waktu mereka yang sangat
sempit saat melakukan pelatihan atau Program Postdoctoral di luar negeri
untuk mencarikan dan mengirimkan jurnal-jurnaf.
Prof. Dr. Garabet Antranikian dan Prof. Dr. Bertus Van den Burg atas
kiriman jurnal-jurnalnya,
Prof. Dr. John Walker atas pemberian buku
"Practical Biochemistry" dan saran-sarannya serta Prof. Dr. F. Meinhardt
atas dorongan semangat yang diberikan.
Wibowo. Nisa, Emmy Hala, lrawan Tan. Dwi Suryanto, Yogi. Rina,
Esti, bu Ika dan teh Eni juga teman-ternan lainnya di Laboratorium
Mikrobiologi dan
Biokimia,
PAU
Bioteknologi,
IPB,
serta
Ari
di
Laboratorium Mikrobiologi Pangan, PAU Pangan dan Gizi, IPB terima
kasih atas persahabatan dan bantuan yang diberikan selama penulis
melakukan penelitian.
Roya, Bambang dan Yusuf di Direktorat Teknologi Agroindustri, BPP
Teknologi, terima kasih atas persahabatan, dorongan semangat dan
bantuannya untuk meringankan tugas-tugas kantor yang harus penulis
selesaikan selama penulis melakukan penelitian.
Atik dan Vita terima kasih atas persahabatan, doa dan dorongan
semangat yang selalu diberikan.
xvii
Ade, Hendar dan Alex dan ternan lainnya di Laboratorium Teknofogi
Agroindustri dan Bioteknologi (TAB), BPP Teknologi, Ciampea , Bogor
atas
bantuan dan kesediaannya untuk membantu dan menemani
walaupun diluar jam kerja. Semua anggota Satpam Laboratorium TAB,
Ciarnpea, Bogor atas kesediaannya menernani penulis saat rnelakukan
penelitian hingga farut malam.
Kedua orang tua penulis, Almarhum Bapak R. M. Solichien dan
lbunda R. Ngt. Sutari Solichien atas kasih sayang, dorongan semangat
dan doa yang tak terputuskan, adik-adik Dete, Nining, Sasongko, Didik,
Bambang, Sulistiono, Sri, nDari, serta keponakan Metta, Endra, Dito dan
yang lainnya atas kasih sayang dan doa yang selalu diberikan.
Segenap teman dan kerabat lain yang tidak dapat penulis sebutkan
satu persatu, terimakasih yang tak terhingga atas perhatian, dorongan
semangat dan kasih sayang yang diberikan kepada penulis, semoga apa
yang telah anda sernua berikan menjadi arnal kebaikan dan mendapat
balasan yang berlipat dari Allah subhanallahu wa taala. Amien.
Bogor, Februari 2001
Penulis
KATA PENGANTAR
Akhir-akhir
ini
masalah
masyarakat, termasuk
lingkungan
dampak
menjadi
lingkungan yang
perhatian
besar
disebabkan oleh
kegiatan industri dan kegiatan kehidupan lainnya. Oleh karena itu orang
mulai mencari proses-proses yang ramah atau arnan bagi lingkungan.
Sejalan dengan itu, penggunaan enzim dalam industri rneningkat dengan
cepat
karena
enzim
rnerupakan
senyawa
organik
yang
mudah
terdegradasi dialam sehingga dianggap sebagai bahan yang aman bagi
lingkungan.
Untuk rnemenuhi perrnintaan yang meningkat baik daIam
kuantitas rnaupun kualitas, terjadi kecenderungan pencarian enzim yang
merniliki stabilitas tinggi terhadap
kondisi lingkungan proses dan
penyirnpanan. Kondisi lingkungan yang dimaksud antara lain pH, suhu
dan medium reaksi.
Dalam perdagangan enzim dunia, protease memberikan kontribusi
yang terbesar yaitu merupakan 60% dari enzim yang diperdagangkan.
40% dari protease tersebut merupakan protease mikroba dan 25% dari
enzim mikroba yang diperdagangkan merupakan enzim terrnofilik (Rao,
et. a/, 1998). Protease dimanfaatkan dalarn berbagai bidang industri
antara lain industri pangan, farmasi, deterjen, kulit dan lain-lainnya.
Dalam
penelitian ini dilakukan pemilihan
isolat yang
memiliki
kemarnpuan tinggi untuk memproduksi protease serta merniliki stabilitas
tinggi terhadap lingkungan ekstrim dari beberapa isolat yang telah
diisolasi dari lingkungan ekstrim yaitu Kawah Domas di daerah Kawah
Tangkuban Perahu. Selanjutnya dilakukan identifikasi isolat, pemurnian
serta
karakterisasi sifat
biokimia
protease yang
dihasilkan
untuk
mengetahui kondisi optimum bagi pemanfaatan dan penyimpanannya dan
sebagai dasar bagi penelitian selanjutnya.
Bogor, Februari 2001
Penulis
DAFTAR 1st
Hafaman
KATA PENGANTAR
xix
DAFTAR IS1
xxi
DAFTAR GAMBAR
xxiii
DAFTAR TABEL
xxv i
DAFTAR LAMPIRAN
xxvi i
DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN
xxviii
DAFTAR TABEL LAMPIRAN
xxix
PENDAHULUAN
Latar belakang
Tujuan penelitian
Manfaat penelitian
Waktu dan tempat penefitian
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme ekstrim terrnofilik
Habitat Mikroorganisme ekstrim termofilik
Identifikasi mikroba
Enzim termostabil
Protease
Pemurnian enzim
BAHAN DAN METODOLOGI
Bahan
Alat
Metodologi
Pemilahan isolat
Laju pertumbuhan isolat dan produksi protease
ldentifikasi isolat
Pengamatan morfologi
Pengamatan reaksi biokimia
lsolasi dan pemurnian DNA
Amplifikasi dan analisis sekuen 16s rRNA
Pemurnian dan karakterisasi protease:
Pemurnian protease
xxi
DAFTAR IS1
(lanjutan)
Halaman
Uji protein
47
48
Uji aktivitas protease
Pengaruh suhu dan pH
48
Pengaruh penghambat protease spesifik, kation, deterjen
dan pereaksi denaturasi
49
Analisis elektroforesis gel dan zimografik
50
Hidrolisis protein
52
Hidrolisis peptida
53
Kestabilan panas protease
54
HASlL PENELlTlAN DAN PEMBAHASAN
Penelitian Pendahuluan
Pernilahan isolat terrnofilik ekstrim
ldentifikasi isolat TPS2d
Pengamatan reaksi biokimia
Analisis 16s rRNA
Laju perturnbuhan dan produksi protease TPS2d
Pernurnian dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler
Karakterisasi larutan protease ekstraseluler
Pengaruh suhu dan pH
Pengaruh PMSF dan EDTA
Pengaruh kation
Pengaruh SDS dan Triton X-100
Kestabilan protease terhadap panas
Zimogram dan bobot masa protease
Hidrofisis protein
Pemumian protease
Pengendapan protein
Penentuan pH penyerapan dan pelepasan protein oleh
rnatriks penukar ion
Pemumian protease dengan kromatografi kolom
Kromatografi penukar ion
Kromatografi filtrasi gel
Karakterisasi enzim murni
Pengaruh suhu
Pengaruh penghambat protease
Pengaruh pereaksi denaturasi dan bahan deterjen
Hidrolisis peptida
DAFTAR PUSTAKA
99
DAFTAR GAMBAR
Nomor
Halaman
Gambar
1. Enam isolat dari Kawah Domas, Tangkuban
Perahu
57
Zona bening isolat TPS2 pada suhu 60°C dan
70°C
57
Pengamatan mikroskopis hasil pewarnaan gram
dan spora isolat TPS2
58
Pengamatan mikroskopis hasil pewarnaan gram
isolat TPS2a, TPS2b, TPS2c dan TPS2d
58
Hubungan antara absorbans larutan fermentasi
isolat TPS2a, TPS2b, TPS2c dan TPS2d dengan
aktivitas protease ekstraseluler
Sebagian sekuen DNA penyandi 16s rRNA isolat
TPS2d hasil penggandaan primer 63f
Dendrogram isolat TPS2d dalam filogeni bakteri
berdasarkan sekuen sebagian gen penyandi 16s
rRNA
taju penumbuhan dan produksi protease
ekstraseluler isolat TPS2d pada 70°C.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d.
?O.
Pengaruh pH terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d
11.
Pengaruh pengharnbat spesifik protease dan
deterjen terhadap aktivitas protease ekstraseluler
TPS2d
67
Pengaruh beberapa kation terhadap
protease ekstraseluler TPS2d
69
12.
aktivitas
xxiii
DAFTAR GAMBAR
(lanjutan)
Nomor
Gambar
Halaman
13. Pengaruh ion kalsiurn terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d
69
Pengaruh suhu terhadap kestabilan aktivitas
larutan kasar protease ekstraseluler TPS2d
73
Hubungan antara logaritma nilai D protease
ekstraseluler TPS2d dengan suhu pemaparan
74
Hasil uji elektroforesis (SDSIPAGE & SDSIPAGEkasein) larutan kasar protease ekstraseluler
TPS2d
77
Hidrolisis beberapa jenis protein oleh larutan
enzim kasar protease ekstraseluler TPS2d
78
Hidrolisis serum albumin bovin 0,196 oleh larutan
enzim kasar protease ekstraseluler TPS2d.pada
37OC dan 75OC.
80
Pengaruh pH terhadap kelarutan protein dalam
larutan enzim kasar
83
Hubungan antara aktivitas protease
endapan protein dengan pH pengendapan
84
pada
Grafik fraksinasi protease ekstraseluler TPS2d
menggunakan
kromatografi
kolom
DEAE
Sepharose Fast Flow
85
Elektroforesis gel protease ekstraseluler TPS2d
(SDSIPAGE dan Zimogram)
86
Grafik
fraksinasi
protease
ekstraseluler
menggunakan kromatografi kolom Superdex 75
87
Pengaruh pemanasan terhadap pita protease
ekstraseluler TPS2d
90
xxiv
DAFTAR GAMBAR
tlanjutan)
Nomor
25.
26.
27.
Gambar
Halaman
Zimogram: pengaruh larutan penyangga contoh
asal dan pendenaturasi terhadap protease
ekstraseluler TPS2d
91
Zimogram: pengaruh PMSF & EDTA terhadap
aktivitas pita protease ekstraseluler TPS2d
92
Zimogram: pengaruh pereaksi denaturasi atau
deterjen terhadap pita protease ekstraseluler
TPS2d
DAFTAR TABEL
Hataman
1.
Tata nama mikroba suhu tinggi
6
2.
Tata nama mikroba suhu tinggi
6
3
4.
Ciri kebanyakan lingkungan alam ekstrirn
10
Resolusi relatif beberapa teknik analisis DNA
12
5. Simbion bakterial dan archaeal dari protozoa dianalisa
dengan pendekatan rRNA
Pemilahan protease
Protease ekstrim dan hipertermofilik
Homologi dan kestabilan panas protease netral dari
spesies Bacillus
Senyawa untuk pengendapan protein
Metode kromatografi untuk fraksinasi protein
Metode ekstraksi dan pemurnian protease termofilik
Nilai D, tx dan z larutan kasar protease ekstraseluler
TPS2d dan nilai t .termolisin
~
Ringkasan hasil pernumian protease ekstraseluler TPS2d
Karakteristik protease ekstraseluler TPS2d
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1.6.
1.7.
1.8.
2
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
Halaman
PROSEDUR PENGUJIAN
Pengujian kadar protein metode Bradford
Metode pengukuran aktifitas protease.
Modifikasi metode Walter
Modifikasi metode Kunitz
Pembuatan larutan penyangga universal
Pewarnaan gram metode Cappuccino & Sherman
lsolasi DNA aenom
Pembuatan pereaksi elektroforesis gel akrilamida
Modifikasi analisis SDSIPAGE dan zimografik
metode Frejdrich & Antranikian
Pewarnaan perak gel elektroforesis metode
Walker
HASlL PENELITIAN
Penelitian pendahuluan: Karakterisasi protease
ekstraseluler TPS2
Pengujian reaksi biokimia isoiat TPS2d
Analisis 16s rRNA isolat TPS2d
Analisis cluster isolat TPS2d dafam filogeni bakteri
Pengendapan protein larutan enzim ekstraseluler
TPS2d
xxvii
DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN
Nomor
L2.1.
Gambar
Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease
ekstrasetuler TPS2
Pengaruh pH terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2
Pengaruh inhibitor protease terhadap aktivitas
protease ekstraseluler TPS2
Penga~h
beberapa kation bivalen terhadap
aktivitas protease ekstraseluler TPS2
Kestabilan protease ekstraseluler TPS2 pada
75%
Kestabilan protease ekstraseluler TPS2 pada 5OC
Aktivitas dan kadar protein fraksi enzim
ekstraseluler TPS? hasil kromatografi kolom
DEAE Sephadex A50
SDSIPAGE dan zimogram protease ekstraseluler
TPS2
Hasil PCR gen penyandi 16s rRNA isolat TPS2d
Pengendapan protein larutan fermentasi TPS2d
dengan amonium sulfat
Halaman
DAFTAR TABEL LAMPIRAN
Nomor
Tabel
L2.1.
Pemurnian protease ekstraseluler TPS2
L2.2.
Reaksi biokimia isolat TPS2d
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Protease mikroba merupakan salah satu enzim hidrolitik yang penting
dalam perdagangan enzirn di dunia. Protease meliputi 60% dari total
enzim yang diperdagangkan. 40% dari total protease merupakan protease
mikrobial (Rao, el at 1998). Protease dihasilkan oleh hewan, tumbuhan
rnaupun mikroba. Dari segi ekonomi protease mikroba merupakan enzim
yang mempunyai peranan paling penting, mengingat kelebihan yang
dimilikinya. Mikroba dapat dibiakkan dalam waktu relatif singkat sehingga
enzim dapat diproduksi dalam jumlah besar dan peningkatan produksinya
relatif lebih mudah. Oalam perdaganganpunenzim mikroba m e ~ p a k ajenis
n
enzim yang memberikan kontribusi ferbanyak.
Protease dimanfaatkan
dalam industri pangan, farmasi, kulit, deterjen dan bioindustri lainnya.
Dalam industri pangan protease antara lain digunakan dalam proses
pembuatan keju, bir, roti, protein hidrolisat, rekayasa protein, pelarutan
protein dan lain-lain.
Dalam proses pengolahan pangan, kondisi higienik merupakan salah
satu syarat mutlak, sedangkan pada umumnya, enzim yang tersedia
memerlukan kondisi yang lunak serta bekerja pada suhu lingkungan yang
dapat mernungkinkan terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme sehingga
kondisi higienik tidak bisa tercapai. Peningkatan suhu proses pada tingkat
tertentu
selain
dapat
mengurangi kemungkinan
kontaminasi
oleh
mikroorganisme juga akan meningkatkan laju reaksi yang dikehendaki
sehingga akan mempersingkat waktu yang diperlukan. Telah ditemukan
sejumlah mikroorganisme termofilik yang menghasilkan enzim ekstraseluler
yang mempunyai kemampuan menghidrolisis polimer seperti protein, pati
dan selulosa (Antranikian.et a1 1995).
Kebanyakan mikroorganisme
Dalam dasawarsa
tersebut tumbuh optimal pada kisaran suhu 60°C-75OC.
terakhir baru dimungkinkan untuk rnengisolasi mikroorganisme yang dapat
tumbuh optimal pada suhu diatas 100°C.Eksplorasi mikroorganisme dari
lingkungan ekstrim diharapkan untuk dapat memperoleh enzim-enzim yang
dapat bekerja pada kondisi ekstrim, antara lain pada suhu, pH dan kadar
garam tinggi atau dalam pelarut organik dimana mikroorganismeyang tidak
dikehendaki tidak dapat berkembang. Lingkungan ekstrim yang dimaksud
antara lain habitat geotermal seperti sumber air panas, daerah solfatarik,
kawah gunung berapi dan hidrotermal laut dalam.
Dalam penetitian ini dilakukan pemilahan isolat penghasil protease yang
mampu tumbuh pada suhu diatas 6WC, pernurnian dan karakterisasi sifatsifat biokimia protease ekstrasefuler yang diproduksi dan identifikasi isolat
yang paling potensial. Mikroba diisolasi dari tanah Kawah Domas, daerah
Tangkuban Perahu, Jawa Barat.
Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan memperoleh isolat termofilik ekstrim penghasil
protease yaitu isolat yang mampu turnbuh dan menghasilkanprotease pada
suhu lebih tinggi daripada 60°C dan menelaah sifat-sifat biokirnia protease
ekstraseluler yang diproduksinya. Sifat enzim yang akan ditelaah meliputi,
bobot molekul, jenis enzim, jenis reaksi dan substrat, sifat kinet~ka,serta
stabilitas enzim terhadap ringkungan reaksi dan penyimpanan. Selain itu
juga dilakukan identifikasi isolat terpilih.
Manfaat Penelitian
Protease termofilik akan sangat berguna dalam industri yang
memerlukan proses aseptis atau proses lain yang lebih efektif apabila
diterapkan pada suhu relatif tinggi. Penelaahan sifat biokimia enzim adalah
untuk memahami karakteristik aktivitas enzim termofilik ekstrim sehingga
dapai diketahui kondisi optimum bagi kerja. penyimpanandan penanganan
enzim.
Pemahaman sifat biokimia diharapkan akan sangat berguna dalam
menentukanjenis pemanfaatan enzim secara optimal dan tepat, serta akan
bermanfaat untuk penelitian biokimia molekuler selanjutnya.
Waktu dan ternpat penelitian
Penelitian dilakukan bulan Agustus 1997 sampai dengan Agustus 2000
di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas lnstitut
Pertanian Bogor, Kampus Darmaga, Bogor, Laboratorium Teknologi
Agroindustri dan Bioteknologi, Badan Pengkajian dan PenerapanTeknologi,
Ciampea, Bogor dan Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Penelitian dan
Pengembangan Kirnia Terapan, Lernbaga llmu Pengetahuan Indonesia di
Serpong, Tangerang.
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme termofilik ekstrim
Mikroorganisme termofilik yang mampu tumbuh pada suhu 50°C-60°C
telah lama diketahui, akan tetapi sejak dipublikasikannya bakteri Thermus
aquaficus yang diketemukan di sumber air panas di Yellowstone National
Park, U.S.A yang mampu tumbuh pada suhu lebih tinggi dari pada 70°C
oleh Brock & Freeze (1969) barulah diketahui adanya kehidupan pada
suhu diatas 70°C.
Akan tetapi, batasan seberapa tinggi suhu untuk
kehidupan hingga kini belum diketahui dengan pasti. Eksplorasi di lokasi
yang berkondisi ekstrirn seperti area kawah gunung berapi yang masih
aktif hampir di seluruh bagian dunia, hidrotermal laut dalam. daerah kutub
dan wilayah dengan kondisi ekstrim lainnya yang dilakukan oleh
beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba
ekstrimofitik
.
Brock (1986) mengemukakan definisi organisme termofilik adalah
organisme yang mampu turnbuh pada suhu diafas 55OC-60°C.
Dengan
ditemukan organisme termofilik yang mampu tumbuh sampai suhu
d~sekitar bahkan diatas titik didih air, selanjutnya beberapa peneliti
memilah mikroba termofilik menjadi beberapa kelompok menurut suhu
perturnbuhannya dengan batasan suhu yang berbeda. Cowan (1992)
mengklasifikasi organisme termofilik berdasarkan batasan suhu minimum,
optimum dan maksimum sebagai disajikan dalam Tabel 1 Sedangkan
Rudiger,
et
a1 (1994)
mengelompokkan mikroorganisme termofilik
berdasarkan batasan kisaran suhu pertumbuhan seperti terlihat pada
Tabel 2.
Tabel 7 . Tatanama mikroba suhu tinggi (Cowan, 1992)
Pertumbuhan
minimun
Terminologi
Termofil
Ekstrim termofil
Hipertermofil
Pertumbuhan
optimum
("C)
("C)
240
=-65
tidak
ditentukan
>lo0
230
Pertumbuhan
maksimum
("C)
250
>60
>70
EKSTRASELULER iSOLAT PROKARIOT TERMOFlLlK
EKSTRIM DARl TANGKUBAN PERAHU
Oleh:
BUDIASIH WAHYUNTARI
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2001
ABSTRACT
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF EXTRACELLULAR
PROTEASE OF AN EXTREME THERMOPHILIC PROCARYOTE
ISOLATE FROM TANGKUBAN PERAHU
Supervised by MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO (Chair of
Advisors), ANTONlUS SUWANTO, DEDl FARDIAZ and DJUMALI
MANGUNWIDJAJA (Co advisors)
Six thermophilic procaryote isolates, which produce extracellular
protease, were collected from soil of Kawah Domas, Tangkuban Perahu,
West Java, Indonesia. The objectives of this work were to screen for an
extreme thermophilic isolate and to study biochemical characteristics of
the extracellular protease that will be useful for further biotechnological or
industrial application.
An extreme thermophilic isolate TPS2d was selected. The isolate is
gram positive with rod like cell, capable of growing aerobically at 70°C.
Based on ~ a r t i a seauence
l
of 16s-rRNA gene. the isolate belongs to
genus of tiacillus with approximately 90% Tdentky. hil lo genetically the
isolate related to Bacillus caldotenax with 67% level of confidence.
The crude enzyme is thermostable with optimal temperature and pH
observed at 75OC and 7.0 respectively. The D value and half-life of the
enzyme at 75OC were 595 minutes and 179 minutes respectively with z
value of 20,85OC.
The crude enzyme activity was enhanced by addition of 2mM calcium,
zinc and manganese chloride.
SDSIPAGE-casein co polymerization analysis of the enzyme revealed
three protein bands possessing proteolytic activity; the molecular weights
of the major proteases were 65kD, 53kD and 42kD. The three proteases
might be different kinds of enzymes.
All of the proteases are
metalloproteases but the 65kD molecule was found as a PMSF sensitive
protease. The 42kD molecule is the most therrnostable and the enzyme
is also stable in the present of l%(w/v) urea, Sh(w1v) dithiotreitol and
2.5%(v/v) p-mercaptoethanol. The activity of all proteases were slightly
decreased by addition of I%(wlv) SDS, however, the supplementation of
5%(vlv) Triton X-100 increased the activity.
Keywords: therrnostable enzyme, neutral metalloproteases.
SUMMARY
BUDlASlH
WAHYUNTARI.
Purification
and
characterization
of
extracellular protease of an extreme thermophilic procaryote isolate from
Tangkuban
Perahu.
SUHARTONO (Chair
Supervised
of
Advisors),
by
MAGGY
ANTONIUS
THENAWIDJAJA
SUWANTO,
DEDl
FARDIAZ and DJUMALI MANGUNWIDJAJA (Co advisors).
Thermostable enzymes have attracted much attention of scientists and
industrial practitioners due to their superior properties as compared to the
mesophilic counterparts. The enzymes are also more stable at ambient
temperature and thus, show longer shelf life. Most thermostable enzymes
are
produced by thermophilic microorganisms.
The
habitats of
thermophilic microorganisms are usually areas related to geothermal
activity such as volcanoes, sea hydrothermal vents, hot springs etc.
The objectives of this experiment were to select an extreme
therrnophilic procaryote isolate with protease activity from Kawah Domas,
Tangkuban Perahu and to characterize the biochemical properties of the
enzyme.
Six protease producing thermophilic isolates (procaryote) designated
as 03, 05, 7.2, SA.1 I , TPS2 and TPS7 were selected for an extreme
thermophile.
The experiment was divided into several steps included
selection and identification of the isolate, characterization of crude
protease, purification of enzyme and characterization of the purified
enzyme.
Identification of selected isolate was
conducted by means of
morphological appearance, biochemical reaction as well as 16s rRNA
analysis.
Study on biochemical properties of the crude enzyme included type of
protease, type of substrate, molecutar weight, thermal stability, and
stability of the enzyme in the presence of detergent substances.
Enzyme purification step included precipitation using ammonium
sulfate, membrane ultrafiltration dialysis using 10kD molecular weight cut
off membrane, and fractionation of the enzyme using anion exchange
(DEAE
Sepharose
Fast
Flow)
and
gel
filtration
(Superdex 75)
chromatography.
Biochemical characterization of the purified enzyme was conducted
qualitatively by means of zymographic analysis method with 0.1% (w/v)
casein copolymerized in 80/0(w/v) PAGE.
Among six isolates selected, only one isolate (TPS2) belongs to
extreme thermophile.
However, it was discovered that TPS2 culture
contained more than one cell shape.
Upon purifcatiin, four individual
colony of the TPS2 spread on solid media were taken for further selection.
The four isolates designated as TPS2a, TPS2b, TPS2c and TPS2d.
TPS2d was chosen for further experiment based on the ability of protease
production and easiness of chromosomal DNA isolation.
The study
indicated that TPS2d is gram positive, rod like shape cell, non-spore
forming microorganism and capable of growing aerobically at 70°C.
Cluster analysis using FASTA3 program, a program from web site of
European Bioinformatics Institute (http:/hnrww/ebi.ac.uk), based on partial
sequence of 16s rRNA gene revealed that TPS2d has *90% identity to
Bacillus spp.
The dendrogram, which was constructed using "Tree Con"
program based on the cluster analysis, indicated that philogenetically the
isolate is related to 13.caldotenax with 67% level of confidence.
Using casein as a substrate, the optimum activity of the crude
extracellular protease was obsewed at 75OC and neutral pH. The enzyme
is also able to hydrolyze bovine serum albumin, gelatin, collagen and a
specific substrate for
(FAGLA).
thermolysin
N-[3-(2-Furyl)acryloil]-Gly-Leu-NH2
The presence of 1,0% (wlv) SDS decreased the enzyme
activity down to 88.79%, however, addition of 2.5%(vlv) Triton X-100
increased the activity up to 169%.
PMSF a specific serine protease
inhibitor at concentration of 2mM slightly decreased the enzyme activity
down to 84.94%. but EDTA a specific metalloprotease inhibitor at 2mM
almost totally inactivated the enzyme, with the remaining activity of
2.35%. This indicated that the crude extracellular proteases might consist
of serine and metalloproteases.
Observation on effect of cations on
enzyme activity showed that the activity was enhanced by 2mM calcium.
zinc and manganese chloride.
Thermal stability study of the enzyme showed that D value of the
enzyme at 75OC, 82OC, 85OC and 90°C were 595, 274, 197, and 113
minutes respectively with z value of 20.85OC. The half-life of the enzyme
at 75OC, 82OC, 85OC and 90°C were 179, 82, 59 and 34 minutes
respectivefy.
Zymographic analysis revealed that the crude enzyme solution
contains three kinds of proteases with approximate molecular weight of
65kD, 53kD and 42kD.
Heat treatment of the enzyrne in 50mM Tris/CI buffer containing 5mM
CaCI2 at pH 7.0 at 75OC for 30 minutes slightly decreased the threeprotease activity, however, heating the enzyme solution for 90 minutes
almost inactivated the 65kD and 53kD molecules but the 42kD stiW
showed its activity. When the enzyme solution was incubated at 85OC for
90 minutes the 65kD and 53kD molecules were almost inactivated, the
42kD enzyme remained active, even after heating for 30 minutes.
Incubation of the enzyme solution at 95OC for 5 minutes resulted in
inactivation of all the three protease-fractions
Study on effect of a serine protease inhibitor 2mM PMSF and a
metalloprotease inhibitcr 2mM EDTA showed that both inhibitors
inactivated the 65kD molecule, which indicated the molecule is a
metalloprotease with serine residue in its active site. However, PMSF did
not affect the 53kD and 42kD molecules but EDTA inactivated both
molecules which indicated that the two fractions being metalloproteases
with no serine residue in their active sites.
The presence of 1% SDS in enzyme solution decreased the three
proteases but 5% Triton X-100 enhanced the activity of the three
enzymes.
Study on the effect of denaturing agent on extracellular protease of
TPS2d showed that the 65kD protease was not stable in the presence of
1% (wlv) urea and 0.5°1,
(wlv) dithiotreitol, but the enzyme could stand
2.5%(v/v) p-rnercaptoethanol.
The 53kD and 42kD proteases could
tolerate the presence of l.O%(w/v) urea, 0.5°/00 (wlv) dithiotreitol and
2.5%(v/v) p-mercaptoethanol.
The above experiments concluded that all the three proteases could
be considered as thermostable proteases. Among the three proteases,
the 42kD molecule is the most thermostable.
BUDlASlH WAHYUNTARI.
Pemurnian dan
karakterisasi protease
ekstraseluler isolat prokariot thermofilik ekstrim dari Tangkuban Perahu.
Dibimbing oleh MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO (Ketua Komisi
Pembimbing), ANTONIUS SUWANTO, DEDl FARDIAZ and DJUMALI
MANGUNWIDJAJA (Anggota Komisi Pembimbing).
Enzim termostabil telah lama menarik perhatian ilmuan dan para
industriawan karena sifat-sifatnya yang lebih unggul dibandingkan dengan
enzim mesofilik. Enzim tersebut lebih stabil pada suhu ruang sehingga
mempunyai umur simpan lebih lama.
dihasilkan oleh mikroba termofilik.
Kebanyakan enzim termostabil
Habitat mikroba termofilik biasanya
adalah tempat-tempat yang berhubungan dengan kegiatan geotermal
seperti gunung berapi, sumber air panas dilaut maupun didarat dan
sebagainya.
Tujuan penelitian ini adalah memilih satu isorat prokariot termofilik
ekstrim yang memproduksi protease ekstraseluler dari Kawah Domas,
Tangkuban Perahu dan mengkarakterisasi sifat biokimia protease
tersebut.
Enam isolate prokariot temofilik penghasil protease ekstraseluler yang
diberi kode 03, 05. 7.2, TPS2 dan TPS7 dipilah untuk mendapatkan isolat
termofilik ekstrim. Percobaan yang dilakukan dibagi menjadi beberapa
tahap yaitu pemilahan dan identifikasi isolat, karakterisasi protease kasar,
pemurnian enzim dan karakterisasi enzim rnurni.
viii
Karakterisasi isolat terpilih meliputi pengamatan morfologi isolat,
reaksi biokimia dan analisis gen penyandi 76s rRNA.
Sifat protease yang diamati adalah jenis protease, jenis substrat,
bobot molekul, kestabilan panas, dan kestabilan enzim terhadap bahan
deterjen. Tahap pernurnian enzim yang dilakukan adalah pengendapan
protein enzim rnenggunakan amonium sulfat, dialisis dengan membran
ultrafiltrasi dengan membran 10kD MWCO, kromatografi penukar anion
DEAE Sepharose Fast Flow dan filtrasi gel dengan Superdex 75.
Karakterisasi sifat biokimia enzim murni dilakukan secara kualitatif
menggunakan metode zimografik dengan kopolimerisasi kasein 0 , l%(b/v)
kedalam PAGE 8%(b/v).
Diantara enarn isolat yang dipilah, hanya ada satu isolat yang
tergolong isolat prokariot termofilik ekstrim yaitu TPS2.
Akan tetapi
pengamatan selanjutnya menunjukkan bahwa dalam kultur TPS2 terdapat
lebih dari satu bentuk sel. Dari kultur sebar TPS2 pada media padat yang
mengandung skim milk diambil empat koloni terpisah yang masingmasing diberi kode sebagai TPS2a, TPSZb, TPS2c dan TPSZd. TPS2d
dipilih untuk digunakan dalarn penelitian selanjutnya berdasarkan
kemampuannya memproduksi protease ekstraseluler dalarn media cair
dan kernudahan untuk mengisolasi DNA kromosom.
Hasil pengamatan rnenunjukkan bahwa set TPS2d berbentuk batang.
bersifat gram positif dan tidak memproduksi spora serta mampu tumbuh
secara aerob pada suhu 70°C.
Analisis cluster menggunakan program FASTA3, dari web site
European Bioinformatics Institute (http:llwww/ebi.ac.uk),
berdasarkan
sebagian sekuen gen penyandi 16s rRNA menunjukkan bahwa isolat
TPS2d
memiliki kemiripan *90%
dengan
Bacillus
spp.
Dalam
dendrogram yang dikonstruksi menggunakan program "Tree Con"
berdasarkan analisis cluster sebelumnya, dalarn fifogeni bakteri isolat
TPS2d mempunyai hubungan terdekat dengan
B. caldotenax
pada
tingkat kepercayaan 67%.
Menggunakan kasein sebagai substrat, aktivitas optimum larutan
protease ekstraseluler kasar ditemukan pada suhu 75OC dan pH sekitar
netral.
Protease tersebut juga mampu menghidrolisis serum albumin
bovin, gelatin, kolagen dan substrat spesifik untuk termolisin N-[3-(2Furyl)acryloiI]-Gly-Leu-NH2
(FAGLA).
Penambahan
SDS
7%(blv)
menyebabkan penurunan aktivitas enzim menjadi 88,79% tetapi adanya
Triton X-100 2,5%(v/v) meningkatkan aktivitas enzim hingga 169%.
Penghambat
spesifik
menurunkan aktivitas
protease
enzim
serin
PMSF
2mM
menjadi 84,9496 tetapi
hanya
sedikit
penambahan
penghambat spesifik protease logam EDTA 2mM hampir menginaktifkan
enzirn secara total dengan sisa aktivitas hanya 2'15%.
Hal tersebut
menandakan bahwa dalam larutan kasar enzim ekstraseluler TPS2d
terdapat protease logam dan serin.
Pengarnatan pengaruh kation
menunjukkan bahwa aktivitas enzim ditingkatkan oleh kalsium, seng dan
mangan klorida 2mM.
Studi kestabilan panas enzim mendapatkan bahwa nilai D pada suhu
75OC, 82OC, 85OC dan 90% masing-masing berturut-turut adalah 595,
274, 197, dan 113 menit dengan nilai z 20.85OC. Sedangkan umur paruh
enzim pada 75OC, 82OC, 85OC dan 90°C masing-masing berturut-turut
adalah 179, 82, 59 and 34 menit.
Analisis zimografik rnenyatakan bahwa dalam larutan protease
ekstraseluler TPSPd terdapat sedikitnya tiga jenis protease yang berbeda
dengan berat molekul masing-masing 65kD, 53kD dan 42kD.
Pemanasan enzim dalam larutan penyangga TrisICI 50mM yang
mengandung CaC12 5mM, pH 7,O pada 75OC selama 30 menit hanya
sedikit menurunkan aktivitas ketiga protease.
Pemanasan pada suhu
yang sarna selama 90 menit menginaktivkan protease 65kD dan 53kD
tetapi tidak mempengaruhi aktivitas protease 42kD. Pemanasan larutan
enzim pada 85OC selama 10 rnenit rnenginaktivkan molekul 65kD dan
53kD tetapi molekul 42kD masih menunjukkan aktivitas walaupun telah
dipanaskan selama 30 rnenit. lnkubasi larutan enzirn pada 95OC selama
5 menit menginaktivkan semua protease.
Studi pengaruh penghambat protease serin PMSF dan protease
logam EDTA menunjukkan bahwa protease 65kD diinaktivkan oleh kedua
jenis penghambat tersebut.
Hal ini menunjukkan bahwa protease
tersebut adalah protease logarn yang mengandung residu serin pada sisi
aktifnya.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa protease 53kD dan
42kD tidak dipengaruhi oleh PMSF 2mM tetapi diinaktivkan oleh EDTA
2mM yang rnengindikasikan bahwa kedua protease tersebut adalah
protease logarn.
Penarnbahan SDS 1°h(blv) dalarn larutan enzirn menurunkan aktivitas
ketiga jenis protease tetapi adanya 5Oh(v/v) Triton X-100 meningkatkan
aktivitas ketiganya.
Studi pengaruh senyawa pendenaturasi terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d menunjukkan bahwa rnolekut 65kD tidak tahan
terhadap urea 1%(b/v) dan ditiotreitol 0,5O/,
mercaptoethanol 2,5%(v/v).
(blv) tetapi tahan terhadap p-
Protease 53kD dan 42kD toleran terhadap
urea ?%(bhr),ditiotreitol 0,5°10, (blv) dan p-rnercaptoethanol2,5%(vIv).
Berdasarkan percobaan diatas dapat disirnpulkan bahwa ketiga
protease ekstraseluler TPS2d adalah protease terrnostabil.
Diantara
ketiga protese tersebut. rnolekul 42kD adalah protease logarn yang paling
stabil terhadap panas.
xii
PEMURNIAN DAN KARAKTERlSASl PROTEASE
EKSTRASELULER ISOLAT PROKARIOT TERMOFlLlK
EKSTRIM DARl TANGKUBAN PERAHU
Oleh:
BUDlASfH WAHYUNTARI
Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
dalam bidang llmu Pangan
pada
Program Pascasarjana, lnstitut Pertanian Bogor
PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2001
xiii
Judul
: Pemurnian
dan
karakterisasi
protease
ekstraseluler isolat prokariot termofilik ekstrim
dari Tangkuban Perahu
Nama mahasiswa : Budiasih Wahyuntari
Nomor pokok
: 9453111LMU PANGAN
Menyetujui:
I.
Kornisi Pembimbing
,
'
Prof. Dr. Ir. ~ d q T.v Suhartono
Ketua Komisi
Dr. Ir. Antonius Suwanto. M Sc
Anggota Kornisi
Anggota Komisi
/-.Anggota Komisi
2. Ketua Program Studi
-
uq&&:
-
Prof.Dr.lr.B.Sm-i Laksrni Jenie,M
Tanggal Lulus
: Kamis, 22 Februari 2001
Manuwoto, MSc
UCAPAN TERJMA KASlH
Alhamdulillah hi
Robil Alarnin
hanya
berkat rakhmat Allah
subhanallahu wa taala, akhirnya penulis dapat menyelesaikan program
Doktor pada Pascasarjana di lnstititut Pertanian Bogor.
Program ini tidak mungkin selesai tanpa bantuan dari banyak fihak.
oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih
dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada:
Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawijaya Suhartono atas kesabarannya
rnemberikan bimbingan dari saat penulis rnemulai program Pascasarjana,
penelitian hingga penulisan disertasi serta perhatian yang besar dan
dorongan semangat saat penulis mengalami kesulitan dan hambatan
dalam melaksanakan penelitian.
Juga terirnakasih atas kepercayaan
yang diberikan kepada penulis untuk turut bergabung dalam mengerjakan
Proyek Kerjasarna antara Pusat Antar Universitas Bioteknologi, lnstitut
Pertanian Bogor dengan Bioproduct Research Center, Yonsey University,
Korea dengan segala fasilitas yang diberikan kepada penulis.
Prof. Dr. Ir. Srikandi Fardiaz, MSG(Alm) yang telah memperkenalkan
penulis dengan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono atas pemberian saran
yang sangat berharga dalarn penyusunan usulan peneiitian.
Dr. ir. Antonius Suwanto, MSc atas kesediaannya mernberikan jalan
keluar
atas
masalah-masalah selama
penulis
mengikuti
program
Pascasarjana dan dalam penelitian maupun saran dasam penulisan
disertasi.
Prof. Dr. Ir. Dedi Fardiaz, MSc atas saran dan rnasukan yang
diberikan selama diskusi dalam penyusunan usulan penelitian dan
penulisan disertasi.
Prof. Dr. Djumali Mangunwidjaja atas arahan dan koreksi yang teliti
pada penulisan disertasi ini.
Dr. Dahrul Syah dan Dr. Mahyudin Abdul Rachman selaku penguji luar
Komisi Pernbimbing, atas saran-sarannya untuk kesernpurnaan penulisan
disertasi ini.
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi atas kesempatan dan
beasiswa yang diberikan untuk mengikuti program Pascasarjana di IPB.
Dr. Ir. lrawadi Jamaran mantan Deputi Ketua Bidang Teknologi
Agroindustri dan Bioteknologi, BPP Teknologi yang memberi kesernpatan
kepada penulis untuk bertugas di Laboratorium Teknologi Agroindustri
dan Bioteknologi, Ciampea, Bogor sehingga penulis bisa rnenyelesaikan
penelitian.
Dr. Suyanto Pawiroharsono selaku Direktur dan segenap temanternan
di
Direktorat
Teknologi
Bioindustri.
BPP
Teknologi
atas
pengertiannya karena penulis tidak banyak terlibat dalam tugas kantor
selama melakukan penelitian hingga penulisan disertasi ini.
Tami Idiyanti, MSc selaku Kepala Laboratoriurn Mikrobiologi, Pusat
Penelitian dan
Pengembangan
Kimia Terapan,
LIP1 di
Serpong,
Tangerang atas ijin, saran, bantuan dan dorongan semangat yang
diberikan selama penelitian.
Juga Ai, dan teman-teman lain di P3KT,
terimakasih atas persahabatan dan bantuannya.
Wenu,
lndri
dan
Yaya,
terimakasih
atas
persahabatan
dan
kesediaannya menyediakan waktu diantara waktu mereka yang sangat
sempit saat melakukan pelatihan atau Program Postdoctoral di luar negeri
untuk mencarikan dan mengirimkan jurnal-jurnaf.
Prof. Dr. Garabet Antranikian dan Prof. Dr. Bertus Van den Burg atas
kiriman jurnal-jurnalnya,
Prof. Dr. John Walker atas pemberian buku
"Practical Biochemistry" dan saran-sarannya serta Prof. Dr. F. Meinhardt
atas dorongan semangat yang diberikan.
Wibowo. Nisa, Emmy Hala, lrawan Tan. Dwi Suryanto, Yogi. Rina,
Esti, bu Ika dan teh Eni juga teman-ternan lainnya di Laboratorium
Mikrobiologi dan
Biokimia,
PAU
Bioteknologi,
IPB,
serta
Ari
di
Laboratorium Mikrobiologi Pangan, PAU Pangan dan Gizi, IPB terima
kasih atas persahabatan dan bantuan yang diberikan selama penulis
melakukan penelitian.
Roya, Bambang dan Yusuf di Direktorat Teknologi Agroindustri, BPP
Teknologi, terima kasih atas persahabatan, dorongan semangat dan
bantuannya untuk meringankan tugas-tugas kantor yang harus penulis
selesaikan selama penulis melakukan penelitian.
Atik dan Vita terima kasih atas persahabatan, doa dan dorongan
semangat yang selalu diberikan.
xvii
Ade, Hendar dan Alex dan ternan lainnya di Laboratorium Teknofogi
Agroindustri dan Bioteknologi (TAB), BPP Teknologi, Ciampea , Bogor
atas
bantuan dan kesediaannya untuk membantu dan menemani
walaupun diluar jam kerja. Semua anggota Satpam Laboratorium TAB,
Ciarnpea, Bogor atas kesediaannya menernani penulis saat rnelakukan
penelitian hingga farut malam.
Kedua orang tua penulis, Almarhum Bapak R. M. Solichien dan
lbunda R. Ngt. Sutari Solichien atas kasih sayang, dorongan semangat
dan doa yang tak terputuskan, adik-adik Dete, Nining, Sasongko, Didik,
Bambang, Sulistiono, Sri, nDari, serta keponakan Metta, Endra, Dito dan
yang lainnya atas kasih sayang dan doa yang selalu diberikan.
Segenap teman dan kerabat lain yang tidak dapat penulis sebutkan
satu persatu, terimakasih yang tak terhingga atas perhatian, dorongan
semangat dan kasih sayang yang diberikan kepada penulis, semoga apa
yang telah anda sernua berikan menjadi arnal kebaikan dan mendapat
balasan yang berlipat dari Allah subhanallahu wa taala. Amien.
Bogor, Februari 2001
Penulis
KATA PENGANTAR
Akhir-akhir
ini
masalah
masyarakat, termasuk
lingkungan
dampak
menjadi
lingkungan yang
perhatian
besar
disebabkan oleh
kegiatan industri dan kegiatan kehidupan lainnya. Oleh karena itu orang
mulai mencari proses-proses yang ramah atau arnan bagi lingkungan.
Sejalan dengan itu, penggunaan enzim dalam industri rneningkat dengan
cepat
karena
enzim
rnerupakan
senyawa
organik
yang
mudah
terdegradasi dialam sehingga dianggap sebagai bahan yang aman bagi
lingkungan.
Untuk rnemenuhi perrnintaan yang meningkat baik daIam
kuantitas rnaupun kualitas, terjadi kecenderungan pencarian enzim yang
merniliki stabilitas tinggi terhadap
kondisi lingkungan proses dan
penyirnpanan. Kondisi lingkungan yang dimaksud antara lain pH, suhu
dan medium reaksi.
Dalam perdagangan enzim dunia, protease memberikan kontribusi
yang terbesar yaitu merupakan 60% dari enzim yang diperdagangkan.
40% dari protease tersebut merupakan protease mikroba dan 25% dari
enzim mikroba yang diperdagangkan merupakan enzim terrnofilik (Rao,
et. a/, 1998). Protease dimanfaatkan dalarn berbagai bidang industri
antara lain industri pangan, farmasi, deterjen, kulit dan lain-lainnya.
Dalam
penelitian ini dilakukan pemilihan
isolat yang
memiliki
kemarnpuan tinggi untuk memproduksi protease serta merniliki stabilitas
tinggi terhadap lingkungan ekstrim dari beberapa isolat yang telah
diisolasi dari lingkungan ekstrim yaitu Kawah Domas di daerah Kawah
Tangkuban Perahu. Selanjutnya dilakukan identifikasi isolat, pemurnian
serta
karakterisasi sifat
biokimia
protease yang
dihasilkan
untuk
mengetahui kondisi optimum bagi pemanfaatan dan penyimpanannya dan
sebagai dasar bagi penelitian selanjutnya.
Bogor, Februari 2001
Penulis
DAFTAR 1st
Hafaman
KATA PENGANTAR
xix
DAFTAR IS1
xxi
DAFTAR GAMBAR
xxiii
DAFTAR TABEL
xxv i
DAFTAR LAMPIRAN
xxvi i
DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN
xxviii
DAFTAR TABEL LAMPIRAN
xxix
PENDAHULUAN
Latar belakang
Tujuan penelitian
Manfaat penelitian
Waktu dan tempat penefitian
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme ekstrim terrnofilik
Habitat Mikroorganisme ekstrim termofilik
Identifikasi mikroba
Enzim termostabil
Protease
Pemurnian enzim
BAHAN DAN METODOLOGI
Bahan
Alat
Metodologi
Pemilahan isolat
Laju pertumbuhan isolat dan produksi protease
ldentifikasi isolat
Pengamatan morfologi
Pengamatan reaksi biokimia
lsolasi dan pemurnian DNA
Amplifikasi dan analisis sekuen 16s rRNA
Pemurnian dan karakterisasi protease:
Pemurnian protease
xxi
DAFTAR IS1
(lanjutan)
Halaman
Uji protein
47
48
Uji aktivitas protease
Pengaruh suhu dan pH
48
Pengaruh penghambat protease spesifik, kation, deterjen
dan pereaksi denaturasi
49
Analisis elektroforesis gel dan zimografik
50
Hidrolisis protein
52
Hidrolisis peptida
53
Kestabilan panas protease
54
HASlL PENELlTlAN DAN PEMBAHASAN
Penelitian Pendahuluan
Pernilahan isolat terrnofilik ekstrim
ldentifikasi isolat TPS2d
Pengamatan reaksi biokimia
Analisis 16s rRNA
Laju perturnbuhan dan produksi protease TPS2d
Pernurnian dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler
Karakterisasi larutan protease ekstraseluler
Pengaruh suhu dan pH
Pengaruh PMSF dan EDTA
Pengaruh kation
Pengaruh SDS dan Triton X-100
Kestabilan protease terhadap panas
Zimogram dan bobot masa protease
Hidrofisis protein
Pemumian protease
Pengendapan protein
Penentuan pH penyerapan dan pelepasan protein oleh
rnatriks penukar ion
Pemumian protease dengan kromatografi kolom
Kromatografi penukar ion
Kromatografi filtrasi gel
Karakterisasi enzim murni
Pengaruh suhu
Pengaruh penghambat protease
Pengaruh pereaksi denaturasi dan bahan deterjen
Hidrolisis peptida
DAFTAR PUSTAKA
99
DAFTAR GAMBAR
Nomor
Halaman
Gambar
1. Enam isolat dari Kawah Domas, Tangkuban
Perahu
57
Zona bening isolat TPS2 pada suhu 60°C dan
70°C
57
Pengamatan mikroskopis hasil pewarnaan gram
dan spora isolat TPS2
58
Pengamatan mikroskopis hasil pewarnaan gram
isolat TPS2a, TPS2b, TPS2c dan TPS2d
58
Hubungan antara absorbans larutan fermentasi
isolat TPS2a, TPS2b, TPS2c dan TPS2d dengan
aktivitas protease ekstraseluler
Sebagian sekuen DNA penyandi 16s rRNA isolat
TPS2d hasil penggandaan primer 63f
Dendrogram isolat TPS2d dalam filogeni bakteri
berdasarkan sekuen sebagian gen penyandi 16s
rRNA
taju penumbuhan dan produksi protease
ekstraseluler isolat TPS2d pada 70°C.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d.
?O.
Pengaruh pH terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d
11.
Pengaruh pengharnbat spesifik protease dan
deterjen terhadap aktivitas protease ekstraseluler
TPS2d
67
Pengaruh beberapa kation terhadap
protease ekstraseluler TPS2d
69
12.
aktivitas
xxiii
DAFTAR GAMBAR
(lanjutan)
Nomor
Gambar
Halaman
13. Pengaruh ion kalsiurn terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2d
69
Pengaruh suhu terhadap kestabilan aktivitas
larutan kasar protease ekstraseluler TPS2d
73
Hubungan antara logaritma nilai D protease
ekstraseluler TPS2d dengan suhu pemaparan
74
Hasil uji elektroforesis (SDSIPAGE & SDSIPAGEkasein) larutan kasar protease ekstraseluler
TPS2d
77
Hidrolisis beberapa jenis protein oleh larutan
enzim kasar protease ekstraseluler TPS2d
78
Hidrolisis serum albumin bovin 0,196 oleh larutan
enzim kasar protease ekstraseluler TPS2d.pada
37OC dan 75OC.
80
Pengaruh pH terhadap kelarutan protein dalam
larutan enzim kasar
83
Hubungan antara aktivitas protease
endapan protein dengan pH pengendapan
84
pada
Grafik fraksinasi protease ekstraseluler TPS2d
menggunakan
kromatografi
kolom
DEAE
Sepharose Fast Flow
85
Elektroforesis gel protease ekstraseluler TPS2d
(SDSIPAGE dan Zimogram)
86
Grafik
fraksinasi
protease
ekstraseluler
menggunakan kromatografi kolom Superdex 75
87
Pengaruh pemanasan terhadap pita protease
ekstraseluler TPS2d
90
xxiv
DAFTAR GAMBAR
tlanjutan)
Nomor
25.
26.
27.
Gambar
Halaman
Zimogram: pengaruh larutan penyangga contoh
asal dan pendenaturasi terhadap protease
ekstraseluler TPS2d
91
Zimogram: pengaruh PMSF & EDTA terhadap
aktivitas pita protease ekstraseluler TPS2d
92
Zimogram: pengaruh pereaksi denaturasi atau
deterjen terhadap pita protease ekstraseluler
TPS2d
DAFTAR TABEL
Hataman
1.
Tata nama mikroba suhu tinggi
6
2.
Tata nama mikroba suhu tinggi
6
3
4.
Ciri kebanyakan lingkungan alam ekstrirn
10
Resolusi relatif beberapa teknik analisis DNA
12
5. Simbion bakterial dan archaeal dari protozoa dianalisa
dengan pendekatan rRNA
Pemilahan protease
Protease ekstrim dan hipertermofilik
Homologi dan kestabilan panas protease netral dari
spesies Bacillus
Senyawa untuk pengendapan protein
Metode kromatografi untuk fraksinasi protein
Metode ekstraksi dan pemurnian protease termofilik
Nilai D, tx dan z larutan kasar protease ekstraseluler
TPS2d dan nilai t .termolisin
~
Ringkasan hasil pernumian protease ekstraseluler TPS2d
Karakteristik protease ekstraseluler TPS2d
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1.6.
1.7.
1.8.
2
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
Halaman
PROSEDUR PENGUJIAN
Pengujian kadar protein metode Bradford
Metode pengukuran aktifitas protease.
Modifikasi metode Walter
Modifikasi metode Kunitz
Pembuatan larutan penyangga universal
Pewarnaan gram metode Cappuccino & Sherman
lsolasi DNA aenom
Pembuatan pereaksi elektroforesis gel akrilamida
Modifikasi analisis SDSIPAGE dan zimografik
metode Frejdrich & Antranikian
Pewarnaan perak gel elektroforesis metode
Walker
HASlL PENELITIAN
Penelitian pendahuluan: Karakterisasi protease
ekstraseluler TPS2
Pengujian reaksi biokimia isoiat TPS2d
Analisis 16s rRNA isolat TPS2d
Analisis cluster isolat TPS2d dafam filogeni bakteri
Pengendapan protein larutan enzim ekstraseluler
TPS2d
xxvii
DAFTAR GAMBAR LAMPIRAN
Nomor
L2.1.
Gambar
Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease
ekstrasetuler TPS2
Pengaruh pH terhadap aktivitas protease
ekstraseluler TPS2
Pengaruh inhibitor protease terhadap aktivitas
protease ekstraseluler TPS2
Penga~h
beberapa kation bivalen terhadap
aktivitas protease ekstraseluler TPS2
Kestabilan protease ekstraseluler TPS2 pada
75%
Kestabilan protease ekstraseluler TPS2 pada 5OC
Aktivitas dan kadar protein fraksi enzim
ekstraseluler TPS? hasil kromatografi kolom
DEAE Sephadex A50
SDSIPAGE dan zimogram protease ekstraseluler
TPS2
Hasil PCR gen penyandi 16s rRNA isolat TPS2d
Pengendapan protein larutan fermentasi TPS2d
dengan amonium sulfat
Halaman
DAFTAR TABEL LAMPIRAN
Nomor
Tabel
L2.1.
Pemurnian protease ekstraseluler TPS2
L2.2.
Reaksi biokimia isolat TPS2d
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Protease mikroba merupakan salah satu enzim hidrolitik yang penting
dalam perdagangan enzirn di dunia. Protease meliputi 60% dari total
enzim yang diperdagangkan. 40% dari total protease merupakan protease
mikrobial (Rao, el at 1998). Protease dihasilkan oleh hewan, tumbuhan
rnaupun mikroba. Dari segi ekonomi protease mikroba merupakan enzim
yang mempunyai peranan paling penting, mengingat kelebihan yang
dimilikinya. Mikroba dapat dibiakkan dalam waktu relatif singkat sehingga
enzim dapat diproduksi dalam jumlah besar dan peningkatan produksinya
relatif lebih mudah. Oalam perdaganganpunenzim mikroba m e ~ p a k ajenis
n
enzim yang memberikan kontribusi ferbanyak.
Protease dimanfaatkan
dalam industri pangan, farmasi, kulit, deterjen dan bioindustri lainnya.
Dalam industri pangan protease antara lain digunakan dalam proses
pembuatan keju, bir, roti, protein hidrolisat, rekayasa protein, pelarutan
protein dan lain-lain.
Dalam proses pengolahan pangan, kondisi higienik merupakan salah
satu syarat mutlak, sedangkan pada umumnya, enzim yang tersedia
memerlukan kondisi yang lunak serta bekerja pada suhu lingkungan yang
dapat mernungkinkan terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme sehingga
kondisi higienik tidak bisa tercapai. Peningkatan suhu proses pada tingkat
tertentu
selain
dapat
mengurangi kemungkinan
kontaminasi
oleh
mikroorganisme juga akan meningkatkan laju reaksi yang dikehendaki
sehingga akan mempersingkat waktu yang diperlukan. Telah ditemukan
sejumlah mikroorganisme termofilik yang menghasilkan enzim ekstraseluler
yang mempunyai kemampuan menghidrolisis polimer seperti protein, pati
dan selulosa (Antranikian.et a1 1995).
Kebanyakan mikroorganisme
Dalam dasawarsa
tersebut tumbuh optimal pada kisaran suhu 60°C-75OC.
terakhir baru dimungkinkan untuk rnengisolasi mikroorganisme yang dapat
tumbuh optimal pada suhu diatas 100°C.Eksplorasi mikroorganisme dari
lingkungan ekstrim diharapkan untuk dapat memperoleh enzim-enzim yang
dapat bekerja pada kondisi ekstrim, antara lain pada suhu, pH dan kadar
garam tinggi atau dalam pelarut organik dimana mikroorganismeyang tidak
dikehendaki tidak dapat berkembang. Lingkungan ekstrim yang dimaksud
antara lain habitat geotermal seperti sumber air panas, daerah solfatarik,
kawah gunung berapi dan hidrotermal laut dalam.
Dalam penetitian ini dilakukan pemilahan isolat penghasil protease yang
mampu tumbuh pada suhu diatas 6WC, pernurnian dan karakterisasi sifatsifat biokimia protease ekstrasefuler yang diproduksi dan identifikasi isolat
yang paling potensial. Mikroba diisolasi dari tanah Kawah Domas, daerah
Tangkuban Perahu, Jawa Barat.
Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan memperoleh isolat termofilik ekstrim penghasil
protease yaitu isolat yang mampu turnbuh dan menghasilkanprotease pada
suhu lebih tinggi daripada 60°C dan menelaah sifat-sifat biokirnia protease
ekstraseluler yang diproduksinya. Sifat enzim yang akan ditelaah meliputi,
bobot molekul, jenis enzim, jenis reaksi dan substrat, sifat kinet~ka,serta
stabilitas enzim terhadap ringkungan reaksi dan penyimpanan. Selain itu
juga dilakukan identifikasi isolat terpilih.
Manfaat Penelitian
Protease termofilik akan sangat berguna dalam industri yang
memerlukan proses aseptis atau proses lain yang lebih efektif apabila
diterapkan pada suhu relatif tinggi. Penelaahan sifat biokimia enzim adalah
untuk memahami karakteristik aktivitas enzim termofilik ekstrim sehingga
dapai diketahui kondisi optimum bagi kerja. penyimpanandan penanganan
enzim.
Pemahaman sifat biokimia diharapkan akan sangat berguna dalam
menentukanjenis pemanfaatan enzim secara optimal dan tepat, serta akan
bermanfaat untuk penelitian biokimia molekuler selanjutnya.
Waktu dan ternpat penelitian
Penelitian dilakukan bulan Agustus 1997 sampai dengan Agustus 2000
di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas lnstitut
Pertanian Bogor, Kampus Darmaga, Bogor, Laboratorium Teknologi
Agroindustri dan Bioteknologi, Badan Pengkajian dan PenerapanTeknologi,
Ciampea, Bogor dan Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Penelitian dan
Pengembangan Kirnia Terapan, Lernbaga llmu Pengetahuan Indonesia di
Serpong, Tangerang.
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme termofilik ekstrim
Mikroorganisme termofilik yang mampu tumbuh pada suhu 50°C-60°C
telah lama diketahui, akan tetapi sejak dipublikasikannya bakteri Thermus
aquaficus yang diketemukan di sumber air panas di Yellowstone National
Park, U.S.A yang mampu tumbuh pada suhu lebih tinggi dari pada 70°C
oleh Brock & Freeze (1969) barulah diketahui adanya kehidupan pada
suhu diatas 70°C.
Akan tetapi, batasan seberapa tinggi suhu untuk
kehidupan hingga kini belum diketahui dengan pasti. Eksplorasi di lokasi
yang berkondisi ekstrirn seperti area kawah gunung berapi yang masih
aktif hampir di seluruh bagian dunia, hidrotermal laut dalam. daerah kutub
dan wilayah dengan kondisi ekstrim lainnya yang dilakukan oleh
beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba
ekstrimofitik
.
Brock (1986) mengemukakan definisi organisme termofilik adalah
organisme yang mampu turnbuh pada suhu diafas 55OC-60°C.
Dengan
ditemukan organisme termofilik yang mampu tumbuh sampai suhu
d~sekitar bahkan diatas titik didih air, selanjutnya beberapa peneliti
memilah mikroba termofilik menjadi beberapa kelompok menurut suhu
perturnbuhannya dengan batasan suhu yang berbeda. Cowan (1992)
mengklasifikasi organisme termofilik berdasarkan batasan suhu minimum,
optimum dan maksimum sebagai disajikan dalam Tabel 1 Sedangkan
Rudiger,
et
a1 (1994)
mengelompokkan mikroorganisme termofilik
berdasarkan batasan kisaran suhu pertumbuhan seperti terlihat pada
Tabel 2.
Tabel 7 . Tatanama mikroba suhu tinggi (Cowan, 1992)
Pertumbuhan
minimun
Terminologi
Termofil
Ekstrim termofil
Hipertermofil
Pertumbuhan
optimum
("C)
("C)
240
=-65
tidak
ditentukan
>lo0
230
Pertumbuhan
maksimum
("C)
250
>60
>70