Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN
SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI
PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS
UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN
REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

SKRIPSI

RIAN HIDAYAT
NIM: 1111102000096

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
2015/1436H

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN

SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI
PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS
UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN
REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RIAN HIDAYAT
NIM: 1111102000096

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
2015/1436H

ABSTRAK

Nama
: Rian Hidayat

Program Studi : 1111102000096
Judul
: Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA
Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk
Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain
reaction)

Status kehalalan pada cangkang kapsul keras masih diragukan statusnya. Dari tiga ribu
jenis obat baru ada tiga produk yang memiliki sertifikat halal. Analisis cangkang kapsul
keras gelatin simulasi telah berhasil dilakukan dengan metode Real Time PCR. DNA
cangkang kapsul keras gelatin simulasi diekstrasi dan diisolasi menggunakan kit
komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS
1%. Hasil ekstraksi dan isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template
Preparation (Roche®) dihasilkan DNA genom simulasi cangkang kapsul keras gelatin
sapi dan babi dan kemurnian berurut-turut adalah antara 8,70 – 19,01 ng/µl dengan
kemurnian 1.169 – 1.851 dan 2.30 – 9.54 ng/µl dengan kemurnian 1.310 – 2.013
sementara dengan cell lysis buffer SDS 1% adalah 13.30 – 15.39 ng/µl dengan
kemurnian 1.345 – 1.424 dan 20, 53 – 36.99 ng/µl dengan kemurnian 1.276 – 1.299.
Nilai konsentrasi dan kemurnian DNA genom dianalis dengan statistik yaitu uji t
dengan nilai p = 0.936 (konsentrasi) dan p = 0.003 (kemurnian) sehingga tidak ada

perbedaan yang signifikan rata-rata konsentrasi dan ada perbedaan yang signifikan ratarata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR
Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%. Berdasarkan hasil
tersebut disimpulkan bahwa metode kit komersial High Pure PCR Tamplate
Praparation lebih unggul daripada metode cell lysis buffer SDS 1%.

Kata Kunci : Gelatin, Real Time PCR, , Kit komersial High Pure PCR Template
Preparation (Roche®), cell lysis buffer SDS 1%, Isolasi DNA, Kemurnian
DNA, Konsentrasi DNA

v
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT
Name
Major
Title

: Rian Hidayat
: Pharmacy
: Comparison of high Pure PCR Tamplate Preparation Kit and SDS

Method for Pig and Cow DNA Isolation from Hard Capsule Shell of
Gelatin for Halal Auntetication Use Real Time PCR (Polymerase
Chain Reaction)

Halal status on hard capsule shell has been hesitated it. Three of three thousand have
halal sertificate. Analysis of gelatin hard capsule shell was successfully done with Real
Time PCR method. DNA from gelatin hard capsule shell were extracted and isolated by
High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit and cell lysis buffer SDS 1%.
Result of extraction and isolation with High Pure PCR Template Preparation (Roche®)
kit from pig and cow gelatin hard capsule shell are approximately 8.70 – 19.01 ng/µl
(purity = 1.169 – 1.851) and 2.30 – 9.54 ng/µl (1.310 – 2.013) while with cell lysis
buffer SDS 1% are 13.30 – 15.39 ng/µl ( purity = 1.345 – 1.424) and 20, 53 – 36.99
ng/µl (purity = 1.276 – 1.299). DNA consentrations and purities value tested with
statistic were t test. P values concentration and purity are 0.936 and 0.003 so it is not
significance concentrations mean different and significance purity means both of them
methods. Based on result that High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit
method is the most better than cell lysis buffer SDS 1% method.

Keywords : Real Time PCR, gelatin, high pure PCR tamplate preparation, cell lysis
buffer SDS 1%, DNAconcentration, DNA purity

vi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan jalan
keluar bagi hamba Nya yang meminta jalan keluar. Atas rahmat Nya skripsi yang
berjudul “Perbandingan Dua Metode Isolasi DNA Babi dan Sapi dari Cangkang
Kapsul Keras Gelatin Simulasi untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time
PCR (Polymerase Chain Reaction)” ini berhasil penulis selesaikan. Sholawat beriring
salam semoga selalu tercurah limpah kepada baginda Rasulullah SAW, manusia terbaik
sepanjang zaman, teladan umat manusia menjalani kehidupan.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat ujian akhir guna
mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah
Jakarta. Rampungnya penelitian dan penulisan skripsi ini pastilah atas bantuan berbagai
pihak, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang
sedalam-dalamnya kepada :
1. Bapak Dr. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I dan Ibu Ofa Suzanthi Betha,
M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang sudah membimbing dan memberikan
ilmu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan
skripsi ini.
3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. dan Ibu Nely Suryani, Ph.D. Apt. selaku Ketua
Program Studi dan Sekretaris Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
4. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Sayat Hidayat dan ibunda Umi Sumiati yang
senantiasa ikhlas memberikan yang terbaik bagi putranya. Kakak-kakak dan
Adik-adik tercinta yang selalu memberikan keceriaan dan semangat bagi
penulis.
5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan
ilmu pengetahuan, bimbingan dan atau bantuan selama penulis menempuh
pendidikan farmasi di FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
6. Teman-teman Farmasi “Beng-beng” yang telah menjadi memori berkesan
selama penulis menuntut ilmu.
7. Teman-teman Pendidikan Dokter, Kesehatan Masyarakat, dan Keperawatan
yang sudah mengispirasi dan menghiasi suasana kampus FKIK.
8. Kakak-kakak laboran Farmasi (Kak Rachmadi, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi,
Kak Liken, Mbak Rani) yang telah membantu penulis dalam melakukan

penelitian di Labolatorium.
9. Pak Deka, Mbak Helen, Kak Ayu yang telah bersedia berbagi ilmunya dan
membantu penulis dalam penyelesaian penelitian RT PCR.

vii
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

10. Teman-teman seperjuangan Halal’s team (Kak Sulaiman, Kak Afifah, Kak
Yanti, dan Fathiyah) yang telah menginspirasi dan menjadi the best partners
dalam penelitian Real Time PCR.
11. Keluarga 3L (Liqoku, Liqomu, Liqota) Kak Sule, Kak Iyus, Suparman, Azmi,
Dendi dan Ali serta Sahabat-sahabat seperjuangan di jalan dakwah yang selalu
mendo’akan dimanapun dan kapanpun semoga Allah mempertemukan kita
dalam surga-Nya.
Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapat ganjaran terbaik di sisi
Allah SWT. Sekali lagi mohon maaf jikalau penulis hanya bisa memberikan ucapan
terima kasih yang sedalam-dalamnya. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi
pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi amal jariah bagi penulisnya. Amiin.

Jakarta, 29 Juni 2015

Penulis

viii
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman
HALAMAN JUDUL ..........................................................................................
HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ..............................................
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..............................................
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ..........................................................
ABSTRAK ..........................................................................................................
ABSTRACT .......................................................................................................
KATA PENGANTAR .......................................................................................
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ......................
DAFTAR ISI ......................................................................................................
DAFTAR GAMBAR .........................................................................................
DAFTAR TABEL ..............................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................

DAFTAR SINGKATAN ...................................................................................
DAFTAR ISTILAH ...........................................................................................
BAB 1. PENDAHULUAN .................................................................................
1.1. Latar Belakang .............................................................................
1.2. Rumusan Masalah ........................................................................
1.3. Tujuan Penelitian .........................................................................
1.4. Manfaat hasil Penelitian ...............................................................
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................
2.1. Gelatin .........................................................................................
2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin ...........................................
2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin ..............................
2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin .....................................
2.2. Kapsul ..........................................................................................
2.2.1 Cangkang Kapsul Keras .....................................................
2.3. Deoxyribonuckeat Acid (DNA) ...................................................
2.3.1 Struktur Kimia DNA ..........................................................
2.3.2 Sifat Fisika DNA ................................................................
2.3.3 DNAMitokondria ................................................................
2.4 Isolasi DNA ......................................................................................
2.5 Polymerase Chain reaction (PCR) ..............................................

2.5.1 Komponen PCR ..................................................................
2.5.2 Tahapan PCR ......................................................................
2.6 Real-Time PCR ............................................................................
BAB 3. METODE PENELITIAN ....................................................................
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................
3.1.1 Tempat ................................................................................
3.1.2 Waktu ..................................................................................
3.2. Alat dan Bahan ...........................................................................

i
ii
iii
iv
v
vi
vii
viii
ix
xii
xiii

xiv
xv
xvi
1
1
3
3
4
5
5
6
7
8
8
9
9
10
12
12
14
17
17
19
20
22
22
22
22
22

x
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.2.1 Alat .....................................................................................
3.2.2 Bahan ..................................................................................
3.3. Prosedur Kerja .............................................................................
3.3.1 Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi .................
3.3.2 Pembuatan Larutan Stok .....................................................
3.3.3 Preparasi Sampel ................................................................
3.3.4 Isolasi DNA ........................................................................
3.3.5 Pengukuran Kemurnian & Kuantitas DNA ........................
3.3.6 Amplifikasi DNA dengan Metode Real-Time PCR ...........
3.3.7 Analisi Statistik ...................................................................
BAB 4. HASI DAN PEMBAHASAN ...............................................................
4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cngkang Kapsul Keras Gela
tin Sapi dan Babi .............................................................................
4.2. Isolasi DNA .....................................................................................
4.2.1 Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Tamplate
Preparation (PCR) ................................................................
4.2.2 Isolasi DNA dengan Larutan Ekstraksi SDS 1% (Sodium
Dodecyl Sulphate) ..................................................................
4.2.3 Pengukuran Isolat DNA .........................................................
4.2.4 Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika .....
4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul
Keras Gelatin dengan Real Time PCR ............................................
4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang
Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Sapi .............
4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang
Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Babi .............
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................
5.1. Kesimpulan .....................................................................................
5.2. Saran ................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................

22
22
23
23
24
24
25
26
27
27
29
29
30
30
31
33
35
36
37
39
41
41
41
42

xi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1
Gambar 2.2
Gambar 2.3
Gambar 2.4
Gambar 2.5
Gambar 2.6
Gambar 2.7
Gambar 2.8
Gambar 4.1
Gambar 4.2
Gambar 4.3

Konversi Kolagen Menjadi Gelatin .............................................
Struktur Kimia Gelatin ................................................................
a. Ikatan 3’-5’ Fosfodiester ..........................................................
b. Rantai DNA yang Lebih Sedrhana ..........................................
Perbedaan struktur DNA dan RNA .............................................
Struktur Mitokondria ...................................................................
Struktur mtDNA ..........................................................................
Tahapan PCR ...............................................................................
Bentuk Kurva Real-Time PCR ....................................................
a. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Sapi Simulasi ......
b. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Babi Simulasi .....
Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul
Keras Gelatin pada Primer Sapi ...................................................
Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul
Keras Gelatin pada Primer Babi ..................................................

6
7
10
10
11
13
13
19
20
29
29
38
39

xii
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Urutan Basa Primer dan Probe ...............................................................
Tabel 2 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS .....................................
Tabel 3 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®) ....
Tabel 4 Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan Simulasi Menurut
Konsentrasi DNA ...................................................................................
Tabel 5 Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan Simulasi Menurut
Kemurnian DNA ....................................................................................

23
33
34
35
36

xiii
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.
Lampiran 2.
Lampiran 3.
Lampiran 4.

Kerangka Penelitian .....................................................................
Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ......
Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ........................
Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe serta Tm (Mel
Ting Temperature) Primer ...........................................................
Lampiran 5. Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure Pcr Tem
plate Preparation (Roche®) dan Campuran Reaksi Hydrolisis
Probe Mastermix .........................................................................
Lampiran 6. Gambar Presipitasi Protein ..........................................................
Lampiran 7. Hasil Analisis Nilai Konsentrasi dengan SPSS ...........................
Lampiran 8. Hasil Analisis Nilai Kemurnian dengan SPSS ............................
Lampiran 9. Bagan Metode Isolasi DNA .........................................................
Lampiran 10. Gambar Bahan-bahan yang Digunkan dalam penelitian .............
Lampiran 11. Gambar Alat-alatyang Digunakan dalam Penelitian ...................

47
48
49
51

52
53
54
57
60
64
65

xiv
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1

: Black Hole Quencher-1

BLAST

: Basic Logical Aligment Search Tool

bp

: Base pair

CP

: Crossing Point

cyt b

: Cytochorme b

dATP

: Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP

: Deoxycytidine Triphosphate

dGTP

: Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP

: Deoxyribonuleaside Triphosphate

dTTP

: Deoxythmidine Triphosphate

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

FAM

: Fluorescein Amidite

mtDNA

: mitochondrial Deoxyribonucleic Acid

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

NTC

: No Template Control

PCR

: Polymerase Chain Reaction

qPCR

: Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE

: Retikulum Endoplasma

RNA

: Ribonucleic Acid

Tm

: Temperature Melting

Ta

: Temperature Annealing

xv
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH
BLAST

; Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program untuk
menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNA atau protein)
dengan urutan basa DNA atau protein dari database NCBI

Blastn

: Nucleotide Blast atau bisa disebut blastn merupakan salah satu
fasilitas dari program BLAST untuk menganalisis kesejajaran
nukleotida yang dimasukan pada query dengan nukleotida pada
database NCBI

CP

: Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan awal
permulaan akumulasi amplikon telah memasuki peningkatan loglinear

Fit Point

: Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis threshold
dengan kurva amplifikasi

Garis Theshold

: Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat
sinyal Flourescent berada pada titik terendah

NCBI

: National Ccenter for Biotechnology Information merupakan
suatu institusi yang dimiliki United States National Library of
Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan
biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat diakses database
bioteknologi meliputi genebank, urutan basa DNA atau protein
juga publikasi-publikasi ilmiah

Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrument LightCycler 480
Maximum

: Dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifiaksi
mengalami kenaikan yang tajam

Query

: Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk
diketahui kesejajarannya dengan data yang tersedia

Tm

: Temperature Melting atau suhu lebar adalah saat dimana 50%
bagian DNA seolah terbuka menjadi untai tunggal

xvi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG
Islam mengatur umatnya dalam dua perkara, yaitu halal dan haram.
Halal adalah segala sesuatu yang diperbolehkan dalam syari’at Islam
sedangkan haram adalah kebalikan dari halal (Al-Qardhawi, 1997). Pada
hadist keenam dalam hadist Arba’in dijelaskan “Sesungguhnya yang halal itu
jelas dan yang haram itu jelas. Di antara keduanya terdapat perkara-perkara
yang syubhat (samar-samar) yang tidak diketahui oleh orang banyak. Maka
siapa yang takut terhadap syubhat berarti dia telah menyelamatkan
agamanya dan kehormatannya. Dan siapa yang terjerumus dalam perkara
syubhat maka akan terjerumus dalam perkara yang diharamkan…” Salah
satu perkara syubhat saat ini adalah sumber bahan baku cangkang kapsul
keras dengan alasan baru ada 3 produk kapsul yang bersertifikat halal dari 3
ribu jenis obat yang ada di Indonesia (LPPOM MUI). Angka tersebut masih
kecil dibanding dengan jumlah penduduk muslim Indonesia yang mencapai
85% (BPS dalam Vivikananda, 2014)
Perkara syubhat dalam cangkang kapsul keras terletak pada sumber
bahan bakunya, yaitu gelatin. Gelatin saat ini umumnya berasal dari kulit,
tulang sapi dan babi (GMIA, 2012) karena gelatin yang dihasilkan memiliki
kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan.
Keragu-raguan dalam memilih produk cangkang kapsul keras bertambah
dengan diketahuinya bahwa produsen gelatin dunia masih didominasi oleh
negara-negara non muslim (Eropa Barat, Kanada, dan Meksiko) (Jamaludin,
et al., 2012). Oleh karena itu, analisis untuk membedakan cangkang kapsul
keras yang bersumber dari gelatin perlu dilakukan.
Beberapa peneliti telah melakukan analisis terhadap cangkang kapsul
keras yang bersumber dari gelatin dengan cara membedakan komposisi asam
amino

menggunakan

metode

Fourier

1

Transform

Infrared

(FTIR)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2

Spectroscopy dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang
dikombinasikan dengan Principal Component Analysis (PCA), dan metode
SDS-PHAGE

(Sodium

Dodecyl

Sulphate

Poly

Acrilamide

Gel

Elektrophoresis) yang mampu mengidentifikasi fragmen gelatin hidrosilatnya
berdasarkan perbedaan bobot molekul (Saputra, 2014 & Syafiqoh, 2014).
Namun, metode ini belum bisa memberikan hasil yang maksimal dikarenakan
protein tidak stabil dalam suhu panas sehingga hasil yang didapatkan akan
berbeda-beda.
Pendeteksian gelatin babi dan gelatin sapi telah berhasil dilakukan
oleh Demirhan., et al (2011), Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015)
dengan mengidentifikasi DNA pada standar gelatin sapi dan babi dan produk
gelatin (marsmallows, gums drops, dan beberapa makanan orang turki)
dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction ). Analisis
menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) membutuhkan
DNA genom yang berkualitas baik secara jumlah maupun kemurnian. Gelatin
merupakan bahan olahan begitu pula cangkang kapsul keras gelatin yang
kemungkinan jumlah DNA relatif sedikit akibat adanya pengolahan
sebelumnya (Demirham, et al., 2011) sehingga diperlukan metode isolasi
DNA yang lebih unggul dari segi konsentrasi DNA genom yang didapat,
tingkat kemurnian yang tinggi, efisiensi waktu pengerjaan, keamanan dan
ekonomis.
Pada penelitian Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015) metode
ekstraksi gelatin yang digunakan adalah kit komersial High Pure PCR
Template Preparation (Roche®). Konsentrasi DNA genom yang didapatkan
masih sedikit dan dengan tingkat kemurniaan yang belum masuk dalam
kemurnian ideal terbukti tidak terbentuknya pita pada gel agarose. Namun,
DNA genom yang didapatkan dapat teramplifikasi pada Real-Time PCR
(Polyemerase Chain Reaction).
Metode ekstraksi lain (konvensional) yang sering digunkan dalam
analisis Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) adalah cell lysis
buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). DNA genom yang didapatkan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3

mampu terdeteksi oleh gel agarose tetapi penggunaan metode ini masih
terbatas dalam bentuk jaringan utuh (daging) dan olahannya (Rahmawati,
2012 & Mulyana, 2010). Oleh karena itu, penelitian selanjutnya akan
dilakukan pendeteksian gelatin sapi dan babi pada simulasi cangkang kapsul
keras dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) dengan metode
ekstraksi menggunakan kit (High Pure PCR Template Preparation (Roche®))
dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode yang paling cocok
untuk isolasi DNA antara kit (High Pure PCR Template Preparation
(Roche®)) dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang
akan diamplifikasi

menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain

Reaction) dengan gen spesifik mitokondria sitokrom b Sapi dan Babi.
1.2 RUMUSAN MASALAH
1. Bagaimanakah perbandingan metode isolasi DNA dengan kit komersial
High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS
1% dalam mengisolasi DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras
berbahan gelatin babi dan gelatin sapi terhadap DNA genom yang
dihasilkan?
2. Apakah DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan
gelatin babi dan gelatin sapi yang diisolasi dengan kit komersial High
Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%
dapat teramplifikasi dengan RT-PCR?
1.3 TUJUAN PENELITIAN
1. Mengetahui perbandingan DNA genom yang dihasilkan dari simulasi
cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan
metode isolasi DNA menggunakan kit komersial High Pure PCR
Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%
2. Menentukan kondisi optimal amplifikasi DNA genom dari cangkang
kapsul keras simulasi berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan
primer sapi dan primer babi pada RT-PCR

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4

1.4 MANFAAT PENELITIAN
Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi metode
isolasi DNA babi dan DNA sapi dari cangkang kapsul keras simulasi
berbahan gelatin sapi dan gelatin babi sehingga dapat dijadikan referensi
dalam mendeteksi status kehalalan produk cangkang kapsul yang berbahan
gelatin.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin
Gelatin merupakan suatu biopolymer yang dihasilkan dari hidrolisis
kolagen yang umumnya berasal dari kingdom hewan dan sebagian besar
penyusunnya adalah protein. (Bailey dan Paul, 1998). Kata gelatin sendiri
berasal dari Bahasa latin yaitu “gelare” yang artinya membuat beku dan
merupakan senyawa yang tidak terjadi secara alamiah (Glicksman, 1969).
Sifat gelatin yang dapat membeku (gelling agent) dan mengental (thickening
agent) menjadi keberadaanya sangat luas terutama dalam produk makanan
(Mariod dan Adam, 2013).
Kolagen merupakan bahan utama dalam pembentukan gelatin yang
sumbernya bisa dari hewan mamalia seperti tulang sapi dan kulit babi maupun
ikan dan serangga (Mariod dan Adam, 2013). Kolagen akan menjadi gelatin
dengan bantuan asam atau basa dan pemanasan yang bertujuan untuk
memutuskan ikatan hydrogen dari molekul tropokolagen sehingga rantairantainya terpisah dan strukturnya rusak (Setiawati, 2009).
Perubahan kolagen menjadi gelatin dan gelatin menjadi gel dipengaruhi
oleh konsentrasi dan suhu seperti yang disajikan pada gambar 2.1. Menurut
Belitz dan Grosch (1999) gelatin akan terbentuk apabila kolagen dipanaskan
dengan suhu di atas suhu pengerutnya (T>Ts) di mana suhu pengerut (Ts)
untuk kolagen dari kulit mamalia berkisar antara 60-650 C sehingga ikatan
silang dari rantai triple helix pada kolagen akan terputus dalam jumlah yang
sangat besar dan struktur kolagen akan terpisah menjadi gulungan (coils)
secara acak yang larut dalam air. Pada saat konsentrasi rendah (C1), struktur
intramolekuler gelatin akan membentuk untaian/ikatan-ikatan tunggal (singlestrands). Namun, untuk kembali ke kondisi semula (pada kolagen) pada saat
konsentrasi tinggi (C2) dan proses pendinginan berjalan lambat (ΔT1), apabila
proses berjalan cepat, maka akan dihasilakan segmen-segmen helix dengan
ikatan-ikatan secara acak pada setiap struktur gulungannya (coils).

5

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6

Gambar 2.1 Konversi kolagen menjadi gelatin (sumber : Belitz dan Grosch, 1999 dalam
Hasan, 2007)

Berdasarkan perlakuan pada saat pembuatan, gelatin dibedakan menjadi
dua perlakuan yaitu dengan asam atau basa. Gelatin dengan asam disebut
gelatin tipe A dan dengan basa disebut gelatin tipe B. Gelatin tipe A memiliki
titik isoelektrik

pada pH 7-9 dan umumnya

diperoleh dari kulit babi.

Sedangkan gelatin tipe B memiliki titik isoelektrik pada pH 4.8 – 5.2 dan
biasanya diperuntukan untuk bahan yang keras dan liat seperti kulit sapi
(Poppe, 1992).
2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin
Gelatin memiliki bentuk flakes, granul, maupun serbuk dengan
warna kuning, tidak berbau, dan tidak berasa. Gelatin larut dalam
gliserin dan air hangat (>300 C). Gelatin praktis tidak larut dalam
kloroform, etanol (95%), aseton, eter, dan methanol. Gelatin kering
stabil di udara dan dalam bentuk larutan dalam air juga stabil dalam
waktu lama jika disimpan di bawah kondisi sejuk tapi dapat terjadi
degradasi oleh bakteri (Rowe, Sheskey dan Owen, 2006). Namun,
menurut Montero, et al (2000), pemanasan yang dilarutkan untuk
melarutkan gelatin sekurang-kurangnya 490 C atau biasanya pada suhu
60-700 C. Pada temperature yang tinggi (di atas 500 C ), larutan gelatin
dapat terjadi depolimerisasi dan reduksi kekuatan gel. Kondisi ini akan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7

lebih cepat pada suhu 650 C dan kekuatan gel dapat berkurang setengah
kali semula ketika dipanaskan pada suhu 800 C selama 1 jam (Rowe,
Sheskey dan Owen, 2006).
Protein merupakan kandungan tertinggi pada gelatin, tetapi kadar
lemaknya rendah. Gelatin kering dengan kadar air 8-12% mengandung
protein sekitar 84% - 86%, lemak dan vitamin hampir tidak ada (Carr et
al, 1995). Bobot molekul gelatin termasuk tinggi sekitar 20.000 g/mol
sampai

250.000 g/mol (Fatimah, 2012). Adanya

perbedaan bobot

molekul tersebut ini memberikan dampak pada kekuatan gel yang
dihasilkan. Semakin tinggi bobot molekul gelatin semakin tinggi bloom
(kekuatan gel) yang dihasilkan (Rabadiya, 2013). Kekuatan gel dapat
ditentukan dengan menggunakan metode Gomez-Guillen et al (2010)
dengan menggunakan analisis Tekstur Model TA-TX2 (Balti et al.,
2010).
2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin
Sebagian besar kandungan gelatin adalah protein yang disusun
dari beberapa asam amino. Komposisi asam amino gelatin bervariasi
tergantung dari sumber kolagen, spesies hewan penghasil, dan jenis
kolagen (Setiawati, 2009).

Menurut Grobben et al., (2004) dalam

Fatimah, (2009) gelatin terdiri dari 18 asam amino yang saling terikat
oleh ikatan peptida dan sebagian besar penyusunnya adalah glisin dan
prolin berturut-turut mencapai 30,5% dan 14,8% - 18%.

Glisin

Prolin

Y

Glisin

X Hidroksiprolin

Gambar 2.2. Struktur kimia gelatin (sumber: Poppe, 1992 dalam Setiawati, 2009)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

8

Senyawa gelatin merupakan suatu polimer linier yang tersusun
oleh satuan terulang asam amino yaitu glisin-prolin-glisin dan glisinprolin-hidroksiprolin yang bergabung membentuk rangkaian polipeptida.
Seperti yang tunjukkan pada gambar 2.2 bahwa susunan asam amino
gelatin merupakan triplet peptide, yaitu glisin-X-Y, dimana X umumnya
adalah asam amino prolin dan Y umumnya adalah asam amino
hidroksiprolin. (Viro, 1992).
2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin
Dalam produk pangan, gelatin menjadi bahan tambahan yang
sering digunakan baik sebagai pengental, penstabil, pengikat, dan
pengemulsi. Gelatin yang dicampurkan bervariasi mulai dari 0.015% 9% tergantung fungsi keberadaannya dalam bahan campuran. Adapun
produk pangan berbahan gelatin adalah jelly, marshmallows, gummy,
wafer, dan cokelat. Selain digunakan dalam industri pangan, gelatin juga
sering digunakan dalam industri fotografi, industri farmasi, dan produk
kedokteran seperti cangkang kapsul keras dan lunak, pengikat pada
tablet, suppositoria,

gelatin sponge, dan pengganti plasma (GMIA,

2012).
Beberapa tahun terakhir fungsi penting gelatin lainnya telah
diidentifikasi

dan dikembangkan.

Kemampuan gelatin yang mirip

dengan lemak terutama teksturnya, menempatkan gelatin sebagai
pengganti lemak pada beberapa aplikasi. Salah satu kelompok produk
utama dimana sifat ini digunakan adalah margarin makan rendah lemak
(Tahmid, 2005).
2.2 Kapsul
Bahan utama dalam pembuatan cangkang kapsul keras yaitu gelatin, air,
gula. Pewarna biasanya ditambahkan untuk membuat kapsul menjadi lebih
menarik dan khas. Selain itu, penambahan titan oksida juga diperlukan untuk
membuat cangkang menjadi tidak transparan dan tidak tembus cahaya.
Berdasarkan elastisitas dan komponen pembentuknya, kapsul dapat dibagi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

9

menjadi dua kategori, yaitu kapsul keras (dua cangang) dan kapsul lunak (satu
cangkang) (Ansel, 2005 & Rabadiya, 2013).
Cangkang kapsul umumnya tidak berbau dan tidak berasa. Cangkang
kapsul gelatin dapat dibuat dengan berbagai ukuran dengan panjang dan
diameter yang bervariasi. Pemilihan ukuran tergantung pada berapa banyak isi
bahan yang akan dimasukkan ke dalam kapsul dan dibandingkan dengan
kapasitas isi dari cangkang kapsul. Karena kepadatan dan penekanan dari
serbuk atau campuran serbuk akan menentukan berapa jumlah yang dapat
ditampung dalam kapsul dan karena tiap bahan mempunyai sifat tersendiri,
maka tidak ada pengaturan yang ketat untuk menentukan ukuran kapsul yang
tepat. Untuk diberikan kepada manusia, cangkang kapsul kosong berkisar dari
000 yang terbesar sampai no. 5 yang terkecil (Ansel, 2005)
2.2.1 Cangkang Kapsul Keras
Cangkang kapsul keras gelatin harus dibuat dalam dua bagian,
yaitu badan kapsul

dan penutupnya

yang biasanya lebih pendek.

Biasanya kapsul dikategorikan sebagai kapsul keras atau lembut
dipengaruhi oleh keberadaan plasticizer seperti gliserol yang dapat
membuat kapsul lembut dan elastis. Kapsul keras dikatakan ideal jika
memiliki kekuatan elastisitas permukaan 200-300 bloom; viskositas (600
C / 6-23%b/b dalam air) 44-60 MP; pH 4,5-6.5 (Rabadiya, 2013).
2.3 Deoxyribonucleat Acid (DNA)
Asam nukleat adalah suatu molekul polimerik yang hanya terdiri dari
empat jenis unit monomerik, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam
ribonukleat (RNA) yang berfungsi menyimpan dan menransmisikan informasi
genetik dalam sel (Champe, et al., 2011; Koolman & Roehm, 2005; dan
Murray, et al., 2012). DNA tidak hanya terdapat pada kromosom di nukleus
organisme eukariot, tetapi juga di mitokondria dan kloroplas tumbuhan.
Namun, pada organisme
mempunyai

prokariot, yang tidak mempunyai nukleus,

satu kromosom

tetapi dapat pula mengandung DNA

nonkromosom dalam bentuk plasmid (Champe, et al., 2011). DNA berperan
dalam sintesisi RNA (transkripsi) yang bertujuan untuk sintesis protein dalam
sitoplasma (Stansfield et al., 2003 dalam Izzah, 2014).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

10

2.3.1 Struktur Kimia DNA
Setiap nukleotida tersusun oleh tiga komponen, yaitu molekul gula
pentosa (deoxyribose untuk DNA dan ribose untuk RNA), gugus fosfat,
dan basa nitrogen. Semua nukleotida memiliki gula pentose dan gugus
fosfat dengan susunan dan bentuk yang identik, sedangkan untuk
penyusun basa nitrogen mempunyai susunan dan bentuk yang berbeda
dari satu nukleotida dengan satu nukleotida yang lainnya. Menurut
molekulnya, basa nitrogen dibagi dua, yaitu basa purin (Adenin dan
guanin) dan basa pirimidin (cytosin, uracyl, dan thimin). Pada DNA
penyusun basa pirimidin adalah sitosin dan timin, sedangkan pada RNA,
yaitu sitosin dan urasil. Basa-basa tersebut berpasangan satu sama lain,
yaitu pada DNA basa guanine berpasangan dengan basa sitosin
membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan basa adenine berpasangan
dengan basa timin (pada RNA dengan urasil) membentuk dua ikatan
hidrogen. Sehingga jumlah dari masing-masing basa baik purin maupun
pirimidin akan selalu sama dalam molekul DNA (Muladno, 2010 dan
Purves et al., 2004).

a

b

Gambar 2.3 a. Ikatan 3’ – 5’ fosfodiester,
b. Rantai DNA yang lebih sederhana (sumber: Champe, et al., 2011)

DNA merupakan poli-deoksiribonukleat yang mengandung
banyak mono-deoksiribonukleat yang dihubungkan secara kovalen
melalui ikatan 3’-5’-fosfodiester. Ikatan fosfodiester menghubungkan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

11

gugus 5’-hidroksil deoksipentosa pada satu nukleotida dengan gugus 3’hidroksil deoksipentosa yang berdekatan melalui gugus fosfat (gambar
2.3).
Rantai panjang ini dengan ujung -5’ (ujung dengan fosfat bebas)
dan ujung -3’ (ujung dengan hidroksil bebas) yang tidak melekat pada
nukleotida lain. Urutan basa DNA yang diperlihatkan pada gambar 2.3
dibaca “timin, adenine, sitosin,

guanin” (5’-TACG-3’). Ikatan

fosfodiester antara nukleotida (di DNA atau RNA) dapat diuraikan
secara hidrolisis oleh bahan kimia, atau dihidrolisis secara enzimatik
oleh famili nuklease: deoksiribonuklease untuk DNA dan ribonuklease
untuk RNA (Champe, et al., 2011). Selain dari basa pirimidin (timin
pada DNA dan urasil pada RNA) perbedaan antara DNA dan RNA
lainnya adalah pada DNA untaiannya berbentuk double helix (untai
ganda) sedangkan pada RNA single helix (untai tunggal) seperti pada
gambar 2.4.

Gambar 2.4 Perbedaan struktur DNA dan RNA
(sumber: National Human Research Institute)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

12

Satuan panjang molekul DNA adalah pasang basa (pb). Satuan ini
adalah unit ukuran panjang

terkecil. Apabila molekul DNA hanya

berbentuk serangkaian nukleotida tunggal (tidak berpasangan ), maka unit
satuannya basa (b) dan bukan pasang basa (pb) (Muladno, 2010).
2.3.2 Sifat Fisika DNA
Struktur untai ganda DNA dapat dipisahkan (dicairkan) menjadi
dua untai komponen dalam larutan dengan cara meningkatkan suhu
(>900 C) atau

menurunkan konsentrasi garam. Akibatnya kedua

tumpukan basa tidak saling menjauh, tetapi tumpukan basa-basa itu
sendiri terurai meskipun masih berada dalam bentuk polimer karena
adanya jembatan fosfodiester. Karena penumpukan basa dan ikatan
hidrogen antar tumpukan, molekul DNA untai-ganda bersifat seperti
batang yang kaku dan dalam larutan, DNA berbentuk seperti material
kental yang akan kehilangan kekentalannya jika mengalami denaturasi.
(Murray, et al., 2012). Denaturasi DNA bersifat reversible dimana
proses renaturasi (pembentukan kembali

struktur untai ganda dari

keadaan terdenaturasi) dapat berjalan apabila suhu mendekati 600 C
(Yuwono, 2009).
2.3.3 DNA Mitokondria
DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda
yang berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan
ukurannya relative sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom
intinya (Susmiarsih, 2010 dan Solihin, 1994). DNA mitokondria
merupakan DNA yang ada di Mitokondria yang berperan dalam sintesis
protein (Koolman, et al., 1994). Mitokondria adalah organel yang
terletak di dalam sitoplasma eukariota (gambar 2.5) yang diselaputi oleh
dua membrane dan dua kompartemen, yaitu membran dalam dan
membran luar, matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh
membrane dalam) dan ruang antar membran (Susmiarsih, 2010).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

13

Gambar 2.5

Struktur Mitokondria (sumber : Susmiarsih, 2010)

Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA
hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama (gambar 2.6), yakni
terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3,
URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I,
Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom Oxidase unit III, Cytochrom b
dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen menyandikan rRNA
(12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa daerah lain
yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah
intergenic (Moritz et al, 1987 dan Solihin, 1994).

Gambar 2.6 Sturktur mtDNA (Andaman, 1992 dalam Pratami, 2011)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

14

DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam
keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu
meng-copy diri dalam

jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah

diisolasi dan dipurifikasi), ukuran yang relative kecil sekitar 14 kb
sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh,
dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 5-10 kali lebih cepat dari
DNA inti (Hartati et al.,2004 dan Solihin, 1994).
2.4 Isolasi DNA
Analisis molekular merupakan suatu metode analisis yang lingkup
pengerjaanya sampai ke tahap molekul seperti analisis asam nukleat dan
protein. Salah satu analisis molekular adalah metode PCR (Polymerase Chain
Reaction) yang dalam tahapannya ada proses isolasi DNA. Isolasi DNA
adalah proses pemisahan DNA dari komponen-komponen

penyusun sel

lainnya. Proses ini melibatkan penghancuran membran sel (lisis), pemisahan
DNA dari protein, dan pemurnian (purifikasi) DNA (Muladno, 2010).
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan
tahapan awal dari isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel
(Holme dan Hazel, 1998). Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan
memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim dan dikombinasikan dengan
EDTA (Etilendiamin tetraasetat), SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), sarkosil
dan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Muladno, 2010 dan
Subandiyah, 2006).
Menurut Giacomazzi et al (2005) ada beberapa cara yang dapat
digunakan untuk menghancurkan sel atau jaringan, yaitu dengan cara fisik
seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam
nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi.
Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.
Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen
yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi
membran sel (Surzycki, 2000).

Sementara cara

enzimatik seperti

menggunakan proteinase K bertujuan untuk melisiskan membran pada sel

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

15

darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun
rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki, 2000).
SDS merupakan deterjen kationik yang mampu melarutkan komponen
lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada
membran sel sehingga merusak struktur membran sel (Kesmen et al., 2009;
Maftuchah & Zainudin, 2006; Malisa et al., 2006). Metode isolasi dengan
SDS lebih dikenal dengan metode fenol-kloroform. Buffer lisis metode ini
biasanya terdiri atas EDTA, Tris HCL, NACL, dan SDS (Utami, et al., 2012).
Setelah struktur sel rusak, komponen-komponen yang ada di dalamnya, yaitu
RNA, DNA, lipid, dan karbohidrat akan keluar (Dale & Malcom, 2002).
Penggunaan EDTA dalam proses lisis berfungsi untuk melindungi
DNA dari aktivitas endogenous nucleases karena EDTA ini merupakan agen
pengkelat ion yang dibutuhkan sebagai kofaktor sebagian besar nucleases
dengan cara mengikat kation divalen (Muladno, 2010; Dale & Malcom, 2002;
Chawla, 2003). Kation divalen merupakan aktivator bagi DNAse yang dapat
memutuskan ikatan fosfodiester pada DNA sehingga dengan pengikatan
kation divalen oleh EDTA dapat menghambat aktivitas DNAse (Saili, 2006;
Weir, 1993; Muladno, 2010; Wilson & Walker, 2005 dalam Rahmawati,
2012 ). Selain EDTA dan SDS ada juga deterjen yang sifatnya sama untuk
menghancurkan membran sel, yaitu CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide). CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan
membran plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB
adalah detergen yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi
dengan DNA ketika konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M.. Presipitasi DNA dari
buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan
massa bergelatin yang komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya
terlihat

jelas dalam

massa tersebut,

tetapi sulit untuk memisahkannya,

sehingga untuk menghindari terbentuknya massa ini digunakan presipitasi
yang tidak menggunakan alkohol (Chawla, 2003). Setelah penambahan bufer
lisis larutan diinkubasi dan proses lisis berakhir dengan pemisahan komponenkomponen hasil lisis dengan cara sentrifugasi (Muladno, 2010).

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

16

Tahapan isolasi DNA yang kedua adalah pemisahan DNA dengan
protein dengan cara penambahan fenol (mengikat protein dan sebagian kecil
RNA), kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan) dan
RNAse (Muladno, 2010 & Utami, 2012). Selain ketiga bahan kimia tersebut
ada pula dalam proses ini menambahkan isoamil alkohol (kloroform:isoamil
alkohol 24:1). Adanya isoamil alkohol bertujuan untuk mengurangi
pembentukan busa (anti foaming agent) (Marmur, 1961 & Restu et al., 2012).
Pada tahapan selanjutnya adalah purifikasi yang sebelumnya dilakukan proses
presipitasi DNA dengan penambahan garam (NaCl) dengan konsentrasi tinggi
sehingga dapat mengendapkan protein dikarenakan adanya proses salting out
(Kurniati, 2009). Pada salting out terjadi kompetisi antara protein dan garam
dalam menghidrasi dalam proses solvasi, sehingga protein dapat mengendap
(Plummer, 1971).
Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, metode isolasi
DNA dapat dilakukan dengan waktu pengerjaan yang lebih efisien. Hal ini
dikarenakan kegiatan preparasi larutan yang mendukung kerja isolasi dapat
diminimalkan atau tidak dilakukan. Salah satu pengembangan teknik isolasi
DNA, yaitu dengan penggunaan kit komersial yang semua larutannya sudah
tersedia dalam satu paket dengan pertimbangan untuk penggunaan beberapa
kali reaksi.
Pengukuran jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan dengan
mengukur melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi
sinar ultraviolet

yang diserap

oleh nukleotida dan protein

dalam

larutan.penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada
panjang gelombang 260nm, sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang
gelombang 280nm. Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm
(A260/A280) dapat memberikan validasi kemurnian DNA. Nilai rasio 1,8 – 2,0
menunjukkan sampel DNA yang murni (Muladno, 2010). Nilai rasio yang
lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein (Teare et al.,
1997; Gallagher, 1989), sedangkan nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan
adanya kontaminasi RNA.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

17

2.5 Polymerase Chain Reaction PCR
PCR

(Polymerase

Chain

Reaction)

merupakan

suatu

teknik

perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida melalui bantuan
enzim dalam suatu thermocycler (Gaffar, S., 2007; Muladno, 2010; &
Sulistyaningsih, 2007). Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai
ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada
sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah
target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak
rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase. Untuk
dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs
yang mencakup dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP (Muladno, 2010).
Menurut Gaffar (2007), PCR melibatkan banyak siklus yang masingmasing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai
DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan
pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh
DNA polymerase.
Keunggulan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan basa
nukleotida ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa
nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n
siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama
pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya
pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target
(Fatchiyah, 2008 dalam widiastika).
2.5.1 Komponen PCR
Ada 5 komponen penting dalam reaksi PCR, yaitu DNA
target/tamplate,

sepasang

primer,

enzim

Taq

Polymerase,

deoxynucleoside triphosphate (dNTP), dan larutan buffer PCR (Gaffar,
2007 dan Muladno, 2010).
1. DNA Template

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

18

Dalam proses PCR, DNA template berfungsi sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama atau molekul
DNA yang menjadi sekuen target yang akan diamplifikasi dan
biasanya berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen
DNA yang mengandung fragmen DNA target yang dituju.
Keberhasilan PCR tergantung dari ada atau tidaknya sekuen yang
sama dengan primer.
2. Primer
Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
untuk proses eksistensi DNA. Pasangan primer terdiri dari 2
oligonukleotida yang

mengandung 16 – 30 nukleotida dan

mempunyai 40 – 60 % basa G-C content. Sekuen primer kurang dari
16 basa dapat memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Untuk
ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming
(penempelan primer pada situs non-target) tinggi, ini akan
menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang
nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR.
3. dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates)
Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block
DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan
menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk
untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. dNTPs
merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin
trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin
trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).
4. Buffer PCR dan MgCl2
Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium
karena reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu.
Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut
berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

19

berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2
akan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA.
5. Enzim DNA Polimerase
Enzim DNA polymerase berfungsi sebagai katalisis untuk
reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan
untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan
pada proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik
oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 950
C. Aktivitas polymerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari
m