Keragaman Genetik Dan Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus Epinephelus Dari Beberapa Perairan Indonesia
KERAGAMAN GENETIK DAN REKONSTRUKSI FILOGENI
IKAN KERAPU GENUS EPINEPHELUS
DARI BEBERAPA PERAIRAN INDONESIA
EDWIN JEFRI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Keragaman Genetik dan
Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus Epinephelus dari beberapa Perairan
Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dan karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor
Bogor, September 2015
Edwin Jefri
NRP C551120011
RINGKASAN
EDWIN JEFRI. Keragaman Genetik dan Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu
Genus Epinephelus dari beberapa Perairan Indonesia. Dibimbing oleh NEVIATY
PUTRI ZAMANI dan HAWIS MADDUPPA.
Ikan kerapu dari genus Epinephelus merupakan jenis ikan demersal yang
sebagian hidupnya di daerah terumbu karang pada perairan tropis dan subtropis.
Namun beberapa jenis pada fase juvenil dan larva ditemukan di daerah hutan
mangrove dan padang lamun. Jumlah jenis ikan kerapu banyak ditemukan di
perairan Indonesia, tercatat ada sekitar 110 spesies yang hidup di perairan IndoPasifik. Para nelayan telah melakukan penangkapan ikan kerapu meliputi hampir
semua perairan karang yang ada di Indonesia. Hal ini disebabkan karena
keuntungan yang diperoleh dalam perdagangan kerapu hidup sangat besar.
Eksploitasi yang tinggi dan kurangnya upaya konservasi dapat menyebabkan
berkurangnya stok ikan kerapu pada beberapa perairan di Indonesia. Upaya
konservasi yang dapat dilakukan adalah dengan menjaga sumberdaya genetik,
jenis dan ekosistem ikan tersebut. Sumber daya genetik merupakan tahapan dasar
dalam upaya melindungi sumber daya ikan kerapu, melalui teknik DNA barcoding
dan studi filogeni. Metode ini akan memudahkan dalam identifikasi bahkan
hingga pada tingkatan spesies jika dibandingkan dengan hanya menggunakan
metode identifikasi berdasarkan karakter morfologi.
Penelitian ini menggunakan sampel ikan kerapu genus Epinephelus
sebanyak 39 individu yang diambil dari perairan Lombok 12 individu,
Karimunjawa 11 individu, Lampung 4 individu, Kendari, Madura, Numfor dan
Tanakeke masing-masing 3 individu. Sampel dipreservasi kemudian dilanjutkan
dengan proses ekstraksi, amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) dan
elektroforesis di Laboratorium Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan,
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, IPB. Tahapan sekuensing selanjutnya
dikirim ke Berkeley Sequencing Facility, USA dengan metode Sanger, didapatkan
panjang sekuen semua sampel sebesar 526bp.
Analisis data menggunakan program MEGA 6.0.5 dengan metode
filogenetik Neighbor Joining (NJ) dan Maksimum Likelihood (ML), model evolusi
Kimura 2-parameter dan replikasi bootstraps 1000x. Dari pohon filogeni terbentuk
sebanyak tujuh clade. yaitu Epinephelus areolatus, Epinephelus merra,
Epinephelus fasciatus, Epinephelus longispinis, Epinephelus coioides,
Epinephelus ongus dan Epinephelus coeruleopunctatus. Selain itu, jarak genetik
terdekat didapatkan adalah Epinephelus ongus dan Epinephelus coeruleopncstatus
dengan jarak genetik 0.091 (9%) dan jarak genetik terjauh antara Epinephelus
ongus dan Epinephelus merra dengan jarak genetik 0.178 (18%).
Kata kunci: Keragaman Genetik, Filogeni, Epinephelus. Perairan Indonesia.
SUMMARY
EDWIN JEFRI. Genetic Diversity and Phylogeny Reconstruction of Grouper
Genus Epinephelus in several Indonesia seas. Under supervision of NEVIATY
PUTRI ZAMANI and HAWIS MADDUPPA.
Groupers genus Epinephelus is a demersal fish are most of his life in the
coral reef of tropical and subtropical coastal waters, However, some types of
juvenile and larvae phase are founded in the mangrove forests and seagrass beds.
The number of groupers are commonly found in the Indonesian seas, stated that
there were approximately 110 species groupers that life in the Indo-Pacific oceans.
The fishermen caught the groupers in almost all coral reef seas in Indonesia. This
is because the trade of live grouper is highly profitable. High exploitation and lack
of conservation efforts will decrease the groupers availability in several seas in
Indonesia. Conservation efforts by maintaining genetic resources, species and
ecosystems such fish. Genetic resources are the basic stages in an effort to protect
the resources of grouper, through the technique of DNA barcoding and phylogeny
studies. This method can accurately identify a wide variety of animals to the
species level compared to just using the identification method based on
morphological characters.
This Study used a total of 39 tissue samples of groupers genus Epinephelus
were collected from seven sites in Indonesia including Lombok (n=12 samples),
Karimunjawa (n=11), Lampung (n=4), Kendari (n=3), Madura (n=3), Tanakeke
(n=3), and Numfor (n=3). Samples preserved proceed with the extraction,
amplification PCR (Polymerase Chain Reaction) and electrophoresis in Marine
Biodiversity and Biosistematika Laboratory, Department of Marine Science and
Technology, IPB. Sequencing stages sent to Berkeley Sequencing Facility, USA
with the Sanger method, the results are long sequences of all the samples obtained
by 526bp.
Analysis of data using the program MEGA 6.0.5 with phylogenetic methods
Neighbor Joining (NJ) and Maximum Likelihood (ML), the model of evolution
Kimura 2-parameter and replication bootstraps 1000x. Phylogeny tree formed
seven clade; Epinephelus areolatus, Epinephelus merra, Epinephelus fasciatus,
Epinephelus longispinis, Epinephelus coioides, Epinephelus ongus and
Epinephelus coeruleopunctatus. In addition, Epinephelus ongus is genetically
closest to Epinephelus caeruleopncstatus with genetic distance 0.091 (9%),
whereas the farthest genetic distance was successfully identified between
Epinephelus ongus and Epinephelus merra with genetic distance 0.178 (18%).
Keywords: Genetic Diversity, Phylogeny, Epinephelus, Indonesian Seas
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KERAGAMAN GENETIK DAN REKONSTRUKSI FILOGENI
IKAN KERAPU GENUS EPINEPHELUS
DARI BEBERAPA PERAIRAN INDONESIA
EDWIN JEFRI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Kelautan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
Judul Tesis : Keragaman Genetik dan Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus
Epinephelus dari beberapa Perairan Indonesia.
Nama
: Edwin Jefri
NIM
: C551120011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Neviaty P. Zamani, M.Sc
Ketua
Dr. Hawis Madduppa, S.Pi M.Si.
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Kelautan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Neviaty P. Zamani, M.Sc
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Ujian: 10 Juli 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahi Robbil Alamin, segala puji bagi Allah SWT atas limpahan
Rahmat dan Karunia-Nya sehingga tesis yang berjudul “Keragaman Genetik dan
Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus Epinephelus dari beberapa Perairan
Indonesia” ini dapat penulis selesaikan. Tesis ini merupakan salah satu syarat
untuk memporoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Kelautan,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor (IKL-SPs IPB).
Penulis juga mengucapkan terimaksih dan penghargaan yang sebesarbesarnya kepada semua pihak yang turut berperan dalam memberi arahan
dukungan dan motivasi, mulai dari saat studi hingga penelitian dan penyusunan
thesis ini, terutama kepada:
Dr. Ir. Neviaty Putri Zamani, M.Sc dan Dr. Hawis Madduppa, S.Pi, M.Si
atas bimbingannya mulai dari penelitian hingga penyusunan tesis ini.
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) Kementrian Pendidikan
dan Kebudayaan, atas Beasiswa Unggulan (BU) yang diberikan selama
studi.
Keluarga Besar atas dukungan dan doanya selama ini, Ayahanda Husni
Ibunda Hanipa, kakanda Erwin Haniyadi, A.Md dan adinda Deni
Zulkarnaen, S.Kep, Ns dan Widia Nurmayani dan semua keluarga yang
tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Rekan-rekan Ilmu Kelautan 2012: Krisye, Hendra, Aradea Bujana
Kusuma, Bertoka Fajar, Nebuchadnezzar Akbar, I Wayan Eka
Dharmawan, Asep Sandra Budiman, Mohamad Gazali, Any Kurniawati,
Nurafni, Sri Yenica Roza.
Rekan-rekan Laboratorium Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan,
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, IPB.
Rekan-rekan di Asrama Mahasiswa NTB Bogor.
Rekan-rekan di Bogor Science Club (BSC-IPB) dan Himpunan Mahasiswa
Muslim Pascasarjana (Himmpas-IPB) atas semua dukungan dan
kerjasamanya selama studi dan mengemban amanah di Bogor.
Serta semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu.
Penulis memiliki harapan besar, penelitian ini bermanfaat dalam
perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang Ilmu kelautan dan
biologi molekuler khususnya untuk ikan kerapu genus Epinephelus.
Bogor, September 2015
Edwin Jefri
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian
1
1
2
3
3
3
2 METODE
Lokasi dan Waktu
Prosedur
Pengambilan Sampel Ikan Kerapu
Analisis Karakter Molekuler
Elektroforesis
Sekuensing DNA
Analisis Data
3
3
4
4
5
5
5
6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Molekuler
Jarak Genetik
Pohon Filogeni
6
6
8
10
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
14
14
14
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
19
RIWAYAT HIDUP
40
DAFTAR TABEL
1 Spesies yang ditemukan dari hasil BLAST di National Center for
Biotechnology Information (NCBI)
2 Jarak genetik antar spesies dari semua sampel yang digunakan
3 Karakter morfologi utama dalam identifikasi ikan kerapu Epinephelus
berdasarkan Heemstra and Randall (1993)
4 Data sekuen ikan kerapu yang diunduh dari National Center for
Biotechnology Information (NCBI)
7
8
8
11
DAFTAR GAMBAR
1 Peta Lokasi Pengambilan Sampel (Sumber; Surfer 12)
2 Kerangka Alur Penelitian
3 Hasil amplifikasi daerah COI menggunakan primer Fish R1 dan Fish F1
setelah dimigrasikan dalam gel agarosa 1,5 % pada tegangan 100 volt
selama 25 menit
4 Hasil penjajaran menggunakan Clustal W pada software MEGA 6.0.5
5 Spesies ikan kerapu Epinephelus yang memiliki jarak genetik terdekat
dan jarak genetik terjauh (Foto; Heemstra dan Randall (1993))
6 Pohon filogeni metode Neighbor Joining, dari 39 sekuen mtDNA CO1
Ikan Kerapu Epinephelus Indonesia dan 31 sekuen dari GeneBank
dengan Cephalopholis cyanostigma sebagai out-group
7 Pohon filogeni metode Maximum Likelihood, dari 39 sekuen mtDNA
CO1 Ikan Kerapu Epinephelus Indonesia dan 31 sekuen dari GeneBank
dengan Cephalopholis cyanostigma sebagai out-group
3
4
5
6
9
12
13
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sampel penelitian ikan kerapu genus Epinephelus dan ikan outgroup
pada pohon filogeni (Cephalopholis cyanostigma)
2 Protokol ekstraksi DNA total ikan kerapu Epinephelus menggunakan
Qiagen kit (DNeasy® Blood & Tissue Kit)
3 Komposisi Master Mix (ABI mix) pada proses PCR (Gold)
4 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) pada ikan kerapu
Epinephelus
5 Basa nukleotida ikan kerapu Epinephelus yang diunduh dari National
Center for Biotechnology Information (NCBI)
19
20
22
22
31
1
1 PENDAHULUAN
Ikan kerapu dari genus Epinephelus merupakan jenis ikan demersal yang
sebagian hidupnya di daerah terumbu karang pada perairan tropis dan subtropis,
namun beberapa jenis pada fase juvenile dan larva ditemukan di daerah hutan
mangrove dan padang lamun, dapat tumbuh dengan ukuran sampai 2,5 m dan
berat mencapai 400 kg. Jumlah jenisnya ada sekitar 110 spesies yang hidup di
perairan Indo-Pasifik (Heemstra dan Randall 1993). Sedangkan data dari WWF
Indonesia (2011) mengatakan ada 39 spesies ikan kerapu dapat ditemukan di
perairan Indonesia dan ada 46 spesies di Asia Tenggara. Merupakan salah satu
komoditas hasil perikanan yang paling penting di Asia dan di seluruh dunia
dengan permintaan pasar yang tinggi (Chiue et al. 2008). Sejak tahun 1980
Indonesia dikenal sebagai pemasok terbesar ketiga ikan kerapu dengan tujuan
ekspor ke beberapa negara yaitu Singapura, Hong Kong dan Cina. Para nelayan
melakukan penangkapan ikan kerapu meliputi hampir semua perairan karang yang
ada di Indonesia. Hal ini disebabkan karena keuntungan yang diperoleh dalam
perdagangan kerapu hidup sangat tinggi, sehingga tidak salah jika ikan ini banyak
diburu dan bernilai ekonomis penting (Nuraini dan Hartati 2006).
Tingkat eksploitasi yang tinggi dalam penangkapan yang dilakukan oleh
nelayan terutama di daerah pemijahan (spawning) (DKP 2008), serta kerusakan
terumbu karang sebagai habitat semakin meluas (Burke et al, 2002), tentu akan
menyebabkan stok ikan kerapu di Indonesia semakin kurang dan mungkin akan
hilang di beberapa perairan di Indonesia. Upaya pengelolaan dan pemanfaatan
dapat dilakukan untuk menjaga sumberdaya genetik, jenis dan ekosistem ikan
tersebut. Mendata sumber daya genetik merupakan tahapan dasar dalam upaya
melindungi sumber daya ikan kerapu, Oleh karena itu, perlu dilakukan upaya
pendataan yang dilakukan dengan menggunakan analisis molekuler.
Pada dasawarsa terakhir identifikasi ikan menggunakan pendekatan analisis
molekuler sudah banyak dilakukan dan mulai berkembang pesat pada tahun 1990
yang disebabkan karena berkembangnya metode untuk membuat pohon filogeni
dan informasi DNA sekuen yang diproleh dari PCR (Polymerase Chain
Reaction). (Ubaidillah 2009). Salah satu pendekatan molekuler yang dapat
digunakan adalah teknik DNA barcoding ditujukan untuk membedakan spesies
dan mengidentifikasi spesimen yang sulit dikenali, seperti fase larva, potongan
organ maupun material yang tidak lengkap secara morfologi, dengan
menggunakan sekuens gen yang cukup pendek (Hebert et al. 2003). DNA
barcoding dapat menjadi salah satu cara dan alternatif dalam mengidentifikasi
ikan kerapu Epinephelus, metode ini akan memudahkan dalam identifikasi bahkan
hingga pada tingkatan spesies jika dibandingkan dengan hanya menggunakan
metode identifikasi berdasarkan karakter morfologi.
Pada teknik DNA barcoding terdapat gen dalam genom mitokondria
(mtDNA) yang sekuennya biasa digunakan sebagai barcode yaitu gen Sitokrom
Oksidase Subunit 1 yang dikenal sebagai COI. Perkembangan literatur tentang
barcode DNA menunjukkan bahwa sebuah fragmen pendek COI dapat digunakan
sebagai penanda variasi yang secara akurat dapat mengidentifikasi berbagai
macam hewan sampai tingkat spesies (Waugh 2007). Sedangkan filogenetik
merupakan suatu metode yang digunakan untuk melihat dan memodelkan
2
kedekatan suatu spesies dengan spesies lainnya. Analisis filogenetik ini digunakan
untuk mengkontruksi dengan tepat hubungan antara organisme dan mengestimasi
perbedaan yang terjadi dari satu nenek moyang kepada keturunannya (Li et al.
1999).
Beberapa penelitian yang telah mendeskripsikan ikan kerapu menggunakan
molekular taksonomi dan filogeni; Ilves dan Taylor (2008), melakukan penelitian
pada Osmeridae, Ku et al. (2009) pada Epinephelus quoyanus, Merritt et al.
(1998) pada beberapa spesies Epinephelus dan Mycteroperca, Sachithanandam et
al. (2012) DNA barcoding dan studi filogeni pada Epinephelus spp. Craig dan
Hastings (2007), melihat kekerabatan spesies ikan kerapu subfamily
Epinephelinae dari beberapa lokasi di perairan Indo-Pasifik, hasilnya
menunjukkan bahwa monophyly dari Epinephelinae selama ini perlu direvisi
menggunakan bantuan analisis molekuler terutama untuk beberapa genus baru.
Selain itu Maggio et al. (2004) juga melakukan sebuah penelitian untuk
mengetahui kekerabatan filogeni ikan kerapu dari genus Epinephelus dan
Mycteroperca di perairan Atlantik Timur menggunakan analisis sekuen
Mitochondrial Cytochrome b (397bp) and 16S rDNA (516bp), estimasi molecular
clock menunjukkan waktu perbedaan dari beberapa spesies yang dianalisis
sebanyak 20-24 mya, yang bertepatan dengan periode Miosen. Bahkan beberapa
Negara seperti Mesir dan Afrika Selatan juga telah melakukan DNA barcoding
serta analisis filogeni untuk peredaran ikan dibeberapa supermarket, hal ini
dilakukan untuk menjaga dari kekhawatiran karena tingginya insiden substitusi
spesies dan regulasi peredaran ikan termasuk kerapu di tingkat International
(Galal-Khallaf et al. 2014) dan (Cawthorn 2012).
Perairan Indonesia dikenal kaya akan sumberdaya hayati laut yang beraneka
ragam, sebarannya di perairan sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor termasuk
adanya arus lintas Indonesia yang sangat dinamis sepanjang tahun. Menjadi sangat
penting untuk mengetahui keragaman genetik dan rekonstruksi filogeni dari ikan
kerapu Epinephelus dari beberapa perairan Indonesia dalam menambah khasanah
ilmu pengetahuan dan database genetik serta filogeni. Hasil penelitian juga akan
menjadi data penunjang penting dalam upaya konservasi sumber daya ikan
terutama konservasi genetik ikan, Hal ini sesuai dengan yang termaktub dalam
Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 60 tahun 2007 tentang
Konservasi Sumber Daya Ikan.
Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian diatas maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai
berikut:
1. Bagaimana keragaman genetik dan filogeni dari ikan kerapu Epinephelus
yang ditemukan di beberapa perairan Indonesia.
2. Bagaimana implikasi analisis genetika molekuler dan filogeni sebagai data
awal dalam usaha konservasi sumberdaya ikan kerapu Epinephelus di
Indonesia.
3
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk menganalisis keragaman genetik dan
filogeni ikan kerapu Epinephelus berdasarkan sekuen DNA Mitokondria Control
Region Sitokrom Oksidase Subunit I (CO1) serta untuk menganalisis hubungan
kekerabatan spesies yang termasuk dalam anggota genus Epinephelus.
Hipotesis
Adapun hipotesis pada penelitian ini adalah:
1. Mitokondria Control Region Sitokrom Oksidase Subunit I (CO1) mampu
menganalisis keragaman genetik dan filogeni ikan kerapu Epinephelus.
2. Adanya hubungan kekerabatan spesies yang erat dari ikan kerapu anggota
genus Epinephelus dari beberapa perairan di Indonesia.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah untuk menyediakan data keragaman genetik
dan filogeni yang akan membantu menjelaskan sejauh mana kekerabatan ikan
kerapu Epinephelus di beberapa perairan Indonesia.
2 METODE
Waktu dan Lokasi
Penelitian ini dilaksanakan bulan Januari - Mei 2014. Pengambilan sampel
ikan kerapu Epinephelus dilakukan di beberapa perairan di Indonesia; Lampung
bulan Februari (4 individu), Karimunjawa bulan Mei (11 individu), Madura bulan
April (3 individu), Lombok bulan Januari (12 individu), Tanakeke bulan Februari
(3 individu), Kendari bulan Januari (3 individu) dan Numfor bulan Mei (3
individu) (Gambar 1). Sedangkan analisis molekuler dikerjakan di Laboratorium
Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan, Departemen Ilmu dan Teknologi
Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Gambar 1 Peta Lokasi Pengambilan Sampel (Sumber; Surfer 12)
Keterangan; 1. Lampung, 2. Karimunjawa, 3. Madura, 4. Lombok, 5.
Tanakeke 6. Kendari 7. Numfor
5
Analisis Karakter Molekuler
Sebelum dilakukan ekstraksi, sampel jaringan dicuci menggunakan aquades
untuk menghilangkan pengaruh EtOH. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan
dua metode yaitu larutan Chelex 10% (Walsh et al. 1991) pada suhu 95˚C dan
ekstraction kit (Qiagen Kit) pada inkubasi suhu 56º C hingga jaringan lisis
(Lampiran 2).
Segmen target gen CO1, proses amplifikasi PCR (Polymerase Chain
Reaction) menggunakan primer: Fish R1-5’TAGACTTCTGGGTGGCC
AAAGAATCA3’ dan Fish F1-5TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3’
(Sachithanandam et al. 2012).
Kit PCR menggunakan AB1 master mix (Lampiran 3). Pada suhu Predenaturasi 94o C selama 5 menit, Denaturasi 94o C selama 30 detik, Anneling 56o
C selama 60 detik, Extention 72o C selama 60 detik dan Final Extention 72o C
selama 7 menit dengan 40x siklus (Sachithanandam et al. 2012).
Elektroforesis
Visualisasi produk PCR ini dilakukan melalui elektroforesis. Tahap awal
eletroforesisi adalah pembuatan gel agarosa 1,5% dengan pewarna Etidium
Bromide (4µl) sebagai media elektroforesis. Produk Hasil PCR diambil sebanyak
4µl dan dicampurkan dengan Loading Dye (1µl), kemudian disisipkan di sumuran
agarosa. Elektroforesis pada tegangan 100 volt selama 25 menit. Pita hasil
elektroforesis dapat dilihat dengan menggunakan sinar UV transluminator. Hasil
visualisasi produk PCR yang bagus akan memperlihatkan satu pita yang jelas
dengan ukuran produk sepanjang 500–700bp (base pairs), dengan demikian
produk PCR yang dihasilkan siap untuk disekuensing (Zein dan Dewi 2013).
Target COI
Epinephelus
1500bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
Penanda
(DNA Marker)
Gambar 3 Hasil amplifikasi daerah COI menggunakan primer Fish R1 dan Fish
F1 setelah dimigrasikan dalam gel agarosa 1,5 % pada tegangan 100
volt selama 25 menit
Sekuensing DNA
Sekuensing atau pengurutan DNA merupakan suatu teknik untuk
menentukan urutan basa nukleotida pada molekul DNA, hal ini bertujuan untuk
menentukan identitas gen dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan
sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Hasil PCR dikirim ke Berkeley
Sequencing Facility, USA dengan metode Sanger (Sanger et al. 1977).
6
Analisis Data
Data yang didapatkan setelah sekuensing DNA kemudian diurutkan
menggunakan program MEGA 6.0.5 (Moleculer Evolutionary Genetic Analysis).
Data tersebut diedit supaya sejajar menggunakan Clustal W pada program tersebut
untuk melihat keragaman basa nukleotidanya (Tamura et al. 2013) (Gambar 4).
Analisis sekuen DNA yang terbaik kemudian dibandingkan dengan sekuen DNA
pada basis data (database) DNA. Penelusuran dilakukan dengan menggunakan
internet melalui program pelacakan database Basic Local 38 Alignment Search
Tool (BLAST) pada National Center for Biotechnology Information, National
Institute for Health, USA (NCBI). Hal ini bertujuan untuk menentukan jenis
spesies dengan cara membandingkan database sekuen DNA pada GenBank dan
juga melihat similaritasnya dengan sequen ikan kerapu yang telah ada pada
database tersebut.
Gambar 4 Hasil penjajaran menggunakan Clustal W pada software MEGA 6.0.5
(Tamura et al. 2013)
Sekuen DNA yang didapatkan dianalisis menggunakan program MEGA
6.0.5 (Tamura et al. 2013) dengan analisis filogenetik metode Neighbor Joining
(NJ) dan Maksimum Likelihood (ML), model evolusi Kimura 2-parameter dan
replikasi bootstraps sebanyak 1000x. Analisis bootstrap 1000x dilakukan untuk
menguji kestabilan posisi filogeni dari clade tertentu pada pohon filogeni yang
dihasilkan.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Molekuler
Penggunaan teknik DNA barcoding pada genom mitokondria COI telah
banyak digunakan ke beberapa biota laut oleh para peneliti dan hasilnya terbukti
berhasil. Hal yang sama juga terlihat dari analisis ikan kerapu Epinephelus pada
penelitian ini. Proses ekstraksi dan sekuensing dilakukan terhadap 39 sampel
Epinephelus kemudian dilakukan BLAST di National Center for Biotechnology
7
Information, National Institute for Health, USA (NCBI), didapatkan hasil
sebanyak tujuh spesies, antara lain; Epinephelus areolatus, Epinephelus merra,
Epinephelus ongus, Epinephelus fasciatus, Epinephelus coioides, Epinephelus
coeruleopunctatus dan Epinephelus longispinis (Lampiran 1), setiap spesies
memperlihatkan nilai kemiripan sebesar 99% - 100% (Tabel 1).
Tabel 1 Spesies yang ditemukan dari hasil BLAST di National Center for
Biotechnology Information (NCBI)
No.
1
2
3
4
5
6
7
Spesies
Lokasi
Karimunjawa, Madura,
Kendari, Lombok, Lampung
Karimunjawa, Tanakeke,
E. merra
Kendari, Lombok, Numfor
Karimunjawa, Tanakeke,
E. ongus
Lombok
E. fasciatus
Lombok, Lampung
E. coioides
Karimunjawa
E. coeruleopunctatus
Numfor
E. longispinis
Lampung
Total
Epinephelus areolatus
Total
Persentase BLAST
(%)
(%)
Status
IUCN
15
38. 46
100
LN
13
33.33
99
LN
3
7.69
100
LN
4
2
1
1
39
10.25
5.12
2.56
2.56
100
99
100
99
100
99-100
LN
LN
LN
LN
LN
Ket: LN (Least Concern/beresiko rendah).
Panjang fragmen hasil amplifikasi PCR yang didapatkan dengan
menggunakan COI dan primer Fish R1 dan Fish F1 dari total 39 sampel sebesar
526bp (base pairs) (Lampiran 4). Peneliti sebelumnya juga telah melakukan hal
yang sama dan mendapatkan panjang fragmen sebesar 582bp pada spesies ikan
kerapu Epinephelus septemfasciatus (Guan et al. 2014), Epinephelus longispinis
sebesar 516bp Epinephelus ongus sebesar 522bp dan Epinephelus areolatus
sebesar 318bp (Sachithanandam et al. 2012). Perbedaan panjang sekuen akan
ditentukan oleh perbedaan kualitas DNA pada setiap sampel yang dikoleksi,
namun tidak menunjukan adanya pengaruh terhadap hasil analisis sekuens pada
tiap sampel. Penelitian DNA barcoding menggunakan sampel ikan yang
didapatkan dari beberapa supermarket juga memperlihatkan hasil sekuen yang
cukup baik (300-600bp) selama proses koleksi dan penyimpanan dilakukan
dengan baik (Filonzi et al. 2010). Bahkan, sampel yang didapatkan dari museum
yang telah tersimpan lama masih bisa dianalisis dengan panjang sekuen
IKAN KERAPU GENUS EPINEPHELUS
DARI BEBERAPA PERAIRAN INDONESIA
EDWIN JEFRI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Keragaman Genetik dan
Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus Epinephelus dari beberapa Perairan
Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dan karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor
Bogor, September 2015
Edwin Jefri
NRP C551120011
RINGKASAN
EDWIN JEFRI. Keragaman Genetik dan Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu
Genus Epinephelus dari beberapa Perairan Indonesia. Dibimbing oleh NEVIATY
PUTRI ZAMANI dan HAWIS MADDUPPA.
Ikan kerapu dari genus Epinephelus merupakan jenis ikan demersal yang
sebagian hidupnya di daerah terumbu karang pada perairan tropis dan subtropis.
Namun beberapa jenis pada fase juvenil dan larva ditemukan di daerah hutan
mangrove dan padang lamun. Jumlah jenis ikan kerapu banyak ditemukan di
perairan Indonesia, tercatat ada sekitar 110 spesies yang hidup di perairan IndoPasifik. Para nelayan telah melakukan penangkapan ikan kerapu meliputi hampir
semua perairan karang yang ada di Indonesia. Hal ini disebabkan karena
keuntungan yang diperoleh dalam perdagangan kerapu hidup sangat besar.
Eksploitasi yang tinggi dan kurangnya upaya konservasi dapat menyebabkan
berkurangnya stok ikan kerapu pada beberapa perairan di Indonesia. Upaya
konservasi yang dapat dilakukan adalah dengan menjaga sumberdaya genetik,
jenis dan ekosistem ikan tersebut. Sumber daya genetik merupakan tahapan dasar
dalam upaya melindungi sumber daya ikan kerapu, melalui teknik DNA barcoding
dan studi filogeni. Metode ini akan memudahkan dalam identifikasi bahkan
hingga pada tingkatan spesies jika dibandingkan dengan hanya menggunakan
metode identifikasi berdasarkan karakter morfologi.
Penelitian ini menggunakan sampel ikan kerapu genus Epinephelus
sebanyak 39 individu yang diambil dari perairan Lombok 12 individu,
Karimunjawa 11 individu, Lampung 4 individu, Kendari, Madura, Numfor dan
Tanakeke masing-masing 3 individu. Sampel dipreservasi kemudian dilanjutkan
dengan proses ekstraksi, amplifikasi PCR (Polymerase Chain Reaction) dan
elektroforesis di Laboratorium Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan,
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, IPB. Tahapan sekuensing selanjutnya
dikirim ke Berkeley Sequencing Facility, USA dengan metode Sanger, didapatkan
panjang sekuen semua sampel sebesar 526bp.
Analisis data menggunakan program MEGA 6.0.5 dengan metode
filogenetik Neighbor Joining (NJ) dan Maksimum Likelihood (ML), model evolusi
Kimura 2-parameter dan replikasi bootstraps 1000x. Dari pohon filogeni terbentuk
sebanyak tujuh clade. yaitu Epinephelus areolatus, Epinephelus merra,
Epinephelus fasciatus, Epinephelus longispinis, Epinephelus coioides,
Epinephelus ongus dan Epinephelus coeruleopunctatus. Selain itu, jarak genetik
terdekat didapatkan adalah Epinephelus ongus dan Epinephelus coeruleopncstatus
dengan jarak genetik 0.091 (9%) dan jarak genetik terjauh antara Epinephelus
ongus dan Epinephelus merra dengan jarak genetik 0.178 (18%).
Kata kunci: Keragaman Genetik, Filogeni, Epinephelus. Perairan Indonesia.
SUMMARY
EDWIN JEFRI. Genetic Diversity and Phylogeny Reconstruction of Grouper
Genus Epinephelus in several Indonesia seas. Under supervision of NEVIATY
PUTRI ZAMANI and HAWIS MADDUPPA.
Groupers genus Epinephelus is a demersal fish are most of his life in the
coral reef of tropical and subtropical coastal waters, However, some types of
juvenile and larvae phase are founded in the mangrove forests and seagrass beds.
The number of groupers are commonly found in the Indonesian seas, stated that
there were approximately 110 species groupers that life in the Indo-Pacific oceans.
The fishermen caught the groupers in almost all coral reef seas in Indonesia. This
is because the trade of live grouper is highly profitable. High exploitation and lack
of conservation efforts will decrease the groupers availability in several seas in
Indonesia. Conservation efforts by maintaining genetic resources, species and
ecosystems such fish. Genetic resources are the basic stages in an effort to protect
the resources of grouper, through the technique of DNA barcoding and phylogeny
studies. This method can accurately identify a wide variety of animals to the
species level compared to just using the identification method based on
morphological characters.
This Study used a total of 39 tissue samples of groupers genus Epinephelus
were collected from seven sites in Indonesia including Lombok (n=12 samples),
Karimunjawa (n=11), Lampung (n=4), Kendari (n=3), Madura (n=3), Tanakeke
(n=3), and Numfor (n=3). Samples preserved proceed with the extraction,
amplification PCR (Polymerase Chain Reaction) and electrophoresis in Marine
Biodiversity and Biosistematika Laboratory, Department of Marine Science and
Technology, IPB. Sequencing stages sent to Berkeley Sequencing Facility, USA
with the Sanger method, the results are long sequences of all the samples obtained
by 526bp.
Analysis of data using the program MEGA 6.0.5 with phylogenetic methods
Neighbor Joining (NJ) and Maximum Likelihood (ML), the model of evolution
Kimura 2-parameter and replication bootstraps 1000x. Phylogeny tree formed
seven clade; Epinephelus areolatus, Epinephelus merra, Epinephelus fasciatus,
Epinephelus longispinis, Epinephelus coioides, Epinephelus ongus and
Epinephelus coeruleopunctatus. In addition, Epinephelus ongus is genetically
closest to Epinephelus caeruleopncstatus with genetic distance 0.091 (9%),
whereas the farthest genetic distance was successfully identified between
Epinephelus ongus and Epinephelus merra with genetic distance 0.178 (18%).
Keywords: Genetic Diversity, Phylogeny, Epinephelus, Indonesian Seas
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KERAGAMAN GENETIK DAN REKONSTRUKSI FILOGENI
IKAN KERAPU GENUS EPINEPHELUS
DARI BEBERAPA PERAIRAN INDONESIA
EDWIN JEFRI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Kelautan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
Judul Tesis : Keragaman Genetik dan Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus
Epinephelus dari beberapa Perairan Indonesia.
Nama
: Edwin Jefri
NIM
: C551120011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Neviaty P. Zamani, M.Sc
Ketua
Dr. Hawis Madduppa, S.Pi M.Si.
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Kelautan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Neviaty P. Zamani, M.Sc
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr
Tanggal Ujian: 10 Juli 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahi Robbil Alamin, segala puji bagi Allah SWT atas limpahan
Rahmat dan Karunia-Nya sehingga tesis yang berjudul “Keragaman Genetik dan
Rekonstruksi Filogeni Ikan Kerapu Genus Epinephelus dari beberapa Perairan
Indonesia” ini dapat penulis selesaikan. Tesis ini merupakan salah satu syarat
untuk memporoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Kelautan,
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor (IKL-SPs IPB).
Penulis juga mengucapkan terimaksih dan penghargaan yang sebesarbesarnya kepada semua pihak yang turut berperan dalam memberi arahan
dukungan dan motivasi, mulai dari saat studi hingga penelitian dan penyusunan
thesis ini, terutama kepada:
Dr. Ir. Neviaty Putri Zamani, M.Sc dan Dr. Hawis Madduppa, S.Pi, M.Si
atas bimbingannya mulai dari penelitian hingga penyusunan tesis ini.
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) Kementrian Pendidikan
dan Kebudayaan, atas Beasiswa Unggulan (BU) yang diberikan selama
studi.
Keluarga Besar atas dukungan dan doanya selama ini, Ayahanda Husni
Ibunda Hanipa, kakanda Erwin Haniyadi, A.Md dan adinda Deni
Zulkarnaen, S.Kep, Ns dan Widia Nurmayani dan semua keluarga yang
tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Rekan-rekan Ilmu Kelautan 2012: Krisye, Hendra, Aradea Bujana
Kusuma, Bertoka Fajar, Nebuchadnezzar Akbar, I Wayan Eka
Dharmawan, Asep Sandra Budiman, Mohamad Gazali, Any Kurniawati,
Nurafni, Sri Yenica Roza.
Rekan-rekan Laboratorium Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan,
Departemen Ilmu dan Teknologi Kelautan, IPB.
Rekan-rekan di Asrama Mahasiswa NTB Bogor.
Rekan-rekan di Bogor Science Club (BSC-IPB) dan Himpunan Mahasiswa
Muslim Pascasarjana (Himmpas-IPB) atas semua dukungan dan
kerjasamanya selama studi dan mengemban amanah di Bogor.
Serta semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu.
Penulis memiliki harapan besar, penelitian ini bermanfaat dalam
perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang Ilmu kelautan dan
biologi molekuler khususnya untuk ikan kerapu genus Epinephelus.
Bogor, September 2015
Edwin Jefri
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Hipotesis
Manfaat Penelitian
1
1
2
3
3
3
2 METODE
Lokasi dan Waktu
Prosedur
Pengambilan Sampel Ikan Kerapu
Analisis Karakter Molekuler
Elektroforesis
Sekuensing DNA
Analisis Data
3
3
4
4
5
5
5
6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Molekuler
Jarak Genetik
Pohon Filogeni
6
6
8
10
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
14
14
14
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
19
RIWAYAT HIDUP
40
DAFTAR TABEL
1 Spesies yang ditemukan dari hasil BLAST di National Center for
Biotechnology Information (NCBI)
2 Jarak genetik antar spesies dari semua sampel yang digunakan
3 Karakter morfologi utama dalam identifikasi ikan kerapu Epinephelus
berdasarkan Heemstra and Randall (1993)
4 Data sekuen ikan kerapu yang diunduh dari National Center for
Biotechnology Information (NCBI)
7
8
8
11
DAFTAR GAMBAR
1 Peta Lokasi Pengambilan Sampel (Sumber; Surfer 12)
2 Kerangka Alur Penelitian
3 Hasil amplifikasi daerah COI menggunakan primer Fish R1 dan Fish F1
setelah dimigrasikan dalam gel agarosa 1,5 % pada tegangan 100 volt
selama 25 menit
4 Hasil penjajaran menggunakan Clustal W pada software MEGA 6.0.5
5 Spesies ikan kerapu Epinephelus yang memiliki jarak genetik terdekat
dan jarak genetik terjauh (Foto; Heemstra dan Randall (1993))
6 Pohon filogeni metode Neighbor Joining, dari 39 sekuen mtDNA CO1
Ikan Kerapu Epinephelus Indonesia dan 31 sekuen dari GeneBank
dengan Cephalopholis cyanostigma sebagai out-group
7 Pohon filogeni metode Maximum Likelihood, dari 39 sekuen mtDNA
CO1 Ikan Kerapu Epinephelus Indonesia dan 31 sekuen dari GeneBank
dengan Cephalopholis cyanostigma sebagai out-group
3
4
5
6
9
12
13
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sampel penelitian ikan kerapu genus Epinephelus dan ikan outgroup
pada pohon filogeni (Cephalopholis cyanostigma)
2 Protokol ekstraksi DNA total ikan kerapu Epinephelus menggunakan
Qiagen kit (DNeasy® Blood & Tissue Kit)
3 Komposisi Master Mix (ABI mix) pada proses PCR (Gold)
4 Hasil pengurutan basa nukleotida (sequencing) pada ikan kerapu
Epinephelus
5 Basa nukleotida ikan kerapu Epinephelus yang diunduh dari National
Center for Biotechnology Information (NCBI)
19
20
22
22
31
1
1 PENDAHULUAN
Ikan kerapu dari genus Epinephelus merupakan jenis ikan demersal yang
sebagian hidupnya di daerah terumbu karang pada perairan tropis dan subtropis,
namun beberapa jenis pada fase juvenile dan larva ditemukan di daerah hutan
mangrove dan padang lamun, dapat tumbuh dengan ukuran sampai 2,5 m dan
berat mencapai 400 kg. Jumlah jenisnya ada sekitar 110 spesies yang hidup di
perairan Indo-Pasifik (Heemstra dan Randall 1993). Sedangkan data dari WWF
Indonesia (2011) mengatakan ada 39 spesies ikan kerapu dapat ditemukan di
perairan Indonesia dan ada 46 spesies di Asia Tenggara. Merupakan salah satu
komoditas hasil perikanan yang paling penting di Asia dan di seluruh dunia
dengan permintaan pasar yang tinggi (Chiue et al. 2008). Sejak tahun 1980
Indonesia dikenal sebagai pemasok terbesar ketiga ikan kerapu dengan tujuan
ekspor ke beberapa negara yaitu Singapura, Hong Kong dan Cina. Para nelayan
melakukan penangkapan ikan kerapu meliputi hampir semua perairan karang yang
ada di Indonesia. Hal ini disebabkan karena keuntungan yang diperoleh dalam
perdagangan kerapu hidup sangat tinggi, sehingga tidak salah jika ikan ini banyak
diburu dan bernilai ekonomis penting (Nuraini dan Hartati 2006).
Tingkat eksploitasi yang tinggi dalam penangkapan yang dilakukan oleh
nelayan terutama di daerah pemijahan (spawning) (DKP 2008), serta kerusakan
terumbu karang sebagai habitat semakin meluas (Burke et al, 2002), tentu akan
menyebabkan stok ikan kerapu di Indonesia semakin kurang dan mungkin akan
hilang di beberapa perairan di Indonesia. Upaya pengelolaan dan pemanfaatan
dapat dilakukan untuk menjaga sumberdaya genetik, jenis dan ekosistem ikan
tersebut. Mendata sumber daya genetik merupakan tahapan dasar dalam upaya
melindungi sumber daya ikan kerapu, Oleh karena itu, perlu dilakukan upaya
pendataan yang dilakukan dengan menggunakan analisis molekuler.
Pada dasawarsa terakhir identifikasi ikan menggunakan pendekatan analisis
molekuler sudah banyak dilakukan dan mulai berkembang pesat pada tahun 1990
yang disebabkan karena berkembangnya metode untuk membuat pohon filogeni
dan informasi DNA sekuen yang diproleh dari PCR (Polymerase Chain
Reaction). (Ubaidillah 2009). Salah satu pendekatan molekuler yang dapat
digunakan adalah teknik DNA barcoding ditujukan untuk membedakan spesies
dan mengidentifikasi spesimen yang sulit dikenali, seperti fase larva, potongan
organ maupun material yang tidak lengkap secara morfologi, dengan
menggunakan sekuens gen yang cukup pendek (Hebert et al. 2003). DNA
barcoding dapat menjadi salah satu cara dan alternatif dalam mengidentifikasi
ikan kerapu Epinephelus, metode ini akan memudahkan dalam identifikasi bahkan
hingga pada tingkatan spesies jika dibandingkan dengan hanya menggunakan
metode identifikasi berdasarkan karakter morfologi.
Pada teknik DNA barcoding terdapat gen dalam genom mitokondria
(mtDNA) yang sekuennya biasa digunakan sebagai barcode yaitu gen Sitokrom
Oksidase Subunit 1 yang dikenal sebagai COI. Perkembangan literatur tentang
barcode DNA menunjukkan bahwa sebuah fragmen pendek COI dapat digunakan
sebagai penanda variasi yang secara akurat dapat mengidentifikasi berbagai
macam hewan sampai tingkat spesies (Waugh 2007). Sedangkan filogenetik
merupakan suatu metode yang digunakan untuk melihat dan memodelkan
2
kedekatan suatu spesies dengan spesies lainnya. Analisis filogenetik ini digunakan
untuk mengkontruksi dengan tepat hubungan antara organisme dan mengestimasi
perbedaan yang terjadi dari satu nenek moyang kepada keturunannya (Li et al.
1999).
Beberapa penelitian yang telah mendeskripsikan ikan kerapu menggunakan
molekular taksonomi dan filogeni; Ilves dan Taylor (2008), melakukan penelitian
pada Osmeridae, Ku et al. (2009) pada Epinephelus quoyanus, Merritt et al.
(1998) pada beberapa spesies Epinephelus dan Mycteroperca, Sachithanandam et
al. (2012) DNA barcoding dan studi filogeni pada Epinephelus spp. Craig dan
Hastings (2007), melihat kekerabatan spesies ikan kerapu subfamily
Epinephelinae dari beberapa lokasi di perairan Indo-Pasifik, hasilnya
menunjukkan bahwa monophyly dari Epinephelinae selama ini perlu direvisi
menggunakan bantuan analisis molekuler terutama untuk beberapa genus baru.
Selain itu Maggio et al. (2004) juga melakukan sebuah penelitian untuk
mengetahui kekerabatan filogeni ikan kerapu dari genus Epinephelus dan
Mycteroperca di perairan Atlantik Timur menggunakan analisis sekuen
Mitochondrial Cytochrome b (397bp) and 16S rDNA (516bp), estimasi molecular
clock menunjukkan waktu perbedaan dari beberapa spesies yang dianalisis
sebanyak 20-24 mya, yang bertepatan dengan periode Miosen. Bahkan beberapa
Negara seperti Mesir dan Afrika Selatan juga telah melakukan DNA barcoding
serta analisis filogeni untuk peredaran ikan dibeberapa supermarket, hal ini
dilakukan untuk menjaga dari kekhawatiran karena tingginya insiden substitusi
spesies dan regulasi peredaran ikan termasuk kerapu di tingkat International
(Galal-Khallaf et al. 2014) dan (Cawthorn 2012).
Perairan Indonesia dikenal kaya akan sumberdaya hayati laut yang beraneka
ragam, sebarannya di perairan sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor termasuk
adanya arus lintas Indonesia yang sangat dinamis sepanjang tahun. Menjadi sangat
penting untuk mengetahui keragaman genetik dan rekonstruksi filogeni dari ikan
kerapu Epinephelus dari beberapa perairan Indonesia dalam menambah khasanah
ilmu pengetahuan dan database genetik serta filogeni. Hasil penelitian juga akan
menjadi data penunjang penting dalam upaya konservasi sumber daya ikan
terutama konservasi genetik ikan, Hal ini sesuai dengan yang termaktub dalam
Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor 60 tahun 2007 tentang
Konservasi Sumber Daya Ikan.
Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian diatas maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai
berikut:
1. Bagaimana keragaman genetik dan filogeni dari ikan kerapu Epinephelus
yang ditemukan di beberapa perairan Indonesia.
2. Bagaimana implikasi analisis genetika molekuler dan filogeni sebagai data
awal dalam usaha konservasi sumberdaya ikan kerapu Epinephelus di
Indonesia.
3
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk menganalisis keragaman genetik dan
filogeni ikan kerapu Epinephelus berdasarkan sekuen DNA Mitokondria Control
Region Sitokrom Oksidase Subunit I (CO1) serta untuk menganalisis hubungan
kekerabatan spesies yang termasuk dalam anggota genus Epinephelus.
Hipotesis
Adapun hipotesis pada penelitian ini adalah:
1. Mitokondria Control Region Sitokrom Oksidase Subunit I (CO1) mampu
menganalisis keragaman genetik dan filogeni ikan kerapu Epinephelus.
2. Adanya hubungan kekerabatan spesies yang erat dari ikan kerapu anggota
genus Epinephelus dari beberapa perairan di Indonesia.
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah untuk menyediakan data keragaman genetik
dan filogeni yang akan membantu menjelaskan sejauh mana kekerabatan ikan
kerapu Epinephelus di beberapa perairan Indonesia.
2 METODE
Waktu dan Lokasi
Penelitian ini dilaksanakan bulan Januari - Mei 2014. Pengambilan sampel
ikan kerapu Epinephelus dilakukan di beberapa perairan di Indonesia; Lampung
bulan Februari (4 individu), Karimunjawa bulan Mei (11 individu), Madura bulan
April (3 individu), Lombok bulan Januari (12 individu), Tanakeke bulan Februari
(3 individu), Kendari bulan Januari (3 individu) dan Numfor bulan Mei (3
individu) (Gambar 1). Sedangkan analisis molekuler dikerjakan di Laboratorium
Biodiversitas dan Biosistematika Kelautan, Departemen Ilmu dan Teknologi
Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Gambar 1 Peta Lokasi Pengambilan Sampel (Sumber; Surfer 12)
Keterangan; 1. Lampung, 2. Karimunjawa, 3. Madura, 4. Lombok, 5.
Tanakeke 6. Kendari 7. Numfor
5
Analisis Karakter Molekuler
Sebelum dilakukan ekstraksi, sampel jaringan dicuci menggunakan aquades
untuk menghilangkan pengaruh EtOH. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan
dua metode yaitu larutan Chelex 10% (Walsh et al. 1991) pada suhu 95˚C dan
ekstraction kit (Qiagen Kit) pada inkubasi suhu 56º C hingga jaringan lisis
(Lampiran 2).
Segmen target gen CO1, proses amplifikasi PCR (Polymerase Chain
Reaction) menggunakan primer: Fish R1-5’TAGACTTCTGGGTGGCC
AAAGAATCA3’ dan Fish F1-5TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3’
(Sachithanandam et al. 2012).
Kit PCR menggunakan AB1 master mix (Lampiran 3). Pada suhu Predenaturasi 94o C selama 5 menit, Denaturasi 94o C selama 30 detik, Anneling 56o
C selama 60 detik, Extention 72o C selama 60 detik dan Final Extention 72o C
selama 7 menit dengan 40x siklus (Sachithanandam et al. 2012).
Elektroforesis
Visualisasi produk PCR ini dilakukan melalui elektroforesis. Tahap awal
eletroforesisi adalah pembuatan gel agarosa 1,5% dengan pewarna Etidium
Bromide (4µl) sebagai media elektroforesis. Produk Hasil PCR diambil sebanyak
4µl dan dicampurkan dengan Loading Dye (1µl), kemudian disisipkan di sumuran
agarosa. Elektroforesis pada tegangan 100 volt selama 25 menit. Pita hasil
elektroforesis dapat dilihat dengan menggunakan sinar UV transluminator. Hasil
visualisasi produk PCR yang bagus akan memperlihatkan satu pita yang jelas
dengan ukuran produk sepanjang 500–700bp (base pairs), dengan demikian
produk PCR yang dihasilkan siap untuk disekuensing (Zein dan Dewi 2013).
Target COI
Epinephelus
1500bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
Penanda
(DNA Marker)
Gambar 3 Hasil amplifikasi daerah COI menggunakan primer Fish R1 dan Fish
F1 setelah dimigrasikan dalam gel agarosa 1,5 % pada tegangan 100
volt selama 25 menit
Sekuensing DNA
Sekuensing atau pengurutan DNA merupakan suatu teknik untuk
menentukan urutan basa nukleotida pada molekul DNA, hal ini bertujuan untuk
menentukan identitas gen dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan
sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Hasil PCR dikirim ke Berkeley
Sequencing Facility, USA dengan metode Sanger (Sanger et al. 1977).
6
Analisis Data
Data yang didapatkan setelah sekuensing DNA kemudian diurutkan
menggunakan program MEGA 6.0.5 (Moleculer Evolutionary Genetic Analysis).
Data tersebut diedit supaya sejajar menggunakan Clustal W pada program tersebut
untuk melihat keragaman basa nukleotidanya (Tamura et al. 2013) (Gambar 4).
Analisis sekuen DNA yang terbaik kemudian dibandingkan dengan sekuen DNA
pada basis data (database) DNA. Penelusuran dilakukan dengan menggunakan
internet melalui program pelacakan database Basic Local 38 Alignment Search
Tool (BLAST) pada National Center for Biotechnology Information, National
Institute for Health, USA (NCBI). Hal ini bertujuan untuk menentukan jenis
spesies dengan cara membandingkan database sekuen DNA pada GenBank dan
juga melihat similaritasnya dengan sequen ikan kerapu yang telah ada pada
database tersebut.
Gambar 4 Hasil penjajaran menggunakan Clustal W pada software MEGA 6.0.5
(Tamura et al. 2013)
Sekuen DNA yang didapatkan dianalisis menggunakan program MEGA
6.0.5 (Tamura et al. 2013) dengan analisis filogenetik metode Neighbor Joining
(NJ) dan Maksimum Likelihood (ML), model evolusi Kimura 2-parameter dan
replikasi bootstraps sebanyak 1000x. Analisis bootstrap 1000x dilakukan untuk
menguji kestabilan posisi filogeni dari clade tertentu pada pohon filogeni yang
dihasilkan.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Molekuler
Penggunaan teknik DNA barcoding pada genom mitokondria COI telah
banyak digunakan ke beberapa biota laut oleh para peneliti dan hasilnya terbukti
berhasil. Hal yang sama juga terlihat dari analisis ikan kerapu Epinephelus pada
penelitian ini. Proses ekstraksi dan sekuensing dilakukan terhadap 39 sampel
Epinephelus kemudian dilakukan BLAST di National Center for Biotechnology
7
Information, National Institute for Health, USA (NCBI), didapatkan hasil
sebanyak tujuh spesies, antara lain; Epinephelus areolatus, Epinephelus merra,
Epinephelus ongus, Epinephelus fasciatus, Epinephelus coioides, Epinephelus
coeruleopunctatus dan Epinephelus longispinis (Lampiran 1), setiap spesies
memperlihatkan nilai kemiripan sebesar 99% - 100% (Tabel 1).
Tabel 1 Spesies yang ditemukan dari hasil BLAST di National Center for
Biotechnology Information (NCBI)
No.
1
2
3
4
5
6
7
Spesies
Lokasi
Karimunjawa, Madura,
Kendari, Lombok, Lampung
Karimunjawa, Tanakeke,
E. merra
Kendari, Lombok, Numfor
Karimunjawa, Tanakeke,
E. ongus
Lombok
E. fasciatus
Lombok, Lampung
E. coioides
Karimunjawa
E. coeruleopunctatus
Numfor
E. longispinis
Lampung
Total
Epinephelus areolatus
Total
Persentase BLAST
(%)
(%)
Status
IUCN
15
38. 46
100
LN
13
33.33
99
LN
3
7.69
100
LN
4
2
1
1
39
10.25
5.12
2.56
2.56
100
99
100
99
100
99-100
LN
LN
LN
LN
LN
Ket: LN (Least Concern/beresiko rendah).
Panjang fragmen hasil amplifikasi PCR yang didapatkan dengan
menggunakan COI dan primer Fish R1 dan Fish F1 dari total 39 sampel sebesar
526bp (base pairs) (Lampiran 4). Peneliti sebelumnya juga telah melakukan hal
yang sama dan mendapatkan panjang fragmen sebesar 582bp pada spesies ikan
kerapu Epinephelus septemfasciatus (Guan et al. 2014), Epinephelus longispinis
sebesar 516bp Epinephelus ongus sebesar 522bp dan Epinephelus areolatus
sebesar 318bp (Sachithanandam et al. 2012). Perbedaan panjang sekuen akan
ditentukan oleh perbedaan kualitas DNA pada setiap sampel yang dikoleksi,
namun tidak menunjukan adanya pengaruh terhadap hasil analisis sekuens pada
tiap sampel. Penelitian DNA barcoding menggunakan sampel ikan yang
didapatkan dari beberapa supermarket juga memperlihatkan hasil sekuen yang
cukup baik (300-600bp) selama proses koleksi dan penyimpanan dilakukan
dengan baik (Filonzi et al. 2010). Bahkan, sampel yang didapatkan dari museum
yang telah tersimpan lama masih bisa dianalisis dengan panjang sekuen