Penentuan Konsentrasi Low Melting Point Agarose Dan Lysis Solution Untuk Mendeteksi Kerusakan Dna Spermatozoa Ternak Sapi, Domba, Kambing

PENENTUAN KONSENTRASI LOW MELTING POINT AGAROSE
DAN LYSIS SOLUTION UNTUK MENDETEKSI KERUSAKAN
DNA PADA SPERMATOZOA SAPI, DOMBA, KAMBING

TEGUH ARI PRABOWO

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini
berjudul Penentuan Konsentrasi Low Melting Point Agarose dan Lysis Solution
untuk Mendeteksi Kerusakan DNA Spermatozoa Sapi, Domba, Kambing
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada Prof Dr Dra R Iis Arifiantini MSi dan Prof drh Dondin Sajuthi
MST PhD selaku selaku ketua dan anggota komisi pembimbing atas bimbingan,
arahan, perhatian dan nasihatnya selama melakukan penelitian dan penulisan
karya ilmiah ini sehingga penulis dapat menyelesaikan rangkaian penelitian ini
hingga selesai. Terima kasih kepada Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf MSi selaku

penguji luar komisi, serta Prof Dr drh Mohamad Agus Setiadi selaku Ketua
Program Studi Biologi Reproduksi, Sekolah Pascasarjana IPB. Ucapan
terimakasih juga penulis sampaikan kepada KEMENRISTEK DIKTI atas
beasiswa yang telah diberikan dalam program Beasiswa Pascasarjana Dalam
Negeri (BPPDN) Calon Dosen Tahun 2013 sehingga dapat membantu penulis
selama masa studi.
Penulis menyampaikan terima kasih kepada seluruh Dosen dan Staf
Program Studi Biologi Reproduksi Sekolah Pascasarjana IPB. Penulis juga tidak
lupa mengucapkan terimakasih kepada teman-teman mahasiswa program studi
Biologi Reproduksi, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor atas bantuan
tenaga serta pikiran yang diberikan kepada penulis selama penulis melaksanakan
studi. Ungkapan terima kasih yang sedalam-dalamnya juga disampaikan kepada
ayahanda (Alm) Jamadi Amd dan ibunda Suminem Amd, kakak Nanang Wahyu
Wibowo dan istri tercinta Ufi Khasanah SP atas doa, dukungan dan kasih
sayangnya. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan informasi yang
bermanfaat dan berguna bagi semuanya.

Bogor, Agustus 2016

Teguh Ari Prabowo

Judul Tesis
Nama
NIM

: Penentuan Konsentrasi Low Melting Point Agarose dan Lysis
Solution untuk Mendeteksi Kerusakan DNA pada Spermatozoa
Sapi, Domba, Kambing
: Teguh Ari Prabowo
: B352130051
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr Dra R Iis Arifiantini, MSi
Ketua

Prof drh Dondin Sajuthi, MST PhD
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biologi Reproduksi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Mohamad Agus Setiadi

Dr Ir Dahrul Syah, MscAgr

Tanggal Ujian: 20 Juli 2016

Tanggal Lulus:

i

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Penentuan Konsentrasi Low
Melting Point Agarose dan Lysis Solution untuk Mendeteksi Kerusakan DNA

Spermatozoa Sapi, Domba, Kambing adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2016
Teguh Ari Prabowo
B352130051

ii

RINGKASAN
TEGUH ARI PRABOWO. Penentuan Konsentrasi Low Melting Point Agarose
dan Lysis Solution untuk Mendeteksi Kerusakan DNA Spermatozoa Ternak Sapi,
Domba, Kambing. Dibimbing oleh R. IIS ARIFIANTINI dan DONDIN SAJUTHI.
Deoxyribose-nucleic acid (DNA) merupakan suatu polimer heliks ganda yang
terdiri dari nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen; satu basa

nitrogen, satu gula pentosa yang disebut deoxyribosa dan satu gugus fosfat. Basa
nitrogennya bisa adenin (A), timin (T), guanin (G), atau sitosin (S). Adenin dan
guanin adalah purin, basa nitrogen dengan dua cincin organik. Sitosin dan timin
adalah anggota famili basa nitrogen yang dikenal sebagai pirimidin yang
mempunyai satu cincin tunggal.
DNA dapat mengalami kerusakan karena perubahan polimer DNA dan secara
terus menerus terpapar pada lingkungan fisik dan kimia yang sangat bervariasi yang
berpotensi mengubah struktur alamiah DNA tersebut. Perubahan ini akan
memengaruhi proses replikasi dan transkripsi DNA yang mengarah pada kerusakan
DNA. Bentuk kerusakan yang lain adalah terputusnya struktur polimer DNA.
Pemanasan yang melebihi 37ºC akan menyebabkan terputusnya ikatan glikosida
yang menghubungkan basa nitrogen dan struktur gula fosfat sehingga basa nitrogen
akan hilang.
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan kit deteksi kerusakan DNA
spermatozoa ternak yang saat ini masih impor dengan harga yang mahal. Penelitian
dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Pusat Satwa Primata (PSSP) Institut
Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR),
Departemen Klinik Reproduksi dan patologi, Fakultas Kedokteran Hewan (FKH)
IPB. Semen dikoleksi menggunakan vagina buatan sebanyak dua kali dalam
seminggu yang diperoleh dari tiga ekor kambing jantan, tiga ekor domba jantan dan

satu ekor sapi FH jantan.
Penelitian terdiri dari tiga tahap. Tahap I penentuan konsentrasi low melting
point-agarose (LMP-agarose), tahap II penentuan lysis solution (LS), dan tahap III
pengujian pewarnaan kromatin DNA spermatozoa. Konsentrasi LMP-agarose yang
digunakan adalah 0.6%, 0.7% dan 0.8%. Spermatozoa dan konsentrasi LMPagarose terbaik selanjutnya dilisiskan menggunakan tiga jenis LS. LS I (0.4M Tris,
0.8M DTT, 1% SDS), jenis LS II (0.4M Tris, 2M NaCl, 1% SDS), dan jenis LS III
(0.4M Tris-HCl, 2M NaCl, 1% SDS, 0.05M EDTA) pengujian pewarnaan kromatin
DNA menggunakan tiga pewarnaan yaitu eosin yellow methylene blue.
Kesimpulan penelitian ini adalah konsentrasi 0.6% LMP-agarose merupakan
konsentrasi yang dapat digunakan untuk menjebak spermatozoa domba dan
kambing bila dibandingkan dengan kedua konsentrasi yang diujikan, sedangkan
pada spermatozoa sapi ketiga konsentrasi yang diujikan tidak dapat digunakan.
Pada penelitian tahap kedua, lysis solution (LS) yang dapat digunakan untuk
melisiskan membran spermatozoa ternak adalah LS III (0.4M Tris-HCl, 2M NaCl,
1% SDS, 0.05M EDTA, pH 7.5), Pewarnaan terbaik menggunakan pewarnaan
eosin Yellow dan methylene blue dengan perbandingan 2:1.
Key word: Chromatin, DNA, spermatozoa, LMP-agarose, lysis solution, staining

iii

SUMMARY
TEGUH ARI PRABOWO. Determination of Low Melting Point Agarose
Concentration and Lysis Solution to Detect DNA Damage on Bull, Ram and Buck
Spermatozoa. Supervised by R. IIS ARIFIANTINI and DONDIN SAJUTHI.
Deoxyribonucleic acid (DNA) is a double helix polymer composed of
nucleotides. Each nucleotide contains of three components; a nitrogen base, a
pentose sugar called deoxyribosa and a phosphate group. The four types of nitrogen
bases are adenine (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (S). Adenine and
guanine are known as purines with two organic rings. Whereas cytosine and
thymine are recognized as pyrimidine which having a single organic ring.
DNA damage can occurs by the changes in DNA polymer and continuously
exposed to varied physical and chemical environments that could potentially
change the natural structure of the DNA. This change will affect replication and
transcription of DNA that lead to DNA damage. Another damage is the dissolution
of DNA polymer structure. The heating above 37ºC will cause the breakdown of
the glycoside bond which linking the nitrogen base and phosphate sugar which lead
to the loss of nitrogen base.
The research aim to develop the detection kit of DNA damage of livestock
spermatozoa which was still imported with a high price. The research was consisted
of 3 phase. The first phase was determine of low-melting point agarose (LMPagarose) concentration. The second phase was determine the lysis solution (LS),

and the third phase was examine the DNA spermatozoa chromatin staining. The
LMP-agarose concentrations used were 0.6%, 0.7% and 0.8%. The best
concentration of LMP-agarose were lysis using three types of LS such us LS I (0.4
M Tris, 0.8 M DTT, 1% SDS), LS II (0.4 M Tris, 2 M NaCl, 1% SDS), and LS III
(0.4 M Tris-HCl, 2 M NaCl, 1% SDS, 0.05 M EDTA) while examining the DNA
chromatin staining was performed by eosin yellow staining and methylene blue.
The study was conducted at the Biotechnology Laboratory of Primate Center
(PSSP) at Bogor Agricultural University and the Laboratory of Reproductive
Rehabilitation Unit (URR) at Faculty of Veterinary Medicine (FKH) of Bogor
Agricultural University. The semen was collected using an artificial vagina twice a
week obtained from 3 male goats, 3 male sheeps and 1 male FH cow.
The results showed that the LMP-agarose concentration of 0.8% was the
better concentration that can be used to trap the livestock spermatozoa than the
other two concentrations, and the best lysis solution (LS) was LS III (0.4 m TrisHCl, 2M NaCl, 1% SDS, 0.05M EDTA, pH 7.5,), while the best staining was by
using eosin yellow and methylene blue with the ratio of 2: 1.This result can be used
as detect deoxyribonucleic Acid (DNA) Damage on ram and buck Spermatoza.
while for spermatozoa cows, need to do more research to determine the best
concentrations of LMP agarose.
Key words: DNA spermatozoa, LMP-agarose, lysis solution, eosin yellow and
methylene blue staining

iv

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

v

PENENTUAN KONSENTRASI LOW MELTING POINT AGAROSE
DAN LYSIS SOLUTION UNTUK MENDETEKSI KERUSAKAN
DNA PADA SPERMATOZOA SAPI, DOMBA, KAMBING

TEGUH ARI PRABOWO

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Studi Biologi Reproduksi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

vi

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf, MS

vii

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

x

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kerangka Pemikiran
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis

1
1
2
3
3
3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Komponen Spermatozoa
Evaluasi Kerusakan Kromatin DNA Spermatozoa Ternak

3
5
6

3 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Metode Penelitian
Penelitian I. Menentukan konsentrasi Low Melting Point-agarose
(LMP-agarose) Terbaik.
Penelitian II. Pengujian Jenis Lysis solution (LS) untuk Melisis
Membran Spermatozoa
Tahap III. Pengujian jenis pewarnaan

8
8
8

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi LMP-Agarose Terbaik untuk Menjebak Spermatozoa
Ternak
Lysis Solution (LS) Tebaik untuk Melisiskan Membran Spermatozoa
Ternak
Jenis Pewarnaan Terbaik untuk Mewarnai Kromatin DNA

10

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

16
16
16

DAFTAR PUSTAKA
RIWAYAT HIDUP

8
9
10

10
12
15

17
20

viii

DAFTAR TABEL
1
2.
3

Konsentrasi Low Melting Point-agarose (LMP-agarose)
Jumlah spermatozoa yang terjebak di dalam LMP-agarose (ratarata±SD)
Morfometri Spermatozoa Ternak

8
11
11

ix

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
6

Morfologi Spermatozoa
Nukleosom yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat (abu-abu)
dan histon oktamer (Histon H2A , H2B , H3 and H4)
Spermatozoa yang ditetesi Lysis Solution (LS)
Mekanisme EDTA dalam menginduksi fluiditas dan permeabilitas
membran lipid
Perbandingan konsentrasi methylene blue dan eosin Y

4
7
13
14
15

I PENDAHULUAN
Latar Belakang
Keberhasilan program Inseminasi Buatan (IB) ditentukan oleh beberapa
faktor di antaranya faktor sumber daya manusia (SDM) yaitu inseminator dan
peternak. Faktor betina (umur dan kesehatan reproduksi) dan faktor pejantan
dalam hal ini adalah kualitas semen yang diinseminasikan. Inseminasi buatan
pada saat ini sebagian besar menggunakan semen beku yang diproduksi oleh Balai
Inseminasi Buatan (BIB). Indonesia saat ini memiliki dua BIB nasional yaitu BIB
Lembang dan Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB) Singosari serta lebih dari 15
Balai Inseminasi Buatan Daerah (BIBD).
Persayaratan mutu semen beku berdasarkan Standar Nasional Indonesia
(SNI) nomor 4869.1:2008 mengenai semen beku sapi, yang dikeluarkan oleh
Badan Sandardisasi Nasional (BSN) setelah thawing (post thawing) harus
menunjukkan spermatozoa hidup dan bergerak maju (motil spermatozoa) minimal
40 % dan skor gerakan spermatozoa minimal dua. Morrell dan RodriguezMartinez (2009) menyatakan sub populasi spermatozoa yang dapat memfertilisasi
ovum adalah spermatozoa yang motil, viable dengan morfologi yang normal serta
mempunyai kromatin yang intact. Berdasarkan pernyataan tersebut, seharusnya
keempat parameter tersebut harus diuji untuk memastikan spermatozoa mampu
membuahi ovum.
Pengujian motilitas, viabilitas dan morfologi spermatozoa sebelum dan
setelah pembekuan di Indonesia telah banyak dilaporkan, sedangkan kerusakan
kromatin Deoxyribonucleic acid (DNA) spermatozoa, baru dilaporkan oleh
Priyanto et al. (2015). Penyebab kerusakan kromatin DNA menurut RodriguezMartinez (2009) dapat terjadi akibat perubahan polimer DNA dan secara terus
menerus terpapar pada lingkungan fisik dan kimia yang bervariasi yang berpotensi
mengubah struktur alamiah DNA tersebut. Perubahan ini akan memengaruhi
proses replikasi (Oliva 2006) dan transkripsi DNA yang mengarah pada kerusakan
DNA (Evenson et al. 2002).
Kerusakan kromatin DNA spermatozoa semakin diakui sebagai faktor
penting penyebab terjadinya infertilitas. Beberapa kasus menunjukkan terdapat
korelasi antara kerusakan kromatin DNA spermatozoa dengan fertilitas (Evenson
dan Wixon 2006), penurunan integritas membran plasma (Nishizono et al. 2004),
kesalahan kondensasi kromatin, dan peningkatan fragmentasi DNA (Yildiz et al.
2007). Priyanto et al. (2015) membandingkan pengujian DNA spermatozoa
menggunakan cytochemical assay dengan pewarnaan toluidine blue dan Kit
halomax, hasilnya menunjukkan Kit halomax lebih sensitif untuk menguji
kerusakan spermatozoa setelah pembekuan dengan melihat dispersi kromatin yang
terjadi.
Pada proses identifikasi kerusakan kromatin DNA spermatozoa penting
digunakan untuk mendiagnosa ternak yang akan digunakan sebagai sumber semen
dalam program IB, dalam hal ini berhubungan mengenai infertilitas pejantan, dan
pendiagnosaan infertilitas pejantan dilakukan satu tahun sekali. Terdapat berbagai
metode pemeriksaan untuk menganalisis kerusakan DNA spermatozoa. Kerusakan
DNA spermatozoa dapat dianalisis menggunakan metode terminal

2

deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick end
labelling (TUNEL), single cell gel electrophoresis assay (COMET), in situ nick
translation (ISNT), sperm chromatin structure assay (SCSA), dan sperm
chromatin dispersion (SCD). Namun metode tersebut membutuhkan biaya yang
mahal dan tidak semua peralatan untuk menganalisis kerusakan kromatin DNA
terdapat di Balai Inseminasi Buatan (BIB) di Indonesia.
Kit halomax merupakan produk komersial dan harus diimpor sehingga
harganya mahal dan tidak efisien karena satu jenis kit hanya digunakan untuk
menguji kerusakan kromatin DNA pada satu jenis ternak saja. Penggunaan Kit
halomax berdasarkan prosedurnya diamati menggunakan mikroskop fluorescent
yang sulit didapatkan di BIB, sehingga perlu dilakukan modifikasi dengan
pewarnaan tertentu sehingga bisa diamati menggunakan Bright-field microscopy .
Pengujian kromatin DNA spermatozoa sangat penting untuk dilakukan
sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode pengujian
dispersi kromatin DNA buatan sendiri dengan prinsip kerja yang sama dengan Kit
halomax tetapi dapat digunakan pada spermatozoa ternak yang memiliki
morfometri spermatozoa yang hampir sama seperti domba, kambing dan sapi.
Kerangka Pemikiran
Kromatin DNA adalah protein kompleks histon yang bertanggungjawab
untuk melindungi materi genetik sel spermatozoa yang dilindungi oleh membran
sel tersusun dari 43% lipid, 48% protein, 9% karbohidrat dan zat-zat lain yang
bergabung bersama secara non kovalen dan sangat sensitif terhadap faktor-faktor
ekstrinsik seperti suhu, kekuatan ionik dan polaritas pelarut. Di dalam kromosom,
DNA dibungkus ke dalam susunan kromatin. Kromatin DNA terdiri dari protein
histon struktural, dan protein nonhiston. Histon berperan untuk memelihara
bentuk dan struktur kromatin. Struktur kromatin dikendalikan oleh berbagai
histone modifikasi, mencakup metilasi, fosforilasi, dan asetilasi yang terjadi di
aminoterminal histone. Identifikasi kerusakan kromatin DNA spermatozoa
penting dilakukan.
Diagnosis spermatozoa ternak yang akan digunakan sebagai sumber semen
dalam program IB, dalam hal ini berhubungan dengan infertilitas pejantan
tersebut. Diagnosis infertilitas pejantan dapat dilakukan satu tahun sekali.
Berbagai metode pemeriksaan kerusakan DNA spermatozoa telah dikembangkan.
Kerusakan DNA spermatozoa dapat dianalisis menggunakan metode terminal
deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick end
labelling (TUNEL), single cell gel electrophoresis assay (COMET), in situ nick
translation (ISNT), sperm chromatin structure assay (SCSA), dan sperm
chromatin dispersion (SCD). Metode-metode tersebut membutuhkan biaya yang
mahal dan tidak semua peralatan untuk menganalisis kerusakan kromatin DNA
tersebut terdapat di BIB di Indonesia. Pada penelitian ini, terdapat tiga tahap yang
harus diperhatikan yaitu konsentrasi Low Melting Point-agarose (LMP-agarose)
untuk menjebak spermatozoa, penentuan jenis lysis solution (LS), dan pewarnaan.
Spermatozoa memiliki ukuran kepala yang berbeda-beda bergantung jenis ternak.
Ukuran kepala spermatozoa ini menjadi landasan dalam menjebak spermatozoa

3

menggunakan LMP-agarose. LMP-agarose apabila dilihat secara mikroskopis
akan terbentuk seperti pori-pori di mana kerapatan pori-pori ini dipengaruhi oleh
konsentrasi LMP-agarose. Semakin tinggi konsentrasi LMP-agarose, maka poripori yang terbentuk akan semakin rapat, dan sebaliknya. Lysis Solution (LS)
merupakan zat yang dapat melisiskan sel membran namun tidak merusak
komponen inti sel. Proses melisiskan sel membran ini dengan cara membuat
membran menjadi tidak stabil namun tidak merusak struktur DNA sehingga
materi DNA dapat diamati dari luar. Kromatin DNA yang rusak akan keluar,
sedangkan kromatin DNA yang masih bagus akan tetap tersusun di antara
protamin dan histon sehingga tidak keluar dari sel membran. Setelah sel membran
lysis maka dilakukan pewarnaan untuk mengidentifikasi kromatin. Pewarnaan
yang sering digunakan untuk pewarnaan spermatozoa pada mikroskop cahaya
ialah eosin dan methylen blue.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah:
1. Menentukan konsentrasi Low Melting-agarose (LMP-agarose) untuk menjebak
spermatozoa sapi, domba dan kambing.
2. Menentukan jenis lysis solution (LS) untuk melisiskan membran sel
spermatozoa sapi, domba dan kambing.
3. Memperoleh pewarnaan yang mudah digunakan untuk identifikasi kerusakan
kromatin DNA pada spermatozoa ternak yang dapat diamati dengan mikroskop
binokuler.
Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari pelaksanaan penelitian ini adalah diperoleh
Kit buatan sendiri untuk menguji kerusakan kromatin DNA spermatozoa ternak.
Hipotesis
1. Konsentrasi 0.7% LMP-agarose dapat digunakan untuk menjebak spermatozoa
dengan baik.
2. Jenis LS dengan resep 0.4M Tris, 0.8M DTT, 1% SDS dan 50mM EDTA, pH
7.5 adalah yang terbaik.
3. Pewarnaan terbaik yang dapat digunakan untuk identifikasi kerusakan kromatin
DNA spermatozoa ternak adalah kombinasi eosin Y dengan methylen blue satu
berbanding satu.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Fisiologi Semen dan Morfologi Spermatozoa
Semen adalah cairan yang disekresikan dari organ kelamin jantan yang
keluar pada saat ejakulasi terdiri atas plasma semen dan sel kelamin jantan atau
gamet jantan pembawa materi genetik, yang terbagi atas bagian kepala dan bagian
ekor. Johnson et al. (1997) menyatakan bahwa spermatozoa terdiri atas kepala dan
ekor yang keseluruhannya diselubungi oleh membran plasma. Bagian kepala

4

spermatozoa pada hewan ruminansia berbentuk oval, datar dengan nukleus terdiri
atas kromatin yang kompak. Jumlah kromosom yang terdapat pada spermatozoa
adalah haploid atau setengah dari jumlah DNA sel somatik pada spesies yang
sama, yang dihasilkan dari pembelahan miosis yang terjadi selama pembentukan
spermatozoa (Ball dan Peters 2004). Gilbert (1994) menyatakan bahwa
spermatozoa terdiri atas suatu inti haploid, sistim penggerak spermatozoa dan
kumpulan enzim yang dapat membantu kepala spermatozoa memasuki sitoplasma
oosit pada saat fertilisasi. Inti haploid akan mengalami perubahan, demikian
halnya dengan DNA akan mengalami pemadatan juga. Lebih lanjut dikatakan
bahwa di depan inti sel spermatozoa terdapat akrosom yang berasal dari aparatus
golgi dan mengandung banyak enzim-enzim.

Gambar 1 Morfologi Spermatozoa (Schill 2006)
Johnson dan Everit (2000) menyatakan spermatozoa sapi memiliki ukuran
panjang 9-10 μm, lebar 4-5 μm, tebal kepala 1 μm dan memiliki panjang ekor 4550 μm. Seluruh permukaan spermatozoa dilapisi oleh membran plasma berupa
fosfolipid bilayer yang bersifat selektif semi permeable. Bagian kepala
spermatozoa membawa materi genetik (DNA) dan enzim yang terletak di dalam
akrosom berfungsi untuk menembus ovum dan lapisan-lapisan sel yang
melindungi ovum. Bagian tersebut dilindungi oleh membran inti dan membran
plasma, yang bersifat dapat dipengaruhi oleh faktor luar. Pada bagian ekor
terdapat mitokondria yang berfungsi untuk merombak Adenosin Tri Phosphat
(ATP) menjadi Adenosin di Phosphat (ADP) ataupun ADP menjadi Adenosin
mono Phosphat (AMP) yang hasilnya akan digunakan untuk pergerakan
spermatozoa. Pergerakan spermatozoa sendiri dilakukan oleh fibril-fibril atau
aksonema dalam jumlah tertentu dengan bantuan energi dari mitokondria tadi

5

ataupun dari media lingkungan. Lapisan plasma terdiri dari glikoprotein,
fosfolipid dan lemak di mana susunannya dapat berubah apabila dalam
lingkungan yang kurang sesuai misalnya pada proses pembekuan semen dapat
memengaruhi kerusakan membran plasma dan berakibat pada kerusakan DNA.
Komponen Spermatozoa
Aspek yang menentukan kualitas semen adalah motilitas, konsentrasi,
morfologi spermatozoa dan keutuhan kromatin DNA. Kromatin DNA merupakan
salah satu parameter yang kurang mendapat perhatian pada pengolahan semen di
Indonesia, padahal di luar negeri seperti Amerika, Swedia dan Belanda, pengujian
keutuhan kromatin DNA merupakan salah satu faktor yang diperhitungkan dalam
evaluasi semen cair dan semen beku. Kajian kerusakan kromatin DNA
spermatozoa perlu dilakukan mengingat sudah cukup banyak penelitian-penelitian
yang membahas korelasi antara kerusakan kromatin DNA dan fertilitas pada
berbagai ternak (Sailer et al. 1996). Johnson et al. (1997) menyatakan
spermatozoa terdiri atas kepala dan ekor yang keseluruhannya diselubungi oleh
membran plasma.
Pada bagian kepala terdapat inti sel dengan DNA yang merupakan materi
genetik jantan dan akrosom dengan enzim-enzim hidrolitik dan proteolitiknya
yang dibutuhkan untuk menembus cumulus oophorus dan dinding ovum pada saat
fertilisasi. Lebih lanjut Sassone-Corsi (2002) menyatakan spermatozoa terdiri atas
suatu inti haploid, sistem penggerak spermatozoa dan kumpulan enzim yang dapat
membantu inti memasuki sitoplasma oosit pada saat fertilisasi. Kebanyakan
organel pada sitoplasma spermatozoa akan menghilang pada saat maturasi
berlangsung dan tinggal beberapa organel termodifikasi yang tetap menjalankan
fungsi spermatozoa. Selain itu inti haploid juga mengalami perubahan, demikian
halnya dengan DNA yang akan mengalami pemadatan. (Aitken dan Krausz 2001).
Lebih lanjut dikatakan bahwa di depan inti sel spermatozoa terdapat akrosom
yang berasal dari aparatus golgi dan mengandung banyak enzim-enzim pencerna
protein dan gula (Arpanahi et al. 2009). Struktur yang melindungi bentuk tiga
dimensi inti sel disebut matriks inti. Matriks ini tersusun atas jalinan benangbenang protein yang meliputi seluruh permukaan inti sel, nukleolus, RNA,
polisakarida dan selubung yang berisi pori-pori inti. Matriks sama sekali tidak
mempunyai histon dan lipid serta hanya mengandung 5% DNA dalam keadaan
terlindugi.
Ukuran inti sel dapat berubah-ubah walaupun bentuknya dapat
dipertahankan pada saat dimasukan ke dalam suatu suspensi. Matriks inti
nampaknya bersifat elastis pada batas-batas tertentu di dalam lingkungan in vitro
sebagai reaksi terhadap perubahan ion. Perubahan ion ini diperkirakan akan
berpengaruh terhadap tingkat kondensasi kromatin (Langdon 2012). Walaupun
struktur yang mempertahankan inti sel telah diketahui dengan baik, sangat sedikit
pengetahuan tentang faktor-faktor yang berpengaruh terhadap struktur inti
tersebut. Beberapa hipotesis telah dibangun untuk menerangkan faktor internal
dan eksternal yang berpengaruh terhadap struktur inti. Faktor internal melibatkan
perubahan bentuk kromatin dan aktivitas elemen kontraktil dalam inti (Lewis dan
Aitken 2005). Sedangkan faktor eksternal merupakan pengaruh kerja aktin
mikrofilamen, intermedit filamen dan mikrotubul yang menyusun sitoskeleton

6

(Nandre et al. 2011). Selubung inti bertaut dengan filamen sitoplasma intermediet
yang menjulur ke plasma membran (Chenoweth 2005).
Salah satu cara dalam mengidentifikasi kerusakan kromatin DNA
spermatozoa ternak adalah dengan evaluasi secara morfometrik, yaitu mengukur
bagian terpanjang dan terlebar kepala spermatozoa. Pengkajian terhadap
morfometri spermatozoa perlu dilakukan untuk mengetahui karakteristik ukuranukuran spermatozoa pada berbagai hewan (Gizejewski et al. 2002). Gunarso
(1989) menyatakan kajian morfologi dapat dilakukan dengan mikroteknik
penggunaan preparat ulas yang diwarnai dengan pewarnaan khusus. Teknik ini
direkomendasikan karena cukup mudah dilakukan di lapangan dan pewarnaan
(staining) dapat dilakukan di laboratorium untuk selanjutnya dilakukan
pengamatan morfologi.
Evaluasi Kerusakan Kromatin DNA Spermatozoa Ternak
Deoxyribose-nucleic acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung
materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh
bentuk kehidupan secara seluler. Struktur DNA, dilihat dari organismenya
berbeda. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,
sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Kerusakan
DNA dapat diartikan sebagai semua bentuk perubahan polimer DNA. Perubahan
ini dapat memengaruhi proses replikasi dan transkripsi DNA yang mengarah pada
kerusakan DNA. Konsekuensi biologisnya dapat berupa kejadian mutasi atau
kematian sel bahkan kanker, kemunduran mental dan terkait pertumbuhan dan
perkembangan (Meistrich et al. 2003). Kerusakan DNA dapat dilihat dari struktur
DNA misalnya kromatin. Kromatin terdiri atas kompleks dari protein kromosonal
histon dan non histon dengan DNA sel eukariota (Evenson et al. 2002).
Kromatin adalah kompleks dari asam deoksiribonukleat, protein histon
dan protein non histon yang ditemukan pada inti sel eukariota. Kromatin
merupakan bahan yang mudah diwarnai oleh suatu zat pewarna dan pada berbagai
sel eukariota tingkat tinggi, ada dua bentuk kromatin pada
tahap interfase yaitu eukromatin dan heterokromatin. Kromatin terfragmentasi dan
menggumpal selama mitosis atau meiosis untuk membentuk wujud seperti batang
yang disebut kromosom. Kromosom yang berkembang dari kromatin terbukti
tersusun dari sejumlah besar protein dan asam-asam nukleat yang sekarang
dikenal sebagai asam deoksiribonukleat. Dua pasang dari tiap protein histon
tersebut yaitu histon H2A, H2B, H3 dan H4 membentuk oktamer dengan 145
hingga 147 pasangan basa asam deoksiribonukleat yang membungkusnya
membentuk inti nukleosom (Gambar 2) (Prigent et al.1996).
Protamin adalah suatu protein utama di dalam inti spermatozoa yang
mengikat DNA (Aulanni’am et al. 2011). Pada manusia dan tikus terdapat dua
jenis protamin P1, protamin P2 (Corzett et al. 2002), pada sapi dan kambing
hanya satu tipe yaitu protamin P1 (Aoki et al. 2006). Protamin berperan penting
untuk pembentukan kromatin yang diperlukan pada fungsi normal spermatozoa.
Ekspresi protamin abnormal menyebabkan terjadinya penurunan jumlah
spermatozoa, motilitas, morfologi dan peningkatan kerusakan kromatin
spermatozoa (Mengual et al. 2003), penurunan viabilitas dan meningkatkan

7

kerusakan DNA (Aoki et al. 2006). Selama tahap elongasi spermatid pada saat
spermiogenesis sekitar 85 % inti spermatozoa histon akan diganti oleh protamin
(Aulanni’am et al. 2011).
Keseluruhan genom spermatozoa terdapat di dalam pilinan DNA dengan
panjang rata-rata 27 kilobite. Pilinan DNA ini berikatan dengan elemen struktural
inti yang disebut matriks inti. Histon merupakan protein yang terdiri dari lima sub
unit yaitu histon H1, H2A, H2B, H3 dan H4. Sub unit-sub unit ini kaya akan asam
amino yang bermuatan positif atau bersifat basa seperti lisin dan arginin. Histon
ini akan bereaksi dengan asam deoksiribonukleat melalui interaksi antara protein
yang bermuatan positif dengan fosfodiester dari asam deoksiribonukleat yang
bermuatan negatif (Strahl dan Allis 2000).
Asosiasi antara satu histon dengan satu segmen asam deoksiribonukleat
disebut nukleosom. Asosiasi nukleosom merupakan tahap awal pengemasan asam
deoksiribonukleat ke dalam bentuk yang padat. Tiap inti nukleosom terdiri atas
delapan protein histon (histon oktamer) yang kompleks dan DNA rantai ganda
dengan panjang 147 pasang nukleotida. Kompleks histon oktamer ini masingmasing terdiri atas 4 molekul histon H2A, H2B, H3, dan
H4. Modifikasi histon memengaruhi perubahan bentuk kromatin (Martianov et al.
2004).

Gambar 2 Nukleosom yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat (abu-abu) dan
histon oktamer Histon H2A , H2B , H3 and H4 (Campbell et al. 2000)
Asosiasi pertama deoxyribonucleic acid dengan protein berlangsung dengan
histon membentuk struktur nukleosom. Empat subunit histon selain H1 akan
membentuk suatu butiran protein oktamer dan setiap subunit terdapat dalam dua
rangkap. Asam deoksiribonukleat kemudian akan melekat pada butiran
oktamer tersebut. Pada tiap butiran terbentuk dua lilitan deoxyribonucleic acid
yang panjangnya 146 pasangan basa (pb). Asosiasi ini merupakan inti
nukleosom.
Dua
pasang
dari
tiap
protein
histon H2A, H2B,H3 dan H4 membentuk oktamer dengan
145-147
pb deoxyribonucleic acid yang membungkus dan membentuk inti nukleosom.
Referensi lama menyebutkan bahwa serabut deoxyribonucleic acid dan
protein ini dapat ditemukan saat interfase dari sel eukariot yang dibangun
dari nukleosom-nukleosom dan terdiri atas histon oktamer yang berasosiasi
dengan sekitar 200 pb deoxyribonucleic acid. Unsur inti nukleosom tersebut
selanjutnya berasosiasi dengan protein histon H1 serta 20 pb asam

8

deoksiribonukleat, yaitu masing-masing 10 pb di hilir dan hulu deoxyribonucleic
acid unsur inti nukleosom. Satu nukleosom keseluruhannya berasosiasi 166 pb
ADN dengan lima jenis protein histon (Balhorn et al. 2000).
Teknik pewarnaan untuk evaluasi morfologi dan kromatin DNA
spermatozoa merupakan bagian penting dalam karakterisasi spermatozoa.
Identifikasi kerusakan kromatin DNA hingga saat ini belum ditemukan teknik
pewarnaan yang mudah digunakan pada mikroskop binokuler . Teknik pewarnaan
yang umum digunakan dalam evaluasi spermatozoa adalah pewarnaan eosin.
Eosin merupakan zat warna dengan sifat asam dan termasuk ke dalam kelompok
molekul yang memiliki cincin kuinoid yang ditautkan pada cincin non-kuinoid
melalui atom-atom C dan O, sedangkan Methylen blue sering digunakan sebagai
pewarna inti (Griesbeck et al. 2012).

3 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Pusat Studi Satwa
Primata (PSSP), Laboratorium Reproduksi Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR),
Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan,
Institut Pertanian Bogor (FKH-IPB). Penelitian ini berlangsung selama lima
bulan, dimulai pada bulan Februari sampai bulan Juni 2015.
Metode Penelitian
Penelitian dibagi ke dalam tiga tahap. Tahap pertama adalah menentukan
konsentrasi Low Melting Point-agarose (LMP-agarose) untuk menjebak
spermatozoa, tahap kedua adalah mencari komposisi lysis solution terbaik dalam
melisis membran spermatozoa dan tahap ketiga adalah mencari bahan pewarnaan
terbaik.
Penelitian I. Menentukan konsentrasi Low Melting Point-agarose (LMPagarose) Terbaik.
Pembuatan LMP-agarose
Pada penelitian ini konsentrasi LMP-agarose yang digunakan ada tiga jenis
yaitu 0.6%; 0.7% dan 0.8% dengan komposisi seperti pada Tabel 1. Selanjutnya
LMP- agarose yang telah dibuat dimasukkan dalam mikrotub 5 ml dan disimpan
dalam suhu 5oC.
Tabel 1 Konsentrasi Low Melting Point-agarose (LMP-agarose)
Bahan
LMP (g)
Aquadest (mL)

0.6 %
0.6
100

Konsentrasi LMP-agarose
0.7%
0.7
100

Keterangan: LMP-agarose= Low Melting Point-agarose

0.8%
0.8
100

9

Semen yang digunakan untuk menguji LMP-agarose ini adalah semen segar
sapi, domba dan kambing. Semen dikoleksi menggunakan vagina buatan,
dievaluasi secara makro dan mikroskopis kemudian semen dari masing-masing
ternak diencerkan dengan Phosphate Bufer Saline (PBS) hingga 20 juta sel/ml.
Pengujian Kerapatan LMP-agarose
Tiga konsentrasi LMP-agarose dilelehkan dalam water bath (100°C)
selama 5 menit, kemudian dipindahkan ke water bath 37°C. Semen segar (sapi,
kambing dan domba) yang sudah diencerkan diteteskan ke dalam LMP-Agarose.
Sebanyak 20µL campuran LMP-agarose dengan semen diteteskan masing-masing
ke dalam “sumur” pada object glass khusus dan ditutup dengan cover glass.
Object glass diinkubasi dalam lemari es (4°C). Cover glass diambil dengan cara
digeser ke samping, selanjutnya object glass dievaluasi di bawah mikroskop
binokuler (Olympus CX21), dan spermatozoa yang terdapat dalam masing-masing
konsentrasi dari masing-masing ternak dihitung dari sepuluh lapangan pandang.
Penelitian II. Pengujian Jenis Lysis solution (LS) untuk Melisis Membran
Spermatozoa
Persiapan lysis solution.
Jenis LS yang digunakan adalah Jenis LS 1 mengadopsi resep Chohan et al.
(2006) yaitu campuran dari 0.4 M Tris, 0.8M DTT, 1% SDS, pH 7.5. Jenis LS 2
mengadopsi Fernandez et al. (2003) yaitu campuran dari 0.4 M Tris, 2 M NaCl,
1% SDS, pH 7.5. Jenis LS 3 mengadopsi Enciso et al. (2005). 0.4 M Tris-HCl, 2
M NaCl, 1% SDS, 0.05 M EDTA, pH 7.5. Seluruh LS yang telah dibuat disimpan
pada tabung, dan disimpan pada suhu 5oC.
Sampel semen untuk pengujian LS.
Struktur sel pada spermatozoa sapi, kambing dan domba memiliki struktur
sel yang sama sehingga dalam pengujian jenis lysis solution (LS) digunakan
hanya satu jenis spermatozoa ternak yaitu spermatozoa sapi. Sampel semen yang
digunakan untuk pengujian LS adalah semen beku sapi, yang diperoleh dari BIB
Lembang. Semen beku disimpan pada kontainer (-196oC). Sebelum pengujian
semen beku dithawing pada suhu 37oC selama 30 detik. Semen yang telah dithawing masing-masing disimpan dalam mikrotub, selanjutnya semen beku sapi
diencerkan menggunakan PBS, dengan konsentrasi akhir 15-20 juta sel/mL.
Pengujian LS pada semen beku
LMP-agarose terbaik pada tahap I yang sudah dilelehkan dan disimpan
pada suhu 37°C. Sebanyak 50µL semen yang sudah diencerkan, dimasukan ke
dalam tabung yang berisi LMP-agarose dan dihomogenkan. Campuran agarose
dan semen selanjutya diteteskan dalam tiga buah object glass, ditutup cover glass,
dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 5menit. Cover glass kemudian diangkat
perlahan dari samping, setelah itu dilakuan pengamatan menggunakan mikroskop
binokuler.
Setiap object glass diteteskan dengan jenis LS yang berbeda masingmasing LS I, LS II dan LS III. Seluruh object glass dibiarkan pada suhu ruang
selama 5 menit. Setelah itu preparat direndam dalam aquadest selama 5 menit,

10

dilanjutkan dengan direndam dalam etanol 70%, 90%, 100% (masing-masing 4
menit), dan dikeringkan. Setelah itu preparat diinkubasi dalam aquadest selama
5menit, kemudian dikeringanginkan dan direndam dalam eosin yellow (Eosin Y)
1% selama 5 menit, direndam dalam aquadest selama 5 menit, dilanjutkan dengan
direndam dalam methylen blue selama 5 menit dan terakhir direndam dalam
aquadest selama 5 menit. Preparat diangkat dan dikeringanginkan. Pengamatan
dilakukan di bawah mikroskop binokuler dengan pebesaran 400X. Kepala
spermatozoa yang mengeluarkan benang-benang kromatin menandakan bahwa
membran sel spermatozoa di lisis oleh lysis solution (LS).
Tahap III. Pengujian jenis pewarnaan
Persiapan pewarna.
Jenis pewarnaan yang digunakan pada penelitian ini adalah; a) Pewarnaan
bertahap Eosin Y dengan Methylene blue 1:1, b) Pewarnaan campuran Eosin Y
dengan Methylene blue 1:1, c) Pewarnaan bertahap Eosin Y dengan Methylene
blue 2:1.
Sampel semen
Semen yang digunakan adalah semen beku sapi, domba dan kambing dari
BIB Lembang. Prosedur thawing dan pengenceran semen sama dengan yang
digunakan pada tahap II, kemudian dimasukkan dalam LMP-agarose terbaik
tahap I, dan dimasukkan pada LS terbaik tahap II.
Pengujian pewarna
Semen diwarnai dengan tiga macam pewarnaan berbeda sesuai metode
tahap II. Preparat diamati di bawah mikroskop binokuler dengan perbesaran 400X
menggunakan green filter. Pewarnaan yang dapat mewarnai benang-benang
kromatin DNA spermatozoa dengan jelas merupakan pewarnaan yang dapat
digunakan untuk mendeteksi kerusakan kromatin DNA spermatoza ternak.
Analisis Data
Percobaan Tahap 1 diuji secara kualitatif disajikan bentuk rataan dan
standard eror mean (SEM) yang dianalisis menggunakan microsoft excell.
Penelitian pada Tahap II dan III dianalisis secara deskriptif.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi LMP-Agarose Terbaik untuk Menjebak Spermatozoa Ternak
LMP-agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah
yang digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100bp, sedangkan
untuk memisahkan DNA dengan ukuran lebih pendek dapat digunakan gel
poliakrilamid (Surzycky 2000). LMP-agarosa merupakan bahan yang dapat
memisahkan substansi berdasarkan ukuran substansi tersebut, ukuran pori-pori
agarose dipengaruhi oleh tingkat konsentrasinya.
Pada penelitian ini terbukti semakin tinggi konsentrasi spermatozoa maka
semakin banyak spermatozoa yang terjebak. Pada spermatozoa sapi diketahui

11

konsentrasi 0.8% LMP-agarose merupakan konsentrasi terbanyak untuk
menjebak spermatozoa dengan jumlah 30.69±1.28 sel. Pada semen kambing dan
domba konsentrasi LMP-agarose yang sama, spermatozoa yang terjebak paling
banyak adalah 28.29±0.81 dan 26.58±1.47 sel (Tabel 2).
Tabel 2 Jumlah spermatozoa yang terjebak di dalam LMP-agarose (rata-rata±SD)
Jenis Ternak
Sapi
Kambing
Domba

Konsentrasi
0.6%
0.7%
0.8%
0.6%
0.7%
0.8%
0.6%
0.7%
0.8%

Spermatozoa
20.100±0.562
24.310±1.272
30.690±1.278
14.950±0.712
21.770±1.479
28.290±0.810
15.795±1.148
20.545±1.179
26.585±1.468

Merujuk kepada Cerolini et al. (2001) jumlah spermatozoa dalam satu
lapang pandang agar mudah diamati adalah 10-15 sel spermatozoa. Berdasarkan
hal tersebut pada penelitian ini konsentrasi LMP-agarose yang paling baik untuk
menjebak dan mengamati spermatozoa kambing dan domba adalah konsentrasi
0.6% dengan jumlah spermatozoa yang teramati pada satu lapang pandang
sebanyak 15 sel spermatozoa kambing dan 16 sel spermatozoa domba. Pada sapi,
jumlah spermatozoa yang terjebak pada konsentrasi 0.6% LMP-agarose masih
melebihi batas lapang pandang terbaik, sehingga pada spermatozoa sapi
disarankan konsentrasi agarose dapat diturunkan untuk memudahkan
pengamatan. Terjebaknya spermatozoa di dalam LMP-agarose diduga
dikarenakan ukuran morfometri spermatozoa ternak lebih besar dibandingkan
dengan pori-pori LMP-agarose. Bartlett dan Stirling (2003) menyatakan semakin
tinggi konsentrasi agarose, semakin kaku gel yang dibuat dan pori-pori yang
terbentuk semakin rapat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul
DNA. Konsentrasi agarose yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang
berukuran kecil, konsentasi agarose yang lebih rendah memudahkan pemisahan
DNA dengan ukuran yang lebih besar.
Berdasarkan morfometrinya, panjang kepala spermatozoa sapi 0.6 µm lebih
panjang dari kepala spermatozoa kambing dan domba, demikian juga lebar kepala
spermatozoa sapi lebih lebar sekitar 0.20µm dibandingkan lebar kepala
spermatozoa domba dan kambing (Tabel 3).
Tabel 3 Morfometri Spermatozoa Ternak
Spesifikasi Spermatozoa
Panjang Kepala (µm)
Lebar Kepala (µm)
Sapi
8.94±0.24
4.59±0.24
Kambing
8.32± 0.24
4.30±0.24
Domba
8.33±0.24
4.32±0.22
Sumber : Tappa et al. (2007)
Jenis Ternak

12

Lebih panjang dan lebih lebarnya morfometri spermatozoa sapi memiliki
arti bahwa morfometri spermatozoa sapi lebih besar daripada kambing dan
domba. Oleh karena itu, pada konsentrasi LMP-agarose 0.6%
jumlah
spermatozoa sapi akan lebih banyak terjebak dibandingkan kedua ternak lainnya.
Lysis Solution (LS) Terbaik untuk Melisiskan Membran Spermatozoa
Ternak
Menurut Holme dan Hazel (1998) tahap pertama dalam isolasi DNA adalah
proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel yang bertujuan
untuk mengeluarkan isi sel. Metode yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid
antara lain yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis,
dan enzimatic digestion.
Pada penelitian tahap II, spermatozoa yang digunakan adalah spermatozoa
yang bersumber dari semen beku sapi. Hal ini disebabkan komposisi membran sel
dari ketiga spermatozoa ternak tersebut hampir sama yaitu terdiri dari 43% lipid,
48% protein, 9% karbohidrat dan zat-zat lain yang bergabung bersama secara non
kovalen. Membran spermatozoa berfungsi untuk pemeliharaan integritas membran
dan membentuk permukaan yang dinamis antar sel serta sebagai perlindungan
terhadap lingkungan (Watson 2000).
Integritas membran spermatozoa adalah keutuhan membran spermatozoa
atau suatu keadaan yang menunjukkan mekanisme fungsi fisiologis membran
tetap terjaga sebagai kontrol terhadap sistem transport, motilitas dan viabilitas
spermatozoa mempengaruhi fungsi integritas membran spermatozoa dalam
ejakulasi spermatozoa yang mengalami kerusakan membran tidak dapat
menunjukkan pembengkakan di bawah kondisi hypoosmotic (Esteves et al. 2008).
Lipid merupakan komponen membran spermatozoa yang berperan penting dalam
menjaga stabilitas dan kelangsungan hidup spermatozoa secara keseluruhan
termasuk kemampuan spermatozoa untuk mengkapasitasi serta membuahi sel
telur. Beberapa peneliti melaporkan lipid membran spermatozoa tersusun dari
fosfolipid, kolesterol, triasilgliserol dan asam lemak bebas (Dorota dan Kurpisz
2004). Fosfolipid merupakan komponen utama lipid membran spermatozoa yang
membentuk membran lapis ganda, kepala fosfolipid hidrofilik dan fosfolipid
hidrofobik yang sangat penting kaitannya dengan proses fertilisasi dan
mempertahankan ketidakstabilannya selama pembekuan adalah fosfolipid dan
kolesterol.
Kepala fosfolipid hidrofilik membentuk permukaan membran bagian luar
sedangkan kepala hidrofobik membentuk permukaan membran bagian dalam
(Darnell et al. 1990). Di antara lapisan kepala fosfolipid hidrofilik dan kepala
fosfolipid hidrofobik terdapat protein globular dan fibrous dengan distribusi yang
bervariasi, protein-protein ini bersifat dinamis dan dapat bergerak bebas diantara
kedua lapisan fosfolipid. Protein-protein pada membran ini ada yang terletak
secara vertikal sehingga sebagian masuk dan menembus ke dalam dua lapisan
fosfolipid (lipid bilayer) serta berinteraksi dengan bagian hidrofilik dari lipid
membran yang disebut protein integral.
Protein-protein yang terletak dipermukaan bagian luar membran sebagai
pembatas dua lapisan fosfolipid disebut protein ferifer. Protein-protein ini
berfungsi sebagai reseptor terhadap rangsangan eksternal dan sinyal (misalnya

13

cahaya, aroma, hormon, obat-obatan, faktor penumbuh dan transporter), sebagai
enzim dan antigen yang terlibat dalam pengenalan kepala spermatozoa (misalnya
adesi zona pelusida-spermatozoa, induksi reaksi akrosom dan fusi spermatozoa sel
telur). Pada bagian luar dari kedua lapisan fosfolipid terdapat karbohidrat yang
sebagian besar berbentuk glikokaliks, merupakan oligosakarida yang berikatan
dengan protein dan membran lipid, karbohidrat membran spermatozoa selain
berfungsi sebagai sumber untuk pembentukan Adenosine Triposphate (ATP) juga
berperan penting dalam membantu proses kapasitasi dan reaksi akrosom
spermatozoa (Herrero et al. 2009).
Hasil penelitian pada tahap II menunjukkan bahwa spermatozoa yang diberi
LS III (0.4M Tris-HCl, 2M NaCl, 1% SDS, 0.05M EDTA) dapat melisiskan
membran sel spermatozoa ternak. Hal tersebut dapat dilihat pada Gambar 3.c,
pada kepala spermatozoa ternak terdapat benang-benang kromatin berwarna
merah yang menunjukkan adanya kerusakan kromatin DNA pada semen beku
tersebut.

a

b

c

Gambar 3 Spermatozoa yang ditetesi Lysis Solution (LS) (a) Spermatozoa yang
diberi LS I; (b) Spermatozoa yang ditetesi LS II; (c) Spermatozoa yang
diberi LS III.
Hal ini diduga karena LS III mengandung EDTA yang berfungsi sebagai
chelating agent pada proses melisiskan membran spermatozoa ternak.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) adalah pengkelat hexadentate
(mempunyai enam tangan) yang mampu mengikat ion logam secara stoikiometri
melalui empat gugus karboksilat dan dua kelompok amina tersier (Gyliene dan
Aikaite 2003). Pelisisan membran sel dipicu interaksi molekuler antara kepala
lipid dengan molekul EDTA yang mengakibatkan fluiditas dan penonjolan
komponen lipid ke luar dalam interkalasi membran lipid dan pengikatan ion

14

logam. Hal ini kemudian menyebabkan ketidakstabilan membran dan melisiskan
sel (Corkill dan Rapley 2008).
Prachayasittikul et al. (2007) menyatakan EDTA cenderung mengalami
interkalasi dengan molekul fosfolipid melalui pembentukan jembatan garam yang
melibatkan gugus amonium positif dari kolin dan gugus karbonil dari EDTA.
Jembatan garam adalah bentuk khusus ikatan hidrogen kuat yang berperan penting
dalam struktur dan fungsi protein (Kumar et al. 2001). Adanya jembatan garam
dalam proses ini sesuai dengan metode yang dikemukakan oleh Kumar dan
Nussinov (1999) sebagai gugus atom dengan muatan parsial yang berlawanan
dalam jarak 3.5 Å.
Muladno (2002) menyatakan proses isolasi DNA menggunakan LS yang
mengandung EDTA berfungsi merusak membran sel secara kimiawi dengan cara
mengikat ion magnesium, selain itu EDTA juga berfungsi mempertahankan
integritas sel maupun aktifitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat.

Fluiditas dan perluasan membran

Tonjolan membran ke luar
EDTA mengunduksi penyusunan
kembali membran

Lengkungan membran

Gambar 4 Mekanisme EDTA dalam menginduksi fluiditas dan permeabilitas
membran lipid
Interaksi kuat antara EDTA dan gugus kepala lipid, yang berhubungan
dengan tekanan area isotermal pada beberapa EDTA sehingga tetap melekat pada
monolayer pada tekanan permukaan yang tinggi hingga 45 mN/m. Penyisipan
EDTA ke dalam membran lipid memperluas permukaan dan memengaruhi
struktural himpunan domain. Keterbatasan area yang tersedia pada membran lipid
saat interkalasi EDTA ke dalam gugus kepala lipid menyebabkan adanya
introduksi stres mekanik himpunan lipid, merangsang terjadinya lengkungan dan
penonjolan membran (Prachayasittikul et al. 2005). Tonjolan tersebut kemudian
dikeluarkan dari membran lipid, diikuti dengan penataan ulang membran.

15

Mekanisme yang diawali induksi EDTA terhadap fluiditas dan destabilisasi
membran secara skematis digambarkan pada Gambar. 4.
Beberapa pernyataan di atas mendukung bahwa LS3 yang mengandung
EDTA merupakan LS yang terbaik dalam melisiskan membran sel spermatozoa
ternak.
Jenis Pewarnaan Terbaik untuk Mewarnai Kromatin DNA
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pewarnaan eosin Y methylen blue 1:2
memberi hasil yang lebih baik (kromatin DNA mudah diamati) bila dibandingkan
dengan kedua konsentrasi.
Hal tersebut terlihat jelas pada Gambar 5.c kromatin dan membran sel
spermatozoa dapat lebih jelas terlihat bila dibandingkan dengan kedua pewarna
lainnya. Menurut Benson dan Brown (2004) pewarnaan eosin yellow (Eosin Y)
secara khas digunakan dalam konsentrasi 1% sampai 5 % volume, yang dilarutkan
dalam air atau etanol sedangkan untuk methylen blue (MB) konsentrasi yang
digunakan ialah 0.5% sampai 1%.

a

b

c

Gambar 5.a) Perbandingan konsentrasi methylene blue dan eosin Y
1:1(dicampur); b) Perbandingan konsentrasi methylene blue dan eosin Y
1:1; c) Perbandingan konsentrasi methylene blue dan eosin Y 1:2
Menurut Harley dan Prescott (2002) MB dan eosin merupakan zat warna
yang sering digunakan dalam pewarnaan sederhana, dimana MB dapat bekerja
dengan baik pada membran sel karena bersifat basa alkalin (komponen
kromofiknya bermuatan positif), sedangkan sitoplasma sel spermatozoa bersifat
basofilik (suka terhadap basa) sehingga terjadilah gaya tarik antara komponen
kromofor pada pewarna dengan sel spermatozoa. Hal tersebut menyebabkan sel
spermatozoa dapat menyerap pewarna dengan sel spermatozoa. Eosin digunakan

16

pada pewarnaan negatif yang merupakan pewarna asam dan memiliki komponen
kromofik yang bermuatan negatif, yang juga dimiliki oleh sitoplasma
spermatozoa. Sehingga pewarna tidak dapat menembus atau terpenetrasi ke dalam
sel spermatozoa karena muatan negatif pada permukaan sel spermatozoa.

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Pengembangan metode identifikasi kerusakan DNA spermatozoa ternak
domba dan kambing dapat dibuat menggunakan konsentrasi LMP-agarose 0.6%,
dengan lysis solution III (0.4 M Tris-HCl, 2 M NaCl, 1% SDS, 0.05 M EDTA, pH
7.5) dan diwarnai dengan menggunakan perbandingan pewarnaan Eosin Yellow
dan Methylene blue 2:1.
Saran
Perlu diteliti lebih lanjut konsentrasi LMP-agarose untuk menjebak
spermatozoa sapi yang lebih tepat

17

DAFTAR PUSTAKA
Aitken R, Krausz C. 2001. Oxidative stress DNA damage and the Y chromosome.
Reproduction. 122:497-506.
Aoki VW, Liu L, Jones KP, Hatasaka HH, Gibson M, Peterson CM, Carrell DT.
2006. Sperm protamine 1 protamine 2 ratios are related to in vitro
fertilization pregnancy rates and predictive of fertili