Metabolomic Study of Temulawak Rhizome from Different Origins Based on Gas Chromatography-Mass Spectrometry
i
STUDI METABOLOMIK RIMPANG TEMULAWAK
DARI BERBAGAI DAERAH MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI GAS-SPEKTROMETRI MASSA
AENI ANGGRAINI PRALUPI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
AENI ANGGRAINI PRALUPI. Studi Metabolomik Rimpang Temulawak dari
Berbagai daerah Menggunakan Kromatografi Gas-Spektometri Massa. Dibimbing
oleh RUDI HERYANTO dan LATIFAH K DARUSMAN.
Temulawak (Curcuma xanthorriza) merupakan tanaman obat yang
mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, antirematik, antihepatotoksik,
antibakteri, dan antiinflamasi. Tujuan penelitian ini adalah membuat profil
metabolit rimpang temulawak dengan kromatografi gas-spektrometri massa dan
melakukan diferensiasi rimpang temulawak yang berasal dari 5 daerah yang
berbeda menggunakan metode analisis komponen utama (PCA), serta
menjelaskan mutu rimpang temulawak berdasarkan sifat bioaktivitasnya
(toksisitas). Hasil penelitian menunjukkan bahwa keragaman senyawa metabolit
rimpang temulawak dari Bogor, Karanganyar, Sukabumi, Sragen, dan Wonogiri
berturut-turut mempunyai komposisi sebanyak 70, 70, 57, 66, dan 68 senyawa
dengan 4 komponen dominan yang sama, yaitu α-kurkumena, α-sedrena,
xantorizol, dan germakron. Analisis PCA menggunakan 2 komponen utama, yaitu
PC 1 = 60% dan PC 2 = 30%. Ekstrak rimpang temulawak yang berasal dari
daerah Bogor, Karanganyar, dan Sragen mempunyai tingkat toksisitas yang lebih
tinggi sehingga mutu rimpang temulawak lebih baik daripada ekstrak dari daerah
Wonogiri dan Sukabumi.
ABSTRACT
AENI ANGGRAINI PRALUPI. Metabolomic Study of Temulawak Rhizome
from Different Origins Based on Gas Chromatography-Mass Spectrometry.
Supervised by RUDI HERYANTO and LATIFAH K DARUSMAN.
Temulawak (Curcuma xanthorriza) is widely used as herbal medicinal plant
that has potential such as antioxidant, antirheumatic, antihepatotoxic,
antibacterial, and anti-inflammatory. The objectives of this research were to
perform metabolic profiling of temulawak rhizomes by gas chromatography-mass
spectrometry and to discriminate temulawak rhizomes from different origins with
principal component analysis (PCA) and quality control of temulawak rhizomes
based on their natural bioactivity (toxicity). The results showed that diversity of
chemical components of temulawak rhizomes from Bogor, Karanganyar,
Sukabumi, Sragen, and Wonogiri consisted of 70, 70, 57, 66, and 68 components,
respectively, with 4 common major components, namely α-curcumene, α-cedrene,
xanthorrizol, and germacrone. PCA analysis using 2 main components: PC 1 =
60%, PC 2 = 30%. Extracts of temulawak rhizomes from Bogor, Karanganyar,
and Sragen exhibited the best quality than that of Wonogiri and Sukabumi.
iii
STUDI METABOLOMIK RIMPANG TEMULAWAK DARI
BERBAGAI DAERAH MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI GAS-SPEKTROMETRI MASSA
AENI ANGGRAINI PRALUPI
Skripsi
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul
: Studi Metabolomik Rimpang Temulawak dari Berbagai Daerah
Menggunakan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
: Aeni Anggraini Pralupi
: G44080055
Nama
NIM
Disetujui
Pembimbing I,
Rudi Heryanto, S.Si, M.Si.
NIP 19760428 200501 1 002
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS
NIP 19530824 197603 2 003
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga Karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi ini disusun berdasarkan
hasil penelitian dengan judul Studi Metabolomik Rimpang Temulawak dari
Berbagai Daerah Menggunakan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa yang
dilaksanakan mulai bulan Maret sampai dengan September 2012 di Laboraturium
Kimia Analitik, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Rudi Heryanto, S.Si, M.Si dan
Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS. selaku pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, saran, arahan, dan ilmu selama penelitan dan penyusunan
karya ilmiah ini. Terima kasih kepada tim peneliti metabolomik (Ambarsari et al.
2012) yang telah mengikutsertakan penulis dalam tema penelitian metabolomik.
Ungkapan terima kasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada kedua orang
tua (Supranoto dan Rohanah), adik (Apriliaana Putri), dan Keluarga besar atas doa
yang telah diberikan dan menjadi motivasi penulis. Selain itu penulis
mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf dan laboran Kimia Analitik atas
fasilitas dan bantuan yang telah diberikan, teman bimbingan (Septhia, Anissa,
Fakih, dan Kiki) yang telah memberikan semangat dan membantu selama
penelitian berlangsung, semoga mendapat balasan pahala dari Allah SWT.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
Aeni Anggraini Pralupi
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juli 1990 dari Ayah Supranoto
dan Ibu Rohanah. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis
memiliki satu orang adik perempuan bernama Apriliaana Putri. Tahun 2008
penulis lulus dari SMA Negeri 58 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis
diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur USMI. Penulis tercatat
sebagai mahasiswa Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Selama masa perkuliahan penulis pernah aktif di organisasi Koperasi
Mahasiswa (KOPMA) dan Kesenian Gentra Kaheman (2008-2009) serta Dewan
Perwakilan Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (DPM
FMIPA) 2010-2011. Pada bulan Juli 2011 penulis mengikuti kegiatan Praktik
Lapangan di Laboratorium Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi
Minyak dan Gas Bumi (PPPTMGB) LEMIGAS, Jakarta. Selama menjadi
mahasiswa, penulis juga pernah menjadi asisten praktikum kimia Tingkat
Persiapan Bersama IPB, praktikum Kimia Analitik Layanan, praktikum Kimia
Organik Layanan, dan praktikum Kimia Lingkungan.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................................vi
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................................vi
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................................vi
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 2
Temulawak .................................................................................................... 2
Ekstraksi ........................................................................................................ 3
Metabolomik .................................................................................................. 3
Kromatografi Gas-Spekrometri Massa .......................................................... 3
Kemometrik ................................................................................................... 4
Analisis Komonen Utama (PCA) .................................................................. 4
Uji Letalitas Larva Udang ............................................................................. 4
Artemia salina................................................................................................ 4
BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 5
Bahan dan alat................................................................................................ 5
Metode ........................................................................................................... 5
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 7
Ekstraksi dan Uji Kualitas Rimpang Temulawak dengan Metode
Uji BSLT ....................................................................................................... 7
Analisis Profil Metabolit Rimpang Temulawak ............................................ 8
Pengelompokan Rimpang Temulawak dengan PCA ................................... 11
Pendugaan Senyawa Penciri ........................................................................ 12
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 12
Simpulan ...................................................................................................... 12
Saran ............................................................................................................ 12
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 13
LAMPIRAN .......................................................................................................... 17
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Nilai LC50 ekstrak rimpang temulawak .............................................................. 7
2 Senyawa kimia pada ekstrak temulawak .......................................................... 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur xantorizol (a), kurkumin (b), dan demetoksikurkumin (c). .................. 2
2 Nilai LC50 berdasarkan asal daerah .................................................................... 8
3 Senyawa α-curcumene (a), α-cedrene (b), germacrone (c),
dan xanthorrizol (d). ........................................................................................... 8
4 Profil kromatogram ekstrak rimpang temulawak hasil analisis GC-MS. ........... 9
5 Skor plot dua PC pertama data kromatogram utuh. ......................................... 11
6 Skor plot dua PC pertama kromatogram yang telah direduksi. ........................ 11
7 Skor plot dua PC pertama kromatogram yang telah direduksi
dan dihilangkan pencilannya. ........................................................................... 12
8 Plot loading PCA untuk penentuan senyawa penanda. .................................... 12
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian ......................................................................................... 18
2 Hasil kadar air rimpang temulawak.................................................................. 19
3 Hasil kadar abu rimpang temulawak ................................................................ 20
4 Rendemen ekstrak etil asetat rimpang temulawak ........................................... 21
5 Hasil uji ANOVA ............................................................................................. 21
6 Hasil uji Duncan ............................................................................................... 21
7 Dugaan senyawa hasil identifikasi GC-MS...................................................... 22
8 Referensi nilai Kovats Index (IR) yang telah dipublikasi NIST ...................... 24
9 Kondisi lingkungan asal daerah temulawak ..................................................... 24
10 Tahap pemrosesan kromatogram GC-MS dengan AMDIS ............................. 25
11 Tahap pemrosesan PCA data kromatogram berupa waktu retensi
dan luas area dengan The Unscrambler ........................................................... 26
12 Data uji toksisitas ekstrak rimpang temulawak dengan pelarut
etil asetat terhadap A. salina ............................................................................. 28
1
PENDAHULUAN
Temulawak
(Curcuma
xanthorriza)
merupakan keluarga Zingeberaceae telah
banyak digunakan di Indonesia sebagai
tanaman obat tradisional karena mempunyai
aktivitas sebagai antioksidan, antihipertensi,
antirematik, antihepatotoksik, antibakteria,
dan antijamur (Sears 2005). Pemanfaatannya
yang cukup luas pada bidang farmasi
menyebabkan temulawak merupakan tanaman
obat
yang
cukup
potensial
untuk
dikembangkan. Rimpangnya mengandung
komponen utama yang berkhasiat, yaitu
kurkuminoid dan minyak atsiri. Kurkuminoid
memberikan warna kuning pada rimpang
temulawak yang terdiri atas kurkumin dan
desmetoksikurkumin.
Komponen
kimia
minyak atsiri lain yang terdapat dalam
temulawak antara lain felandren, kamfer,
turmerol, tolilmetilkarbinol, -kurkumen,
zingiberen, kuzerenon, germakron,
βturmeron, dan xanthorizol (Rahardjo &
Rostiana 2005).
Kualitas temulawak sebagai bahan baku
obat dapat ditunjukkan dengan sifat
bioaktivitasnya yang dipengaruhi oleh
komposisi senyawa kimia dalam temulawak
tersebut.
Faktor-faktor
yang
dapat
mempengaruhi keragaman komposisi kimia
temulawak, yaitu kondisi lingkungan daerah
asal, perbedaan jenis tanah, perbedaan iklim,
perbedaan waktu panen, dan perbedaan
ketinggian tempat (Xiang et al. 2011). Agar
memperoleh mutu temulawak yang ajeg
diperlukan suatu teknik analisis yang dapat
mendeteksi berbagai molekul yang berbeda
karena perbedaan kondisi agrobiofisik asal
daerah temulawak tersebut.
Metabolomik merupakan salah satu
cabang penelitian “omik” yang fokus pada
identifikasi molekul metabolit pada suatu
tanaman (Krastanov 2010). Sekarang ini,
pendekatan studi metabolomik telah secara
luas digunakan untuk menguji kualitas suatu
tanaman. Dobson et al. (2010) mempelajari
pebedaan fitokimia pada tanaman kentang
(Solanum tuberosum) berdasarkan perbedaan
asal daerah, Kim et al. (2011) menganalisis
profil metabolit Angelica gigas dari asal
geografis yang berbeda, Choi et al. (2010)
menguji kualitas kopi yang berasal dari
beberapa wilayah antara lain Asia, Amerika
Serikat, dan Afrika dengan latar belakang
geografis yang berbeda. Xiang et al. (2011)
mengidentifikasi komposisi senyawa kimia
pada tiga spesies curcuma (Curcuma
phaeocaulis, C. kwangsiensis, dan C.
Wenyujin).
Teknik yang dapat digunakan untuk
pemprofilan metabolit adalah spektrometri
inframerah transformasi fourier (FT-IR),
kromatografi gas-spektometri massa (GCMS), kromatografi cair-spekrometri massa
(LC-MS), dan elektron impact-spektometri
massa (EI-MS), spektroskopi resonansi
magnet inti (NMR) (Krastanov 2010). Pada
penelitian ini, keragaman metabolit pada
temulawak
diidentifikasi
menggunakan
Kromatografi gas-spektometri massa (GCMS). Keuntungan dari teknik analisis dengan
GC-MS yaitu memiliki sensitivitas dan
resolusi
yang
tinggi,
menghasilkan
keterulangan yang baik, mudah dalam
menggunakan instrumennya dan biaya
operasinya yang relatif murah (Tianniam et al.
2008).
Identifikasi senyawa dalam GC-MS dapat
dilakukan dengan mencocokkan spektra
massa yang terdapat dalam kumpulan data
NIST dan Wiley. Senyawa yang telah berhasil
diidentifikasi diperkuat kebenarannya dengan
mengevaluasi nilai indeks Kovats (IR). Data
hasil analisis dengan GC-MS dianalisis lebih
lanjut dengan metode kemometrik karena data
yang diperoleh merupakan suatu set data yang
kompleks sehingga untuk penafsirannya
memerlukan bantuan metode kemometrik.
Metode kemometrik ini dimaksudkan untuk
mengekstraksi informasi yang ada dalam
ekstrak yang diuji (Darusman et al. 2007).
Teknik pengenalan pola kemometrik yang
digunakan adalah analisis komponen utama
(PCA) dengan menggunakan perangkat lunak
The Unscrambler versi 9.7 yang dapat
mengelompokkan
rimpang
temulawak
berdasarkan perbedaan asal daerah dan
mengidentifikasi senyawa penciri pada
rimpang temulawak yang berkaitan dengan
sifat bioaktivitasnya (toksisitas) dengan
metode uji letalitas larva udang (BSLT).
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi
keragaman
senyawa
metabolit
yang
terkandung dalam rimpang temulawak dari
lima daerah yang berbeda, yaitu Bogor,
Karanganyar,
Sukabumi,
Sragen,
dan
Wonogiri dengan usia tanam 9 sampai 12
bulan menggunakan GC-MS. Selain itu juga
mengelompokkan
sampel
berdasarkan
kandungan metabolit pencirinya dengan PCA
dan menjelaskan kualitas rimpang temulawak
yang dikaitkan dengan sifat bioaktivitasnya.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Temulawak
Temulawak tumbuh di hutan-hutan
bebarapa pulau jawa di Indonesia, antara lain
Jawa, Maluku, dan Kalimantan (Supriadi
2008). Tanaman temulawak ini sudah lama
digunakan dalam pengobatan tradisional.
Curcuma berasal dari kata Arab: kurkum yang
berarti kuning. xanthorriza berasal dari kata
Yunani: xanthos berarti kuning dan rhiza
berarti akar. Temulawak dikenal juga dengan
nama geelwortel (Belanda), Javanischer
gelbwurzel (Jerman), koneng gede (Sunda),
dan temolobak (Madura) (Oei et al. 1985).
Berdasarkan
taksonominya,
temuawak
termasuk ke dalam kingdom plantae, divisi
Spermatophyta, subdivisi Angiospermae,
kelas Monocotyledonae, ordo Zingiberales,
famili Zingiberaceae, genus Curcuma, dan
spesies Curcuma xanthorriza Roxb.
Temulawak merupakan tanaman obat yang
berupa tumbuhan rumpun berbatang semu
dengan ketinggian hingga lebih dari 1 m tetapi
kurang dari 2 m, berwarna hijau atau coklat
gelap. Akar rimpang terbentuk dengan
sempurna dan bercabang kuat dan berwarna
hijau gelap. Tiap batang mempunyai daun 2-9
helai dengan bentuk bulat memanjang, warna
daun hijau atau cokelat keungguan terang
sampai gelap. Rimpang temulawak dapat
dipanen setelah memasuki usia 8 sampai 12
bulan. Tanaman yang siap dipanen memiliki
daun dan bagian tanaman yang telah
menguning dan mengering, serta memiliki
rimpang besar berwarna kuning kecoklatan
(Kurniawan 2011). Temulawak dapat tumbuh
pada ketinggian tempat 5-1800 m dpl, iklim
tropis, curah hujan 1500-4000 mm/tahun,
suhu 19 sampai 35 ˚C, jenis tanah berkapur,
berpasir, maupun tanah liat (Asriani 2010).
Temulawak dapat digunakan sebagai jamu
untuk obat demam (malaria), pegal-pegal, dan
sembelit. Air perasan atau rebusannya dapat
digunakan sebagai alternatif ganguan hati dan
penyakit kuning. Selain itu, ekstrak
temulawak juga dapat menambah nafsu
makan, menurunkan kadar kolesterol dan
trigliserida darah, menghambat kerja enzim
yang penting untuk pertumbuhan sel tumor,
serta mencegah dan menyembuhkan jerawat
(Sidik et al. 1992).
Semua bagian dari temulawak berkhasiat,
namun bagian yang paling berkhasiat adalah
rimpangnya atau umbinya. Menurut Sugiharto
(2004)
menyatakan
bahwa
rimpang
temulawak mengandung senyawa metabolit
aktif, seperti xantorizol (Gambar 1a),
kurkumin (Gambar 1b), minyak atsiri, zat pati,
flavonoid, kamfor, turmerol, felandren,
mirsen,
isofuranogermakren,
ptolylmetilkarbitol, kation Fe, Ca, Na, dan K.
Sedangkan menurut Wijayakusuma (2001)
rimpang temulawak ini mengandung lebih
dari 100 macam senyawa seperti pati, protein,
serat, kurkumin, glikosida, toluil metil
karbinol, kalium oksalat, essoil, Lsikloiprenmirsen,
dan
minyak
atsiri.
Kandungan kimia rimpang temulawak yang
memberi arti pada penggunaannya sebagai
bahan pangan, bahan baku industri, dan bahan
baku obat ialah pati, minyak atsiri, dan
kurkuminoid (Sidik et al. 1992). Minyak atsiri
merupakan komponen dalam temulawak yang
memberikan bau yang khas, sedangkan
kurkuminoid yang memberikan warna kuning
pada temulawak terdiri atas kurkumin dan
demetoksikurkumin (Gambar 1c).
CH3
CH3
H3C
CH3
(a)
O
O
OCH 3
H3CO
HO
OH
(b)
O
O
H3CO
HO
OH
(c)
Gambar 1 Struktur xantorizol (a), kurkumin
(b), dan demetoksikurkumin (c).
3
Ekstraksi
Ekstraksi
merupakan
istilah
yang
digunakan untuk mengambil senyawa tertentu
dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
Metode ekstraksi tergantung pada polaritas
senyawa yang akan diekstraksi. Prinsipnya
adalah like dissolve like, yaitu pelarut polar
akan melarutkan senyawa polar dan pelarut
nonpolar akan melarutkan senyawa nonpolar.
Pemilihan pelarut yang digunakan juga
bergantung pada sifat kelarutan zat terlarut
tersebut (Khopkar 2002). Suatu senyawa akan
menunjukkan kelarutan yang berbeda-beda
dalam pelarut yang berbeda pelarut berbeda
pula.
Metode
ekstraksi
yang
paling
konvensional adalah maserasi. Metode
ekstraksi
terus
dikembangkan
untuk
mempersingkat
waktu
ekstraksi
dan
mendapatkan ekstrak yang lebih banyak serta
volume pelarut yang lebih sedikit. Metode
sonikasi menggunakan pengaruh gelombang
ultrasonik
untuk
membantu
proses
penghancuran sel daun sehingga senyawaan
bioaktif yang terdapat di dalam sel akan lebih
cepat keluar dan terlarut dalam pelarut. Selain
itu, proses ekstraksi daun dengan metode
sonikasi akan menghasilkan ekstrak yang
bersifat less degradation product dan hasil
yang besar (Pinarosa & Gaspare 2004).
Pandiangan (2009) melakukan ekstraksi
temulawak menggunakan metode maserasi
menggunakan dua pelarut, yaitu etanol dan
etil asetat, hasil rendemen ekstrak yang
diperoleh dengan menggunakan pelarut etanol
sebesar 8.63% lebih besar daripada pelarut etil
asetat. sebesar 6.67%. Hal ini terjadi karena
komponen polar yang terdapat dalam
temulawak lebih dominan dibandingkan
komponen yang bersifat polar.
Metabolomik
Metabolomik adalah ilmu yang terdiri atas
kimia organik, kimia analitik, kemometrik,
informatik dan biosains. Metabolomik
memungkinkan klasifikasi sampel dan
diskriminasi dari bermacam-macam keadaan
biologi, asal dan kualitas dalam sampel
melalui analisis multivariat dengan metode
kemometrik. Metabolomik digunakan dalam
pendekatan sistem biologi, termasuk manusia,
tumbuhan, dan mikroorganisme. Selain itu,
metabolomik dapat diaplikasikan di bidang
kesehatan, diagnostik, industri pangan,
maupun mikrobiologi (Krastanov 2010).
Beberapa pendekatan untuk metabolomik
yang dapat menggolongkan secara kasar
menurut data kualitas dan jumlah metabolit
yang dapat dideteksi. Pertama adalah
metabolite targeted analysis yang dapat
mendeteksi dan mengkuantifikasi sekelompok
kecil metabolit maupun senyawa target
tunggal. Kedua adalah metabolite profiling
yang dapat mendeteksi, mengidentifikasi, dan
mengkuantifikasi sekelompok besar metabolit
yang dikaitkan dengan jalur biosintesis dari
yang spesifik. Ketiga adalah metabolite
fingerprinting yang dapat digunakan untuk
melengkapi perbandingan metabolom, yang
dapat dilakukan dengan analisis spektra dari
komposis total tanpa perlu mengidentifikasi
kelompok senyawa tersebut (Krastanov 2010).
Ada beberapa langkah dalam analisis
metabolomik antara lain pemprofilan,
identifikasi, validasi, dan interpretasi.
Pemprofilan dilakukan untuk menemukan
metabolit pada sampel. Identifikasi digunakan
untuk menentukan struktur kimia dari
metabolit setelah pemprofilan. Validasi
digunakan untuk memvalidasi senyawa yang
telah
diidentifikasi
dan
biasanya
membutuhkan standar. Interpretasi merupakan
langkah akhir yang dapat menghubungkan
metabolit yang telah ditemukan dengan proses
biologisnya. Alur kerja dari metabolomik
adalah preparasi sampel, analisis, proses data,
dan analisis data (Krastanov 2010).
Pendekatan metabolomik dengan analisis
target dan statistik algoritma juga telah
dilakukan untuk membedakan spesies kopi
yang bertujuan mengontrol kualitas kopi
(Choi et al. 2010). Teknik metabolomik juga
telah
berhasil
mengarakterisasi
profil
metabolit Angelica gigas dari daerah tanam
yang berbeda menggunakan analisis 1H NMR
dan UPLC-MS (Kim et al. 2011) dan studi
metabolit ekstrak bioaktif Pancratium
canariense (Torras et al. 2009).
Kromatografi Gas-Spekrometri Massa
Prinsip kerja GC-MS yaitu pada saat
sampel diinjeksi kedalam injektor sampel
akan diubah menjadi uap yang kemudian
dibawa mengikuti aliran gas pembawa menuju
detektor yang kemudian oleh detektor diubah
menjadi beberapa peak kromatogram yang
mana setiap peak kromatogram dihubungkan
dengan spektrum massa. GC-MS ini biasa
digunakan untuk analisis kualitatif senyawa
organik yang pada umumnya bersifat dapat
diuapkan (volatil).
Kromatografi gas berfungsi sebagai alat
pemisah berbagai komponen campuran dalam
sampel, sedangkan spektroskopi massa
4
berfungsi
mendeteksi
masing-masing
komponen yang telah dipisahkan pada sistem
kromatografi gas. Analisis dengan GC-MS
merupakan metode yang cepat dan akurat
untuk memisahkan campuran yang rumit
maupun menganalisis cuplikan dalam jumlah
yang sangat kecil dan menghasilkan data yang
berguna mengenai struktur serta identifikasi
senyawa organik (Agusta 2000).
Metode GC-MC telah digunakan oleh
Catchpole et al. (2005). untuk menganalisis
senyawa metabolit yang polar (seperti asam
amino, amina aromatik, asam organik, gula,
dan gula alkohol) dalam umbi kentang
Dobson et al. (2010) mempelajari keragaman
fitokimia pada umbi kentang berdasarkan
perbedaan daerahnya. Derwich et al. (2010)
mengidentifikasi senyawa volatil minyak
atsiri pada daun Mentha pulegium yang
tumbuh di daerah Maroko.
Kemometrik
Metode kemometrik merupakan suatu
analisis multivariat yang menyediakan metode
untuk mengurangi data berukuran besar yang
diperoleh dari suatu instrument, seperti
kromatografi. Multivariat merupakan salah
satu teknik analisis kemometrik yang banyak
digunakan untuk analisis matriks kompleks
dan analisis multikomponen pada sistem
sederhana. Metode kalibrasi multivariat dapat
berupa multiple linier regression (MLR),
principal component regression (PCR), dan
artificial neural network (AAN) Analisis
multivariat yang dapat digunakan untuk
pengenalan pola antara lain adalah
exploratory data analysis (EDA) yang terdiri
atas principal component analysis PCA dan
factor analysis (FA), unsupervised pattern
recognation,
dan
supervisaed
pattern
recognation (Brereton 2003).
Analisis Komonen Utama (PCA)
PCA merupakan suatu teknik untuk
mengurangi jumlah peubah dalam suatu
matrik data. Prinsip PCA adalah mencari
komponen utama yang merupakan kombinai
linier dari peubah asli. Secara keseluruhan
kegunaan PCA adalah untuk mengklasifikasi
sampel menjadi grup yang umum, mendeteksi
adanya pencilan (outliers), melakukan
pemodelan data, serta menseleksi variabel
untuk klasifikasi maupun untuk pemodelan.
Komponen-komponen utama ini dipilih
sedemikian rupa sehingga komponen utama
pertama memiliki variasi terbesar dalam set
data, sedangkan komponen utama kedua tegak
lurus terhadap komponen utama pertama dan
memiliki variasi terbesar berikutnya (Miller &
Miller 2000). Kedua komponen utama
pertama ini pada umumnya digunakan sebagai
bidang proyeksi utama pemeriksaan visual
data multivariat.
Uji Letalitas Larva Udang
Uji letalitas larva udang dengan
menggunakan metode BSLT merupakan salah
satu metode uji bioaktif pada penelitian
senyawa bahan alam. Metode ini telah
digunakan sejak tahun 1956 untuk mengetahui
residu peptisida, anastesik lokal, senyawa
turunan morfin, mitotoksin, karsiogenitas
suatu senyawa dan polutan air laut. Beberapa
keuntungan dari uji bioaktivitas menggunakan
larva udang, yaitu waktu uji yang cepat,
murah, sederhana, dan tidak memerlukan
keahlian serta peralatan khusus (Mayer et al.
1982). Senyawa aktif yang memiliki daya
toksisitas tinggi diketahui berdasarkan nilai
lethal concentration 50% (LC50), yaitu nilai
yang menunjukkan konsentrasi zat toksik
yang dapat menyebabkan kematian hewan uji
sampai 50%. Meyer et al. (1982)
menyebutkan tingkat toksisitas suatu ekstrak
LC50 ≤ γ0 µg/mL bersifat sangat toksik, 30
µg/mL ≤ LC50 ≤ 1000 µg/mL bersifat toksik,
dan LC50 > 1000 µg/mL bersifat tidak toksik.
Artemia salina
Artemia salina merupakan kelompok
udang-udangan (Crustaceae) dari filum
Arthropoda, kingdom animalia. A. salina
hidup dilingkungan danau berair asin.
Keunggulan penggunaan A. salina untuk uji
BSLT ialah sifatnya yang peka terhadap
bahan uji, waktu siklus hidup yang lebih
cepat, mudah dibiakkan, dan harganya murah.
Sifat peka A. salina kemungkinan disebabkan
oleh keadaan membran kulitnya yang sangat
tipis sehingga memungkinkan terjadinya
difusi zat dari lingkungan yang mempengaruhi
metabolisme dalam tubuhnya. Uji BSLT
menggunakan A. salina dilakukan dengan
menetaskan telur-telur tersebut dalam air laut
yang dibantu dengan aerasi. Telur A. salina
yang baik digunakan untuk uji BSLT ialah
yang berumur 48 jam sebab jika lebih dari 48
jam dikhawatirkan kematian A. salina bukan
disebabkan toksisitas ekstrak melainkan oleh
terbatasnya persediaan makanan (Meyer et al.
1982).
5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah temulawak yang
diperoleh dari 5 daerah berbeda, yaitu Bogor
(Jawa Barat), Karanganyar (Jawa Tengah),
Sukabumi (Jawa Barat), Sragen (Jawa
Tengah), dan Wonogiri (Jawa Tengah) dengan
umur panen 9 sampai 12 bulan, data
kromatogram hasil analisis GC-MS, etil
asetat, air laut, dan larva udang Artemia
salina. Alat-alat yang digunakan adalah
peralatan gelas, penangas ultrasonik, oven,
penyaring milipore filter unit berukuran 0.45
μm, penguap putar, GC-MS Simadhzu QP
2010, perangkat keras komputer, perangkat
lunak The Unscrambler versi 9.7, AMDIS,
dan SPSS 16.
Metode
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap,
yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian
utama. Penelitian pendahuluan telah dilakukan
oleh Ambarsari et al. (2012) mencangkup
ekstraksi rimpang temulawak dengan pelarut
etil asetat dan analisis menggunakan GC-MS,
sedangkan penelitian utama mencangkup
penentuan kadar air dan kadar abu, evaluasi
metabolit dengan indeks Kovats (IR) dengan
mencocokkan nilai IR yang ada pada koleksi
database NIST 1969 dan diferensiasi
metabolit
dengan
PCA
menggunakan
perangkat lunak The Unscrambler, serta uji
toksisitas ekstrak etil asetat rimpang
temulawak dengan metode BSLT (Lampiran
1).
Preparasi Rimpang Temulawak
Rimpang segar dari 5 daerah dicuci
dengan air bersih, ditiriskan, dirajang kecilkecil, dikeringkan, lalu diserbukan. Preparasi
sampel dilakukan dua kali, sampel yang akan
digunakan untuk analisis dengan GC-MS dan
uji toksisitas.
Analisis Kadar Air (AOAC 2007)
Cawan porselen dikeringkan pada suhu
105 °C selama 30 menit kemudian
didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Sebanyak 2 g serbuk temulawak kering
dimasukkan ke dalam cawan dan dikeringkan
pada suhu 105 °C selama 5 jam kemudian
didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Prosedur ini dilakukan hingga diperoleh bobot
yang tetap. Kadar air contoh ditentukan
dengan persamaan,
Kadar air =
-
× 100%
Keterangan:
A= bobot contoh awal (g)
B= bobot contoh kering (g)
Analisis Kadar Abu (AOAC 2007)
Cawan porselen yang bersih dan kering
dimasukkan
ke
dalam
tanur
untuk
menghilangkan sisa-sisa kotoran yang
menempel di cawan. Setelah didinginkan
dalam eksikator, cawan ditimbang. Sebanyak
2 g serbuk rimpang temulawak kering
dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan
dipanaskan sampai tidak berasap kemudian
dibakar dalam tanur pada suhu 600 °C selama
2 jam sampai diperoleh abu. Cawan berisi abu
didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Kadar abu contoh dihitung dengan persamaan,
Kadar abu =
× 100%
Keterangan:
A= bobot contoh awal (g)
B= bobot abu (g)
Ekstraksi Rimpang dengan Etil asetat
(Ambarsari et al. 2012)
Ekstraksi sampel rimpang temulawak
dilakukan dua kali, pertama ekstrak sampel
yang akan digunakan untuk analisis dengan
GC-MS telah dilakukan oleh Ambarsari et al.
(2012) dan ekstraksi sampel untuk uji
toksisitas. Ekstraksi rimpang temulawak untuk
analisis GC-MS ditimbang sebanyak 200 mg
sampel temulawak dari masing-masing 5
daerah kemudian dilarutkan ke dalam 4 mL
etil asetat dan disonikasi selama 30 menit.
Setelah itu didiamkan selama semalam dan
maserat dikumpulkan dan dipekatkan dengan
penguap putar. Ekstrak yang telah diperoleh
kemudian disaring dengan saringan milipore
0.45 mikron kemudian diinjeksi ke dalam
kolom GC-MS.
Ekstraksi rimpang temulawak untuk uji
toksisitas, ditimbang sebanyak 10 mg sampel
temulawak temulawak dari masing-masing 5
daerah kemudian dilarutkan ke dalam 100 mL
etil asetat dan disonikasi selama 30 menit.
Setelah itu didiamkan selama semalam dan
maserat dikumpulkan dan dipekatkan dengan
penguap putar. Bobot ekstrak kering yang
diperoleh ditimbang. Rendemen setiap ekstrak
dihitung dengan membandingkan bobot
ekstrak yang diperoleh dengan bobot sampel
6
awal. Kadar air sampel digunakan sebagai
faktor koreksi.
Rendemen (%) =
Keterangan:
A = bobot contoh awal (g)
B = bobot ekstrak (g)
C = kadar air
Komponen kimia ekstrak rimpang
temulawak dianalisis dengan GC-MS. Proses
analisis menggunakan GC Shimadzu QP 2010
yang ditendem dengan detektor spektometer
massa Shimadzu QP 2010; kolom kapiler DBsns (J&W) (dimensi 30 m 0.248 nm), film
thickness 0.25 µm, model aliran konstan
dengan laju alir 0.5 mL/menit; gas pembawa
H2; tipe injektor manual dengan volume
injeksi 1 µL; suhu inlet β50 ˚C dengan teknik
injeksi split; suhu awal oven 180 ˚C, waktu
awal 5 menit dengan waktu operasi oven 30
menit; Program suhu diawali dengan 180 ˚C
ditahan 5 menit kemudian diubah perlahanlahan dengan laju kenaikan suhu 14 ˚C/menit
hingga mencapai γ00 ˚C dan ditahan selama 5
menit.
Evaluasi Data GC-MS
Identifikasi senyawa dilakukan dengan
mencocokkan spektra massa yang diperoleh
hasil analisis GC-MS dengan spektra massa
database NIST dan Wiley. Selanjutnya
dilakukan perhitungan nilai indeks Kovats
(IR) menggunakan deret homolog n-alkana
untuk memperkuat dugaan senyawa yang
berhasil diidentifikasi. Konfirmasi komponen
dilakukan dengan mencocokkan nilai IR
komponen
dengan
IR
yang
sudah
dipublikasikan NIST tahun 1969. Nilai indeks
Kovats (IR) dihitung dengan persamaan,
IR=100z + 100[
logt ( 1) - logt
yang muncul sebelum x
= n-alkana dengan jumlah karbon
z + 1 yang muncul setelah x
(Hubschman 2009).
Analisis dengan Prinsip Komponen Utama
Analisis dengan GC-MS
logt ( ) - logt
z+1
]
Keterangan:
IR
= Kovat Indeks retensi
t‟
R(x)
= waktu retensi terkoreksi senyawa x
t‟
Rz
= waktu retensi terkoreksi n-alkana
dengan jumlah karbon z yang
muncul sebelum komponen x
t‟
= waktu retensi terkoreksi n-alkana
R(z+1)
dengan jumlah karbon z+1 yang
muncul setelah x
x
= senyawa yang dipilih
z
= n-alkana dengan jumlah karbon z
Data GC-MS yang telah dievaluasi
kemudian diolah juga dengan metode PCA
menggunakan
perangkat
lunak
The
Unscrambler untuk menentukan metabolit
dominan (penciri) pada masing-masing
rimpang temulawak, sehingga dapat dilakukan
klasifikasi terhadap rimpang temulawak yang
berasal dari daerah berbeda.
Uji
Toksisitas
Ekstrak
Rimpang
Temulawak dengan Metode BSLT
Telur A. salina direndam dalam air laut.
Suhu penetasan adalah 25-γ0˚C selama 48
jam dan siap untuk uji BSLT (Nurhayati et al.
2006). Ekstrak rimpang temulawak ditimbang
sebanyak 0.01 g kemudian dilarutkan dengan
air laut di dalam labu takar 10 mL. Dibuat
stok ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/mL
lalu dibuat bebarapa konsentrasi, yaitu 20, 30,
40, 50, 75 dan 100 µg/mL serta blanko tanpa
penambahan sampel. Pengujian dilakukan
dengan memasukkan 15 ekor larva A. salina
yang berumur 48 jam ke dalam sumur
(multiwell) yang telah berisi air laut kemudian
ditambahkan larutan ekstrak dengan total
volume sumur 2 mL. Setelah 24 jam, jumlah
larva yang mati dihitung dengan bantuan kaca
pembesar.
Parameter yang digunakan adalah jumlah
larva yang mati 50% dari total larva uji.
Kemudian dihitung nilai LC50 dengan
memasukkan angka probit (50% kematian
larva uji). Rumus persen kematian ditentukan
dengan rumus Abbot,
% kematian larva =
15
× 100%
Keterangan:
T = jumlah larva mati
K = jumlah larva kontrol mati
15 = jumlah larva uji
Dengan mengetahui kematian larva
A.salina, kemudian dicari angka probit
melalui tabel probit dan dibuat persamaan
garis,
y = a+bx
dengan y = log konsentrasi
x = angka probit
7
Dari persamaan tersebut, selanjutnya LC50
dihitung dengan memasukkan nilai probit
(50% kematian) (Meyer et al. 1982).
Analisis Statistik
Hasil penelitian diolah menggunakan
perangkat lunak Minitab versi 14 dengan
program analisys of variance (ANOVA) oneway. Selanjutnya dilakukan uji lanjut Duncan
dengan software SPSS versi 16 terhadap
parameter yang dianalisis meliputi hubungan
perlakuan terhadap nilai LC50.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi dan Uji Kualitas Rimpang
Temulawak dengan Metode Uji BSLT
Hasil kadar air ekstrak temulawak dari
sampel Bogor (17.03 0.19%), Sragen (16.89
0.12%), Sukabumi (19.54 1.77%),
Wonogiri (17.97 0.17%), dan Karanganyar
(19.95 1.45%) (Lampiran 2). Kandungan air
rimpang temulawak segar cukup besar,
sehingga tidak baik untuk disimpan dalam
waktu yang lama. Supaya diperoleh kadar air
yang kecil maka rimpang temulawak harus
dikeringkan dahulu agar sampel tidak mudah
rusak dan dapat disimpan pada waktu yang
lama. Menurut Winarno (1992) menyatakan
bahwa kadar air minimum agar bakteri tidak
tumbuh ialah kurang dari 10% sehingga pada
kadar air ini bahan dapat disimpan dalam
jangka waktu yang lama dan risiko terkena
jamur kecil. Penentuan kadar abu juga
dilakukan untuk sampel rimpang temulawak
dari lima daerah yang berbeda yang bertujuan
menentukan kandungan mineral dalam suatu
bahan. Hasil kadar abu ekstrak temulawak
dari sampel Bogor (5.43 0.11%), Sragen
(8.78 0.15%), Sukabumi (6.75 0.17%),
Wonogiri (7.41 0.12%), dan Karanganyar
(6.82 0.12%) (Lampiran 3). Kandungan
mineral rimpang temulawak dari daerah
Sragen lebih banyak tetapi jumlah air yang
terikat
secara
fisik
lebih
sedikit
dibandingankan rimpang temulawak dari
daerah lain.
Sampel rimpang temulawak dari lima
daerah
yang
berbeda
diekstraksi
menggunakan metode maserasi dengan
pelarut etil asetat. Hasil rendemen yang
diperoleh untuk ekstrak dari Bogor (9.38%),
Sragen (8.78%), Sukabumi (9.87%), Wonogiri
(8.84%), dan Karanganyar (9.78%) (Lampiran
4). Rendemen ekstrak ini perlu dikoreksi
kandungan airnya dengan menghitung nilai
persentase kadar air. Keberadaan air dalam
bahan dapat menggangu proses ekstraksi. Jika
kadar air terlalu tinggi maka bahan akan
mudah terserang jamur dan dalam proses
ekstraksi mengakibatkan terhalangnya pelarut
masuk kedalam dinding sel karena pelarut
yang digunakan tidak bisa bercampur dengan
air maka hasil rendemen ekstrak yang
diperoleh sedikit (Meilani 2006).
Uji kualitas rimpang temulawak dilakukan
dengan
menguji
tingkat
toksisitasnya
menggunakan metode BSLT dengan hewan
uji adalah A. salina. Uji toksisitas
menggunakan metode BSLT cukup praktis,
cepat, mudah, dan cukup akurat. Senyawa
aktif yang memiliki daya toksisitas diketahui
berdasarkan nilai lethal concentration 50%,
yaitu suatu nilai yang menunjukkan kosentrasi
zat toksik yang dapat menyebabkan kematian
hewan uji sampai 50%.
Suatu ekstrak dianggap sangat toksik bila
memiliki nilai LC50 ≤ 30 µg/mL, dianggap
toksik bila γ1 µg/mL ≤ LC50 ≤ 1000 µg/mL
dan dianggap tidak toksik bila nilai LC50 di ≥
1000 µg/mL (Meyer et al. 1982). Jadi, jika
nilai LC50 semakin kecil dari suatu ekstrak,
maka senyawa tersebut semakin tinggi
keaktifannya atau semakin toksik (Tabel 1).
Tabel 1
Sampel
Bogor
Nilai LC50 ekstrak rimpang
temulawak
Rerata
kategori
LC
50
LC50
Duncan
26.80
28.21b
sangat
toksisik
21.15a
sangat
toksik
51.28d
toksik
29.62
Sragen
20.41
21.89
Sukabumi
50.58
51.98
Wonogiri
32.35
32.00c
toksik
31.65
Karanganyar
21.47
21.54
21.505a
sangat
toksik
Angka yang diikuti oleh huruf superscripts yang sama
tidak berbeda signifikan pada taraf uji (P
STUDI METABOLOMIK RIMPANG TEMULAWAK
DARI BERBAGAI DAERAH MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI GAS-SPEKTROMETRI MASSA
AENI ANGGRAINI PRALUPI
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
AENI ANGGRAINI PRALUPI. Studi Metabolomik Rimpang Temulawak dari
Berbagai daerah Menggunakan Kromatografi Gas-Spektometri Massa. Dibimbing
oleh RUDI HERYANTO dan LATIFAH K DARUSMAN.
Temulawak (Curcuma xanthorriza) merupakan tanaman obat yang
mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, antirematik, antihepatotoksik,
antibakteri, dan antiinflamasi. Tujuan penelitian ini adalah membuat profil
metabolit rimpang temulawak dengan kromatografi gas-spektrometri massa dan
melakukan diferensiasi rimpang temulawak yang berasal dari 5 daerah yang
berbeda menggunakan metode analisis komponen utama (PCA), serta
menjelaskan mutu rimpang temulawak berdasarkan sifat bioaktivitasnya
(toksisitas). Hasil penelitian menunjukkan bahwa keragaman senyawa metabolit
rimpang temulawak dari Bogor, Karanganyar, Sukabumi, Sragen, dan Wonogiri
berturut-turut mempunyai komposisi sebanyak 70, 70, 57, 66, dan 68 senyawa
dengan 4 komponen dominan yang sama, yaitu α-kurkumena, α-sedrena,
xantorizol, dan germakron. Analisis PCA menggunakan 2 komponen utama, yaitu
PC 1 = 60% dan PC 2 = 30%. Ekstrak rimpang temulawak yang berasal dari
daerah Bogor, Karanganyar, dan Sragen mempunyai tingkat toksisitas yang lebih
tinggi sehingga mutu rimpang temulawak lebih baik daripada ekstrak dari daerah
Wonogiri dan Sukabumi.
ABSTRACT
AENI ANGGRAINI PRALUPI. Metabolomic Study of Temulawak Rhizome
from Different Origins Based on Gas Chromatography-Mass Spectrometry.
Supervised by RUDI HERYANTO and LATIFAH K DARUSMAN.
Temulawak (Curcuma xanthorriza) is widely used as herbal medicinal plant
that has potential such as antioxidant, antirheumatic, antihepatotoxic,
antibacterial, and anti-inflammatory. The objectives of this research were to
perform metabolic profiling of temulawak rhizomes by gas chromatography-mass
spectrometry and to discriminate temulawak rhizomes from different origins with
principal component analysis (PCA) and quality control of temulawak rhizomes
based on their natural bioactivity (toxicity). The results showed that diversity of
chemical components of temulawak rhizomes from Bogor, Karanganyar,
Sukabumi, Sragen, and Wonogiri consisted of 70, 70, 57, 66, and 68 components,
respectively, with 4 common major components, namely α-curcumene, α-cedrene,
xanthorrizol, and germacrone. PCA analysis using 2 main components: PC 1 =
60%, PC 2 = 30%. Extracts of temulawak rhizomes from Bogor, Karanganyar,
and Sragen exhibited the best quality than that of Wonogiri and Sukabumi.
iii
STUDI METABOLOMIK RIMPANG TEMULAWAK DARI
BERBAGAI DAERAH MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI GAS-SPEKTROMETRI MASSA
AENI ANGGRAINI PRALUPI
Skripsi
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul
: Studi Metabolomik Rimpang Temulawak dari Berbagai Daerah
Menggunakan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa
: Aeni Anggraini Pralupi
: G44080055
Nama
NIM
Disetujui
Pembimbing I,
Rudi Heryanto, S.Si, M.Si.
NIP 19760428 200501 1 002
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS
NIP 19530824 197603 2 003
Diketahui
Ketua Departemen Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga Karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi ini disusun berdasarkan
hasil penelitian dengan judul Studi Metabolomik Rimpang Temulawak dari
Berbagai Daerah Menggunakan Kromatografi Gas-Spektrometri Massa yang
dilaksanakan mulai bulan Maret sampai dengan September 2012 di Laboraturium
Kimia Analitik, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Rudi Heryanto, S.Si, M.Si dan
Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS. selaku pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, saran, arahan, dan ilmu selama penelitan dan penyusunan
karya ilmiah ini. Terima kasih kepada tim peneliti metabolomik (Ambarsari et al.
2012) yang telah mengikutsertakan penulis dalam tema penelitian metabolomik.
Ungkapan terima kasih sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada kedua orang
tua (Supranoto dan Rohanah), adik (Apriliaana Putri), dan Keluarga besar atas doa
yang telah diberikan dan menjadi motivasi penulis. Selain itu penulis
mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf dan laboran Kimia Analitik atas
fasilitas dan bantuan yang telah diberikan, teman bimbingan (Septhia, Anissa,
Fakih, dan Kiki) yang telah memberikan semangat dan membantu selama
penelitian berlangsung, semoga mendapat balasan pahala dari Allah SWT.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
Aeni Anggraini Pralupi
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juli 1990 dari Ayah Supranoto
dan Ibu Rohanah. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis
memiliki satu orang adik perempuan bernama Apriliaana Putri. Tahun 2008
penulis lulus dari SMA Negeri 58 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis
diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur USMI. Penulis tercatat
sebagai mahasiswa Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Selama masa perkuliahan penulis pernah aktif di organisasi Koperasi
Mahasiswa (KOPMA) dan Kesenian Gentra Kaheman (2008-2009) serta Dewan
Perwakilan Mahasiswa Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (DPM
FMIPA) 2010-2011. Pada bulan Juli 2011 penulis mengikuti kegiatan Praktik
Lapangan di Laboratorium Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi
Minyak dan Gas Bumi (PPPTMGB) LEMIGAS, Jakarta. Selama menjadi
mahasiswa, penulis juga pernah menjadi asisten praktikum kimia Tingkat
Persiapan Bersama IPB, praktikum Kimia Analitik Layanan, praktikum Kimia
Organik Layanan, dan praktikum Kimia Lingkungan.
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................................vi
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................................vi
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................................vi
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 2
Temulawak .................................................................................................... 2
Ekstraksi ........................................................................................................ 3
Metabolomik .................................................................................................. 3
Kromatografi Gas-Spekrometri Massa .......................................................... 3
Kemometrik ................................................................................................... 4
Analisis Komonen Utama (PCA) .................................................................. 4
Uji Letalitas Larva Udang ............................................................................. 4
Artemia salina................................................................................................ 4
BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 5
Bahan dan alat................................................................................................ 5
Metode ........................................................................................................... 5
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 7
Ekstraksi dan Uji Kualitas Rimpang Temulawak dengan Metode
Uji BSLT ....................................................................................................... 7
Analisis Profil Metabolit Rimpang Temulawak ............................................ 8
Pengelompokan Rimpang Temulawak dengan PCA ................................... 11
Pendugaan Senyawa Penciri ........................................................................ 12
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 12
Simpulan ...................................................................................................... 12
Saran ............................................................................................................ 12
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 13
LAMPIRAN .......................................................................................................... 17
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Nilai LC50 ekstrak rimpang temulawak .............................................................. 7
2 Senyawa kimia pada ekstrak temulawak .......................................................... 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Struktur xantorizol (a), kurkumin (b), dan demetoksikurkumin (c). .................. 2
2 Nilai LC50 berdasarkan asal daerah .................................................................... 8
3 Senyawa α-curcumene (a), α-cedrene (b), germacrone (c),
dan xanthorrizol (d). ........................................................................................... 8
4 Profil kromatogram ekstrak rimpang temulawak hasil analisis GC-MS. ........... 9
5 Skor plot dua PC pertama data kromatogram utuh. ......................................... 11
6 Skor plot dua PC pertama kromatogram yang telah direduksi. ........................ 11
7 Skor plot dua PC pertama kromatogram yang telah direduksi
dan dihilangkan pencilannya. ........................................................................... 12
8 Plot loading PCA untuk penentuan senyawa penanda. .................................... 12
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian ......................................................................................... 18
2 Hasil kadar air rimpang temulawak.................................................................. 19
3 Hasil kadar abu rimpang temulawak ................................................................ 20
4 Rendemen ekstrak etil asetat rimpang temulawak ........................................... 21
5 Hasil uji ANOVA ............................................................................................. 21
6 Hasil uji Duncan ............................................................................................... 21
7 Dugaan senyawa hasil identifikasi GC-MS...................................................... 22
8 Referensi nilai Kovats Index (IR) yang telah dipublikasi NIST ...................... 24
9 Kondisi lingkungan asal daerah temulawak ..................................................... 24
10 Tahap pemrosesan kromatogram GC-MS dengan AMDIS ............................. 25
11 Tahap pemrosesan PCA data kromatogram berupa waktu retensi
dan luas area dengan The Unscrambler ........................................................... 26
12 Data uji toksisitas ekstrak rimpang temulawak dengan pelarut
etil asetat terhadap A. salina ............................................................................. 28
1
PENDAHULUAN
Temulawak
(Curcuma
xanthorriza)
merupakan keluarga Zingeberaceae telah
banyak digunakan di Indonesia sebagai
tanaman obat tradisional karena mempunyai
aktivitas sebagai antioksidan, antihipertensi,
antirematik, antihepatotoksik, antibakteria,
dan antijamur (Sears 2005). Pemanfaatannya
yang cukup luas pada bidang farmasi
menyebabkan temulawak merupakan tanaman
obat
yang
cukup
potensial
untuk
dikembangkan. Rimpangnya mengandung
komponen utama yang berkhasiat, yaitu
kurkuminoid dan minyak atsiri. Kurkuminoid
memberikan warna kuning pada rimpang
temulawak yang terdiri atas kurkumin dan
desmetoksikurkumin.
Komponen
kimia
minyak atsiri lain yang terdapat dalam
temulawak antara lain felandren, kamfer,
turmerol, tolilmetilkarbinol, -kurkumen,
zingiberen, kuzerenon, germakron,
βturmeron, dan xanthorizol (Rahardjo &
Rostiana 2005).
Kualitas temulawak sebagai bahan baku
obat dapat ditunjukkan dengan sifat
bioaktivitasnya yang dipengaruhi oleh
komposisi senyawa kimia dalam temulawak
tersebut.
Faktor-faktor
yang
dapat
mempengaruhi keragaman komposisi kimia
temulawak, yaitu kondisi lingkungan daerah
asal, perbedaan jenis tanah, perbedaan iklim,
perbedaan waktu panen, dan perbedaan
ketinggian tempat (Xiang et al. 2011). Agar
memperoleh mutu temulawak yang ajeg
diperlukan suatu teknik analisis yang dapat
mendeteksi berbagai molekul yang berbeda
karena perbedaan kondisi agrobiofisik asal
daerah temulawak tersebut.
Metabolomik merupakan salah satu
cabang penelitian “omik” yang fokus pada
identifikasi molekul metabolit pada suatu
tanaman (Krastanov 2010). Sekarang ini,
pendekatan studi metabolomik telah secara
luas digunakan untuk menguji kualitas suatu
tanaman. Dobson et al. (2010) mempelajari
pebedaan fitokimia pada tanaman kentang
(Solanum tuberosum) berdasarkan perbedaan
asal daerah, Kim et al. (2011) menganalisis
profil metabolit Angelica gigas dari asal
geografis yang berbeda, Choi et al. (2010)
menguji kualitas kopi yang berasal dari
beberapa wilayah antara lain Asia, Amerika
Serikat, dan Afrika dengan latar belakang
geografis yang berbeda. Xiang et al. (2011)
mengidentifikasi komposisi senyawa kimia
pada tiga spesies curcuma (Curcuma
phaeocaulis, C. kwangsiensis, dan C.
Wenyujin).
Teknik yang dapat digunakan untuk
pemprofilan metabolit adalah spektrometri
inframerah transformasi fourier (FT-IR),
kromatografi gas-spektometri massa (GCMS), kromatografi cair-spekrometri massa
(LC-MS), dan elektron impact-spektometri
massa (EI-MS), spektroskopi resonansi
magnet inti (NMR) (Krastanov 2010). Pada
penelitian ini, keragaman metabolit pada
temulawak
diidentifikasi
menggunakan
Kromatografi gas-spektometri massa (GCMS). Keuntungan dari teknik analisis dengan
GC-MS yaitu memiliki sensitivitas dan
resolusi
yang
tinggi,
menghasilkan
keterulangan yang baik, mudah dalam
menggunakan instrumennya dan biaya
operasinya yang relatif murah (Tianniam et al.
2008).
Identifikasi senyawa dalam GC-MS dapat
dilakukan dengan mencocokkan spektra
massa yang terdapat dalam kumpulan data
NIST dan Wiley. Senyawa yang telah berhasil
diidentifikasi diperkuat kebenarannya dengan
mengevaluasi nilai indeks Kovats (IR). Data
hasil analisis dengan GC-MS dianalisis lebih
lanjut dengan metode kemometrik karena data
yang diperoleh merupakan suatu set data yang
kompleks sehingga untuk penafsirannya
memerlukan bantuan metode kemometrik.
Metode kemometrik ini dimaksudkan untuk
mengekstraksi informasi yang ada dalam
ekstrak yang diuji (Darusman et al. 2007).
Teknik pengenalan pola kemometrik yang
digunakan adalah analisis komponen utama
(PCA) dengan menggunakan perangkat lunak
The Unscrambler versi 9.7 yang dapat
mengelompokkan
rimpang
temulawak
berdasarkan perbedaan asal daerah dan
mengidentifikasi senyawa penciri pada
rimpang temulawak yang berkaitan dengan
sifat bioaktivitasnya (toksisitas) dengan
metode uji letalitas larva udang (BSLT).
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi
keragaman
senyawa
metabolit
yang
terkandung dalam rimpang temulawak dari
lima daerah yang berbeda, yaitu Bogor,
Karanganyar,
Sukabumi,
Sragen,
dan
Wonogiri dengan usia tanam 9 sampai 12
bulan menggunakan GC-MS. Selain itu juga
mengelompokkan
sampel
berdasarkan
kandungan metabolit pencirinya dengan PCA
dan menjelaskan kualitas rimpang temulawak
yang dikaitkan dengan sifat bioaktivitasnya.
2
TINJAUAN PUSTAKA
Temulawak
Temulawak tumbuh di hutan-hutan
bebarapa pulau jawa di Indonesia, antara lain
Jawa, Maluku, dan Kalimantan (Supriadi
2008). Tanaman temulawak ini sudah lama
digunakan dalam pengobatan tradisional.
Curcuma berasal dari kata Arab: kurkum yang
berarti kuning. xanthorriza berasal dari kata
Yunani: xanthos berarti kuning dan rhiza
berarti akar. Temulawak dikenal juga dengan
nama geelwortel (Belanda), Javanischer
gelbwurzel (Jerman), koneng gede (Sunda),
dan temolobak (Madura) (Oei et al. 1985).
Berdasarkan
taksonominya,
temuawak
termasuk ke dalam kingdom plantae, divisi
Spermatophyta, subdivisi Angiospermae,
kelas Monocotyledonae, ordo Zingiberales,
famili Zingiberaceae, genus Curcuma, dan
spesies Curcuma xanthorriza Roxb.
Temulawak merupakan tanaman obat yang
berupa tumbuhan rumpun berbatang semu
dengan ketinggian hingga lebih dari 1 m tetapi
kurang dari 2 m, berwarna hijau atau coklat
gelap. Akar rimpang terbentuk dengan
sempurna dan bercabang kuat dan berwarna
hijau gelap. Tiap batang mempunyai daun 2-9
helai dengan bentuk bulat memanjang, warna
daun hijau atau cokelat keungguan terang
sampai gelap. Rimpang temulawak dapat
dipanen setelah memasuki usia 8 sampai 12
bulan. Tanaman yang siap dipanen memiliki
daun dan bagian tanaman yang telah
menguning dan mengering, serta memiliki
rimpang besar berwarna kuning kecoklatan
(Kurniawan 2011). Temulawak dapat tumbuh
pada ketinggian tempat 5-1800 m dpl, iklim
tropis, curah hujan 1500-4000 mm/tahun,
suhu 19 sampai 35 ˚C, jenis tanah berkapur,
berpasir, maupun tanah liat (Asriani 2010).
Temulawak dapat digunakan sebagai jamu
untuk obat demam (malaria), pegal-pegal, dan
sembelit. Air perasan atau rebusannya dapat
digunakan sebagai alternatif ganguan hati dan
penyakit kuning. Selain itu, ekstrak
temulawak juga dapat menambah nafsu
makan, menurunkan kadar kolesterol dan
trigliserida darah, menghambat kerja enzim
yang penting untuk pertumbuhan sel tumor,
serta mencegah dan menyembuhkan jerawat
(Sidik et al. 1992).
Semua bagian dari temulawak berkhasiat,
namun bagian yang paling berkhasiat adalah
rimpangnya atau umbinya. Menurut Sugiharto
(2004)
menyatakan
bahwa
rimpang
temulawak mengandung senyawa metabolit
aktif, seperti xantorizol (Gambar 1a),
kurkumin (Gambar 1b), minyak atsiri, zat pati,
flavonoid, kamfor, turmerol, felandren,
mirsen,
isofuranogermakren,
ptolylmetilkarbitol, kation Fe, Ca, Na, dan K.
Sedangkan menurut Wijayakusuma (2001)
rimpang temulawak ini mengandung lebih
dari 100 macam senyawa seperti pati, protein,
serat, kurkumin, glikosida, toluil metil
karbinol, kalium oksalat, essoil, Lsikloiprenmirsen,
dan
minyak
atsiri.
Kandungan kimia rimpang temulawak yang
memberi arti pada penggunaannya sebagai
bahan pangan, bahan baku industri, dan bahan
baku obat ialah pati, minyak atsiri, dan
kurkuminoid (Sidik et al. 1992). Minyak atsiri
merupakan komponen dalam temulawak yang
memberikan bau yang khas, sedangkan
kurkuminoid yang memberikan warna kuning
pada temulawak terdiri atas kurkumin dan
demetoksikurkumin (Gambar 1c).
CH3
CH3
H3C
CH3
(a)
O
O
OCH 3
H3CO
HO
OH
(b)
O
O
H3CO
HO
OH
(c)
Gambar 1 Struktur xantorizol (a), kurkumin
(b), dan demetoksikurkumin (c).
3
Ekstraksi
Ekstraksi
merupakan
istilah
yang
digunakan untuk mengambil senyawa tertentu
dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
Metode ekstraksi tergantung pada polaritas
senyawa yang akan diekstraksi. Prinsipnya
adalah like dissolve like, yaitu pelarut polar
akan melarutkan senyawa polar dan pelarut
nonpolar akan melarutkan senyawa nonpolar.
Pemilihan pelarut yang digunakan juga
bergantung pada sifat kelarutan zat terlarut
tersebut (Khopkar 2002). Suatu senyawa akan
menunjukkan kelarutan yang berbeda-beda
dalam pelarut yang berbeda pelarut berbeda
pula.
Metode
ekstraksi
yang
paling
konvensional adalah maserasi. Metode
ekstraksi
terus
dikembangkan
untuk
mempersingkat
waktu
ekstraksi
dan
mendapatkan ekstrak yang lebih banyak serta
volume pelarut yang lebih sedikit. Metode
sonikasi menggunakan pengaruh gelombang
ultrasonik
untuk
membantu
proses
penghancuran sel daun sehingga senyawaan
bioaktif yang terdapat di dalam sel akan lebih
cepat keluar dan terlarut dalam pelarut. Selain
itu, proses ekstraksi daun dengan metode
sonikasi akan menghasilkan ekstrak yang
bersifat less degradation product dan hasil
yang besar (Pinarosa & Gaspare 2004).
Pandiangan (2009) melakukan ekstraksi
temulawak menggunakan metode maserasi
menggunakan dua pelarut, yaitu etanol dan
etil asetat, hasil rendemen ekstrak yang
diperoleh dengan menggunakan pelarut etanol
sebesar 8.63% lebih besar daripada pelarut etil
asetat. sebesar 6.67%. Hal ini terjadi karena
komponen polar yang terdapat dalam
temulawak lebih dominan dibandingkan
komponen yang bersifat polar.
Metabolomik
Metabolomik adalah ilmu yang terdiri atas
kimia organik, kimia analitik, kemometrik,
informatik dan biosains. Metabolomik
memungkinkan klasifikasi sampel dan
diskriminasi dari bermacam-macam keadaan
biologi, asal dan kualitas dalam sampel
melalui analisis multivariat dengan metode
kemometrik. Metabolomik digunakan dalam
pendekatan sistem biologi, termasuk manusia,
tumbuhan, dan mikroorganisme. Selain itu,
metabolomik dapat diaplikasikan di bidang
kesehatan, diagnostik, industri pangan,
maupun mikrobiologi (Krastanov 2010).
Beberapa pendekatan untuk metabolomik
yang dapat menggolongkan secara kasar
menurut data kualitas dan jumlah metabolit
yang dapat dideteksi. Pertama adalah
metabolite targeted analysis yang dapat
mendeteksi dan mengkuantifikasi sekelompok
kecil metabolit maupun senyawa target
tunggal. Kedua adalah metabolite profiling
yang dapat mendeteksi, mengidentifikasi, dan
mengkuantifikasi sekelompok besar metabolit
yang dikaitkan dengan jalur biosintesis dari
yang spesifik. Ketiga adalah metabolite
fingerprinting yang dapat digunakan untuk
melengkapi perbandingan metabolom, yang
dapat dilakukan dengan analisis spektra dari
komposis total tanpa perlu mengidentifikasi
kelompok senyawa tersebut (Krastanov 2010).
Ada beberapa langkah dalam analisis
metabolomik antara lain pemprofilan,
identifikasi, validasi, dan interpretasi.
Pemprofilan dilakukan untuk menemukan
metabolit pada sampel. Identifikasi digunakan
untuk menentukan struktur kimia dari
metabolit setelah pemprofilan. Validasi
digunakan untuk memvalidasi senyawa yang
telah
diidentifikasi
dan
biasanya
membutuhkan standar. Interpretasi merupakan
langkah akhir yang dapat menghubungkan
metabolit yang telah ditemukan dengan proses
biologisnya. Alur kerja dari metabolomik
adalah preparasi sampel, analisis, proses data,
dan analisis data (Krastanov 2010).
Pendekatan metabolomik dengan analisis
target dan statistik algoritma juga telah
dilakukan untuk membedakan spesies kopi
yang bertujuan mengontrol kualitas kopi
(Choi et al. 2010). Teknik metabolomik juga
telah
berhasil
mengarakterisasi
profil
metabolit Angelica gigas dari daerah tanam
yang berbeda menggunakan analisis 1H NMR
dan UPLC-MS (Kim et al. 2011) dan studi
metabolit ekstrak bioaktif Pancratium
canariense (Torras et al. 2009).
Kromatografi Gas-Spekrometri Massa
Prinsip kerja GC-MS yaitu pada saat
sampel diinjeksi kedalam injektor sampel
akan diubah menjadi uap yang kemudian
dibawa mengikuti aliran gas pembawa menuju
detektor yang kemudian oleh detektor diubah
menjadi beberapa peak kromatogram yang
mana setiap peak kromatogram dihubungkan
dengan spektrum massa. GC-MS ini biasa
digunakan untuk analisis kualitatif senyawa
organik yang pada umumnya bersifat dapat
diuapkan (volatil).
Kromatografi gas berfungsi sebagai alat
pemisah berbagai komponen campuran dalam
sampel, sedangkan spektroskopi massa
4
berfungsi
mendeteksi
masing-masing
komponen yang telah dipisahkan pada sistem
kromatografi gas. Analisis dengan GC-MS
merupakan metode yang cepat dan akurat
untuk memisahkan campuran yang rumit
maupun menganalisis cuplikan dalam jumlah
yang sangat kecil dan menghasilkan data yang
berguna mengenai struktur serta identifikasi
senyawa organik (Agusta 2000).
Metode GC-MC telah digunakan oleh
Catchpole et al. (2005). untuk menganalisis
senyawa metabolit yang polar (seperti asam
amino, amina aromatik, asam organik, gula,
dan gula alkohol) dalam umbi kentang
Dobson et al. (2010) mempelajari keragaman
fitokimia pada umbi kentang berdasarkan
perbedaan daerahnya. Derwich et al. (2010)
mengidentifikasi senyawa volatil minyak
atsiri pada daun Mentha pulegium yang
tumbuh di daerah Maroko.
Kemometrik
Metode kemometrik merupakan suatu
analisis multivariat yang menyediakan metode
untuk mengurangi data berukuran besar yang
diperoleh dari suatu instrument, seperti
kromatografi. Multivariat merupakan salah
satu teknik analisis kemometrik yang banyak
digunakan untuk analisis matriks kompleks
dan analisis multikomponen pada sistem
sederhana. Metode kalibrasi multivariat dapat
berupa multiple linier regression (MLR),
principal component regression (PCR), dan
artificial neural network (AAN) Analisis
multivariat yang dapat digunakan untuk
pengenalan pola antara lain adalah
exploratory data analysis (EDA) yang terdiri
atas principal component analysis PCA dan
factor analysis (FA), unsupervised pattern
recognation,
dan
supervisaed
pattern
recognation (Brereton 2003).
Analisis Komonen Utama (PCA)
PCA merupakan suatu teknik untuk
mengurangi jumlah peubah dalam suatu
matrik data. Prinsip PCA adalah mencari
komponen utama yang merupakan kombinai
linier dari peubah asli. Secara keseluruhan
kegunaan PCA adalah untuk mengklasifikasi
sampel menjadi grup yang umum, mendeteksi
adanya pencilan (outliers), melakukan
pemodelan data, serta menseleksi variabel
untuk klasifikasi maupun untuk pemodelan.
Komponen-komponen utama ini dipilih
sedemikian rupa sehingga komponen utama
pertama memiliki variasi terbesar dalam set
data, sedangkan komponen utama kedua tegak
lurus terhadap komponen utama pertama dan
memiliki variasi terbesar berikutnya (Miller &
Miller 2000). Kedua komponen utama
pertama ini pada umumnya digunakan sebagai
bidang proyeksi utama pemeriksaan visual
data multivariat.
Uji Letalitas Larva Udang
Uji letalitas larva udang dengan
menggunakan metode BSLT merupakan salah
satu metode uji bioaktif pada penelitian
senyawa bahan alam. Metode ini telah
digunakan sejak tahun 1956 untuk mengetahui
residu peptisida, anastesik lokal, senyawa
turunan morfin, mitotoksin, karsiogenitas
suatu senyawa dan polutan air laut. Beberapa
keuntungan dari uji bioaktivitas menggunakan
larva udang, yaitu waktu uji yang cepat,
murah, sederhana, dan tidak memerlukan
keahlian serta peralatan khusus (Mayer et al.
1982). Senyawa aktif yang memiliki daya
toksisitas tinggi diketahui berdasarkan nilai
lethal concentration 50% (LC50), yaitu nilai
yang menunjukkan konsentrasi zat toksik
yang dapat menyebabkan kematian hewan uji
sampai 50%. Meyer et al. (1982)
menyebutkan tingkat toksisitas suatu ekstrak
LC50 ≤ γ0 µg/mL bersifat sangat toksik, 30
µg/mL ≤ LC50 ≤ 1000 µg/mL bersifat toksik,
dan LC50 > 1000 µg/mL bersifat tidak toksik.
Artemia salina
Artemia salina merupakan kelompok
udang-udangan (Crustaceae) dari filum
Arthropoda, kingdom animalia. A. salina
hidup dilingkungan danau berair asin.
Keunggulan penggunaan A. salina untuk uji
BSLT ialah sifatnya yang peka terhadap
bahan uji, waktu siklus hidup yang lebih
cepat, mudah dibiakkan, dan harganya murah.
Sifat peka A. salina kemungkinan disebabkan
oleh keadaan membran kulitnya yang sangat
tipis sehingga memungkinkan terjadinya
difusi zat dari lingkungan yang mempengaruhi
metabolisme dalam tubuhnya. Uji BSLT
menggunakan A. salina dilakukan dengan
menetaskan telur-telur tersebut dalam air laut
yang dibantu dengan aerasi. Telur A. salina
yang baik digunakan untuk uji BSLT ialah
yang berumur 48 jam sebab jika lebih dari 48
jam dikhawatirkan kematian A. salina bukan
disebabkan toksisitas ekstrak melainkan oleh
terbatasnya persediaan makanan (Meyer et al.
1982).
5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah temulawak yang
diperoleh dari 5 daerah berbeda, yaitu Bogor
(Jawa Barat), Karanganyar (Jawa Tengah),
Sukabumi (Jawa Barat), Sragen (Jawa
Tengah), dan Wonogiri (Jawa Tengah) dengan
umur panen 9 sampai 12 bulan, data
kromatogram hasil analisis GC-MS, etil
asetat, air laut, dan larva udang Artemia
salina. Alat-alat yang digunakan adalah
peralatan gelas, penangas ultrasonik, oven,
penyaring milipore filter unit berukuran 0.45
μm, penguap putar, GC-MS Simadhzu QP
2010, perangkat keras komputer, perangkat
lunak The Unscrambler versi 9.7, AMDIS,
dan SPSS 16.
Metode
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap,
yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian
utama. Penelitian pendahuluan telah dilakukan
oleh Ambarsari et al. (2012) mencangkup
ekstraksi rimpang temulawak dengan pelarut
etil asetat dan analisis menggunakan GC-MS,
sedangkan penelitian utama mencangkup
penentuan kadar air dan kadar abu, evaluasi
metabolit dengan indeks Kovats (IR) dengan
mencocokkan nilai IR yang ada pada koleksi
database NIST 1969 dan diferensiasi
metabolit
dengan
PCA
menggunakan
perangkat lunak The Unscrambler, serta uji
toksisitas ekstrak etil asetat rimpang
temulawak dengan metode BSLT (Lampiran
1).
Preparasi Rimpang Temulawak
Rimpang segar dari 5 daerah dicuci
dengan air bersih, ditiriskan, dirajang kecilkecil, dikeringkan, lalu diserbukan. Preparasi
sampel dilakukan dua kali, sampel yang akan
digunakan untuk analisis dengan GC-MS dan
uji toksisitas.
Analisis Kadar Air (AOAC 2007)
Cawan porselen dikeringkan pada suhu
105 °C selama 30 menit kemudian
didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Sebanyak 2 g serbuk temulawak kering
dimasukkan ke dalam cawan dan dikeringkan
pada suhu 105 °C selama 5 jam kemudian
didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Prosedur ini dilakukan hingga diperoleh bobot
yang tetap. Kadar air contoh ditentukan
dengan persamaan,
Kadar air =
-
× 100%
Keterangan:
A= bobot contoh awal (g)
B= bobot contoh kering (g)
Analisis Kadar Abu (AOAC 2007)
Cawan porselen yang bersih dan kering
dimasukkan
ke
dalam
tanur
untuk
menghilangkan sisa-sisa kotoran yang
menempel di cawan. Setelah didinginkan
dalam eksikator, cawan ditimbang. Sebanyak
2 g serbuk rimpang temulawak kering
dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan
dipanaskan sampai tidak berasap kemudian
dibakar dalam tanur pada suhu 600 °C selama
2 jam sampai diperoleh abu. Cawan berisi abu
didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Kadar abu contoh dihitung dengan persamaan,
Kadar abu =
× 100%
Keterangan:
A= bobot contoh awal (g)
B= bobot abu (g)
Ekstraksi Rimpang dengan Etil asetat
(Ambarsari et al. 2012)
Ekstraksi sampel rimpang temulawak
dilakukan dua kali, pertama ekstrak sampel
yang akan digunakan untuk analisis dengan
GC-MS telah dilakukan oleh Ambarsari et al.
(2012) dan ekstraksi sampel untuk uji
toksisitas. Ekstraksi rimpang temulawak untuk
analisis GC-MS ditimbang sebanyak 200 mg
sampel temulawak dari masing-masing 5
daerah kemudian dilarutkan ke dalam 4 mL
etil asetat dan disonikasi selama 30 menit.
Setelah itu didiamkan selama semalam dan
maserat dikumpulkan dan dipekatkan dengan
penguap putar. Ekstrak yang telah diperoleh
kemudian disaring dengan saringan milipore
0.45 mikron kemudian diinjeksi ke dalam
kolom GC-MS.
Ekstraksi rimpang temulawak untuk uji
toksisitas, ditimbang sebanyak 10 mg sampel
temulawak temulawak dari masing-masing 5
daerah kemudian dilarutkan ke dalam 100 mL
etil asetat dan disonikasi selama 30 menit.
Setelah itu didiamkan selama semalam dan
maserat dikumpulkan dan dipekatkan dengan
penguap putar. Bobot ekstrak kering yang
diperoleh ditimbang. Rendemen setiap ekstrak
dihitung dengan membandingkan bobot
ekstrak yang diperoleh dengan bobot sampel
6
awal. Kadar air sampel digunakan sebagai
faktor koreksi.
Rendemen (%) =
Keterangan:
A = bobot contoh awal (g)
B = bobot ekstrak (g)
C = kadar air
Komponen kimia ekstrak rimpang
temulawak dianalisis dengan GC-MS. Proses
analisis menggunakan GC Shimadzu QP 2010
yang ditendem dengan detektor spektometer
massa Shimadzu QP 2010; kolom kapiler DBsns (J&W) (dimensi 30 m 0.248 nm), film
thickness 0.25 µm, model aliran konstan
dengan laju alir 0.5 mL/menit; gas pembawa
H2; tipe injektor manual dengan volume
injeksi 1 µL; suhu inlet β50 ˚C dengan teknik
injeksi split; suhu awal oven 180 ˚C, waktu
awal 5 menit dengan waktu operasi oven 30
menit; Program suhu diawali dengan 180 ˚C
ditahan 5 menit kemudian diubah perlahanlahan dengan laju kenaikan suhu 14 ˚C/menit
hingga mencapai γ00 ˚C dan ditahan selama 5
menit.
Evaluasi Data GC-MS
Identifikasi senyawa dilakukan dengan
mencocokkan spektra massa yang diperoleh
hasil analisis GC-MS dengan spektra massa
database NIST dan Wiley. Selanjutnya
dilakukan perhitungan nilai indeks Kovats
(IR) menggunakan deret homolog n-alkana
untuk memperkuat dugaan senyawa yang
berhasil diidentifikasi. Konfirmasi komponen
dilakukan dengan mencocokkan nilai IR
komponen
dengan
IR
yang
sudah
dipublikasikan NIST tahun 1969. Nilai indeks
Kovats (IR) dihitung dengan persamaan,
IR=100z + 100[
logt ( 1) - logt
yang muncul sebelum x
= n-alkana dengan jumlah karbon
z + 1 yang muncul setelah x
(Hubschman 2009).
Analisis dengan Prinsip Komponen Utama
Analisis dengan GC-MS
logt ( ) - logt
z+1
]
Keterangan:
IR
= Kovat Indeks retensi
t‟
R(x)
= waktu retensi terkoreksi senyawa x
t‟
Rz
= waktu retensi terkoreksi n-alkana
dengan jumlah karbon z yang
muncul sebelum komponen x
t‟
= waktu retensi terkoreksi n-alkana
R(z+1)
dengan jumlah karbon z+1 yang
muncul setelah x
x
= senyawa yang dipilih
z
= n-alkana dengan jumlah karbon z
Data GC-MS yang telah dievaluasi
kemudian diolah juga dengan metode PCA
menggunakan
perangkat
lunak
The
Unscrambler untuk menentukan metabolit
dominan (penciri) pada masing-masing
rimpang temulawak, sehingga dapat dilakukan
klasifikasi terhadap rimpang temulawak yang
berasal dari daerah berbeda.
Uji
Toksisitas
Ekstrak
Rimpang
Temulawak dengan Metode BSLT
Telur A. salina direndam dalam air laut.
Suhu penetasan adalah 25-γ0˚C selama 48
jam dan siap untuk uji BSLT (Nurhayati et al.
2006). Ekstrak rimpang temulawak ditimbang
sebanyak 0.01 g kemudian dilarutkan dengan
air laut di dalam labu takar 10 mL. Dibuat
stok ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/mL
lalu dibuat bebarapa konsentrasi, yaitu 20, 30,
40, 50, 75 dan 100 µg/mL serta blanko tanpa
penambahan sampel. Pengujian dilakukan
dengan memasukkan 15 ekor larva A. salina
yang berumur 48 jam ke dalam sumur
(multiwell) yang telah berisi air laut kemudian
ditambahkan larutan ekstrak dengan total
volume sumur 2 mL. Setelah 24 jam, jumlah
larva yang mati dihitung dengan bantuan kaca
pembesar.
Parameter yang digunakan adalah jumlah
larva yang mati 50% dari total larva uji.
Kemudian dihitung nilai LC50 dengan
memasukkan angka probit (50% kematian
larva uji). Rumus persen kematian ditentukan
dengan rumus Abbot,
% kematian larva =
15
× 100%
Keterangan:
T = jumlah larva mati
K = jumlah larva kontrol mati
15 = jumlah larva uji
Dengan mengetahui kematian larva
A.salina, kemudian dicari angka probit
melalui tabel probit dan dibuat persamaan
garis,
y = a+bx
dengan y = log konsentrasi
x = angka probit
7
Dari persamaan tersebut, selanjutnya LC50
dihitung dengan memasukkan nilai probit
(50% kematian) (Meyer et al. 1982).
Analisis Statistik
Hasil penelitian diolah menggunakan
perangkat lunak Minitab versi 14 dengan
program analisys of variance (ANOVA) oneway. Selanjutnya dilakukan uji lanjut Duncan
dengan software SPSS versi 16 terhadap
parameter yang dianalisis meliputi hubungan
perlakuan terhadap nilai LC50.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi dan Uji Kualitas Rimpang
Temulawak dengan Metode Uji BSLT
Hasil kadar air ekstrak temulawak dari
sampel Bogor (17.03 0.19%), Sragen (16.89
0.12%), Sukabumi (19.54 1.77%),
Wonogiri (17.97 0.17%), dan Karanganyar
(19.95 1.45%) (Lampiran 2). Kandungan air
rimpang temulawak segar cukup besar,
sehingga tidak baik untuk disimpan dalam
waktu yang lama. Supaya diperoleh kadar air
yang kecil maka rimpang temulawak harus
dikeringkan dahulu agar sampel tidak mudah
rusak dan dapat disimpan pada waktu yang
lama. Menurut Winarno (1992) menyatakan
bahwa kadar air minimum agar bakteri tidak
tumbuh ialah kurang dari 10% sehingga pada
kadar air ini bahan dapat disimpan dalam
jangka waktu yang lama dan risiko terkena
jamur kecil. Penentuan kadar abu juga
dilakukan untuk sampel rimpang temulawak
dari lima daerah yang berbeda yang bertujuan
menentukan kandungan mineral dalam suatu
bahan. Hasil kadar abu ekstrak temulawak
dari sampel Bogor (5.43 0.11%), Sragen
(8.78 0.15%), Sukabumi (6.75 0.17%),
Wonogiri (7.41 0.12%), dan Karanganyar
(6.82 0.12%) (Lampiran 3). Kandungan
mineral rimpang temulawak dari daerah
Sragen lebih banyak tetapi jumlah air yang
terikat
secara
fisik
lebih
sedikit
dibandingankan rimpang temulawak dari
daerah lain.
Sampel rimpang temulawak dari lima
daerah
yang
berbeda
diekstraksi
menggunakan metode maserasi dengan
pelarut etil asetat. Hasil rendemen yang
diperoleh untuk ekstrak dari Bogor (9.38%),
Sragen (8.78%), Sukabumi (9.87%), Wonogiri
(8.84%), dan Karanganyar (9.78%) (Lampiran
4). Rendemen ekstrak ini perlu dikoreksi
kandungan airnya dengan menghitung nilai
persentase kadar air. Keberadaan air dalam
bahan dapat menggangu proses ekstraksi. Jika
kadar air terlalu tinggi maka bahan akan
mudah terserang jamur dan dalam proses
ekstraksi mengakibatkan terhalangnya pelarut
masuk kedalam dinding sel karena pelarut
yang digunakan tidak bisa bercampur dengan
air maka hasil rendemen ekstrak yang
diperoleh sedikit (Meilani 2006).
Uji kualitas rimpang temulawak dilakukan
dengan
menguji
tingkat
toksisitasnya
menggunakan metode BSLT dengan hewan
uji adalah A. salina. Uji toksisitas
menggunakan metode BSLT cukup praktis,
cepat, mudah, dan cukup akurat. Senyawa
aktif yang memiliki daya toksisitas diketahui
berdasarkan nilai lethal concentration 50%,
yaitu suatu nilai yang menunjukkan kosentrasi
zat toksik yang dapat menyebabkan kematian
hewan uji sampai 50%.
Suatu ekstrak dianggap sangat toksik bila
memiliki nilai LC50 ≤ 30 µg/mL, dianggap
toksik bila γ1 µg/mL ≤ LC50 ≤ 1000 µg/mL
dan dianggap tidak toksik bila nilai LC50 di ≥
1000 µg/mL (Meyer et al. 1982). Jadi, jika
nilai LC50 semakin kecil dari suatu ekstrak,
maka senyawa tersebut semakin tinggi
keaktifannya atau semakin toksik (Tabel 1).
Tabel 1
Sampel
Bogor
Nilai LC50 ekstrak rimpang
temulawak
Rerata
kategori
LC
50
LC50
Duncan
26.80
28.21b
sangat
toksisik
21.15a
sangat
toksik
51.28d
toksik
29.62
Sragen
20.41
21.89
Sukabumi
50.58
51.98
Wonogiri
32.35
32.00c
toksik
31.65
Karanganyar
21.47
21.54
21.505a
sangat
toksik
Angka yang diikuti oleh huruf superscripts yang sama
tidak berbeda signifikan pada taraf uji (P