Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah Piper crocatum terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase
AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper
crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA
(MDA) DAN ENZIM TIROSINASE
MUSTIKA WENI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas
Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Pembentukan
Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2014
Mustika Weni
NIM G84100047
ABSTRAK
MUSTIKA WENI. Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper
crocatum) terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.
Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SYAEFUDIN.
Daun sirih merah (Piper crocatum) berkhasiat sebagai tanaman obat.
Tanaman tersebut memiliki kandungan senyawa yang berperan sebagai
antioksidan. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidasi dan
penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah. Proses ekstraksi dilakukan
secara terpisah menggunakan pelarut etanol dan n-heksana. Penentuan aktivitas
antioksidan menggunakan metode Thiobarbituric acid (TBA), sedangkan
penghambatan tirosinase menggunakan metode Microplate Reader. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah konsentrasi 200 ppm
memiliki daya hambat pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05)
dengan vitamin E, ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat
pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05) dengan vitamin E.
Aktivitas penghambatan tirosinase menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah
memiliki nilai IC50 sebesar 1655 ppm sedangkan ekstrak n-heksana sirih merah
memiliki nilai IC50 sebesar 3090.56 ppm. Ekstrak etanol sirih merah memiliki
kemampuan menghambat MDA dan enzim tirosinase lebih tinggi dibandingkan
ekstrak n-heksana sirih merah.
Kata kunci : Aktivitas antioksidasi, Enzim tirosinase, Piper crocatum
ABSTRACT
MUSTIKA WENI. Inhibitory Activity of Piper crocatum Extract to
Malondialdehida Formation and Tyrosinase Activity. Supervised by MEGA
SAFITHRI and SYAEFUDIN.
Piper crocatum leave bark is a medicinal plant. It contains antioxidant
compounds. The objectives of this research was to determine the antioxidant
activity and inhibitory activity to tyrosinase of P. crocatum extract. Extraction
process of Piper crocatum was conducted separately by using the solvent ethanol
70% and n-hexane. Determination of antioxidant activity was conducted with
Thiobarbituric acid method (TBA) and for tyrosinase inhibitory activity using
microplate reader. The results showed that the ethanol extract at concentration of
200 ppm higher (α>0.05), inhibitory effects than vitamin E on the formation
malondialdehida. n-hexane extract at concentration of 200 ppm higher (α>0.05).
Tyrosinase inhibition activity test showed the ethanol extract has IC50 1655 ppm,
n-hexane extract has IC50 3090.56 ppm. Ethanol extract has inhibitory MDA and
enzyme tyrosinase than n-hexane extract.
Keywords : Antioxidative activity, Tyrosinase, Piper crocatum
AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper
crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA (MDA)
DAN ENZIM TIROSINASE
MUSTIKA WENI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
Pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
Judul Skripsi : Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah Piper crocatum
terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim
Tirosinase
Nama
: Mustika Weni
NIM
: G84100047
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri,SSi MSi
Pembimbing I
Syaefudin, SSi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 hingga April 2014 ini
adalah Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap
Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Mega Safithri, SSi MSi dan
Syaefudin, SSi MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan
pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada
Ibu Meri, Ibu Tini beserta seluruh staf Laboran Biokimia yang telah membantu
selama penelitian berlangsung. Terima kasih juga disampaikan kepada mba Leli
dan seluruh staf Pusat Studi Biofarmaka (PSB) yang telah banyak membantu
selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk
segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Mustika Weni
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
vi
vi
vi
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
Pengeringan Bahan Uji
3
Penetapan Kadar Air Metode Oven
4
Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum)
4
Rendemen
4
Analisis Fitokimia
4
Uji Aktifitas Antioksidan Metode TBA-MDA
5
Uji Inhibitor Tirosinase
6
HASIL
7
Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah
7
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
7
Aktivitas Antioksidasi terhadap Penghambatan Malondialdehida (MDA)
7
Penentuan Penghambatan Enzim Tirosinase pada Ekstrak Etanol 70% dan nHeksana
8
PEMBAHASAN
Pembuatan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
9
9
11
Potensi Antioksidan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
terhadap Penghambatan MDA
11
Penentuan Penghambatan (IC50) Ekstrak Etanol 70% dan Ekstrak n-Heksana
Sirih Merah terhadap Enzim Tirosinase
14
SIMPULAN DAN SARAN
15
Simpulan
15
Saran
15
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
19
DAFTAR GAMBAR
1 Aktivitas antioksidan dengan metode TBA ekstrak daun sirih merah
2 Aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah
3 Kurva kadar MDA terhadap waktu
8
9
12
DAFTAR TABEL
1
2
Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah
Metabolit sekunder ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih
merah
7
7
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Tahapan umum penelitian
Ekstraksi daun sirih merah
Pengujian fitokimia
Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat
Analisis aktivitas antioksidan dari metode TBA
Kadar air simplisia daun sirih merah
Rendemen simplisia daun sirih merah
Rendemen simplisia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Grafik hubungan antara konsentrasi inhibitor ekstrak etanol 70% dan
ekstrak n-heksana terhadap persen inhibisi
Fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Hasil absorbansi kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)
Kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)
Absorbansi inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu
Aktivitas antoksidan ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun
sirih merah metode TBA
Analisis perhitungan IC50 difenolase ekstrak etanol 70% dan ekstrak
n-heksana daun sirih merah
Analisis stastistika terhadap penghambatan MDA
Analisis stastistika terhadap penghambatan enzim tirosinase
20
20
20
20
21
22
22
22
22
23
23
24
24
24
25
25
26
PENDAHULUAN
Kulit merupakan organ terbesar dan terluar tubuh manusia. Kulit langsung
terkena prooksida dari lingkungan, seperti radiasi ultraviolet (UV), obat-obatan
dan polusi udara. Selain pemicu eksternal serangan oksidatif, kulit juga harus
menghadapi endogen spesies oksigen reaktif (ROS) dan radikal bebas lainnya,
yang terus-menerus diproduksi selama metabolisme. Keseimbangan antara
oksidan dan antioksidan diperlukan untuk meminimalkan kerusakan jaringan.
Namun, jika keseimbangan ini terganggu stres oksidatif dapat terjadi dan hasilnya
adalah kerusakan oksidatif. Spesies oksigen reaktif (ROS) diketahui menyebabkan
modifikasi oksidatif DNA, protein dan lipid (Kang et al. 2005). Dalam mengatasi
bahaya yang timbul akibat radikal bebas, tubuh mengembangkan mekanisme
perlindungan untuk mencegah pembentukan radikal bebas dan peroksidasi lipid,
termasuk pada kulit. Berbagai kompartemen kulit (epidermis, dermis, subkutis)
dilengkapi dengan sistem antioksidan spesifik untuk mempertahankan
keseimbangan antara ROS dan antioksidan, sehingga dapat mencegah stres
oksidatif (Thiele dan Ekanayake-Mudiyanselage 2007).
Melanin pada epidermis berfungsi sebagai kromofor endogen yang akan
menyerap sinar matahari sehingga dianggap sebagai pelindung dampak buruk dari
sinar matahari. Melanin akan menyerap sinar matahari kemudian terjadi proses
fotokimiawi yang merubah molekul-molekul yang stabil menjadi molekul yang
sangat reaktif. Hasil reaksi fotokimiawi dikenal sebagai photo product antara lain
ROS (reactive oxygen species) seperti oksigen singlet, anion superaktif dan
radikal hidroksil. ROS yang terbentuk ini akan memicu kerja tirosinase dan
berakhir dengan sintesis melanin. Produksi melanin secara berlebihan dapat
mengarah pada terjadinya penumpukan melanin di lapisan epidermal
(hiperpigmentasi) dan menyebabkan kulit menjadi lebih gelap. Tirosinase
merupakan enzim yang berfungsi mengatur biosintesis melanin. Enzim tirosinase
bekerja mengubah tirosin menjadi DOPA dan kemudian menjadi dopakuinon
yang selanjutnya melalui beberapa tahap transformasi dikonversi menjadi melanin
(Fitrie 2004). Fungsi antioksidan berperan sebagai ROS scavenger sehingga
mengurangi hiperpigmentasi (Momtaz et al. 2008). Antioksida seperti flavonoid
juga diduga berperan sebagai inhibitor kompetitif enzim tirosinase karena struktur
dari flavonoid yang mirip dengan DOPA sebagai substrat (Chang 2009).
Senyawa antioksidan yang berperan sebagai penghambat pembentukan
melanin dapat diperoleh dari senyawa sintetik ataupun dari bahan alam. Senyawa
yang sering ditemukan dalam bahan kosmetik sebagai pencegah terbentuknya
melanin antara lain asam askorbat, arbutin, asam kojat, merkuri dan hidrokuinon.
Asam kojat memiliki aktivitas inhibisi dan kestabilan paling besar dalam
menghambat pembentukan melanin, serta banyak digunakan dalam produk
kosmetik dibandingkan produk pemutih lain. Namun, Miyazawa (2007)
menyatakan bahwa asam kojat bersifat karsinogenik dan penggunaannya dalam
konsentrasi tinggi dapat merusak kulit.
Pencarian alternatif inhibitor tirosinase yang aman bagi kesehatan terus
dilakukan, misalnya dari bahan alam. Penggunaan tumbuhan sebagai obat telah
lama dikenal secara luas oleh masyarakat Indonesia yang disebut sebagai obat
tradisional. Penggunaan obat tradisional dewasa ini sangat popular dan semakin
2
disukai oleh masyarakat. Hal ini disebabkan obat tradisional sangat murah, mudah
didapat dan memiliki efek samping serta tingkat toksisitasnya jauh lebih rendah.
Sejauh ini ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) mengandung
senyawa fitokimia dan ekstrak air rebusan daun sirih merah mengandung alkaloid,
flavonoid dan tanin (Safithri dan Fahma 2008). Penelitian lain menyatakan bahwa
ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi, yaitu dapat
menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat terbesar 80.40% dan
sebagai radical scavenger dengan nilai IC50 85.82 ppm. Ekstrak etanol daun sirih
merah juga memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase sebesar
39.62% (Alfarabi 2010). Berdasarkan hasil penelitian Safithri et al. (2011) ekstrak
air rebusan daun sirih merah (P. crocatum) memiliki aktivitas antioksidasi
terhadap SOD dan katalase sebesar 3,41±0,04 U/ml dan 0,13± 0,02 mU/ml, dan
total fenol sebesar 532,6 ppm. Berdasarkan hasil penelitian pra klinis
menunjukkan bahwa ekstrak air rebusan formula daun sirih merah dan kayu manis
dengan perbandingan 3:2 (60.55%) konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat
yang sebanding dan tidak berbeda nyata dengan vitamin E konsentrasi 200 ppm
(61.40%) (Kartika 2012). Pengujian toksisitas akut air rebusan daun sirih merah
terhadap tikus percobaan Sprague dawley yang diberikan rebusan sirih merah
dengan berbagai dosis, menunjukkan bahwa selama 24 jam pertama sampai 7 hari
masa percobaan tidak ada hewan yang mati baik untuk kelompok dosis 0, 5, 10,
maupun 20 g/kg BB. Dengan tidak adanya kematian tikus putih pada semua dosis
yang diujikan, maka dapat dikatakan bahwa rebusan sirih merah tidak bersifat
toksik (Safithri et al. 2012). Menurut Pranakusumanagara (1998) rebusan daun
sirih merah digunakan untuk membasuh muka atau mandi. Kandungan karvakro
dan arekolin yang terkandung dalam sirih merah ini yang dipercaya meremajakan
kulit, memutihkan, menyegarkan dan membuat tampak lebih awet muda. Sirih
merah juga mengandung senyawa flavonoid yang diduga dapat menghambat kerja
enzim tirosinase (Chang 2009). Berdasarkan uraian diatas, untuk
mempertimbangkan kemungkinan aplikasi sirih merah sebagai pemutih alami
pada kosmetik kecantikan, maka diperlukan kajian mengenai aktivitas
inhibitornya terhadap enzim tirosinase dan aktivitas antioksidan.
Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan ekstrak daun
sirih merah terhadap pembentukan malondialdehida (MDA) dan enzim tirosinase.
Parameter yang digunakan adalah pengujian antioksidasi daun sirih merah secara
in vitro menggunakan metode tiobarbiturat (TBA) dan pengujian aktivitasnya
dalam menghambat enzim tirosinase. Hasil penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antioksidasi dan penghambatan
terhadap enzim tirosinase daun sirih merah secara in vitro dan dapat dijadikan
dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai antioksidan dan
sebagai pemutih wajah.
METODE
Bahan dan Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik
Ohaus GA 200, eksikator, oven memmert, pisau, blender, cawan porselin, sanstat
water bath, tabung reaksi, pipet tetes, pH meter, pipet mohr, kertas saring, labu
3
takar, erlenmeyer, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), rotav eyela
n-1100, bulp, gelas ukur, sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm), corong
plastik, multi-well plate, ELISA reader epoch biotek dan mikropipet.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun
sirih merah, etanol 70%, n-heksana, HCl 2 N, akuades, pereaksi Dragendorff,
pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, metanol, etil asetat, metanol 30%, etanol 30%,
etanol 99.8%, amoniak, kloroform, eter, FeCl3, tirosinase, L-3, 4dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), larutan standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana
(TMP) 6 M, natrium hidroksida (NaOH), asetat anhidrida, asam sulfat (H2SO4),
buffer fosfat pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat, Dimethyl sulfoxide
(DMSO), asam trikloroasetat (TCA) 20%, asam kojat sebagai kontrol positif dan
asam tiobarbiturat (TBA) 1%.
Prosedur Penelitian
Analisis daun sirih merah dibagi dalam 3 tahap penting, yaitu analisis
fitokimia dari ekstrak sirih merah, analisis antioksidan ekstrak sirih merah dengan
metode TBA dan analisis inhibitor ekstrak sirih merah terhadap enzim tirosinase.
Tahap awal, daun sirih merah dikeringkan dalam oven suhu 50°C selama ± 4 hari
dengan tujuan untuk mengurangi kadar air pada daun sirih merah. Daun sirih
merah yang sudah kering dihaluskan dengan ukuran 60 mesh. Kadar air daun sirih
merah diukur dengan tujuan untuk mengetahui kadar air dari sirih merah. Kadar
air tidak lebih dari 12% (b/b). Selanjutnya, daun sirih merah diekstrak dengan
metode maserasi menggunakan 2 pelarut, yaitu etanol 70% dan n-heksana. Dasar
pemilihan kedua pelarut ini adalah kandungan metabolit sekunder daun sirih
merah (flavonoid dan minyak atsiri) diharapkan dapat terlarut dalam kedua pelarut
yang digunakan. Kedua ekstrak sirih merah (etanol 70% dan n-heksana) dianalisis
fitokimia, yaitu uji alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid dan triterpenoid
dengan tujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder sirih merah pada
kedua ekstrak. Ekstrak etanol 70% dan n-heksana selanjutnya diuji aktivitas
antioksidan dengan metode TBA. Sebelum analisis ekstrak etanol 70% dan nheksana, asam linoleat diinkubasi dengan tujuan untuk menentukan waktu
inkubasi ekstrak dengan asam linoleat. Selanjutnya, dilakukan analisis
penghambatan ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah terhadap enzim
tirosinase dengan menggunakan metode microplate reader.
Pengeringan Bahan Uji (Safithri 2012)
Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian adalah daun sirih
merah tua yang diperoleh dari 3-5 helai dari pucuk tanaman dengan bentuk daun
yang sempurna yang diperoleh dari perumahan Bogor Raya Permai. Sampel daun
segar diambil sebanyak 2 kg. Daun sirih merah dicuci dengan air bersih dan
ditiriskan dalam wadah plastik dan dikeringkan dalam oven dengan suhu 50oC
selama 4-5 hari sampai diperoleh berat akhirnya yang konstan agar didapatkan
sampel kering dengan kadar air tidak lebih dari 12% (b/b). Daun sirih merah
kering dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi serbuk halus,
4
lalu diayak dengan saringan sehingga ukuran serbuk menjadi 60 mesh. Simplisia
dibungkus dengan plastik dan disimpan untuk pengujian selanjutnya.
Penetapan kadar air metode oven (AOAC 2006)
Prinsip penghitungan kadar air adalah bobot hilang pada pemanasan 105ºC
dianggap sebagai kadar air yang terdapat pada sirih merah, karena titik didih air
sebesar 100ºC. Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105°C selama
1 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator selama 15 menit. Cawan porselen
ditimbang untuk menentukan bobot kosongnya. Cawan kosong ditimbang dan
dicatat bobotnya. Dua gram simplisia daun sirih merah dimasukkan ke dalam
cawan kemudian dicatat bobotnya, dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C
selama 3 jam setelah itu didinginkan dalam eksikator. Cawan porselen ditimbang
kembali.
Kadar Air =
× 100 %
Keterangan:
a = bobot sampel sebelum dikeringkan (g)
b = bobot sampel setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum) (BPOM RI 2004)
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia daun sirih merah ditambahkan pelarut
dengan perbandingan 1:10 (b/v), lalu diletakkan pada shaker selama 24 jam,
kemudian disaring. Perlakuan maserasi (menggunakan sampel daun, bekas
maserasi sebelumnya) diulang sebanyak 3 kali. Maserat dipekatkan menggunakan
rotary evaporator pada suhu 50ºC untuk ekstrak etanol 70% dan 45ºC untuk
ekstrak n-heksana. Residu yang diperoleh ditimbang dan ditentukan rendemennya.
Rendemen
Rendemen ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun sirih merah
dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak
yang dihasilkan
% Rendemen ekstrak =
x 100%
Analisis Fitokimia (Harbone 1987)
Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL kloroform
dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform yang diperoleh dipisahkan dan diasamkan
dengan 2 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung dan masingmasing tabung ditambahkan dengan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner
sebanyak 3 tetes. Sampel positif mengandung alkaloid ditandai dengan
terbentuknya endapan putih untuk perekasi Mayer, endapan merah untuk pereaksi
Dragendorf dan endapan coklat untuk pereaksi Wagner.
5
Uji flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL
metanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat yang terbentuk
ditambahkan dengan 3 tetes H2SO4. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan warna merah.
Uji saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL
akuades kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel dikocok selama 5 menit.
Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa yang stabil setelah
didiamkan selama 10 menit.
Uji triterpenoid dan steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan
dengan 5 mL etanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel disaring,
filtrat yang diperoleh diuapkan hingga kering. Residu ditambah 0.5 mL eter dan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan pereaksi
Liebermann Burchard (3 tetes asam asetat anhiridat dan 1 tetes H2SO4 pekat).
Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu,
sedangkan adanya steroid ditunjukkan dengan warna hijau atau biru.
Uji tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL akuades,
kemudian didihkan selama 5 menit. Sampel selanjutnya disaring, filtrat yang
diperoleh ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Adanya warna biru tua atau
hitam yang terbentuk menunjukkan adanya tanin.
Uji Aktivitas Antioksidan Metode TBA-MDA (Kikuzaki dan Nakatani 1993)
Penentuan kurva standar larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP).
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan TMP dengan
konsentrasi 1, 5, 8, 10, 13, 15, 18, 20 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan
ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam
asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10
menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter
rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada
panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko menggunakan 1 mL akuades yang
diberi perlakuan seperti larutan konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP).
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan Metode TBA.
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan menggunakan 6 mL bufer fosfat
0.1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,
dan 3 mL air bebas ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL campuran ditempatkan di
botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40oC. Pengukuran
intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL campuran asam
linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL
larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam
penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan
kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Panjang
gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan
setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL
6
campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7, kemudian
ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1% dalam asetat 50%. Larutan
blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Larutan
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama
15 menit.
Analisis konsentrasi malondialdehida (MDA) dengan metode TBA.
Analisis antioksidan ekstrak daun sirih merah dibuat dalam konsentrasi 25, 50, 75,
100, dan 200 ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL kemudian
ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam
etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol (200 ppm), 2
mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%.
Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di
penangas 40oC selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA dengan
mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA
20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi
diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama
15 menit. Panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm.
Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer
fosfat 0.1 M pH 7, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1%
dalam asetat 50%. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC
selama 10 menit. Larutan disentrifus dengan kecepatan 300 rpm (diameter rotor
sentrifus 130 mm) selama 15 menit.
Uji Inhibitor Tirosinase (Batubara et al. 2010)
Ekstrak dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasinya 10.000 ppm.
Larutan stok disiapkan dengan cara melarutkan ekstrak pekat kedalam bufer fosfat
50 mM (pH 6.5) hingga memperoleh konsentrasi 600 mg/mL. Ekstrak diuji
dengan konsentarsi 20, 200, 400, 800, 1600 dan 3200 ppm. Asam kojat sebagai
kontrol positif diuji pada konsentrasi 200 ppm ditambahkan 30 µL enzim tironase
(sigma, 333unit/mL dalam bufer fosfat) dan campuran diinkubasi selama 5 menit.
Setelah itu, sebanyak 110 µL substrat (L-DOPA 12 mM) ditambahkan dan
campurannya diinkubasi pada suhu 37°C selam 30 menit. Larutan pada masingmasing sumur diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan microplate reader
pada panjang gelombang 492 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai
konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara
membandingkan absorbansi sampel tanpa ekstrak (A) dengan penambahan ekstrak
(B) pada panjang gelombang 492 nm.
% Inhibisi =
× 100 %
Analisis data.
Analisis statistik terhadap aktivitas antioksidasi menggunakan rancangan
acak lengkap, yaitu dengan uji analysis of varian (ANOVA) pada tingkat
kepercayaan λ5% dan taraf α=0.05. Data dianalisis dengan program perangkat
lunak Statistical Programme for Social Science (SPSS) PASW 18.0.
7
HASIL
Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah
Daun sirih merah dianalisis kadar air terlebih dahulu sebelum digunakan
untuk ekstraksi. Hasil analisis kadar air menunjukkan bahwa proses pengeringan
dengan oven suhu 50°C selama 4 hari mampu menurunkan kadar air hingga
dibawah 10%, kadar air simplisia yang diperoleh sebesar 7.75%. Rendemen
tertinggi hasil Rotary evaporator diperoleh ekstrak etanol 70% daun sirih merah
sebesar 17.84%, sedangkan ekstrak n-heksana sebesar 4.88% (Tabel 1).
Tabel 1 Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah
Jenis ekstrak
Etanol
n-heksana
%Rendemen ekstrak
17.84% ± 0.66
4.88% ± 4.80
n = 2 kali ulangan
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% sirih merah
mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dan steroid. Ekstrak n-heksana
sirih merah mengandung saponin dan steroid (Tabel 2).
Tabel 2 Uji fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Senyawa
Alkaloid
Flavonoid
Saponin
Tanin
Steroid dan Triterpenoid
Ekstrak
Etanol 70%
+
+
+
+
+
n-heksana
+
+
Ket : (+) terdeteksi; (-) tidak terdeteksi
Aktivitas Antioksidasi terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA)
Berdasarkan hasil yang diperlihatkan pada Gambar 1, peningkatan daya
hambat ekstrak etanol 70% terhadap pembentukan MDA tidak berbanding lurus
dengan konsentrasi. Vitamin E konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol
positif. Penghambatan tertinggi ekstrak etanol 70% terdapat pada konsentrasi 200
ppm sebesar 52.13%. Analisis statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70%
pada konsentrasi 50 ppm tidak berbeda nyata (P
crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA
(MDA) DAN ENZIM TIROSINASE
MUSTIKA WENI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas
Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Pembentukan
Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2014
Mustika Weni
NIM G84100047
ABSTRAK
MUSTIKA WENI. Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper
crocatum) terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.
Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SYAEFUDIN.
Daun sirih merah (Piper crocatum) berkhasiat sebagai tanaman obat.
Tanaman tersebut memiliki kandungan senyawa yang berperan sebagai
antioksidan. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidasi dan
penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah. Proses ekstraksi dilakukan
secara terpisah menggunakan pelarut etanol dan n-heksana. Penentuan aktivitas
antioksidan menggunakan metode Thiobarbituric acid (TBA), sedangkan
penghambatan tirosinase menggunakan metode Microplate Reader. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah konsentrasi 200 ppm
memiliki daya hambat pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05)
dengan vitamin E, ekstrak n-heksana konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat
pembentukan malondialdehid (MDA) sama besar (α>0.05) dengan vitamin E.
Aktivitas penghambatan tirosinase menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah
memiliki nilai IC50 sebesar 1655 ppm sedangkan ekstrak n-heksana sirih merah
memiliki nilai IC50 sebesar 3090.56 ppm. Ekstrak etanol sirih merah memiliki
kemampuan menghambat MDA dan enzim tirosinase lebih tinggi dibandingkan
ekstrak n-heksana sirih merah.
Kata kunci : Aktivitas antioksidasi, Enzim tirosinase, Piper crocatum
ABSTRACT
MUSTIKA WENI. Inhibitory Activity of Piper crocatum Extract to
Malondialdehida Formation and Tyrosinase Activity. Supervised by MEGA
SAFITHRI and SYAEFUDIN.
Piper crocatum leave bark is a medicinal plant. It contains antioxidant
compounds. The objectives of this research was to determine the antioxidant
activity and inhibitory activity to tyrosinase of P. crocatum extract. Extraction
process of Piper crocatum was conducted separately by using the solvent ethanol
70% and n-hexane. Determination of antioxidant activity was conducted with
Thiobarbituric acid method (TBA) and for tyrosinase inhibitory activity using
microplate reader. The results showed that the ethanol extract at concentration of
200 ppm higher (α>0.05), inhibitory effects than vitamin E on the formation
malondialdehida. n-hexane extract at concentration of 200 ppm higher (α>0.05).
Tyrosinase inhibition activity test showed the ethanol extract has IC50 1655 ppm,
n-hexane extract has IC50 3090.56 ppm. Ethanol extract has inhibitory MDA and
enzyme tyrosinase than n-hexane extract.
Keywords : Antioxidative activity, Tyrosinase, Piper crocatum
AKTIVITAS PENGHAMBATAN EKSTRAK SIRIH MERAH (Piper
crocatum) TERHADAP PEMBENTUKAN MALONDIALDEHIDA (MDA)
DAN ENZIM TIROSINASE
MUSTIKA WENI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
Pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
Judul Skripsi : Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah Piper crocatum
terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA) dan Enzim
Tirosinase
Nama
: Mustika Weni
NIM
: G84100047
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri,SSi MSi
Pembimbing I
Syaefudin, SSi MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 hingga April 2014 ini
adalah Aktivitas Penghambatan Ekstrak Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap
Malondialdehida (MDA) dan Enzim Tirosinase.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Mega Safithri, SSi MSi dan
Syaefudin, SSi MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan
pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada
Ibu Meri, Ibu Tini beserta seluruh staf Laboran Biokimia yang telah membantu
selama penelitian berlangsung. Terima kasih juga disampaikan kepada mba Leli
dan seluruh staf Pusat Studi Biofarmaka (PSB) yang telah banyak membantu
selama pengumpulan data penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada ayah, ibu, serta seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk
segala doa, kasih sayang dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Mustika Weni
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
vi
vi
vi
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Prosedur Penelitian
3
Pengeringan Bahan Uji
3
Penetapan Kadar Air Metode Oven
4
Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum)
4
Rendemen
4
Analisis Fitokimia
4
Uji Aktifitas Antioksidan Metode TBA-MDA
5
Uji Inhibitor Tirosinase
6
HASIL
7
Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah
7
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
7
Aktivitas Antioksidasi terhadap Penghambatan Malondialdehida (MDA)
7
Penentuan Penghambatan Enzim Tirosinase pada Ekstrak Etanol 70% dan nHeksana
8
PEMBAHASAN
Pembuatan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
9
9
11
Potensi Antioksidan Ekstrak Etanol 70% dan n-Heksana Daun Sirih Merah
terhadap Penghambatan MDA
11
Penentuan Penghambatan (IC50) Ekstrak Etanol 70% dan Ekstrak n-Heksana
Sirih Merah terhadap Enzim Tirosinase
14
SIMPULAN DAN SARAN
15
Simpulan
15
Saran
15
DAFTAR PUSTAKA
15
LAMPIRAN
19
DAFTAR GAMBAR
1 Aktivitas antioksidan dengan metode TBA ekstrak daun sirih merah
2 Aktivitas penghambatan tirosinase ekstrak daun sirih merah
3 Kurva kadar MDA terhadap waktu
8
9
12
DAFTAR TABEL
1
2
Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah
Metabolit sekunder ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih
merah
7
7
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Tahapan umum penelitian
Ekstraksi daun sirih merah
Pengujian fitokimia
Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat
Analisis aktivitas antioksidan dari metode TBA
Kadar air simplisia daun sirih merah
Rendemen simplisia daun sirih merah
Rendemen simplisia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Grafik hubungan antara konsentrasi inhibitor ekstrak etanol 70% dan
ekstrak n-heksana terhadap persen inhibisi
Fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Hasil absorbansi kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)
Kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)
Absorbansi inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu
Aktivitas antoksidan ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun
sirih merah metode TBA
Analisis perhitungan IC50 difenolase ekstrak etanol 70% dan ekstrak
n-heksana daun sirih merah
Analisis stastistika terhadap penghambatan MDA
Analisis stastistika terhadap penghambatan enzim tirosinase
20
20
20
20
21
22
22
22
22
23
23
24
24
24
25
25
26
PENDAHULUAN
Kulit merupakan organ terbesar dan terluar tubuh manusia. Kulit langsung
terkena prooksida dari lingkungan, seperti radiasi ultraviolet (UV), obat-obatan
dan polusi udara. Selain pemicu eksternal serangan oksidatif, kulit juga harus
menghadapi endogen spesies oksigen reaktif (ROS) dan radikal bebas lainnya,
yang terus-menerus diproduksi selama metabolisme. Keseimbangan antara
oksidan dan antioksidan diperlukan untuk meminimalkan kerusakan jaringan.
Namun, jika keseimbangan ini terganggu stres oksidatif dapat terjadi dan hasilnya
adalah kerusakan oksidatif. Spesies oksigen reaktif (ROS) diketahui menyebabkan
modifikasi oksidatif DNA, protein dan lipid (Kang et al. 2005). Dalam mengatasi
bahaya yang timbul akibat radikal bebas, tubuh mengembangkan mekanisme
perlindungan untuk mencegah pembentukan radikal bebas dan peroksidasi lipid,
termasuk pada kulit. Berbagai kompartemen kulit (epidermis, dermis, subkutis)
dilengkapi dengan sistem antioksidan spesifik untuk mempertahankan
keseimbangan antara ROS dan antioksidan, sehingga dapat mencegah stres
oksidatif (Thiele dan Ekanayake-Mudiyanselage 2007).
Melanin pada epidermis berfungsi sebagai kromofor endogen yang akan
menyerap sinar matahari sehingga dianggap sebagai pelindung dampak buruk dari
sinar matahari. Melanin akan menyerap sinar matahari kemudian terjadi proses
fotokimiawi yang merubah molekul-molekul yang stabil menjadi molekul yang
sangat reaktif. Hasil reaksi fotokimiawi dikenal sebagai photo product antara lain
ROS (reactive oxygen species) seperti oksigen singlet, anion superaktif dan
radikal hidroksil. ROS yang terbentuk ini akan memicu kerja tirosinase dan
berakhir dengan sintesis melanin. Produksi melanin secara berlebihan dapat
mengarah pada terjadinya penumpukan melanin di lapisan epidermal
(hiperpigmentasi) dan menyebabkan kulit menjadi lebih gelap. Tirosinase
merupakan enzim yang berfungsi mengatur biosintesis melanin. Enzim tirosinase
bekerja mengubah tirosin menjadi DOPA dan kemudian menjadi dopakuinon
yang selanjutnya melalui beberapa tahap transformasi dikonversi menjadi melanin
(Fitrie 2004). Fungsi antioksidan berperan sebagai ROS scavenger sehingga
mengurangi hiperpigmentasi (Momtaz et al. 2008). Antioksida seperti flavonoid
juga diduga berperan sebagai inhibitor kompetitif enzim tirosinase karena struktur
dari flavonoid yang mirip dengan DOPA sebagai substrat (Chang 2009).
Senyawa antioksidan yang berperan sebagai penghambat pembentukan
melanin dapat diperoleh dari senyawa sintetik ataupun dari bahan alam. Senyawa
yang sering ditemukan dalam bahan kosmetik sebagai pencegah terbentuknya
melanin antara lain asam askorbat, arbutin, asam kojat, merkuri dan hidrokuinon.
Asam kojat memiliki aktivitas inhibisi dan kestabilan paling besar dalam
menghambat pembentukan melanin, serta banyak digunakan dalam produk
kosmetik dibandingkan produk pemutih lain. Namun, Miyazawa (2007)
menyatakan bahwa asam kojat bersifat karsinogenik dan penggunaannya dalam
konsentrasi tinggi dapat merusak kulit.
Pencarian alternatif inhibitor tirosinase yang aman bagi kesehatan terus
dilakukan, misalnya dari bahan alam. Penggunaan tumbuhan sebagai obat telah
lama dikenal secara luas oleh masyarakat Indonesia yang disebut sebagai obat
tradisional. Penggunaan obat tradisional dewasa ini sangat popular dan semakin
2
disukai oleh masyarakat. Hal ini disebabkan obat tradisional sangat murah, mudah
didapat dan memiliki efek samping serta tingkat toksisitasnya jauh lebih rendah.
Sejauh ini ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum) mengandung
senyawa fitokimia dan ekstrak air rebusan daun sirih merah mengandung alkaloid,
flavonoid dan tanin (Safithri dan Fahma 2008). Penelitian lain menyatakan bahwa
ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi, yaitu dapat
menghambat oksidasi asam lemak dengan daya hambat terbesar 80.40% dan
sebagai radical scavenger dengan nilai IC50 85.82 ppm. Ekstrak etanol daun sirih
merah juga memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim α-glukosidase sebesar
39.62% (Alfarabi 2010). Berdasarkan hasil penelitian Safithri et al. (2011) ekstrak
air rebusan daun sirih merah (P. crocatum) memiliki aktivitas antioksidasi
terhadap SOD dan katalase sebesar 3,41±0,04 U/ml dan 0,13± 0,02 mU/ml, dan
total fenol sebesar 532,6 ppm. Berdasarkan hasil penelitian pra klinis
menunjukkan bahwa ekstrak air rebusan formula daun sirih merah dan kayu manis
dengan perbandingan 3:2 (60.55%) konsentrasi 200 ppm memiliki daya hambat
yang sebanding dan tidak berbeda nyata dengan vitamin E konsentrasi 200 ppm
(61.40%) (Kartika 2012). Pengujian toksisitas akut air rebusan daun sirih merah
terhadap tikus percobaan Sprague dawley yang diberikan rebusan sirih merah
dengan berbagai dosis, menunjukkan bahwa selama 24 jam pertama sampai 7 hari
masa percobaan tidak ada hewan yang mati baik untuk kelompok dosis 0, 5, 10,
maupun 20 g/kg BB. Dengan tidak adanya kematian tikus putih pada semua dosis
yang diujikan, maka dapat dikatakan bahwa rebusan sirih merah tidak bersifat
toksik (Safithri et al. 2012). Menurut Pranakusumanagara (1998) rebusan daun
sirih merah digunakan untuk membasuh muka atau mandi. Kandungan karvakro
dan arekolin yang terkandung dalam sirih merah ini yang dipercaya meremajakan
kulit, memutihkan, menyegarkan dan membuat tampak lebih awet muda. Sirih
merah juga mengandung senyawa flavonoid yang diduga dapat menghambat kerja
enzim tirosinase (Chang 2009). Berdasarkan uraian diatas, untuk
mempertimbangkan kemungkinan aplikasi sirih merah sebagai pemutih alami
pada kosmetik kecantikan, maka diperlukan kajian mengenai aktivitas
inhibitornya terhadap enzim tirosinase dan aktivitas antioksidan.
Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan ekstrak daun
sirih merah terhadap pembentukan malondialdehida (MDA) dan enzim tirosinase.
Parameter yang digunakan adalah pengujian antioksidasi daun sirih merah secara
in vitro menggunakan metode tiobarbiturat (TBA) dan pengujian aktivitasnya
dalam menghambat enzim tirosinase. Hasil penelitian ini diharapkan dapat
memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antioksidasi dan penghambatan
terhadap enzim tirosinase daun sirih merah secara in vitro dan dapat dijadikan
dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai antioksidan dan
sebagai pemutih wajah.
METODE
Bahan dan Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik
Ohaus GA 200, eksikator, oven memmert, pisau, blender, cawan porselin, sanstat
water bath, tabung reaksi, pipet tetes, pH meter, pipet mohr, kertas saring, labu
3
takar, erlenmeyer, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), rotav eyela
n-1100, bulp, gelas ukur, sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm), corong
plastik, multi-well plate, ELISA reader epoch biotek dan mikropipet.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun
sirih merah, etanol 70%, n-heksana, HCl 2 N, akuades, pereaksi Dragendorff,
pereaksi Mayer, pereaksi Wagner, metanol, etil asetat, metanol 30%, etanol 30%,
etanol 99.8%, amoniak, kloroform, eter, FeCl3, tirosinase, L-3, 4dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), larutan standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana
(TMP) 6 M, natrium hidroksida (NaOH), asetat anhidrida, asam sulfat (H2SO4),
buffer fosfat pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat, Dimethyl sulfoxide
(DMSO), asam trikloroasetat (TCA) 20%, asam kojat sebagai kontrol positif dan
asam tiobarbiturat (TBA) 1%.
Prosedur Penelitian
Analisis daun sirih merah dibagi dalam 3 tahap penting, yaitu analisis
fitokimia dari ekstrak sirih merah, analisis antioksidan ekstrak sirih merah dengan
metode TBA dan analisis inhibitor ekstrak sirih merah terhadap enzim tirosinase.
Tahap awal, daun sirih merah dikeringkan dalam oven suhu 50°C selama ± 4 hari
dengan tujuan untuk mengurangi kadar air pada daun sirih merah. Daun sirih
merah yang sudah kering dihaluskan dengan ukuran 60 mesh. Kadar air daun sirih
merah diukur dengan tujuan untuk mengetahui kadar air dari sirih merah. Kadar
air tidak lebih dari 12% (b/b). Selanjutnya, daun sirih merah diekstrak dengan
metode maserasi menggunakan 2 pelarut, yaitu etanol 70% dan n-heksana. Dasar
pemilihan kedua pelarut ini adalah kandungan metabolit sekunder daun sirih
merah (flavonoid dan minyak atsiri) diharapkan dapat terlarut dalam kedua pelarut
yang digunakan. Kedua ekstrak sirih merah (etanol 70% dan n-heksana) dianalisis
fitokimia, yaitu uji alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid dan triterpenoid
dengan tujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder sirih merah pada
kedua ekstrak. Ekstrak etanol 70% dan n-heksana selanjutnya diuji aktivitas
antioksidan dengan metode TBA. Sebelum analisis ekstrak etanol 70% dan nheksana, asam linoleat diinkubasi dengan tujuan untuk menentukan waktu
inkubasi ekstrak dengan asam linoleat. Selanjutnya, dilakukan analisis
penghambatan ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah terhadap enzim
tirosinase dengan menggunakan metode microplate reader.
Pengeringan Bahan Uji (Safithri 2012)
Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian adalah daun sirih
merah tua yang diperoleh dari 3-5 helai dari pucuk tanaman dengan bentuk daun
yang sempurna yang diperoleh dari perumahan Bogor Raya Permai. Sampel daun
segar diambil sebanyak 2 kg. Daun sirih merah dicuci dengan air bersih dan
ditiriskan dalam wadah plastik dan dikeringkan dalam oven dengan suhu 50oC
selama 4-5 hari sampai diperoleh berat akhirnya yang konstan agar didapatkan
sampel kering dengan kadar air tidak lebih dari 12% (b/b). Daun sirih merah
kering dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi serbuk halus,
4
lalu diayak dengan saringan sehingga ukuran serbuk menjadi 60 mesh. Simplisia
dibungkus dengan plastik dan disimpan untuk pengujian selanjutnya.
Penetapan kadar air metode oven (AOAC 2006)
Prinsip penghitungan kadar air adalah bobot hilang pada pemanasan 105ºC
dianggap sebagai kadar air yang terdapat pada sirih merah, karena titik didih air
sebesar 100ºC. Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105°C selama
1 jam, kemudian didinginkan dalam eksikator selama 15 menit. Cawan porselen
ditimbang untuk menentukan bobot kosongnya. Cawan kosong ditimbang dan
dicatat bobotnya. Dua gram simplisia daun sirih merah dimasukkan ke dalam
cawan kemudian dicatat bobotnya, dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C
selama 3 jam setelah itu didinginkan dalam eksikator. Cawan porselen ditimbang
kembali.
Kadar Air =
× 100 %
Keterangan:
a = bobot sampel sebelum dikeringkan (g)
b = bobot sampel setelah dikeringkan (g)
Ekstraksi Serbuk Daun Sirih Merah (P. crocatum) (BPOM RI 2004)
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia daun sirih merah ditambahkan pelarut
dengan perbandingan 1:10 (b/v), lalu diletakkan pada shaker selama 24 jam,
kemudian disaring. Perlakuan maserasi (menggunakan sampel daun, bekas
maserasi sebelumnya) diulang sebanyak 3 kali. Maserat dipekatkan menggunakan
rotary evaporator pada suhu 50ºC untuk ekstrak etanol 70% dan 45ºC untuk
ekstrak n-heksana. Residu yang diperoleh ditimbang dan ditentukan rendemennya.
Rendemen
Rendemen ekstrak etanol 70% dan ekstrak n-heksana daun sirih merah
dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak
yang dihasilkan
% Rendemen ekstrak =
x 100%
Analisis Fitokimia (Harbone 1987)
Uji alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL kloroform
dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform yang diperoleh dipisahkan dan diasamkan
dengan 2 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung dan masingmasing tabung ditambahkan dengan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner
sebanyak 3 tetes. Sampel positif mengandung alkaloid ditandai dengan
terbentuknya endapan putih untuk perekasi Mayer, endapan merah untuk pereaksi
Dragendorf dan endapan coklat untuk pereaksi Wagner.
5
Uji flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL
metanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat yang terbentuk
ditambahkan dengan 3 tetes H2SO4. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan warna merah.
Uji saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL
akuades kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel dikocok selama 5 menit.
Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa yang stabil setelah
didiamkan selama 10 menit.
Uji triterpenoid dan steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan
dengan 5 mL etanol 30 %, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Sampel disaring,
filtrat yang diperoleh diuapkan hingga kering. Residu ditambah 0.5 mL eter dan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan dengan pereaksi
Liebermann Burchard (3 tetes asam asetat anhiridat dan 1 tetes H2SO4 pekat).
Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu,
sedangkan adanya steroid ditunjukkan dengan warna hijau atau biru.
Uji tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 mL akuades,
kemudian didihkan selama 5 menit. Sampel selanjutnya disaring, filtrat yang
diperoleh ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Adanya warna biru tua atau
hitam yang terbentuk menunjukkan adanya tanin.
Uji Aktivitas Antioksidan Metode TBA-MDA (Kikuzaki dan Nakatani 1993)
Penentuan kurva standar larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP).
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan TMP dengan
konsentrasi 1, 5, 8, 10, 13, 15, 18, 20 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan
ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam
asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10
menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter
rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada
panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko menggunakan 1 mL akuades yang
diberi perlakuan seperti larutan konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP).
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan Metode TBA.
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan menggunakan 6 mL bufer fosfat
0.1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%,
dan 3 mL air bebas ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL campuran ditempatkan di
botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40oC. Pengukuran
intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL campuran asam
linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL
larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam
penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan
kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Panjang
gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan
setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL
6
campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7, kemudian
ditambahkan 2 mL TCA 20% dan 2 mL TBA 1% dalam asetat 50%. Larutan
blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Larutan
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama
15 menit.
Analisis konsentrasi malondialdehida (MDA) dengan metode TBA.
Analisis antioksidan ekstrak daun sirih merah dibuat dalam konsentrasi 25, 50, 75,
100, dan 200 ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL kemudian
ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam
etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol (200 ppm), 2
mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%.
Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di
penangas 40oC selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA dengan
mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA
20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi
diletakkan dalam penangas air 100oC selama 10 menit. Setelah dingin larutan
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama
15 menit. Panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm.
Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8% dan 2 mL bufer
fosfat 0.1 M pH 7, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1%
dalam asetat 50%. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100oC
selama 10 menit. Larutan disentrifus dengan kecepatan 300 rpm (diameter rotor
sentrifus 130 mm) selama 15 menit.
Uji Inhibitor Tirosinase (Batubara et al. 2010)
Ekstrak dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasinya 10.000 ppm.
Larutan stok disiapkan dengan cara melarutkan ekstrak pekat kedalam bufer fosfat
50 mM (pH 6.5) hingga memperoleh konsentrasi 600 mg/mL. Ekstrak diuji
dengan konsentarsi 20, 200, 400, 800, 1600 dan 3200 ppm. Asam kojat sebagai
kontrol positif diuji pada konsentrasi 200 ppm ditambahkan 30 µL enzim tironase
(sigma, 333unit/mL dalam bufer fosfat) dan campuran diinkubasi selama 5 menit.
Setelah itu, sebanyak 110 µL substrat (L-DOPA 12 mM) ditambahkan dan
campurannya diinkubasi pada suhu 37°C selam 30 menit. Larutan pada masingmasing sumur diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan microplate reader
pada panjang gelombang 492 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai
konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara
membandingkan absorbansi sampel tanpa ekstrak (A) dengan penambahan ekstrak
(B) pada panjang gelombang 492 nm.
% Inhibisi =
× 100 %
Analisis data.
Analisis statistik terhadap aktivitas antioksidasi menggunakan rancangan
acak lengkap, yaitu dengan uji analysis of varian (ANOVA) pada tingkat
kepercayaan λ5% dan taraf α=0.05. Data dianalisis dengan program perangkat
lunak Statistical Programme for Social Science (SPSS) PASW 18.0.
7
HASIL
Kadar Air dan Rendemen Daun Sirih Merah
Daun sirih merah dianalisis kadar air terlebih dahulu sebelum digunakan
untuk ekstraksi. Hasil analisis kadar air menunjukkan bahwa proses pengeringan
dengan oven suhu 50°C selama 4 hari mampu menurunkan kadar air hingga
dibawah 10%, kadar air simplisia yang diperoleh sebesar 7.75%. Rendemen
tertinggi hasil Rotary evaporator diperoleh ekstrak etanol 70% daun sirih merah
sebesar 17.84%, sedangkan ekstrak n-heksana sebesar 4.88% (Tabel 1).
Tabel 1 Rendemen ekstrak etanol 70% dan n-heksana daun sirih merah
Jenis ekstrak
Etanol
n-heksana
%Rendemen ekstrak
17.84% ± 0.66
4.88% ± 4.80
n = 2 kali ulangan
Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Daun Sirih Merah
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% sirih merah
mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, tanin dan steroid. Ekstrak n-heksana
sirih merah mengandung saponin dan steroid (Tabel 2).
Tabel 2 Uji fitokimia ekstrak etanol 70% dan n-heksana sirih merah
Senyawa
Alkaloid
Flavonoid
Saponin
Tanin
Steroid dan Triterpenoid
Ekstrak
Etanol 70%
+
+
+
+
+
n-heksana
+
+
Ket : (+) terdeteksi; (-) tidak terdeteksi
Aktivitas Antioksidasi terhadap Pembentukan Malondialdehida (MDA)
Berdasarkan hasil yang diperlihatkan pada Gambar 1, peningkatan daya
hambat ekstrak etanol 70% terhadap pembentukan MDA tidak berbanding lurus
dengan konsentrasi. Vitamin E konsentrasi 200 ppm digunakan sebagai kontrol
positif. Penghambatan tertinggi ekstrak etanol 70% terdapat pada konsentrasi 200
ppm sebesar 52.13%. Analisis statistik menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70%
pada konsentrasi 50 ppm tidak berbeda nyata (P