Pemurnian dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler Isolat Bakteri Termofilik GP-04

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI
PROTEASEEKSTRASELULER
DARl ISOLAT BAKTERI TERMOFlLlK GP-04

OLEH:
NlSA RACHMANIA MUBARIK

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2001

Dengan Nama Allah , Maha Pemurah,

Maha Penyayang

Dia menciptakan seluruh langit dan bumi
dengan suatu tujuan kekal,
dan Dia memberi kamu bentuk
dan membuat bentukmu indah,
dan kepada Dia-lah akhirnya kamu kembali

Terima kasih atas segala karunia-Mu

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang bejudul:
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEASE EKSTRASELULER
DARl ISOLAT BAKTERI TERMOFlLlK GP-04

Adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pemah dipublikasikan.
Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan
dapat diperiksa kebenarannya.

V

A~ H M A N I A
MUBARIK
Nrp. 975070/810

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI
PROTEASEEKSTRASELULER
DARl ISOLAT BAKTERI TERMOFlLlK GP-04

OLEH:
NlSA RACHMANIA MUBARIK

Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Program Studi Biologi

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2001

Judul

: Pemumian dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler
dari lsolat Bakteri Terrnofilik GP- 04

Nama mahasiswa : Nisa Rachmania Mubarik
Nomor pokok

: 975070

Program Studi

: Biologi

Menyetujui,
1. Komisi Pembimbing

Prof .Dr. Ir. H. Edi Guhardia. M.Sc.
Anggh

2. Ketua Program Studi Biologi

&

Dr. Ir. H. Dede Setiadi. M.S.

ABSTRACT
NlSA RACHMANIA MUBARIK. Purification and Characterization of Extracellular

Proteases from Isolate GP-04, a Thermophilic Bacterium.

Under the direction of

MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, ANTONIUS SUWANTO, DWI ANDREAS
SANTOSA, and ED1 GUHARDJA.
A gram positive, rod-shaped, and aerobic therrnophilic bacterium, designated as
GP-04, was isolated from Gunung Pancar hot spring, near Bogor, West Java. Based on
approximately 400 bases both 5 frames regions and 3 frames ends DNA sequences of
16s-rRNA gene, the isolate is determined to be closely related

90%) to Bacillus

caldovelox. The isolate, produced significant amount of extracellular protease when
grown in a modified Thermophilic Bacillus medium pH 7,O at 6s°C for 16 h in a batch
mode fermentation. Crude protease was purified using 30% ammonium sulphate
precipitation and column chromatography using Sephadex G-25 followed by DEAESephadex A-50.
The protease activity was inhibited by chelating agent at the concentrations as
follows:

1 mM,

5 mM, and 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and

o-phenanthroline. The enzyme activity was enhanced by suplementation of 1 mM,
5 mM, and 10 mM CaCI2 and MgCI2. The 30% ammonium sulphate precipitate was
not inactivated by 1% sodium dodecyl sulphate (SDS). Ommum enzyme activity
occurred at pH 7.5 and temperature 70% -75%. Upon heat treatment at pH 7.0 and
7 0 ' ~the enzyme was still 100 96 activity after 48 hours, and dropped to only 20% after
90 minutes heating at 80°C. Zymogram analysis revealed three translucent zones
coresponding to caseinolytic actvities after 45 minutes of incubation at 7 0 ' ~in the 0.5 M
buffer Tris HCI pH 7.5. The proteolytic activities were detected at 78 kDa, 57kDa, and
44kDa. All the three molecules were not inactivated by 1% P-metcaptoethanol and 1mM
and 5 mM dithiothreitol (DTT). The 78 kDa and 57 kDa were inhibited by 5 mM EDTA.
This indicated that the two protein molecules was neutral-metalloproteases. Protease
GP-04 was able ;to hydrolyze casein Hammarsten, bovine serum albumin, gelatin, fibrin,
and mucin.

Keywords: protease, thermophilic, enzyme characterization, purification, zymogram.

Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 27 Nopember 1967 sebagai anak
peftama dari empat bersaudara dari Bapak Ir. H. Baryono Hardjosuwito dan Ibu
almarhumah dr. Hj. Surati. Tahun 1995 penulis menikah dengan Rikrik Mubarik Ahmad,
SE, dan kini mempunyai dua orang anak, Marini Adani (1995) dan Altafni Mahdia
(2000). Sejak tahun 1992 penulis bekeja sebagai staf pengajar di Jurusan Biologi,
FMlPA IPB, dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi.
Penulis menyelesaikan program sajana dari Jurusan Biologi, FMlPA Universitas
lndonesia pada tahun 1991. Tahun 1992 penulis melanjutkan studi S2 di Program Studi
Kimia, Subprogram Biokimia, Program Pascasajana lnstitut Teknologi Bandung dan
lulus pada tahun 1994. Tahun 1997 penulis melanjutkan

studi

S3 di Program

Pascasajana, lnstitut Pertanian Bogor pada Program Studi Biologi, Subprogram
Mikrobiologi. Beasiswa pendidikan S3 diperoleh dari Beasiswa Program Pascasarjana
(BPPS) tahun 1997-2001. Biaya penelitian S3 diperoleh dari BPPS, DIP SEAMEOBIOTROP tahun 1998-1999, dan Hibah Tim (Proyek URGE) tahun 1999-2001.
Selama mengikuti program S3, penulis menjadi anggota Perhimpunan Biologi
lndonesia (PBI) , Perhimpunan Mikrobiologi lndonesia (Permi),

dan Perhimpunan

Biokimia dan Biologi Molekuler lndonesia (PBBMI), dan menjadi penelaah di Jumal
Hayati (ISSN:0854-8587) Volume 7 tahun 2000. Penulis pemah menyajikan karya ilmiah
bejudul lsolasi dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler dari lsolat Bakteri Terrnofilik
Ekstrim pada Seminar Nasional lndustri Ensim dan Bioteknologi II, Direktorat
Bioteknologi lndustri BPPT, Jakarta pada bulan Febtuari 2000. Naskah yang disajikan
tersebut dimuat dalam buku (prosiding) Mikrobiologi, Ensim, dan Bioteknologi. Dalam
Perspektif Ekonomi dan lndustri (ISBN: 979-95982-0-6). Karya ilmiah yang lain bejudul
Pemumian dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler dari lsolat Bakteri Termofilik GP-04
telah disajikan pada Seminar Nasional XV dan Kongres IX PBBMI di Cisarua, Bogor
pada bulan Juli 2001. Karya-karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari hasil
penelitian S3 penulis.
I

PRAKATA
Segala puji bagi Allah yang Maha Pengasih atas segala karuniaNya sehingga
disertasi ini terselesaikan.

Penelitian yang bejudul Pemumian dan Karakterisasi

Protease Ekstraseluler dari lsolat Bakteri Termofilik GP-04 dilaksanakan dari bulan
Januari 1999 sampai dengan Juni 2001. Penelitian ini didanai dari BPPS tahun 19972001, DIP SEAMEO BIOTROP tahun 1999-2000, dan Proyek Hibah Tim URGE Batch
IV tahun 1999-2001 bejudul E3ploration of the Indonesian Hyperthermophiles: Genetic
Diversity and Screening of Novel Hydrolytic Enzymes.
Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tinggi kepada Prof. Dr.
Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono, M.Sc. sebagai ketua komisi pembimbing yang telah
mencurahkan perhatian dan bimtiingan dalam penelitian dan penulisan disertasi. Suatu
kehormatan bagi penulis untuk mengungkap enzim protease termofilik bersama Ibu.
Terima kasih atas segala fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk melakukan
penelitian di Laboratorium Mikrobiologi & Biokimia, dan kesempatan mengikuti seminar
di Cisarua bulan Juli 2001.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr. Ir.
Antonius Suwanto, M.Sc. atas segala bimbingan dan dorongan semangat sejak penulis
mengikuti perkuliahan, penelitian, dan penulisan disertasi. Terima kasih atas
kepercayaan untuk berperan serta dalam tim penelitian ldentifikasi Enzim Prokaryot dari
Habitat Hipertermofilik, DIP SEAMEO-BlOTROP tahun 1999-2000 dan Proyek Hibah
Tim URGE tahun 1999-2001 No. Kontrak OOSMTPPAVRIRGE kepada Dr. Ir. Antonius
Suwanto, M.Sc. 'dengan dana dan fasilitas penelitian yang lengkap, serb diberikan

kesempatan mengikuti seminar di BPPT bulan Februari 2000.
Ucapan terima kasih dan penghargaan disampaikan kepada Dr. Ir. Dwi Andreas
Santosa, M.S. atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan disertasi; serta kepada

Prof. Dr. Ir. H. Edi Guhardja, M.Sc. atas bimbingan, arahan dalam penulisan disertasi,
dan penyampaian falsafah penelitian yang berharga bagi penulis.
Penulis mengucapkan terima kasih

kepada: DlKTl

-

Depdiknas yang telah

memberikan beasiswa BPPS; Direktur Program Pasmsajana lnstitut Pertanian Bogor;
Direktur PAU Bioteknologi, IPB ; dan Direktur SEAMEO-BIOTROP, Bogor; atas fasilitas
yang telah diberikan selama penulis melaksanakan studi dan penelitian; dan Ketua
Jurusan dan

rekan-rekan staf pengajar di Jurusan Biologi, FMIPA, IPB yang telah

memberikan dorongan semangat selama studi S3 dan penelitian.
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. Akhmaloka dan Dr. Ir. I Made Artika,
M.App.Sc. selaku penguji Luar Komisi atas saran dalam penyempumaan disertasi ini.
Ucapan terima kasih disampaikan Dr. Yaya Rukayadi, Dr. Budiasih, Dr. W~bowo,
Dr. Dwi Suryanto, lrawan Tan, M.Si, rekan-rekan sesama peneliti baik yang masih akbif
maupun telah lulus di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, PAU Bioteknologi, dan
Laboratorium Biologi Molekuler, SEAMEO BIOTROP atas

persahabatan, dorongan

semangat, dan bantuan dalam mencarikan jumal penelitian. Demikian pula kepada Ibu
Ika, Ibu Eni, Pak Husen, Pak Mulya, serta Fudin dan Ida yang siap menolong.
Rasa terima kasih yang tak terhingga disampaikan kepada Bapak, Ibu, almarhumah
Ibu mertua, Mbah, adik-adik, dan kerabat yang senantiasa mendoakan dan memberikan
dorongan semangat Suami yang telah memberikan waktu dan perhatian besar terutama
selama penulis melakukan studi dan penelitian. Anak-anak yang memberikan kesejukan
hati. Serta kenangan yang dalam kepada Almarhumah Ibu atas doa, motivasi, dan kasih
sayang yang tulus.
Semoga ~ l l a hyang Maha Pemurah membalas segala kebaikan yang diberikan

dengan balasan yang lebih sempuma. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat
Bogor, Oktober 2001
Nisa Rachmania Mubarik

DAFTAR IS1
Halaman
DAFTAR TABEL ..................................................................................

xii

DAFTAR GAMBAR ...............................................................................

xiii

DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................

xiv

PENDAHULUAN
Latar Belakang ............................................................................
Tujuan Penelian .........................................................................
Manfaat Penelitian ........................................................................
Waktu dan Tempat ......................................................................
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme dari Lingkungan Bersuhu Tinggi ................................
Bacillus Termofilik .................................................................
Enzim ........................................................................................
Enzim Termostabil................................................................
Protease Mikroorganisme..............................................................
Protease Serina ..................................................................
Protease Asam ...................................................................
Protease Sisteina ................................................................
Metalopmtease ...................................................................
Protease Termostabil Bacilius ................................................
Pemumian Enzim Protease ............................................................
Pemekatan Enzim ...............................................................
Kromatografi Kolom .............................................................
Elektroforesis dan Zimogram .................................................
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan ...........................................................................
Metode .....................................................................................
Pengamatan Morfologi dan Fisiologi lsolat GP-04 ......................
lsolasi DNA Total lsolat GP-04 ...............................................
Amplifikasi dan Analisis Sekuen Gen 16s-rRNA lsolat GP-04 .......
Penyiapan Mwia ................................................................
Media Penyimpanan lsolat .............................................
' Media Pertumbuhan dan Produksi Enzim Protease Ekstraseluler ......................................................................
Pengukuran Laju Pertumbuhan dan Produksi Protease lsolat
GP-04 .............................................................................
Pengukuran AMvitas Protease .............................................
Pengukuran Kadar Protein ...................................................
Produksi dan Pemumian Protease .........................................

1

2
3
3

Karakterisasi AMivitas Protease ..............................................
Analisis Elektroforesis dan Zimogram .:....................................
Hidrolisis Substrat Protein ......................................................
HASlL DAN PEMBAHASAN
ldentifikasi lsolat GP-04 ...............................................................
Ciri-ciri Morfologi dan Fisiologi (Biokimia) ..................................
Analisis 16s-rRNA ...............................................................
Pertumbuhan dan Produksi Protease lsolat GP-04 ............................
Pemumian Protease GP-04 ..........................................................
Analisis Berat Molekul Protein Protease GP-04 .................................
Karakterisasi Protease GP-04 ......................................................
Penentuan Suhu dan pH Optimum Aktivitas Protease ................
Pengaruh Senyawa Penghambat ...........................................
Pengamh Kation ................................................................
Pengaruh Detergen ............................................................
Pengaruh Pelanit Organik dan Senyawa yang Digunakan dalam
Tahap Pemumian................................................................
Pengujian Kestabilan Protease GP-04 ...........................................
Hidrolisis Substrat Protein ...........................................................

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................

DAFTAR TABEL
Halaman
1. Nilai mol % G+C dari DNA dan 16s-rDNA dari delapan galur Bacillus
termofilik .......................................................................................

6

2. Pengelompokandan ciri-ciri protease serina mikroorganisme...................

11

3. Pengelompokan. ciri.ciri. dan contoh metaloprotease mikroorganisme........

13

4. Homologi dan termostabilitas protease netral yang dihasilkan oleh spesies
Bacillus ........................................................................................

15

5. Metode pemumian protease termostabil

22

.............................................

6. Hasil analisis elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram protease termostabil

23

7. Komposisi gel pemisah dan gel penahan untuk sepasang gel ..................

35

8. Ciri-ciri fisiologi (biokimia) isolat GP-04 ................................................

39

9. Perbandingan ciri-ciri morfologi dan fisiologi isolat GP-04 dengan Baallus
termofilik lainnnya .........................................................................

40

10. Pemumian pmtease GP-04 ..............................................................

50

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Hasil pewamaan endosputa isolat GP-04 pada perbesaran 1000 x .............

38

2. Penampakan isolat GP-04 umur lebih dari 48 jam dengan mikroskop elektron
payaran ..........................................................................................

38

3. Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S-rRNA dari isolat GP-04 (135 kb) ....
4. Sebagian sekuen DNA penyandi 16s-rRNA isolat GP-04 dari hasil
.
penggandaan primer 1387r (arah 5' -,3') ..............................................
5. Posisi isolat GP-04 pada pohon filogenetik ............................................

6. Pengatuh pH media terhadap produksi protease isolat GP-04 ...................
7. Pertumbuhan dan pmduksi protease isolat GP-04 pada media cair
Themophitic Baci/lus yang dimodifikasi suhu 6 5 ' ~................................
8. Pengendapan protease GP-04 dengan amonium sulfat ..........................
9. Profil elusi Sephadex G-25 dari protease GP-04 ..................................

10. Aktivitas protease supematan yang telah dicampur dengan matriks DEAESephadex A-50 pada bebagai pH ......................................................
11. Profil elusi DEAESephadex A-50 dari protease GP-04 ..........................
12. SDS-PAGE dan zimograrn dari tahap pernumian pmtease GP-04 ............
13. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease GP-04 hasil pengendapan 30%
amonium sulfat dan kolom DEAE Sephadex A-50 .................................
14. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease Gp04 hasil pengendapan 30%
arnonium SUM
dan kolom DEAE Sephadex A-50 ..................................
15. Penga~h
senyawa penghambat protease t e h d a p aktivitas protease
GP-04 ..........................................................................................
.16. (A) Pengaruh senyawa penghambat dan detergen terhadap aktivitas
protease GP-04 menggunakan zimogram. (B) llustrasi penampakan pita
SDS-PAGE Pengaruh penambahan 5 mM EDTA pada protease GP-04 ............. 58
17. Pengatuh penambahan EDTA terhadap aktivitas protease GP-04
menggunakan (A) zimogram nondenaturasi (native) dan terdenaturasi
(SDS) ...........................................................................................
'

58

18. Hipotesis mekanisme inaktivasi protease rnelalui jalur pembukaan lipatan
polipeptida secara dapat balik ............ .........:........ .................. ..........
19. Hipotesis mekanisme pembentukan produk autolisis protease GP-04
setelah penambahan 5 mM EDTA................................. ............ .........
20. Pengaruh kation terhadap aktivitas protease GP-04 ..............................
21. Pengaruh detergen terhadap aktivitas protease GP-04 hasil pengendapan
30% amonium sulfat .............................. ........................ ............ .....
22. Pengaruh penambahan pelarut organik dan senyawa yang digunakan
dalam tahap pernumian enzi m terhadap aktivitas protease GP-04 ............
23. amogram pengaruh penambahan SDS, p merkaptetanol dan DTT
terhadap aktivitas protease GP-04 ................................................ .....
24. P e n g a ~ penambahan
h
5 mM CaCI2terhadap aktivitas protease GP-04
pa& berbagai suhu inkubasi ......... ...................................................
25. Aktivitas protease GP-04 pada suhu 80°C .................. .........................
26. Aktivitas protease Gp04 pada suhu 7 0 ' ~.............................. .............
27. Zimogram pengaruh suhu inkubasi terhadap aktivitas protease GP-04 ......
28. Kestabilan aktivitas protease GP-04 selama masa penyimpanan suhu 1 0 ' ~
29. SDS-PAGE hidrolisis protein oleh protease GP-04 ........................... ......

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Prosedur pembuatan media dan reagen yang digunakan dalam penelian...

83

2. Hasil analisis kondisi lingkungan dan kandungan secyawa kimia dari air
panas Gunung Pancar ...... ..................... ........................ ...... ,...........

86

3. Hasil analisispFASTA (versi 3.3t09 18 Mei 2001) sekuen DNA penyandi
16s-rRNA isolat GP-04 hasil penggandaan primer 1387r (arah 5'+ 3') .......

87

Latar Belakang

Sumber air panas di kawasan Indonesia yang meliputi kawah, mata air panas,
solfatara dan fumarol menjadi habitat unik bagi termofil dan hipertermofil endemik.
Salah satu penelitian eksplorasi isolat-isolat mikmorganisme yang hidup pada
lingkungan bersuhu tinggi yang berasal dari Indonesia ditulis oleh Huber et at. (1992).
Mereka melaporkan telah menemukan lebih dari sepuluh genera arkaea dan bakteri
terrnofii dan hipertermofil. lsolat bakteri tennofilik ekstrim novel yang mereka temukan,
antara lain berasal dari genus Themtoga yang berasal dari sumber air panas di Pulau
Sangeang, Indonesia.
Karakteristik fisiologi dan filogenetik dari mikroorganisme yang berhabitat

di

lingkungan bersuhu tinggi masih belum banyak diungkap, padahal mikroorganisme
termofil atau hipertermofil ini sangat berpotensi sebagai penghasil enzim termostabil
(stabil panas). Sebagai contoh Thermotoga berpotensi sebagai penghasil enzim:
glukosa isomerase, xilanase, a-amilase, selobiohidrolase, dan $-galaktosidase. Suhu
optimum aktivitas enzim-enzim itu berkisar 7 0 ' ~-100'C (Leuschner & Antranikian 1995;
Sunna et at. 1996 ).
Salah satu enzim yang paling banyak digunakan dalam industri adalah protease,
terutama yang bersifat termostabil. Pmtease sebagai enzim penghidrolisis protein atau
polipeptida telah mencapai 2 60% perdagangan enzim industri, dan 25% di antaranya
bersifat termostabil. Protease telah dirnanfaatkan antara lain dalam industri: detergen,
pangan, farmasi, 'dan kulit (Rao et a/. 1998).
Matsuzawa et at. (1988) melaporkan telah berhasil mengisolasi protease alkalin
senna ekstraseluler aqualisin I dari bakteri Thetmus aquetiws YT-1 yang bersifat

resisten detergen 1% sodiumdodesilsulfat (SDS). Aqualisin I tahan terhadap 1% SDS
dengan waktu pamh kurang dari 15 menit pada suhu 70°C. Cowan et a/. (1987) juga
melaporkan pmtease alkalin yang berasal dari arkaea Desutfumoccus tahan terhadap
0,1% SDS dengan waktu paruh kurang dari 112 menit pada suhu 95'~.
Pengaruh detergen pada protease yang dihasilkan Bacillus diamati oleh Horikoshi
(1971) dan Wahyuntari (2001). Protease alkalin mesofil yang berasal Bacillus No. 221
tahan terhadap 0,2% sodium lauril sulfat (SLS) (Honkashi 1971). Metaloprotease yang
berasal dari isolat Bacillus TPS2d hanya sedikit mempengaruhi aMivitas enzim dengan
sisa alctivitas sebesar 82,9% dan 88,9% masing-masing pada penambahan 0,1% SDS
dan 1%SDS pada suhu pengukuran 7 5 ' ~(Wahyuntari 2001).
Ketahanan enzim terhadap detergen SDS sangat berguna dalam tahap pemumian
(Klingeberg et a/. 1995) dan pemanfaatan enzim dalam industri detergen. Proteinase K
yang telah dipasarkan dan diisolasi dari fungi Trititachium album diaktifkan oleh 0,5%
SDS dan 1% Triton X-100 (Sweeney & Walker 1993).
Beberapa isolat bakteri termofilik aerobik koleksi Suwanto (1999) yang diisolasi
dari sumber air bersuhu tinggi memiliki aktivitas proteolitik ekstraseluler pada kisaran
suhu 40'C - 1 0 0 ~ Salah
~ . satunya adalah isolat GP-04 yang berhasil diisolasi dari kolam
air panas Gunung Pancar, Citeureup, Kabupaten Bogor, Jawa Barat. lsolat ini bersifat
gram positif, behentuk batang, nonmotil, aerob, dan tumbuh optimum pada suhu 6 5 ' ~
-70'C

(Dimawan 2000).

Tujuan Penelitian
t

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemumian dan mengungkap ciri-ciri
biokimia dari enzim protease ekstraseluler yang dihasilkan isolat termofilik GP-04.

Manfaat Penelitian

Enzim yang berasal dari bakteri termofil biasanya bersifat stabil panas
(termostabil). Kestabilan protein dari enzim semacam ini sangat menarik bagi studi kimia
protein. Di samping itu enzim termostabil sangat diperlukan pemakaiannya sebagai
biokatalis dalam aplikasi bioteknologi.

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat
Penelitian Bioteknologi, IPB dan di Laboratorium Biologi Molekuler SEAMEO-BIOTROP,
mulai bulan Januari 1999 sampai Juni 2001.

TINJAUAN PUSTAKA
Mikmorganisme dari Lingkungan Bersuhu Tinggi
Filogeni

mikroorganisme

berdasarkan

sekuen

nukleotida

RNA

ribosom

mengklasifikasikan kehidupan atas tiga domain, yaitu Archaea, Bacteria, dan Eukarya.
Archaea dan Bacteria yang berada dekat dengan akar pohon filogenetik hidup di
lingkungan yang ekstrim, seperti anaernb, pH rendah, kadar garam tinggi, dan suhu
tinggi. Sebagian besar tergolong hipertermofil yang hidup optimum di atas 90°c, seperti
kondisi lingkungan awal kehidupan di bumi. Berdasarkan ha1 tersebut selumh
mikroorganisme diperkirakan memiliki nenek moyang hipertermofil (Adams & Kelly 1995;
Blochl et a/. 1995).
Mikroorganisme yang hidup di lingkungan bersuhu tinggi

diklasifikasikan:

(1) termofil, suhu optimum pertumbuhan di antara 45 OC - 65 OC dan (2) termofil ekstrim
(kaldoaktif), tumbuh di atas 65 OC - 70 OC (Steel & Walker 1991). Madigan et a/. (2000)
menamakan hipertermofil bagi mikroorganisme yang tumbuh optimum pada suhu di atas
90 OC dan mati di bawah 60 OC. Hipertermofil hanya terdapat pada habitat bersuhu tinggi

sepefti mata air panas, kawah, solfatara, dan sumber air panas dasar laut.
Sebagian besar hipertermofil bersifat anaerob obligat, dan beberapa diantaranya
bersifat heterotrof obligat, yaitu hanya dapat menggunakan senyawa karbohidrat atau
protein kompleks sebagai sumber karbon. Ada juga hipertennofil yang tergantung pada
senyawa belerang untuk pertumbuhannya, dan menghasilkan hidrogen sulfida yang
bersifat korosif (Adams & Kelly 1995).

Hipertermofil yang dikenali bani sejumlah 47

spesies yang dikelompokkan ke dalam 23 genera dan 10 ordo dari kelompok bakteri dan
t

arkaea.

Bakteri hipertermofil yang tumbuh pada suhu tertinggi adalah

pymphilus dan Thermotoga maritima masing-masing pada 95

OC

dan 90

Aquifex
OC.

Arkaea

hipertermofil umumnya tumbuh optimum pada suhu yang lebih tinggi daripada bakteri,

yaitu pada kisaran 103-11O'C , misalnya Pyrococcus, Pymbaculum, Pyrodictium, dan
Methanopyms (Blochl et a/. 1995).
Sebagian besar termofil berasal dari genera pembentuk endospora, yaitu Bacillus
dan Clostridium.

Mikroorganisme termofilik yang lain antara lain dari kelompok

aktinomiset, bakteri asam laktat, bakteri gram negatif, dan sianobakter (Stell & Walker
1991).

Bacillus tennofilik
Bacillus termofilik telah diisolasi lebih dari 100 tahun yang lalu pada kisaran
perturnbuhan mesofilik dan termofilik . Mikroorganisme ini sering dijumpai sebagai
kontarninan produk makanan dan juga sebagai penghasil enzim termostabil, seperti
protease, amilase, pullulanase, glukosa isomerase, lipase, xilanase, dan enzim restriksi
DNA. Sifat tennodurik dan kemampuan menghasilkan endospora dari Bacillus termofilik
sering digunakan pula sebagai indikator keberhasilan sterilisasi uap (Rainey et a/. 1994).
Taksonomi Bacillus termofilik sebagian besar berdasarkan pada bentuk fenotipik
dan karakterisasi genotipik. Analisis filogenetik Bacillus termofilik berdasarkan sekuens
16s rDNA dan rRNA telah berhasil dipelajari (Tabel 1). Rainey et a/. (1994) melaporkan
Bacillus termofilik memiliki rasio basa mol % G+C dari gen IS rDNA di antara 57-63.
Pada mikroorganisme mesofilik mol % G + C tersebut di antara 53 dan 55.
Molekul RNA ribosom (rRNA) dapat digunakan untuk rnelihat hubungan evolusi
organisme hidup, karena sifatnya yang konstan, terdistribusi universal, secara
fungsional homolog, dan sangat konservatif sehingga dapat dipakai sebagai jam biologi
(kmnometer) suatu perjalanan evolusi. Penelitian filogenetik prokatyot lebih banyak
menggunakan IS-rRNA (1500 nukleotida), karena memiliki sekuens konservatif yang
tinggi dan sekuens mriabel tertentu yang dapat digunakan sebagai
filogenetik (Madigan et a/. 2000).

kronorneter

Tabel 1. Nilai mol % G+C dari DNA dan 16s-rDNA dari delapan galur Bacillus terrnofilik
(Rainey et a/. 1994)
Galur

mol % G+C
DNA

Suhu opt.*
ec)
. .

pH
opt.*

60

5,5-9,0

61

Mol%
G+C
16s-rDNA
57

B. thermooleovemns DSM 5366

55-65

6,O-7,5

58

59

6.caldovelox DSM 4 11

60-70

6,3-8,5

65

59

6. caldolyt~~s
DSM 405

72

6,O-8,O

52,53

59

B. caldotenax DSM 406

80

7,5-8,5

65,73

59

6. thermodenitrificans DSM 466

65-70

td

49

59

6. themomber DSM 7064

45-48

td

57

57

6. thermocatenulatus DSM 730

65-70

td

69

60

B. tlavothermus DSM 2641

Keterangan: * suhu dan pH optimum pertumbuhan, td = tidak ditentukan

Enzim
Enzim adalah protein yang dihasilkan oleh sel hidup dan berfungsi sebagai
katalis biologi yang spesifik dan efisien. Hampir seluruh reaksi fisiologi dikatalisis enzim
dengan meningkatkan kecepatan reaksi 10~-10'*kali lebih cepat daripada reaksi tanpa
katalis enzim. Reaksi katalitik oleh enzim pada umumnya bersifat cepat membentuk
reaksi kesetimbangan tanpa disertai reaksi samping, bekerja dalam larutan encer,
berlangsung pada suhu rendah, dan kondisi netral (Ottaway & Apps 1984).
Enzim berupa protein globular yang terbentuk dari rantai polipeptida yang berlipat
secara kompak. Konformasi tersier protein globular merupakan bentuk yang paling
stabil, karena ditunjang oleh berbagai ikatan yang menstabilkan struktur tersier protein.
Jenis-jenis ikatan tersebut adalah: ikatan hidrogen yang terdapat di antara gugus R
,
residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion di antara gugus R yang
ben'awanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik,
kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistin (Ottaway & Apps 1984).

dan ikatan

Struktur protein enzim mempenganrhi aktivitas katalitiknya. Aktivitas katalitik enzim
akan hilang bila tejadi denaturasi protein. Denaturasi adalah perubahan konformasi
molekul protein dari bentuk berlipat menjadi bentuk tidak beriipat. Denaturasi dapat
menyebabkan kehilangan aktivitas biologi, kelarutan, dan kemampuan untuk
membentuk kristal. Denaturasi dapat disebabkan oleh kondisi pH ekstrim, suhu tinggi,
dan pengaruh senyawa seperti: detergen ionik, pelarut organik, urea konsentrat, anion
besar dari asam kuat (ClOj, CCI 3CO03, dan ion chaotropic (I-, SCN') (Ottaway & Apps
1984).

Enzim Tennostabil
lstilah termostabil (stabil panas) didefinisikan dengan sejumlah arti dan bersifat
relatif. Sebagian besar definisi termostabil bemubungan dengan sifat alami enzim dan
sumber penghasilnya. Maka ada yang mendefinisikan enzim termostabil sebagai enzim
yang memiliki suhu aktivitas maksimum di atas suhu pertumbuhan organisme
penghasilnya. Namun pada kenyataannya, ada enzim yang dihasilkan oleh
mikroorganisme yang hidup pada suhu 90°C tetapi mempunyai suhu aktivitas optimum
di bawah atau di atas suhu pertumbuhannya.
Definisi enzim termostabil yang lain berhubungan dengan aktivitas enzim yang
masih terukur setelah enzim diinkubasi pada suhu 6 0 ' ~atau lebih selama waktu
tertentu. Definisi tersebut temyata dapat

berlaku

untuk enzim yang bersifat

termotoleran yang masih memiliki aktivitas enzim setelah pemanasan dan terukur pada
kondisi suhu mesofilik. Kestabilan enzim biasanya diukur berdasarkan waktu paruh
aktivitas enzim. Waktu panrh didefinisikan sebagai waktu reaksi aktivitas enzim yang
tufun hingga sepafuh aktivitas semula pada kondisi suhu tertentu. Nilai waktu paruh
masih benrpa ukuran yang relatif. Namun pada umumnya enzim termostabil sejati

memiliki waktu p a ~ pada
h
suhu 5 0 ' ~yang jauh lebih lama dari pada enzim termolabil
(tidak tahan panas) (Ng & Kenealy 1986).
Mikroorganisme (hiper)termofil berpotensi sebagai penghasil enzim termostabil.
Enzim yang dihasilkannya memiliki nilai ekonomis, antara lain:(l) stabil selama
penyimpanan akan mengurangi biaya produksi dan memudahkan untuk proses
pemumian enzim, (2) reaksi berlangsung pada suhu tinggi sehingga akan mengurangi
kontaminasi oleh

bakteri mesofil, (3) lebih tahan terhadap pelarut, detergen, dan

senyawa denaturan, (4) pada suhu tinggi proses fermentasi akan lebih cepat, karena
reaksi enzim akan meningkat, dan (5) pemisahan produk yang mudah menguap akan
lebih cepat (Steel &Walker 1991).
Perbandingan komparatif protein dari mesofil dan termofil menunjukkan terdapat
kesamaan uri-ciri molekuler dan katalitik di antara protein yang mengatalisis reaksi yang
sama dari kedua organisme tersebut (Steel & Walker 1991). Berdasarkan studi residu
asam amino

pada sisi katalitik enzim, protease termostabil yang berasal dari

B. steamthennophilus dan B. themopmteolyticus menunjukkan 85% homolog, dan
protease termolabil (tidak tahan panas) dari B. subtilis dan B. amyloliquefaciens
menunjukkan 82% homolog. Protease B. stearothermophilus hanya menunjukkan 30%
homolog dengan protease B. subtilis. Sekuen dari 17 residu asam amino, termasuk
residu histidina pada sisi aktif dari keempat protease netral ini bersifat sangat
konservatii, dan diduga memiliki struktur tiga dimensi yang sama (Rao et al. 1998).
Sifat stabil panas suatu protein ditentukan struktur intrinsik protein antara lain: (1)
memiliki ikatan disulfida, (2) jumlah interaksi elektrostatik permukaan protein (jembatan
garam) lebih banyak, (3) struktur protein yang lebih kompak dengan adanya interaksi
hidrofobik dan ikatan hidrogen, dart (4) mengandung kation divalen atau monovalen
yang menjaga kestabilan konformasi protein (Steel & Walker 1991).

Sifat ketahanan terhadap panas suatu protein atau enzim dapat diinduksi dengan
penambahan senyawa nonprotein atau melalui modifikasi fisiko kimia. Modifikasi kimia
dilakukan dengan cara mereaksikan enzim dengan substrat, pelarut, garam, dan kation.
Sebagai contoh, gliserol, sukrosa, dan etilen glikol biasa dicampurkan dengan enzim
selama masa penyimpanan. Ion kalsium dapat mempertahankan kestabilan terhadap
panas pada enzim protease dan amilase. Demikian pula ion magnesium, strontium, dan
barium memberikan pengaruh yang sama seperti kalsium pada a -amilase Aspergillus
orylae (Ng & Kenealy 1986).
Enzim termostabil yang dipasarkan ada pula yang berasal dari mesofil. Melalui
teknik rekombinasi DNA, memungkinkan untuk mengklon enzim terrnofilik ke dalam
inang mesofilik untuk menghasilkan enzim termostabil.

lmanaka et

al. (1986)

melakukan mutasi terarah dengan cara mensubstitusi asam amino pada daerah yang
bukan konservatif dari protease netral termostabil dan terrnolabil yang berasal dari
Bacillus temyata dapat pula meningkatkan termostabilitas.

Protease Mikroorganisme
Protease atau enzim proteolitik adalah enzim yang memiliki daya katalitik terhadap
ikatan peptida dari suatu molekul polipeptida atau protein. Protease dapat diisolasi dari
tumbuhan (papain, bromelin), hewan (tripsin, kimotripsin, pepsin, renin), dan
mikroorganisme (bakteri, kapang, dan virus). Protease merupakan enzim hidrolitik yang
paling banyak diperdagangkan dalam industri ( 5 60%), sebanyak 2 40% di antaranya
berasal dari mikrorganisme. lndustri yang memanfaatkan protease antara lain industri
detergen, makarian, tekstil, kulit, dan farrnasi (Rao et al. 1998).
Komisi tatanama International Union of Biochemistry and Molecular Biology
mengelompokkan protease ke dalam kelompok enzim 3 (hidrolase) dan subkelompok 4

(EC 3.4). Protease diklasifikasikan berdasarkan tiga kriteria utama: (1) jenis reaksi yang
dikatalisis, (2) sifat kimia sisi katalitik, dan (3) hubungan evolusi struMur enzim.
Protease terdiri dari dua kelompok utama ditinjau dari jenis reaksi yang dikatalisis
yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase memotong ikatan peptida dekat
dengan ujung amino (aminopeptidase, EC 3.4.11
(karboksipeptidase, EC 3.4.16
(EC 3.4.21

- EC 3.4.18)

- EC 3.4.14),

atau ujung karboksil

dari molekul substrat.

Endopeptidase

- EC 3.4.34) memotong ikatan peptida pada bagian dalam rantai polipeptida

dan jauh dari ujung amino atau karboksil molekul substrat.
Endopeptidase dikelompokkan ke dalam 4 subkelompok berdasarkan mekanisme
katalitik enzim, yaitu: protease serina (EC 3.4.21), pmtease sisteina (EC 3.4.22),
protease asam (EC 3.4.23), dan protease logam atau metaloporotease (EC 3.4.24).
Rawlings & Barret memberi kode bertunrt-turut: S, C, A, dan M untuk memudahkan
penamaan keempat subkelompok tersebut. Endopeptidase yang belum diketahui
mekanisme katalitiknya diberi nomor EC 3.4.99 (Rao eta/. 1998).
Penggolongan protease berdasarkan sekuen asam amino atau sekuen nukleotida
penyandinya mengarah pada hubungan evolusi s t ~ k t u renzim. Sebagai contoh,
dendogram Treeview package menyeleksi sekuen asam amino dari protease yang
berasal dari mikroorganisme, tumbuhan, dan hewan melalui program SWISS-PROT dan
PIR. Protease ini kemudian dikelompokkan ke dalam tiga kelompok yang berbeda
berdasarkan pH aktivitas enzim (Rao et a/. 1998).

-

Protease Serina
Protease serina dicirikan dengan kehadiran gugus serin pada sisi aktif. Protease
serin

dihambat

antara

lain

oleh

senyawa

3,4-dikloroisokoumarin

(3,4-DCI),

fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), diisopropilfluomfosfat (DFP), dan tosil-I-lisin klorometil
keton (TLCK). Protease serina aktii pada kondisi pH netral dan alkalin (pH 7-11).

Protease serina terdiri dari dua tahap reaksi hidrolisis, yaitu asilasi dan deasilasi. Tahap
asilasi ditandai dengan pembentukan senyawa antara enzim-peptida yang berikatan
kovalen bersamaan dengan hilangnya fragmen asam amino atau peptida. Pada tahap
deasilasi terjadi serangan nukleofilik senyawa antara oleh air yang menyebabkan
hidrolisis peptida (Rao et a/. 1998).
Protease serina yang berasal dari mikroorganisme dikelompokkan oleh Morihara
ke dalam empat kelompok protease: serupa tripsin, alkalin, a-litik Myxobacter, dan
stafilikokal (Tabel 2). Protease serina dari setiap kelompok menunjukkan kespesifikan
yang khas pada sisi pemotongan substrat.

Kelompok

pertama menunjukkan

kespesifikan terhadap asam amino basa, kelompok kedua terhadap residu aromatik
atau hidrofobik, kelompok ketiga terhadap residu alifatik sederhana, seperti alanina, dan
kelompok keeempat spesifik terhadap residu asam (aspartat atau glutamat) pada sisi
karboksil dari titik pemotongan substrat sintetik atau rantai-B insulin teroksidasi (Ward
1983).

Tabel 2. Pengelompokan dan ciri-ciri protease serina mikrorganisme (Ward 1983;
Tsuchiya et a/. 1992)
Kelompok
Contoh Mikrob
Ciri-ciri
Senyawa
Protease Serina
Penghasil
Penghambat
Streptomyces sp.
Aktif pada pH 8,O
DFP, TLCK
Serupa tripsin
- BM 20000
- pH isoelektrik 4

-

Alkalin

-Bacillus lichenifomis
(Subtitisin Carlsberg)
-Themoactinomyces
I

SP.

a-litik
Myxobader

- Mycobacterium

Stafilokokal

Staphylococcus
aul~us

- Somngium

- pH optimum 8-9

-

BM 27277
pH isoelektrik 9,4

-

pH optimum 11,5
BM 25000

-

Aktif pada pH 9,O

DFP, PMSF

DFP

- pH optimum 4,O- DFP

-

7,8
BM 12000

Protease Asam
Protease asam atau protease asam aspartat tergantung pada kehadiran residu
asam aspartat untuk aktivitas katalitik enzim. Serangan nukleofilik pada protease asam
dilakukan oleh dua transfer proton: satu dari nukleofil ke diad dari dua gugus karboksil,
dan yang lainnya dari diad ke karbonil oksigen substrat (mekanisme dorong-tank [pushpulll) yang akan membentuk senyawa antara tetraherdral bermuatan netral. Bentuk

tetrahedral ini akan pecah kembali dengan mekanisme dorong-tank (Polgar 1990).
Protease asam terdiri dari tiga subkelompok: pepsin, retropepsin, dan enzim yang
berasal dari pararetrovirus. Sebagian besar protease asam aktif pada pH 3-4, BM
30000

- 40000, titik isoelektrik antara pH 3 - 43, dihambat oleh pestatin, dan sensitif

terhadap senyawa diazoketon, seperti: diazosetil-DL-norleusin metilester (DAN) dan 1,2epoksi-3-(pnitrofenoksi)propana (EPNP) dengan kehadiran ion tembaga. Protease

asam banyak dihasilkan oleh fungi, dan jarang dihasilkan bakteri (Ward 1983; Rao et a/.
1998).

Protease Sisteina
Protease sisteina atau protease tiol memerlukan asam amino sisteina dan histidina
untuk aktivitas katalitik enzim. Berdasarkan kespesifikan rantai samping, protease ini
terdiri dari 4 subkelompok: serupa papain, serupa tripsin, spesifik untuk asam glutamat,
dan lainnya (di luar ketiga subkelompok pertama). Papain mempakan protease sisteina
memiliki pH optimum netral, dan sensitii terhadap senyawa sulfidril, seperti PCMB.
Klostripain merupakan contoh protease sisteina yang menunjukkan kekhasan pada
asam amino bash pada sisi karboksil dari titik potong, BM 50000, dan pH isolelektrik 4,84,Q (Ward 1983; Rao et a/. 1998). Protease sisteina mengkatalisis hidrolisis turunan

asam karboksilat melalui jalur pembentukan asam-basa dan hidmlisis senyawa antara

asil-tiol. Mekanisme reaksi protease sisteina mirip dengan protease serina, kecuali
nukleofil berupa gugus tiolat bukan hidroksil (Polgar 1990).

Metaloprotease
Metaloprotease (protease logam) membutuhkan ion logam divalen untuk aktivitas
enzim. Mekanisme reaksi metaloprotease agak berbeda dengan ketiga jenis protease
lainnya.

Pada termolisin, gugus karboksilat dari Glu 143 membantu serangan

nukleofilik ikatan zink dengan molekul air pada karbon karbonil ikatan peptida.
Pengelompokan protease logam berdasarkan kespesifikan reaksi terdiri dari: netral,
alkalin, Myxobacter I, dan Myxobader II (Tabel 3). Keempat subkelompok ini dihambat
oleh senyawa pengkhelat, seperti etilendiamintetraasetat (EDTA). Protease netral
menunjukkan kespesifikan terhadap asam amino hidrofobik, protease alkalin
menunjukkan kespesifikan yang sangat has, Myxobacter I spesifik pada asam amino
sederhana pada kedua sisi titik potong, dan Myxobacter II spesifik pada residu lisina
pada sisi amino ikatan peptida (Ward 1983; Rao et a/. 1998).
Tabel 3. Pengelompokan, ciri-ciri, dan contoh metaloprotease mikroorganisme
(Ward 1983; Kubo et a/. 1988)
Kelompok
Metaloprotease
Netrai

Contoh Mikrob Penghasii
B. steamthermophilus

Ciri-ciri

-

BM 34000
pH optimum 7,5
dihambat oleh ImM EDTA

- Pseudomonas aemginosa - Semtia spp.
-

BM 48000-60000
pH optimum 7,O-9,O
Peka pada konsentrasi
EDTA > IO-~M

Myxobacter I

- Sorangium sp.
- Mycobacter sp.

-

BM 14000
pH optimum 9,O

Myxobacter II

- Mycobactersp.

-

BM 17000
pH optimum 8,5-9,O

Alkalin

,

-

1

Protease Tennostabil Bacillus
Protease termostabil yang dihasilkan Bacillus dan telah digunakan secara
komersial, antara lain subtilisin, termolisin, dan kaldolisin. Ketiga enzim ini mengikat
satu atau lebih kalsium yang berguna untuk kestabilan enzim di lingkungan
ekstraseluler. Protease yang berikatan dengan kalsium tidak cocok digunakan dalam
industri detergen, karena detergen mengandung senyawa antara lain tripolifosfat yang
dapat mengkhelat kalsium. lndustri detergen memerlukan enzim yang stabil pada pH
alkalin dan denaturan kimia. Subtilisin yang bersifat alkalin telah digunakan dalam
industri detergen dengan terlebih dahulu dimodifikasi. Residu 75-83 yang merupakan
loop pengikatan kalsium subtilisin dihilangkan dan sisi aktii senna 221 diganti dengan
sisteina. Delesi residu 75-83 menyebabkan destabilisasi protein, tetapi kemudian
mereka menciptakan struktur baru untuk kestabilan enzim dengan cara mutagenesis
terarah menggunakan oligonukleotida pendek. Mutan baru yang terbentuk memiliki
aktivitas protease dengan 1000 kali lebih tahan terhadap senyawa pengkhelat
(Strausberg et a/. 1995).

Peningkatan termostabilitas subtilisin dilakukan dengan

menambah ikatan disulfida menggunakan mutagenesis terarah pada AsnlO9 dan
Asn218 dengan Ser (Rao et a/. 1998).
Kaldolisin dihasilkan oleh B. caldolyticus dan Thennus aquaticus T-351. Kaldolisin
memiliki waktu paruh selama 193 jam pada suhu 7 5 ' ~dalam 10 mM CaCI2, dan bila
tanpa kalsium hanya 4,8 menit. Kaldolisin mengikat enam

ion ca2' untuk setiap

molekul enzim. Ada dua tipe pengikatan kalsium pada kaldolisin empat ion ca2' terikat
secara lemah dan dapat dihilangkan dengan kromatografi penukar kation. Dua ion ca2'
v

lainnya terikat kuat dan menentukan kestabilan enzim (Steel & Walker 1991).
Termolisin merupakan metaloendopentidase yang dihasilkan oleh galur-galur
spesies Bacillus. Enzim yang dihasilkan dikenal sebagai protease netral (NP) atau
protease serupa termolisin (TLP). Struktur termolisin pertama kali dilaporkan tahun

1972 dari B. cereus. Enzim ini relatif stabil

terhadap suhu tinggi. Struktur kristal

termolisin termostabil ekstrim yang berasal dari B. thermopmteolyticus, termostabil
moderat NP-cer yang berasal dari 8.cereus terdiri, dan dari NP lainnya terdiri dari
domain N-terminal (residu 1-154) mengandung lipatan beta, dan domain C-terminal
(residu 153316) mengandung alfa heliks. Termolisin mengandung satu atom zink pada
sisi aktiif dan dua hingga empat ion ca2' untuk kestabilan enzim (Eijsink et a/. 1995).
Spesies-spesies Bacillus yang menghasilkan enzim yang memiliki sifat termostabilitas
dan homologi yang serupa dengan termolisin dengan termolisin B. thermopmteolyticus
terdapat pada Tabel 4.
Tabel 4. Homologi dan termostabilitas protease netral yang dihasilkan oleh spesies
Bacillus (Eijsink et a/. 1993).

CC)

Nama enzim

ldentik relatii (%)

termolisin

100

82,O

B. ~ a l d ~ l y f i ~ ~ ~

NP-=I

86

76,7

B. stearothennophilus

NP-ste

85

68,5

8.cereus
8.subtilis

NP-cer

73

60,O

NP-sub

47

55,3

6. amyloliquefaciens

NP-amy

47

55

Spesies Bacillus
6. thermopmteolyticus

T50

Kestabilan TLP biasanya dinyatakan dengan Tsayaitu suhu pada 30 menit inkubasi
aktivitas enzim tereduksi separuhnya. Sebagai contoh Tsatermolisin 86,g0c dan berbeda
dengan TLP yang kurang stabil seperti NP-ste (TS0= 73,4'~) pada 44 asam amino.
Secara keseluruhan kedua enzim hampir sama dan seluruh residu yang terlibat dalam
katalisis dan pengikatan ion logam bersifat konservatii. Perbedaan kestabilan termolisin
dengan NP-cer ditentukan oleh 44 asam amino yang terdapat pada domain N-terminal.
Kestabilan enzim NP atau TLP lainnnya dapat ditingkatkan pada daerah ini (Eijsink et

al. 1995).

Pemumian Enzim Protease

Pemumian bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa yang
tidak dikehendaki lainnya. Tahaptahap pemumian tergantung dari tujuan akhir, apakah
untuk tujuan komersial atau tujuan riset. Enzim yang kasar atau yang dimumikan
sebagian masih dapat dipakai untuk

komersial, sedangkan enzim yang mumi atau

hampir mumi dikehendaki dalam riset atau dipakai dalam produk analitik. Hanis (1989)
menyebutkan minimal ada tiga strategi dalam
dipetttatikan: (1) kualitas; perlu tindakan

pemumian enzim yang hams

untuk mempertahankan aktivitas protein

dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi, (2) kuantitas; pemakaian akhir dari
protein mumi akan menentukan kuantitas enzim yang diperlukan, (3) ekonomis yang
merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam industri, atau diterapkan dalam skala
laboratorium.

Pemekatan Enzim

Pemekatan protein enzim merupakan tahap awal dari prosedur pemumian enzim
sebelum tahap pemumian berikutnya atau dapat pula digunakan untuk keperluan
analisis enzim (Hanis 1989).

Pemekatan protein dapat dilakukan dengan dua metode,

yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan
asam (misalnya asam trikloroasetat), pengendapan organik (misalnya aseton atau
etanol), dan imunopresipitasi dapat menyebabkan denaturasi protein. Berbeda dengan
metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan
protein dengan metode preparatif misalnya dengan menggunakan pengendapan dengan
1

garam, pengendapan dengan pelarut organik, pengendapan dengan polimer organik ,
ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edelstein 1991). Metode pengendapan

protein yang biasa dilakukan dalam pengendapan protease adalah menggunakan
garam amonium sulfat dan pelarut organik aseton.
Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang
berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya
tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH dan suhu
tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan
protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan
konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (saking out). Molekul air yang berikatan
dengan ion-ion garam semakin banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang
mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein sating berinteraksi,
beragregasi, dan kemudian mengendap (Hanis 1989; Scopes 1987). Amonium sulfat
merupakan garam yang paling sering digunakan untuk mengendapkan protein karena
memiliki daya larut tinggi di dalam air, relatif tidak mahal, dan kestabilan protein di dalam
larutan amonium sulfat (2M - 3M) tahan bertahun-tahun (Scopes 1987).
Pengendapan protein dengan menggunakan pelarut organik berdasarkan pada
pengurangan kelarutan protein dan

konstanta dielektrika pelarut. Semakin banyak

pelarut organik yang ditambahkan, semakin berkurang daya solvasi air dan muatan
pada permukaan molekul protein yang hidrofilik. Hal ini akan menjadikan molekulmolekul protein cenderung berinteraksi dengan sesamanya, hingga akhimya protein
mengendap. Prosedur pengendapan pelarut organik dilakukan pada suhu di bawah
O'C.

Pada suhu di atas

loOc,konformasi

protein akan segera berubah yang

memungkinkan molekul-molekul pelarut organik mendapatkan jalan masuk ke bagian
dalam struktur pfotein, kemudian akan merusak interaksi hidrofobik dan akhimya akan
terjadi denaturasi (Hartis 1989; Scopes 1987).
Pengendapan protein dengan polimer organik, misalnya yang paling banyak
menggunakan polietilen glikol (PEG), memiliki mekanisme yang hampir sama dengan

pengendapan pelarut organik, tetapi pada PEG hanya perlu konsentrasi yang lebih
rendah dari 20%. Berat molekul PEG yang digunakan berkisar 6000-20000.PEG adalah
polimer nonionik yang tidak larut.

Pengendapan enzim dengan PEG tidak

mempengaruhi tahap pemumian berikutnya, misalnya dengan kromatografi penukar ion
atau kromatografi afinitas (Hams 1989).
Garam yang berlebih yang terdapat di dalam larutan enzim setelah tahap
fraksinasi dapat dihilangkan dengan cara dialisis. Pada tahap dialisis, protein
ditempatkan di dalam kantung (membran) semipermeabel yang direndam di dalam
larutan bufer tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan ke luar melalui membran, dan
molekul yang berukuran besar akan tertahan di dalam membran dialisis. Ukuran pori
kantung dialisis yang terbuat dari bahan selulosa asetat ini berdiameter 1-20 nm. Ukuran
ini menunjukkan berat molekul minimum yang dapat tertahan di dalam membran.
Selain dengan dialisis, penghilangan garam dapat dilakukan dengan filtrasi gel.
Metode ini biasanya diterapkan untuk sampel yang sedikit, yaitu tidak melampaui 2530% volume kolom untuk mendapatkan resdusi yang memadai antara protein dan
garam. Matriks filtrasi gel memiliki pori yang berukuran kecil , misalnya Sephadex G-25
buatan Pharmacia. Kekurangan metode ini adalah tejadi pengenceran sampel protein
(Harris 1989).

Kromatografi Kolom

Pemumian enzim protease yang biasa dilakukan adalah

menggunakan

kromatografi kolom. Ada beberapa cara kromatografi kolom, antara lain kromatografi
I

filtrasi gel, kromatografi penukar ion, kromatografi interaksi hidrofobik, kromatografi