Preservasi ovarium, isolasi dan kultur folikel in vitro pada domba
PRESERVASI OVARIUM, ISOLASI DAN KULTUR
FOLIKEL IN VITRO PADA DOMBA
BAYU ROSADI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ‘Preservasi Ovarium, Isolasi
dan Kultur Folikel In Vitro pada Domba” adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juni 2010
Bayu Rosadi
NIM B061040041
ABSTRACT
BAYU ROSADI. Ovary Preservation, Isolation and Follicles In Vitro Culture in
Ovine. Under Direction of ARIEF BOEDIONO, M AGUS SETIADI, AND
DONDIN SAJUTHI.
Ovine ovary contains about 36.000 of preantral follicles of which only
0.01% ovulates in the reproductive life. In the last decades, many studies have
been carried out focusing on preservation, isolation and culture of preantral
follicles from several species ovaries. In this study the effect of cooling and
freezing of ovine ovarian tissue were examined on follicles morphology, number
and quality of the follicles. The follicles were isolated by different methods. The
developmental competence of follicles cultured in vitro were evaluated postpreservation.
The study was carried out in 2 experiments. Experiment I, ovaries were
maintained in PBS at -20 oC and room temperature (RT) for 24 h, and at 5 oC for
24 h and 72 h, and vitrification by 10, 20, 30 min equilibration time. After
preservation and warming, the tissues were prepared for histological examination.
Experiment 2, follicles isolated from fresh ovaries both mechanically and
enzymatically. Then, preantral follicles were isolated from a) fresh ovaries
(control), ovaries were stored at 5 oC for: b) 24 h , c) 48 h, d) 72 h, and
vitrified cortex tissue (after 6 d in vitro culture). Preantral follicles (220-240 µm)
were cultured in αMEM supplemented with 5% FCS, 100 mIU/ml r-FSH and ITS
(consist of 5µg/ml insulin, 5 µg/ml transferin, 5 ng/ml selenium) up to ovulation
stage.
No follicle survived after 24 h storage at RT. The percentage of
morphologically normal follicles was significantly reduced in ovarian tissue
stored at -20 oC for 24 h and at 5 oC for 24 h and 72 h,5 oC for 24 h gave the better
results. The antral follicles were damaged in all treatment. Exposing tissue to
equilibration medium for 10 min had higher morphologically normal of cooledwarmed follicles, but had fewer morphologically normal follicles than fresh
ovary. Experiment 2 shown that enzymatic method yielded more follicles than
mechanic method, but fewer intact follicles. Follicle development up to ovulation
of 5 oC storage for 24 h was equal to fresh follicles. Ovarium preserved at 5 oC
for 48 h resulted in a less number of follicles that reach ovulation stage than
others.Vitrification slighty reduced developmental competence in vitro.
We conclude that storage of ovine ovaries for up to 24 h at -20 oC, RT, and
o
5 C declined the number of morphologically normal follicles, 5 oC storage gave
the better results. Primordial follicles preserved their morphology intactness better
than growing follicles. Good morphology of follicles was confirmed when
exposing tissue to equilibration medium for 10 min before freezing. Ovary could
be storage at 5 oC up to 48 h to maintain follicles viability. Vitrification slighty
reduced follicle developmental competence in vitro.
Key words: follicles isolation, preservation, in vitro culture, ovine
RINGKASAN
BAYU ROSADI. Preservasi Ovarium, Isolasi dan Kultur Folikel In Vitro Pada
Domba. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO, M AGUS SETIADI, and
DONDIN SAJUTHI.
Folikel merupakan unit struktural dan fungsional dasar dari ovarium
mamalia yang menyediakan lingkungan mikro yang diperlukan untuk
pertumbuhan dan maturasi oosit. Ovarium domba mengandung sekitar 36.ooo
folikel preantral, diantaranya hanya 0,01% yang ovulasi sepanjang masa
produktifnya. Dalam dekade terakhir, banyak penelitian telah dilakukan dengan
fokus preservasi, isolasi, dan kultur folikel dari berbagai spesies. Pada penelitian
ini, dipelajari pengaruh pendinginan dan pembekuan jaringan ovarium terhadap
morfologi, jumlah dan kualitas folikel domba yang diisolasi dengan metode
berbeda serta kompetensi perkembangan folikel in vitro pasca preservasi.
Penelitian ini dilaksanakan dalam 2 tahap. Pada tahap 1 dilakukan 2
eksperimen preservasi ovarium. Eksperimen 1, ovarium disimpan dalam larutan
PBS pada suhu -20 oC dan suhu kamar selama 24 jam, dan suhu 5 oC selama 24
jam dan 72 jam. Setelah penyimpanan, folikel-folikel dievaluasi secara histologis.
Dalam Eksperiment 2, cortex ovarium dipisahkan dari ovarium dan dibentuk
dalam potongan berukuran ±1 mm3. Potongan jaringan diletakkan di atas
hemistraw dan ditransfer ke larutan ekuilibrasi masing-masing selama 10, 20, dan
30 menit pada suhu kamar, selanjutnya dipindahkan ke larutan vitrifikasi selama 3
menit. Hemistraw beserta jaringan dicelupkan dalam nitrogen cair. Setelah
penghangatan, jaringan dievaluasi secara histologis.
Pada tahap kedua dilakukan isolasi dan kultur in vitro folikel. Eksperimen
3, potongan cortex ovarium berukuran ± 1 mm3 diinkubasi dalam collagenase 1
mg/ml (C1) dan collagenase 2 mg/ml (C2) masing-masing selama 15, 30, 45, dan
60 menit. Folikel-folikel dari cacahan jaringan cortex juga diisolasi secara
mekanik (M) menggunakan jarum 26G. Hasil isolasi dari ketiga perlakuan diamati
dibawah mikroskop menggunakan pembesaran obyektif 40 kali. Eksperimen 4,
folikel-folikel preantral diisolasi pada ovarium segar (kontrol), ovarium yang
disimpan pada suhu 5 oC selama 24 jam (T5-24), 48 jam (T5-48), dan 72 jam (T572) dan jaringan cortex hasil vitrifikasi (V). Folikel-folikel berukuran 220-240 µm
dikultur dalam medium αMEM disuplementasi 5% FCS, 100 mIU/ml r-FSH dan
ITS (terdiri dari 5µg/ml insulin, 5 µg/ml transferin, 5 ng/ml selenium) sampai
ovulasi.
Seluruh folikel mengalami kerusakan morfologi setelah penyimpanan
ovarium pada suhu kamar selama 24 jam. Persentase folikel dengan morfologi
normal menurun secara nyata pada jaringan ovarium yang disimpan pada suhu
-20 oC selama 24 jam, pada suhu 5 oC selama 24 jam dan 72 jam, penyimpanan
pada suhu 5oC selama 24 jam memberikan hasil lebih baik (P
FOLIKEL IN VITRO PADA DOMBA
BAYU ROSADI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi ‘Preservasi Ovarium, Isolasi
dan Kultur Folikel In Vitro pada Domba” adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Juni 2010
Bayu Rosadi
NIM B061040041
ABSTRACT
BAYU ROSADI. Ovary Preservation, Isolation and Follicles In Vitro Culture in
Ovine. Under Direction of ARIEF BOEDIONO, M AGUS SETIADI, AND
DONDIN SAJUTHI.
Ovine ovary contains about 36.000 of preantral follicles of which only
0.01% ovulates in the reproductive life. In the last decades, many studies have
been carried out focusing on preservation, isolation and culture of preantral
follicles from several species ovaries. In this study the effect of cooling and
freezing of ovine ovarian tissue were examined on follicles morphology, number
and quality of the follicles. The follicles were isolated by different methods. The
developmental competence of follicles cultured in vitro were evaluated postpreservation.
The study was carried out in 2 experiments. Experiment I, ovaries were
maintained in PBS at -20 oC and room temperature (RT) for 24 h, and at 5 oC for
24 h and 72 h, and vitrification by 10, 20, 30 min equilibration time. After
preservation and warming, the tissues were prepared for histological examination.
Experiment 2, follicles isolated from fresh ovaries both mechanically and
enzymatically. Then, preantral follicles were isolated from a) fresh ovaries
(control), ovaries were stored at 5 oC for: b) 24 h , c) 48 h, d) 72 h, and
vitrified cortex tissue (after 6 d in vitro culture). Preantral follicles (220-240 µm)
were cultured in αMEM supplemented with 5% FCS, 100 mIU/ml r-FSH and ITS
(consist of 5µg/ml insulin, 5 µg/ml transferin, 5 ng/ml selenium) up to ovulation
stage.
No follicle survived after 24 h storage at RT. The percentage of
morphologically normal follicles was significantly reduced in ovarian tissue
stored at -20 oC for 24 h and at 5 oC for 24 h and 72 h,5 oC for 24 h gave the better
results. The antral follicles were damaged in all treatment. Exposing tissue to
equilibration medium for 10 min had higher morphologically normal of cooledwarmed follicles, but had fewer morphologically normal follicles than fresh
ovary. Experiment 2 shown that enzymatic method yielded more follicles than
mechanic method, but fewer intact follicles. Follicle development up to ovulation
of 5 oC storage for 24 h was equal to fresh follicles. Ovarium preserved at 5 oC
for 48 h resulted in a less number of follicles that reach ovulation stage than
others.Vitrification slighty reduced developmental competence in vitro.
We conclude that storage of ovine ovaries for up to 24 h at -20 oC, RT, and
o
5 C declined the number of morphologically normal follicles, 5 oC storage gave
the better results. Primordial follicles preserved their morphology intactness better
than growing follicles. Good morphology of follicles was confirmed when
exposing tissue to equilibration medium for 10 min before freezing. Ovary could
be storage at 5 oC up to 48 h to maintain follicles viability. Vitrification slighty
reduced follicle developmental competence in vitro.
Key words: follicles isolation, preservation, in vitro culture, ovine
RINGKASAN
BAYU ROSADI. Preservasi Ovarium, Isolasi dan Kultur Folikel In Vitro Pada
Domba. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO, M AGUS SETIADI, and
DONDIN SAJUTHI.
Folikel merupakan unit struktural dan fungsional dasar dari ovarium
mamalia yang menyediakan lingkungan mikro yang diperlukan untuk
pertumbuhan dan maturasi oosit. Ovarium domba mengandung sekitar 36.ooo
folikel preantral, diantaranya hanya 0,01% yang ovulasi sepanjang masa
produktifnya. Dalam dekade terakhir, banyak penelitian telah dilakukan dengan
fokus preservasi, isolasi, dan kultur folikel dari berbagai spesies. Pada penelitian
ini, dipelajari pengaruh pendinginan dan pembekuan jaringan ovarium terhadap
morfologi, jumlah dan kualitas folikel domba yang diisolasi dengan metode
berbeda serta kompetensi perkembangan folikel in vitro pasca preservasi.
Penelitian ini dilaksanakan dalam 2 tahap. Pada tahap 1 dilakukan 2
eksperimen preservasi ovarium. Eksperimen 1, ovarium disimpan dalam larutan
PBS pada suhu -20 oC dan suhu kamar selama 24 jam, dan suhu 5 oC selama 24
jam dan 72 jam. Setelah penyimpanan, folikel-folikel dievaluasi secara histologis.
Dalam Eksperiment 2, cortex ovarium dipisahkan dari ovarium dan dibentuk
dalam potongan berukuran ±1 mm3. Potongan jaringan diletakkan di atas
hemistraw dan ditransfer ke larutan ekuilibrasi masing-masing selama 10, 20, dan
30 menit pada suhu kamar, selanjutnya dipindahkan ke larutan vitrifikasi selama 3
menit. Hemistraw beserta jaringan dicelupkan dalam nitrogen cair. Setelah
penghangatan, jaringan dievaluasi secara histologis.
Pada tahap kedua dilakukan isolasi dan kultur in vitro folikel. Eksperimen
3, potongan cortex ovarium berukuran ± 1 mm3 diinkubasi dalam collagenase 1
mg/ml (C1) dan collagenase 2 mg/ml (C2) masing-masing selama 15, 30, 45, dan
60 menit. Folikel-folikel dari cacahan jaringan cortex juga diisolasi secara
mekanik (M) menggunakan jarum 26G. Hasil isolasi dari ketiga perlakuan diamati
dibawah mikroskop menggunakan pembesaran obyektif 40 kali. Eksperimen 4,
folikel-folikel preantral diisolasi pada ovarium segar (kontrol), ovarium yang
disimpan pada suhu 5 oC selama 24 jam (T5-24), 48 jam (T5-48), dan 72 jam (T572) dan jaringan cortex hasil vitrifikasi (V). Folikel-folikel berukuran 220-240 µm
dikultur dalam medium αMEM disuplementasi 5% FCS, 100 mIU/ml r-FSH dan
ITS (terdiri dari 5µg/ml insulin, 5 µg/ml transferin, 5 ng/ml selenium) sampai
ovulasi.
Seluruh folikel mengalami kerusakan morfologi setelah penyimpanan
ovarium pada suhu kamar selama 24 jam. Persentase folikel dengan morfologi
normal menurun secara nyata pada jaringan ovarium yang disimpan pada suhu
-20 oC selama 24 jam, pada suhu 5 oC selama 24 jam dan 72 jam, penyimpanan
pada suhu 5oC selama 24 jam memberikan hasil lebih baik (P