Uricase activity and stability from lactobacillus plantarum immobilized on natural zeolite for uric acid biosensor

AKTIVITAS DAN STABILITAS URIKASE Lactobacillus
plantarum YANG DIIMOBILISASIKAN PADA ZEOLIT ALAM
UNTUK BIOSENSOR ASAM URAT

OKIK WIDIYATMOKO

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

2

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas dan Stabilitas
Urikase Lactobacillus platarum yang Diimobilisasi pada Zeolit Alam untuk
Biosensor Asam Urat adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2012

Okik Widiyatmoko
NIM G44080066

3

ABSTRAK
OKIK WIDIYATMOKO. Aktivitas dan Stabilitas Urikase Lactobacillus
plantarum yang Diimobilisasi pada Zeolit Alam untuk Biosensor Asam Urat. Di
Bawah Bimbingan DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT,
TRIVADILA.
Bakteri Lactobacillus plantarum telah diketahui menghasilkan enzim urikase,
namun aktivitas dan stabilitasnya masih rendah. Metode pengukuran yang lebih
sensitif dan selektif diperlukan untuk mengukur aktivitas dan stabilitas
urikasenya. Voltametri siklik digunakan untuk menentukan perilaku katalitik pada

biosensor. Penelitian ini dilakukan dengan mengimobilisasi urikase L. plantarum
pada zeolit menggunakan mediator terbaik dan kondisi optimum. Penelitian
bertujuan mengukur aktivitas dan stabilitas urikase yang diimobilisasi pada zeolit
alam. Imobilisasi urikase L. plantarum pada zeolit dapat meningkatkan aktivitas
dan stabilitasnya. Mediator terbaik untuk aktivitas urikase ini adalah Q0 (2,3dimetoksi-5-metil-1,4-benzokuinon). Kondisi optimum imobilisasi urikase pada
zeolit adalah pH 8.5, suhu 40 oC, konsentrasi asam urat 0.05 mM, dan massa
zeolit 220 mg. Nilai konstanta Michaelis-Menten dan laju maksimum (KM dan
Vmaks) urikase L. plantarum yang diperoleh dari persamaan Lineweaver-Burk
adalah 6.0292×10-3 mM dan 6.3331 A. Stabilitas urikase ini dapat dijaga selama
18 hari jika disimpan pada suhu 10 oC.
Kata Kunci : Lactobacillus plantarum, mediator, urikase, voltametri siklik, zeolit

ABSTRACT
OKIK WIDIYATMOKO. Uricase Activity and Stability from Lactobacillus
plantarum Immobilized on Natural Zeolite for Uric Acid Biosensor. Supervised
by DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, TRIVADILA.
Lactobacillus plantarum had been known for its ability in producing uricase,
however, its activity and stability still low. Method was needed to measure its
uricase activity and stability. Cyclic voltametry was used to investigate the
catalytic behavior of the biosensor. This research was done with immobilized L.

plantarum uricase on natural zeolite using the best mediator and the optimum
condition. The research aimed to measure uricase activity and stability that was
immobilized on natural zeolite. Uricase immobilized on natural zeolite increasing
uricase its activity and stability. The best mediator for this uricase was Q0 (2,3dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone). The optimum condition for the
immobilized uricase was pH 8.5, temperature 40 oC, uric acid concentration 0.05
mM, and zeolite mass of 220 mg. Michaelis-Menten constant and maximum
velocity (KM and Vmaks) of L. plantarum uricase obtained from Lineweaver-Burk
equation were 6.0292×10-3 mM and 6.3331 A, respectively. The uricase stability
could be kept for 18 days if stored at 10 oC .
Keyword : Cyclic voltametry, Lactobacillus plantarum, mediator, uricase, zeolite

4

AKTIVITAS DAN STABILITAS URIKASE Lactobacillus
plantarum YANG DIIMOBILISASIKAN PADA ZEOLIT ALAM
UNTUK BIOSENSOR ASAM URAT

OKIK WIDIYATMOKO

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

5

stabilitas urikase Lactobacillus plantarum yang Diimobilisasikan pada Zeoam
untuk Biosensor Asam Urat
Judul Skripsi: Aktivitas dan Stabilitas Urikase Lactobacillus plantarum yang
Diimobilisasi pada Zeolit Alam untuk Biosensor Asam Urat
Nama
: Okik Widiyatmoko
NIM
: G44080066

Disetujui oleh

Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MScAgr
Pembimbing I

Dr Novik Nurhidayat
Pembimbing II

Trivadila, SSi, MSi
Pembimbing III

Diketahui oleh

Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
Ketua Departemen

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala karunia
dan rahmat-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Judul skripsi ini adalah
Aktivitas dan Stabilitas Urikase Lactobacillus plantarum yang Diimobilisasi pada
Zeolit Alam untuk Biosensor Asam Urat.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Dyah Iswantini Pradono,
MSc.Agr, Dr Novik Nurhidayat, dan Trivadilla, SSi, MSi selaku pembimbing
penelitian ini atas semua saran dan arahannya mengenai penelitian yang telah
penulis lakukan. Selain itu, saya ucapkan terima kasih pula kepada Bu Ai, Pak
Ismail, Pak Sobur, dan Mas Eko di Laboratorium Kimia Fisik dan Lingkungan,
Kimia Organik, dan Laboratorium Bersama, Departemen Kimia IPB. Mbak Ratih,
Bu Erna, dan Pak Acun di Laboratorium Genetika, Puslit Biologi LIPI.
Ungkapan terima kasih juga dihaturkan kepada Ayah dan Ibu tercinta,
semua saudaraku atas dukungan dan doanya. Penghargaan disampaikan pula
kepada Pak Budi Arifin, Lukman, Liyonawati, Dini, Pak Muamar, Kak Yuanita
serta seluruh teman-teman kimia angkatan 45 atas doa serta kerja samanya.
Bogor, Desember 2012

Okik Widiyatmoko

7

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 23 Oktober 1990 dari ayah Jiyat
dan ibu Sudarti. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2008
penulis lulus dari SMA Negeri 9 Bekasi dan pada tahun yang sama lulus seleksi
masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih
mayor Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti anggota Badan
Kerohanian Islam Mahasiswa (BKIM) pada tahun 2008/2009 dan panitia
beberapa kegiatan di Ikatan Mahasiswa Kimia (IMASIKA) IPB. Selain itu,
penulis pernah aktif menjadi asisten mata kuliah Kimia Tingkat Persiapan
Bersama pada tahun 2009/2010 dan asisten Kimia Fisik pada tahun 2011/2012.
Penulis juga berkesempatan melakukan praktik kerja lapangan di Laboratorium
Quality Control, PT Indofarma, Tbk pada tahun 2011 dengan judul laporan
Analisis Senyawa Aktif Tablet Obat Trihexyphenidyl HCl 2 mg .

8

DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR TABEL .............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ viii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... viii
PENDAHULUAN

1

TINJAUAN PUSTAKA
Biosensor ............................................................................................................ 2
Urikase................................................................................................................ 3
Bakteri L. plantarum ......................................................................................... 4
Imobilisasi Enzim............................................................................................... 4
METODE
Bahan dan alat .................................................................................................... 5
Prosedur Penelitian............................................................................................. 6
Media GYP ........................................................................................................ 6
Penumbuhan dan panen L. plantarum ............................................................... 6
Pembuatan elektrode pasta karbon .................................................................... 6
Aktivasi zeolit .................................................................................................... 6
Imobilisasi L. plantarum ................................................................................... 6

Pengukuran elektrokimia ................................................................................... 7
Penentuan mediator terbaik ............................................................................... 7
Optimasi aktivitas urikase L. plantarum ............................................................ 7
Parameter kinetika ............................................................................................. 7
Penentuan kestabilan elektrode .......................................................................... 8
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penumbuhan dan panen L. plantarum ............................................................... 8
Aktivasi zeolit .................................................................................................... 9
Penentuan mediator terbaik ............................................................................... 9
Perbandingan imobilisasi L. plantarum ........................................................... 11
Optimalisasi aktivitas urikase L. plantarum .................................................... 12
Optimalisasi aktivitas urikase L. plantarum dengan zeolit ............................. 13
Parameter kinetika urikase L. plantarum ........................................................ 14
Penentuan kestabilan elektrode ....................................................................... 18
SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................. 19
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 19

9

DAFTAR TABEL

1 Arus oksidasi beberapa jenis mediator................................................................. 9
2 Arus oksidasi beberapa sampel ......................................................................... 11
DAFTAR GAMBAR
1 Mekanisme kerja biosensor ............................................................................... 3
2 Reaksi urikase dan asam urat .............................................................................. 3
3 Kultur dan pelet L. plantarum ............................................................................ 8
4 Pola difraktogram zeolit Bayah terhadap asam .................................................. 9
5 Voltamogram Mediator .....................................................................................10
6 Voltamogram perbedaan arus beberapa sampel .............................................. 11
7 Plot kontur pengaruh pH, suhu, dan konsentrasi asam urat .............................. 12
8 Plot kontur pengaruh pH, suhu, konsentrasi asam urat dan zeolit ................... 13
9 Kurva linearitas hubungan [substrat] urikase L. plantarum dan murni ............ 14
10 Kurva Lineweaver-Burk urikase L. plantarum dan murni............................... 15
11 Kurva hubungan arus dengan konsentrasi substrat ........................................ 16
12 Kurva stabilitas urikase pada 10oC dan suhu kamar ...................................... 17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penumbuhan sel Lactobacillus plantarum ................................. 21
2 Diagram alir penelitian secara umum ............................................................. 22
3 Penentuan mediator terbaik ............................................................................. 23
4 Hasil pengukuran arus oksidasi imobilisasi tanpa zeolit ................................ 23

5 Perbandingan tanpa imobilisasi pada pH 7.6, 28 oC dan 40 oC ...................... 24
6 Hasil pengukuran arus oksidasi imobilisasi dengan zeolit .............................. 25
7 Penentuan imobilisasi zeolit pada suhu kamar ................................................ 26
8 Imobilisasi zeolit pada pH 7.6, 28 oC dan pH 10, 40 oC ................................. 26
9 Aktivitas urikase Lactobacillus plantarum terhadap [substrat] ...................... 27
10 Perhitungan persamaan Lineweaver-Burk Lactobacillus plantarum .............. 27
11 Perhitungan persamaan Lineweaver-Burk enzim murni ................................. 29
12 Data hasil pengukuran kestabilan elektrode .................................................... 29

1

PENDAHULUAN
Asam urat adalah sisa metabolisme zat purin yang berasal dari makanan
yang kita konsumsi dan hasil samping dari pemecahan sel dalam darah. Penyakit
asam urat (gout) terjadi jika kadar di dalam serum darah tinggi (hiperurisemia)
yang menyebabkan kristal padat mengumpul di persendiaan sehingga
menimbulkan rasa sakit. Kadar normal asam urat dalam darah sebesar 3.5 7
mg/dL untuk pria dan 2.6 6 mg/dL untuk wanita (Mulyasuryani dan Hardiastutie
2011).
Kandungan asam urat dalam tubuh perlu diukur secara akurat dan cepat,
agar penyakit asam urat dapat diobati sejak dini dan tidak timbul komplikasi
penyakit tersebut seperti kardiovaskular, gagal ginjal, dan Lesch-Nyhan. Salah
satu metode yang umum dan banyak digunakan untuk menentukan kadar asam
urat adalah spektrofotometri, yang didasarkan atas serapan maksimum aktivitas
enzim terhadap suatu substrat (Mateo et al. 2007). Metode spektrofotometri saat
ini mulai ditinggalkan, karena kurang spesifik, mahal, dan sangat peka terhadap
cahaya, dan mulai beralih ke biosensor, yaitu suatu perangkat analisis untuk
mendeteksi analit tertentu yang menggabungkan komponen biologis dengan
komponen detektor fisikokimia (Arslan 2008). Keunggulan biosensor tersebut
adalah aplikatif, selektif, praktis, cepat, dan akurat (Mulyasuryani dan
Hardiastutie 2011).
Komponen terpenting dalam penerapan biosensor asam urat adalah enzim.
Salah satu enzim yang berperan mengatalisis reaksi oksidasi asam urat adalah
urikase. Enzim urikase yang pada umumnya diperoleh dari hewan vertebrata,
namun isolasi yang rumit, ketersediaan bahan atau sumber enzim yang minim,
dan biaya yang besar mendorong penggunaan sumber alternatif lain seperti
kapang, khamir, dan bakteri (Attala et al. 2009). Salah satu bakteri yang penghasil
enzim urikase adalah Lactobacillus plantarum yang telah diketahui memiliki
aktivitas yang baik terhadap asam urat. Bakteri ini dipilih karena mudah
diperoleh, ketahanan hidupnya relatif tinggi, dan tidak sulit penanganannya
(Rostini 2007).
Penelitian aktivitas urikase L. plantarum pada berbagai pH, suhu,
konsentrasi enzim, dan konsentrasi substrat, serta kestabilannya telah dilakukan
oleh Mardiah (2010) dengan metode spektrofotometri. Aktivitas enzim urikase L.
plantarum yang dihasilkan pada suhu, pH, dan konsentrasi optimum dengan
substrat asam urat masih sangat rendah bila dibandingkan dengan menggunakan
enzim urikase murni. Selain itu, kestabilannya pun rendah, yaitu hanya stabil
sampai hari ke-2. Rendahnya aktivitas dan kestabilan enzim urikase L. plantarum
diduga karena kurang selektifnya kinerja spektrofotometer dalam menentukan
aktivitas urikase terhadap substrat. Oleh sebab itu, dilakukan penelitian ini untuk
mengimobilisasi enzim urikase L. plantarum pada suatu nanomaterial untuk
mendapatkan selektivitas dan kestabilan yang lebih baik.
Pemilihan metode imobilisasi yang tepat perlu dilakukan agar respons arus
yang dihasilkan tinggi. Salah satunya adalah dengan mengimobilisasi pada
nanokomposit, yaitu kombinasi 2 atau lebih material berbeda dalam ukuran
nanometer. Penelitian ini menggunakan zeolit sebagai media pengimobilisasi
karena Indonesia memiliki potensi zeolit alam yang cukup besar. Sejauh ini,
belum ada penelitian penggunaan zeolit alam sebagai material pengimobilisasi

2

enzim urikase bakteri L. plantarum. Oleh karena itu, penelitian penggunaan zeolit
sebagai pengimobilisasi untuk enzim urikase yang berasal dari bakteri L.
plantarum perlu untuk dilakukan. Penelitian ini bertujuan mengukur aktivitas dan
kestabilan enzim urikase L. plantarum yang diimobilisasi pada zeolit alam dengan
metode elektrokimia.

TINJAUAN PUSTAKA
Biosensor
Metode yang umumnya banyak digunakan di bidang kedokteran untuk
menentukan kadar asam urat adalah metode sinar-X, metode test strip dengan alat
UA Sureblood uric meter, metode spektrofotometri, dan mikroskop polarisasi
(Kertia dan Widodo 2009). Metode tersebut memiliki banyak kekurangan, seperti
alat yang kurang stabil, biayanya yang mahal, sensitifitas, dan selektifitas yang
rendah merupakan beberapa faktor mulai dikembangkan metode baru yang
memiliki sensitifitas dan selektifitas yang lebih tinggi dari metode sebelumnya
yaitu biosensor, suatu alat yang mengubah respon biologi menjadi sinyal listrik
agar mudah diperoleh informasi di dalamnya. Biosensor yang menggunakan
enzim sebagai elemen biologi dikenal sebagai biosensor berbasis enzim (Chaplin
2004). Biosensor berbasis enzim mulai diperkenalkan pertama kali oleh Prof
Leland C Clark pada tahun 1961. Biosensor ini banyak dikembangkan untuk
mengukur kandungan asam urat (Shankar et al. 2011, Yao et al. 2007,
Mulyasuryani dan Hardiastutie 2011, Ardakani et al. 2010), kapasitas antioksidan
(Pisoschi et al. 2009, Coban 2008), kadar gula (Nien et al. 2006, Iswantini et al.
2011, Kotzian et al. 2006), kolestrol (Yang et al. 2011, Li dan Gu 2006, Nien et
al. 2006), dan lain-lain.
Biosensor berbasis enzim pada dasarnya terdiri dari tiga unsur, yaitu unsur
biologi, transduser, dan sistem elektronik pemroses sinyal. Unsur biologi yang
umumnya digunakan dalam mendesain suatu biosensor dapat berupa enzim,
organel, jaringan, bakteri, jasad renik, dan DNA (Martin 2011). Salah satu enzim
yang digunakan untuk biosensor asam urat adalah urikase. Mekanisme kerja
biosensor asam urat diawali dengan reaksi oksidasi asam urat menjadi allantoin,
karbon dioksida, dan peroksida yang dikatalisis oleh urikase. Elektron yang
dihasilkan dari proses oksidasi tersebut akan mereduksi mediator dan terjadi
perubahan elektron yang lebih jelas. Perubahan elektron tersebut dideteksi oleh
elektrode dan diubah menjadi sinyal listrik oleh transduser (Varoyd et al. 2007).

3

Elektrode

Mediator

Transduser

Gambar 1 Mekanisme kerja biosensor asam urat (Martin 2011)
Penelitian penentuan asam urat secara elektrokimia sudah banyak diteliti
dan akan terus berkembang guna menghasilkan biosensor dengan tingkat
selektifitas dan sensitifitasnya yang tinggi. Penelitian yang telah dilakukan di
antaranya, Wang et al. (2006) yang memodifikasi elektrode karbon gelas dengan
poly(p-toluena asam sulfonat) menghasilkan reprodusibilitas yang baik,
selektifitasnya tinggi, dan sensitivitasnya sangat baik dalam menentukan asam
urat dan asam askorbat. Yao et al. (2007) memodifikasi elektrode karbon gelas
dengan poly(eriocrom black-T) menghasilkan sensitivitas yang bagus dan limit
deteksi yang sangat baik dalam menentukan asam urat, dopamin, dan asam
askorbat pada sampel biologi. Shishehbore dan Nasirizadeh (2009) memodifikasi
elektrode pasta karbon dengan turunan koumestan yang menghasilkan aktivitas
elektrokatalis yang baik pada penentuan asam urat. Zhang et al. (2010)
memodifikasi elektrode gelas dengan lapisan komposit CTAB/kitosan yang dapat
menghasilkan arus yang stabil dalam penentuan asam urat dan asam askorbat.
Shankar et al. (2011) memodifikasi elektrode pasta karbon dengan polykristal
violet menghasilkan stabilitas, sensitivitas, dan sensitivitas yang tinggi serta
reprodusibel.
Urikase
Urikase (asam urat oksidase) merupakan enzim yang memiliki peran
penting dalam metabolisme nitrogen dan katalis spesifik untuk oksidasi asam urat
dengan bantuan air dan oksigen (Gambar 2). Enzim ini memiliki berat molekul
sebesar 125000 g/mol dengan nilai Km dan pH optimum beragam sesuai sumber
enzimnya. Katalisis enzim ini dilakukan dengan cara membuka cincin purin pada
asam urat dengan keberadaan oksigen sebagai oksidator (Arslan 2008).

+ CO2+ H2O2

Asam Urat

Allantoin

Gambar 2 Reaksi urikase dengan asam urat (Arslan 2008)

4

Urikase murni umumnya diperoleh dari hati sapi dan babi yang telah
mengalami proses pemurnian. Penggunaan enzim murni memiliki beberapa
kendala terutama harga enzim yang mahal. Oleh sebab itu, pemanfaatan
mikroorganisme penghasil urikase adalah solusi untuk menekan biaya. Urikase
saat ini telah banyak diisolasi dari beberapa mikroorganisme, misalnya berasal
dari kapang adalah Saccaropolyspora sp. PNR 11 (Dmytruk et al. 2011) dan
Hanasunula polmorpha (Dmytruk et al. 2011); berasal dari khamir adalah
Candida utilis (Dmytruk et al. 2011) dan Gliomastix gueg (Atalla et al. 2009);
sedangkan yang berasal dari bakteri adalah Pseudomonas aerugenosa (Atalla et
al. 2009), Microbacterium sp. (Atalla et al. 2009), Bacillus thermochatelunatus
(Atalla et al. 2009), dan L. plantarum (Mardiah 2010).
Bakteri L. plantarum
Bakteri L. plantarum termasuk ke dalam kingdom Bacteria, filum
Firmicutes, kelas Bacili, ordo Lactobacillus, familia Lactobacillaceae, dan genus
Lactobacillus. Bakteri ini merupakan salah satu jenis bakteri asam laktat (BAL)
homofermentatif dengan suhu optimum kurang dari 30oC dan memiliki pH
optimum untuk pertumbuhan sebesar 6.5. Bakteri L. plantarum memiliki ciri,
yaitu berbentuk batang, tidak bergerak (nonmotil), bersifat katalase negatif, aerob
atau fakultatif anaerobik, mampu mencairkan gelatin, dan toleran terhadap asam.
Selain itu, bakteri ini termasuk ke dalam bakteri gram positif. Ciri bakteri gram
positif adalah dinding selnya terdiri atas 60 100 persen peptidoglikan dan semua
bakteri gram-positif memiliki polimer lurus asam N-asetil muramat dan N-asetil
glukosamin. Jika dinding sel beberapa bakteri gram positif diberi pewarna gram
akan menghasilkan warna ungu (Rostini 2007).
Bakteri L. plantarum telah diketahui dapat menghasilkan beberapa enzim
yang dapat dimanfaatkan sebagai komponen pengenal hayati biosensor. Enzim
yang dihasilkan oleh bakteri tersebut adalah piruvat oksidase (POX) yang
digunakan pada biosensor fosfat (Gavalas dan Chaniotakis 2001), laktat oksidase
(LOX) yang digunakan pada biosensor asam laktat (Gamella 2010), dan urikase
oksidase yang dapat digunakan untuk biosensor asam urat (Mardiah 2010).
Imobilisasi Enzim Urikase
Enzim oksidareduktase umumnya banyak digunakan dalam biosensor
elektrokimia karena enzim tersebut dapat menghasilkan atau menggunakan
elektron untuk mengkatalisis suatu substrat menjadi produk, dimana elektron ini
yang dideteksi (Grieshaber et al. 2008). Beberapa permasalahan akan timbul
ketika menggunakan enzim dalam biosensor yaitu pemulihan enzim, stabilitas
enzim, selektifitas enzim, dan reduksi inhibisi oleh medium atau produk. Menurut
Mateo et al. (2007) permasalahan tersebut dapat diatasi dengan melakukan
imobilisasi enzim dengan menggunakan material tertentu. Fungsi dari imobilisasi
enzim itu sendiri agar enzim dapat digunakan dan diolah kembali sehingga
biayanya lebih murah, menggunakan peralatan yang sederhana, dan dapat
mengontrol reaksi. Stabilitas enzim dapat dijaga dan dikontrol dengan cara
melakukan imobilisasi pada material yang memiliki pori dan untuk meningkatkan
selektifitasnya dapat digunakan nanomaterial (Weniarti 2011).

5

Zeolit memiliki kerangka terbuka sehingga memungkinkan untuk
melakukan adsorpsi ion yang bermuatan positif bertukar dengan Na, Ca, dan K
maupun Al dengan Si (Mutngimaturrahma et al. 2003). Medan elektrostatik yang
kuat di dalam rongga-rongga zeolit menghasilkan interaksi yang sangat kuat
dengan molekul polar seperti air. Molekul nonpolar juga dapat diserap dengan
kuat berkaitan dengan tenaga polarisasi dari medan listrik yang ada, sehingga
separasi dapat dilakukan oleh zeolit (Widianti 2006). Oleh karena sifatnya
tersebut, zeolit banyak dimanfaatkan sebagai katalis, penukar ion, adsorben, dan
filter.
Nanopartikel zeolit yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari alam,
yaitu tepatnya berasal dari Bayah, Banten, Jawa Barat. Mineral zeolit alam
umumnya terdapat dalam bentuk batuan modernit, klinoptilotit, barerit, kabalsit,
stilbit, analkim, dan laumonlit. Zeolit yang berasal dari Bayah dominannya
berjenis klinoptilotit yang merupakan zeolit dengan kandungan Si sedang dan
terbentuk karena sedimentasi vulkanik. Zeolit klinoptilotit memiliki rumus
molekul (Na4K4)(Al8Si40O96). 24H2O dengan kerangka Al dari zeolit tersebut
tidak stabil terhadap panas dan asam (Ginting et al. 2007).

METODE
Penelitian aktivitas dan stabilitas urikase L. plantarum diawali dengan
pembuatan media GYP, penumbuhan dan pemanenan L. plantarum, pembuatan
elektrode pasta karbon, aktivasi zeolit, imobilisasi L. plantarum, pengukuran
elektrokimia, penentuan mediator terbaik, optimalisasi aktivitas urikase L.
plantarum, penentuan kinetika, dan penentuan kestabilan elektrode. Bagan alir
penelitian secara umum ditampilkan pada Lampiran 1 dan 2.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah bufer borat, sel L.
plantarum Mar8, NaCl 0.85% (Himedia, India), akuades, grafit, minyak parafin,
glukosa (Himedia, India), pepton (Himedia, India), natrium asetat (Himedia,
India), larutan garam, tween 80 (Applichem, Jerman), beef extract (Difco, USA),
yeast extract (Himedia, India), DMSO (Merck, Jerman), HCl 3 M (Merck,
Jerman), K3[Fe(CN)6] (Merck, Jerman), 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4 benzokuinon
(QO) (Sigma, Jerman), ferosen (Merck, Jerman), urikase (Sigma, Jerman), asam
urat (Nacalaic tesque, Japan), dan zeolit. Alat yang digunakan pada penelitian ini
adalah oven, tanur, inkubator (Sanyo), autoklaf (Hariyama), sentrifus (Kokusan
H-1500 F), seperangkat alat voltameter siklik (E-Daq potensiostat E-Corder 410),
gelas piala, labu takar, gelas pengaduk, termometer, pipet mikrometer (Gilson),
pinset, pipet mohr/volumetrik, pH meter (TOA DK HM-250), spektrofotometer
UV-Vis (Shimadzu), dan elektrode.

6

Prosedur Penelitian
Media GYP (Glucose Yeast Peptone) (Mardiah 2010)
Media GYP padat dibuat dengan menimbang sebanyak 3.75 gram kalsium
karbonat, 20 gram agar, 10 gram glukosa, 5 gram pepton, 1,4 gram natrium asetat,
5 ml larutan garam, 10 ml tween 80, 2 gram beef extract, dan 10 gram yeast
extract dilarutkan dalam 1000 ml akuades dan diaduk hingga larut. Setelah itu,
larutan kemudian diautoklaf. Media GYP cair padat dibuat sama seperti di atas
tetapi tanpa penambahan agar dan kalsium karbonat.
Penumbuhan dan Pemanenan L. plantarum (Mardiah 2010)
Sebanyak 5 ml media GYP cair dipipet ke dalam tabung reaksi. Sebanyak 1
ose bakteri L. plantarum murni ditanam ke media GYP cair tersebut dan
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah 24 jam, larutan tersebut diukur
nilai OD600 hingga mencapai 0.5. Setelah itu, larutan tersebut dipindahkan ke-50
ml media GYP cair dan dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
Sebanyak 5 ml larutan larutan GYP cair yang sudah ditumbuhi L. plantarum
dipipet ke tabung sentrifus dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm selama 10
menit. Setelah itu, pelet dicuci 2 kali dengan akuades steril dan disentrifus pada
kecepatan 10000 rpm selama 5 menit. Pelet L. plantarum yang sudah bersih diberi
larutan fisiologis (NaCl 0.85%) sebanyak 1 ml, kemudian diukur nilai OD600 = 1.
Pembuatan Elektrode Pasta Karbon (Weniarti 2011)
Elektrode pasta karbon dibuat dengan cara grafit dicampur dengan parafin
cair (2:1), lalu digerus dengan mortar hingga terbentuk pasta. Setelah itu, pasta
karbon dimasukkan ke dalam badan elektrode. Permukaan elektrode dihaluskan
dan dibersihkan dengan amplas dan kertas minyak. Elektrode didiamkan selama 2
hari sebelum digunakan.
Aktivasi Zeolit (Arif 2011)
Sebanyak 50 gram zeolit halus dicuci dengan akuades sampai pH netral,
disaring, dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC. Zeolit yang telah
dikeringkan diaktivasi dengan menambah 250 ml HCl 3 M dalam gelas piala
plastik dan diaduk selama 1 jam. Zeolit yang telah diaktivasi disaring, kemudian
dicuci dengan akuades sampai pHnya netral. Larutan hasil saringan diuji
kandungan klorin dengan AgNO3 dan dicuci kembali dengan akuades sampai
tidak mengandung klorin. Setelah pHnya netral dan bebas klorin zeolit
dikeringkan pada suhu 300 oC selama 3 jam. Zeolit yang telah diaktivasi
kemudian dihaluskan dan diayak dengan ayakan 100 mesh.
Imobilisasi L. plantarum
Matriks nanokomposit zeolit disuspensikan ke dalam 1 ml larutan fisiologis
yang berisi pelet L. plantarum. Campuran tersebut kemudian diaduk dan
didiamkan selama 1 jam. Sebanyak 7.5 l pelet L. plantarum yang telah
diimobilisasi dalam matriks zeolit diteteskan pada permukaan elektrode, dilapisi
dengan membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon, dan diikat dengan parafilm.
Imobilisasi tanpa zeolit dilakukan dengan cara meneteskan secara langsung L.
plantarum pada permukaan elektrode.

7

Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik
menggunakan eDAQ potensiostat (Ecorder 410) yang dilengkapi perangkat lunak
Echem v 2.1.0. Elektrode yang digunakan adalah elektrode Ag/AgCl, platina, dan
pasta karbon yang berturut-turut sebagai elektrode pembanding, elektrode
pembantu (counter), dan elektrode kerja. Parameter pengukuran dibuat dengan
mode cyclic, initial -500 mV, final -500 mV, rate 250 mV/s, step W 20 ms, upper E
800mV, lower E -500 mV, range 5 V, dan arus 100 A.
Sebanyak 2 ml larutan bufer boraks ditambahkan ke dalam sel pengukuran,
lalu puncak arus yang terbentuk diamati sebagai puncak blanko. Selanjutnya,
ditambahkan mediator sebanyak 100 L dan diukur kembali perubahan atau
kenaikan puncak arus yang terjadi. Setelah itu, ditambahkan 100 L asam urat dan
diukur kembali perubahan atau kenaikan puncak arus yang terjadi.
Penentuan Mediator Terbaik (Trivadila 2011)
Sebanyak 10 mM masing-masing mediator dibuat dengan cara dilarutkan
dalam DMSO untuk Ferosena dan 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4-benzokuinon (Q0).
Sedangkan untuk K3[Fe(CN)6] dilarutkan dengan akuabides steril. Setelah itu,
larutan mediator diukur secara elektrokimia dengan menggunakan elektrode kerja
pasta karbon yang telah diimobilisasi dengan pelet L. plantarum tanpa zeolit.
Mediator yang menghasilkan arus paling tinggi adalah mediator terbaik.
Optimalisasi Aktivitas Urikase L. plantarum
Optimalisasi yang akan dilakukan adalah suhu (25 45 oC), pH (7 10),
konsentrasi asam urat (0.001 0.05 mM), dan berat zeolit (30 240 mg). Metode
yang digunakan untuk pengoptimuman aktivitas urikase adalah Respon Surface
Method. Metode ini dilakukan dengan cara memasukan kombinasi faktor-faktor
peubah bebas pada perangkat lunak statistik minitab. Setelah itu, percobaan
dilakukan sesuai dengan kombinasi yang dihasilkan untuk mendapatkan nilai
aktivitas optimumnya.
Parameter Kinetik (Weniarti 2011)
Penentuan parameter kinetik dilakukan setelah diperoleh kondisi optimum
aktivitas urikase. Parameter kinetik ekstrak enzim urikase Lactobacillus
plantarum yang diimobilisasikan ditentukan dengan menggunakan persamaan
Michealis-Menten :
I=

[

]

[

]

dengan
adalah respon arus maksimal yang terukur (apperent),
adalah
konstanta Michaelis-Menten dan [Asam urat] adalah konsentrasi asam urat.
Persamaan yang didapat dibuat turunannya, yaitu plot Lineweaver-Burk.
Prosedur pengukuran adalah sama, namun pada uji kinetika ini, konsentrasi
substrat radikal urikase divariasikan, yaitu dengan memvariasikan konsentrasi
asam urat antara 0.001 0.05 mM.

8

Penentuan Kestabilan Elektrode (Taufan 2012)
Stabilitas elektrode ditentukan dari pengukuran aktivitas enzim urikase
setelah didapatkan kondisi optimumnya. Pengukuran aktivitas secara langsung
dilakukan pada elektrode yang telah dibuat dengan imobilisasi enzim urikase pada
permukaan elektrode. Elektrode diukur ulang tiap kurun waktu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
hari dan seterusnya hingga terjadi penurunan % stabilitas aktivitas urikase.
Presentasi kestabilan elektrode dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
% Stabilitas = (100% ([

(

)

] 100 %)

HASIL DAN PEMBAHASAN
Penumbuhan dan Pemanenan L. plantarum
Bakteri L. plantarum ditumbuhkan pada media GYP cair dan diinkubasi
pada suhu 37 oC, yaitu suhu optimum pertumbuhan L. plantarum. Salah satu ciri
bahwa L. plantarum tumbuh pada media GYP cair adalah terbentuknya warna
putih pada dinding kaca tabung reaksi (Gambar 3a). Pemanenan L. plantarum
dilakukan dengan mengempar media GYP cair yang telah ditumbuhi bakteri. Pelet
L. plantarum yang mengendap di dasar (Gambar 3b).

(a)
(b)
Gambar 3 Kultur L. plantarum menempel pada dinding kaca tabung reaksi (a)
dan pelet L. plantarum yang terpisah dari media (b)
Berdasarkan Gambar 3a, L. plantarum dapat menempel dengan baik pada
dinding kaca. Oleh karena itu, L. plantarum sangat sesuai sebagai
pengimobilisasi. Penelitian ini mengimobilisasi sel bakteri L. plantarum secara
langsung ke permukaan elektrode dan zeolit karena berdasarkan penelitian
Mardiah (2010) bakteri L. plantarum sudah dapat mengeksresikan urikase di
dinding selnya sehingga tidak diperlukan pemecah dinding sel bakteri tersebut.
Aktivasi Zeolit
Zeolit alam yang digunakan pada penelitian ini adalah zeolit Bayah. Zeolit
alam umumnya ditemukan dalam bentuk batuan besar dan pori-porinya tertutup
oleh tanah, kuarsa, serta logam-logam lain (Fe, Na, K, Ca, Mg dan lain-lain)

9

(Ginting et al. 2007). Oleh karena itu, pada penelitian ini zeolit terlebih dahulu
dihaluskan dan diaktivasi. Penghalusan zeolit akan memperluas permukaannya
sehingga dapat meningkatkan efisiensi proses dan meningkatkan kemungkinan
dihasilkannya permukaan yang lebih seragam (Arif 2011).
Aktivasi zeolit pada penelitian ini dilakukan secara fisik dan kimia.
Aktivasi secara fisis dilakukan dengan cara pemanasan pada suhu 300 400 oC,
agar zeolit mengalami dehidrasi, yang membuka pori-pori atau rongga-rongga
utama pada zeolit (Widianti 2006). Aktivasi kimia dilakukan pada suasana asam,
untuk membuang pengotor, mengatur kembali letak atom yang dapat
dipertukarkan, dan diharapkan dapat menaikkan daya tukar kationnya (Widianti
2006). Digunakan konsentrasi HCl yang tinggi, yaitu HCl 3 M untuk
mempersingkat waktu aktivasi. Penggunaan konsentrasi tinggi ini tidak merusak
struktur zeolit. Pola difraktogram pada Gambar 4 tidak memperlihatkan
perubahan signifikan setelah aktivasi zeolit dengan berbagai konsentrasi HCl
hingga 3 molar.

Gambar 4 Pola difraktogram zeolit Bayah dengan perlakuan asam (Arif 2011)
Penentuan Mediator Terbaik
Mediator merupakan agen pentransfer elektron yang mudah berpartisipasi
dalam reaksi redoks dengan komponen biologis tertentu sehingga dapat
mempercepat proses transfer elektron pada reaksi enzimatis. Mediator terbaik
adalah yang memberikan arus paling tinggi pada proses oksidasi senyawa tertentu
(Jiang dan Zhao 2010).
Dari ketiga jenis mediator, yaitu K3[Fe(CN)6], 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4benzokuinon (Q0), dan ferosena (Fe(C5H5)2), mediator terbaik untuk proses
oksidasi asam urat oleh urikase L. plantarum adalah Q0. Berdasarkan Tabel 1, Q0
memberikan arus oksidasi paling tinggi dibandingkan dengan mediator yang lain.
Nilai arus oksidasi ditentukan dengan mengukur puncak oksidasi pada kurva
voltamogram (Gambar 5) menggunakan program Echem v2.1.0. Data hasil
pengukuran dapat dilihat pada Lampiran 3.
Tabel 1 Arus oksidasi rata-rata beberapa jenis mediator
Mediator
Q0
Ferosena
K3[Fe(CN)6]

Arus Oksidasi ( A)
28.2800
5.4400
4.2100

10

(a)

(b)

(c)
Gambar 5 Voltamogram (a) QO, (b) Ferosena, dan (c) K3Fe(CN)6; Bufer (
dan mediator (
)

)

Perbandingan Imobilisasi L. plantarum
Dua jenis metode imobilisasi urikase L. plantarum dibandingkan dalam
penelitian ini, yaitu imobilisasi langsung ke permukaan elektrode pasta karbon
dan imobilisasi pada zeolit baru kemudian ke permukaan elektrode. Jumlah sel L.
plantarum yang digunakan untuk setiap imobilisasi adalah 7.5 × 105 cfu/ml.
L. plantarum yang diimobilisasi pada zeolit terlebih dahulu menghasilkan
respons arus lebih tinggi daripada yang langsung ke permukaan elektrode (Tabel
2). Hasil ini sesuai dengan penelitian Varoyd et al. (2007) : modifikasi elektrode
pasta karbon dengan zeolit dan metilena biru sebagai mediator dapat
menghasilkan arus oksidasi yang baik. Khalilzadeh et al. (2009) melaporkan
modifikasi elektrode pasta karbon dengan nanokomposit zeolit dan FeCl3 sebagai
mediator yang ternyata dapat meningkatkan arus yang dihasilkan dibandingkan

11

tanpa zeolit. Ardacani et al. (2009) menggunakan nanokomposit zeolit dan
elektrode pasta karbon dapat meningkatkan sensitivitas dan arus pada penentuan
logam Cu2+. Kemampuan zeolit meningkatkan respon arus dikarenakan zeolit
memiliki rangka dan pori yang seragam sehingga enzim yang terjerap
menghasilkan selektivitas dan keterulangan yang lebih tinggi (Weniarti 2011).
Voltamogram perbedaan metode imobilisasi dapat dilihat pada Gambar 6.
Tabel 2 Arus oksidasi beberapa sampel
Arus Oksidasi ( A)
1.3300
3.3000
5.5700
14.4200

Arus ( A)

Sampel
Bufer
Q0
Asam urat
Asam urat , Zeolit

Gambar 6 Voltamogram perbedaan arus oksidasi beberapa sampel; bufer (
QO (
), asam urat (
), dan asam urat dengan zeolit (
)

),

Optimalisasi Aktivitas Urikase L. plantarum
Optimalisasi untuk aktivitas urikase L. plantarum dilakukan dengan
menggunakan rancangan percobaan metode respons permukaan (RSM) meliputi
parameter suhu (25 45 oC), pH (7 10), dan konsentrasi asam urat (0.001 0.05
mM), (Lampiran 4). Gambar 7 memperlihatkan alur kontur hubungan suhu
dengan pH (a), suhu dengan konsentrasi asam urat (b), dan konsentrasi asam urat
dengan pH (c). Kondisi optimum aktivitas urikase L. plantarum diperoleh pada
pH 7.6, suhu 40 oC, dan konsentrasi asam urat 0.05 mM. Daerah optimum tersebut
ditunjukkan dengan warna alur kontur yang semakin gelap dan arus oksidasi yang
tinggi. Hasil optimalisasi yang diperoleh digunakan untuk pengukuran
selanjutnya.

12
Contour Plot of Arus vs [asam urat]; Suhu

Contour Plot of Arus vs pH; Suhu

0,05
Arus
< 2
2- 3
3- 4
4- 5
5- 6
> 6

9,5

pH

9,0

Hold Values
[asam urat] 0,0255

8,5

Arus
< 2
2- 3
3- 4
4- 5
5- 6
6- 7
> 7

0,04

[asam urat]

10,0

0,03

Hold Values
pH 8,5

0,02

8,0

0,01

7,5

7,0
25,0

27,5

30,0

32,5 35,0
Suhu

37,5

25,0 27,5

40,0

(a)

30,0 32,5 35,0
Suhu

37,5 40,0

(b)
Contour Plot of Arus vs [asam urat]; pH

0,05

Arus
< 3
3 - 4
4 - 5
5 - 6
> 6

[asam urat]

0,04

Hold Values
Suhu 32,5

0,03

0,02

0,01

7,0

7,5

8,0

8,5
pH

9,0

9,5

10,0

(c)
Gambar 7 Alur kontur hubungan suhu dengan pH (a), suhu dengan konsentrasi
asam urat (b), dan konsentrasi asam urat dengan pH (c)
Sensor tidaklah praktis bila digunakan pada suhu 40 oC. Oleh karena itu,
dilakukan pengukuran pada suhu kamar. Arus yang diperoleh dari hasil
pengukuran tersebut tidaklah berbeda jauh dengan suhu 40 oC (Lampiran 5)
sehingga sensor dapat digunakan pada suhu kamar. Hasil yang diperoleh dengan
kondisi optimum penelitian Mardiah (2010) menggunakan metode
spektrofotometri, yaitu aktivitas urikase L. plantarum adalah pada pH 8.5 dan
suhu 35 oC. Ini dikarenakan perbedaan sensitivitas dan selektivitas kinerja alat
yang digunakan.
Optimalisasi Aktivitas Urikase L. plantarum dengan Zeolit
Optimalisasi aktivitas urikase L. plantarum yang diimobilisasi pada
nanokomposit zeolit dilakukan untuk melihat pengaruh penambahan zeolit
terhadap aktivitas dan stabilitas urikase. Parameter yang dioptimalkan adalah suhu
(25 45 oC), pH (7 10), konsentrasi asam urat (0.001 0.05 mM), dan massa zeolit
(30 240 mg), (Lampiran 6). Alur kontur pada Gambar 8 menunjukkan kondisi

13

optimum L. plantarum yang diimobilisasi pada nanokomposit zeolit, pH 10, suhu
40 oC, konsentrasi asam urat 0.05 mM, dan massa zeolit 225 mg.
Contour Plot of arus vs pH; Suhu
10,0

arus
< 6
6 - 7
7 - 8
8 - 9
9 - 10
> 10

9,5

200
175

Zeolit

pH

9,0

arus
< 5
5 - 6
6 - 7
7 - 8
> 8

225

8,5

8,0

150
125
100
75

7,5

50

7,0
25,0

27,5

30,0

32,5
Suhu

35,0

37,5

40,0

25,0

27,5

30,0

(a)

35,0

37,5

40,0

(b)

Contour Plot of arus vs [asam urat]; Suhu
0,05

Contour Plot of arus vs Zeolit; pH
arus
< 6
7
8
9
- 10
- 11
> 11

225

6
7
8
9
10

0,04

0,03

5,5
6,0
6,5
7,0

200
175
Zeolit

[asam urat]

32,5
Suhu

arus
< 5,5
- 6,0
- 6,5
- 7,0
- 7,5
> 7,5

150
125

0,02
100
75

0,01

50

25,0

27,5

30,0

32,5
Suhu

35,0

37,5

7,0

40,0

(c)

8,0

8,5
pH

9,0

9,5

10,0

(d)

Contour Plot of arus vs [asam urat]; pH

Contour Plot of arus vs [asam urat]; Zeolit
0,05
arus
< 5
5 - 6
6 - 7
7 - 8
8 - 9
9 - 10
> 10

0,04

0,03

0,02

arus
< 4
4 - 6
6 - 8
8 - 10
> 10

0,04

[asam urat]

0,05

[asam urat]

7,5

0,03

0,02

0,01

0,01

50

75

100 125 150 175 200 225
Zeolit

(e)

7,0

7,5

8,0

8,5
pH

9,0

9,5

10,0

(f)

Gambar 8 Alur kontur hubungan suhu dengan pH (a), suhu dengan zeolit (b),
suhu dengan asam urat (c), pH dengan zeolit (d), zeolit dengan asam
urat (e), dan pH dengan asam urat
Perbedaan pH imobilisasi dan tanpa imobilisasi pada zeolit kemungkinan
dikarenakan adanya interaksi yang terjadi antara enzim dengan zeolit sehingga

14

mempengaruhi aktivitas enzim urikase. Nilai pH yang diperoleh masuk ke dalam
selang imobilisasi maksimum enzim urikase yaitu 7.5-10 (Mulyasuryani dan
Hardiastutie 2011). Sensor menjadi kurang praktis bila digunakan pada suhu 40
o
C. Oleh dikarena itu, pengoptimalan pada suhu kamar dilakukan dengan faktor
pH dan suhu (Lampiran 7) sehingga diperoleh kondisi pH 7.6, suhu 28 oC,
konsentrasi asam urat 0.05 mM, dan massa zeolit 225 mg (Lampiran 8).
Kinetika Urikase L. plantarum
Spesifitas enzim terhadap substrat dapat ditentukan dari parameter kinetika
enzim, yaitu tetapan Michaelis-Menten (KM) dan laju maksimum (Vmaks) yang
dianalogikan dengan arus maksimum. Parameter kinetika enzim ditentukan
dengan mengukur aktivitas urikase L. plantarum pada konsentrasi substrat
0.001 0.05 mM. Data hasil pengukuran aktivitas ditampilkan pada Lampiran 6
dan dialirkan pada Gambar 9.
7.5

Aktivitas Urikase ( A)

7

y = 5.4347 + 434.5643x
R2 = 97.21%
y= 3.5560 + 494.4942x
R2 = 98.77%

6.5
6
5.5
5
4.5

Urikase
murni
y= 3.0208+
554.0087x
R2 = 97.78%
Tanpa Zeolit

4

Zeolit

3.5
3

[Asam Urat] (mM)
Gambar 9 Persamaan regresi dan linearitas hubungan konsentrasi substrat dengan
aktivitas urikase; urikase murni (
), tanpa zeolit (
)
dan dengan zeolit (
)
Alur pada Gambar 9 menunjukan hubungan konsentrasi substrat dan
aktivitas urikase L. plantarum yang identik dengan kurva Michaelis-Menten.
Kurva tersebut menunjukkan 2 tahap reaksi. Tahap pertama terjadi pada kisaran
konsentrasi 0.001 0.005 mM dan belum semua tapak aktif urikase L. plantarum
mengikat asam urat. Kisaran konsentrasi tersebut sama dengan hasil penelitian
Mardiah (2010). Tahap kedua terjadi pada konsentrasi lebih dari 0.005 mM dan
enzim telah jenuh dengan substrat sehingga penambahan konsentrasi substrat
tidak akan meningkatkan aktivitas urikase. Gambar 9 lebih lanjut menunjukkan
bahwa urikase yang diimobilisasi langsung pada permukaan elektrode pasta
karbon memiliki linearitas yang lebih kecil dibandingkan dengan yang
diimobilisasikan ke zeolit terlebih dahulu, yaitu berturut-turut 97.78% dan
98.77%.

15

Untuk memperoleh nilai KM dan Vmaks, digunakan persamaan MichaelisMenten ke transformasi aljabar persamaan Lineweaver-Burk. Kurva dan
persamaan regresi yang diperoleh (Gambar 10) menghasilkan nilai KM dan Vmaks
seperti dijelaskan pada Lampiran 7 dan 8.

y = 0,1764 + 1,0704
R2 = 92,49 %

0.3

× 10-3x

1/Vo ( A-1)

0.25

y = 0,1579 + 1,0271 × 10-4 x
R2 = 92,15%

0.2
0.15
0.1

y = 0,1335 + 4,1898 × 10-4 x
R2 = 94,83 %

0.05
0
0

200

400

600

800

1000

1200

1/[S] (mM-1)
Gambar 10 Kurva Lineweaver-Burk urikase L. plantarum; urikase murni (
tanpa zeolit (
), dan dengan zeolit (
)

),

Nilai KM dan Vmaks tanpa imobilisasi dan dengan imobilisasi adalah 6.068 ×
10-3 mM dan 5.6689 A serta 6.0292 × 10-3 mM dan 6.3331 A. Nilai KM dengan
imobilisasi lebih kecil daripada tanpa imobilisasi menunjukkan afinitas enzim
dengan imobilisasi lebih besar sehingga rendahnya konsentrasi substrat sudah
dapat menjenuhkan enzim. Jika hasil tersebut dibandingkan dengan nilai KM
urikase murni Bacillus fastidious dan Candida sp. maka hasilnya berbeda yaitu
3.1384 × 10-3 mM dan 5.2 × 10-3 mM (Yang et al. 2011). Perbedaan ini
dikarenakan jenis bakteri yang digunakan berbeda namun demikian nilai Km yang
diperoleh masuk ke dalam selang Km untuk urikase yaitu 1.3 × 10-3 60 × 10-3
mM (Yang et al. 2011).
Nilai KM dan Vmaks yang diperoleh berbeda dengan penelitian Mardiah
(2010) yaitu 0.1541 mM dan 1.3635. Ini kemungkinan dikarenakan perbedaan
sensitivitas dan selektivitas kinerja alat. Spektrofotometer hanya mengukur
berdasarkan seberapa banyak sinar yang diserap atau dihamburkan oleh sampel
sedangkan metode elektrokimia hanya mendeteksi elektron yang dihasilkan dari
proses oksidasi maupun reduksi. Selain itu, konsentrasi asam urat yang dapat
dideteksi dengan menggunakan metode spektrofotometer secara in vivo sampai
0.0045 mM (Mardiah 2010) dan bila menggunakan metode elektrokimia dapat
mendeteksi asam urat hingga konsentrasi 0.5 mM (Gambar 13).

16

6.5

Arus ( A)

6
5.5
5
4.5
4
0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.01 0.03 0.05

0.5

[Asam Urat] (mM)
Gambar 11 Kurva hubungan arus dengan konsentrasi asam urat
Kestabilan Elektrode
Stabilitas elektrode ditentukan dari pengukuran aktivitas urikase setelah
didapatkan kondisi optimal urikase secara langsung melalui pengukuran arus yang
didapat. Stabilitas elektrode digambarkan sebagai hubungan persen kestabilan
dengan waktu dimana persen kestabilan pada hari ke-0 dianggap 100% yang
ditunjukan pada Gambar 14.

a

b

Gambar 12 Kurva stabilitas urikase pada 10 oC (a) dan 28 oC (b)
Berdasarkan hasil pengujian yang telah dilakukan bahwa kestabilan
elektrode yang disimpan pada suhu 10 oC lebih lama yaitu stabil sampai hari ke-6,
sedangkan bila disimpan pada suhu kamar (28 oC) elektrode tersebut stabil sampai
hari ke-2. Ini karena terjadi denaturasi enzim oleh panas. Semakin tinggi suhu
semakin mudah rusak enzim tersebut dan aktivitasnya menurun (Lehninger 1998).

17

Hasil kestabilan pada suhu kamar yang diperoleh sama dengan hasil penelitian
oleh Mardiah (2010) dengan menggunakan metode spektrofotometri.
Imobilisasi L. plantarum pada zeolit dapat meningkatkan kestabilan. Ini
dapat dilihat pada Gambar 12, yaitu kestabilan elektrode pada suhu kamar (28 oC)
stabil sampai hari ke-6, sedangkan bila disimpan pada suhu 10 oC elektrode stabil
sampai hari ke-18. Kenaikan kestabilan elektrode dengan mengimobilisasi L.
plantarum pada zeolit kemungkinan karena sebagian sisi aktif enzim terlindungi
oleh zeolit sehingga memperlambat proses denaturasi. Data hasil pengukuran
kestabilan dapat dilihat pada Lampiran 9.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Urikase L. plantarum yang diimobilisasi pada zeolit memiliki aktivitas yang
lebih tinggi dibandingkan tanpa diimobilisasi dengan zeolit. Aktivitas enzim
dihubungkan dengan perubahan arus listrik. Nilai KM urikase L. plantarum tanpa
imobilisasi pada zeolit lebih kecil dibandingkan KM dengan imobilisasi pada
zeolit. Ini menunjukkan afinitas urikase L. plantarum dengan imobilisasi pada
zeolit lebih besar dibandingkan tanpa imobilisasi pada zeolit. Imobilisasi urikase
L. plantarum pada zeolit dapat meningkatkan kestabilan dan kestabilan elektrode
akan meningkat bila disimpan pada suhu 10 oC.
Saran
1.
2.
3.

Perlu dilakukan pemberian nutrisi pada saat imobilisasi untuk meningkatkan
stabilitas elektrode.
Perlu dilakukan imobilisasi pada jenis zeolit alam yang lain untuk
menentukan jenis zeolit terbaik.
Hasil penelitian yang telah dilakukan perlu diaplikasikan secara langsung
pada seperangkat alat biosensor asam urat.

DAFTAR PUSTAKA
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media
pendeteksi studi kasus : kromium heksavalen [tesis]. Bogor (ID) : Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Arslan F. 2008. An amperometric biosensor for uric acid determination prepared
from uricase immobilized in polyaniline-polypyrrole film. Sensors Articels
8:492-500. doi : 10.3390/s8095492.
Attala MM et al. 2009. Optimum conditions uricase enzyme production by
Gliomastix gueg. J Microbiol 5:45-50. Tersedia dari : web.usm.my/mjm
/issues/vol5no1/research8.pdf.

18

Ardacani MM, Akrami Z, Kazeiman H, Zare RH. 2009. Preconcentration and
electroanalysis of copper at zeolite nanocomposite modified carbon paste
electrode.
Int
J
Electrochem
4:308-319.
Tersedia
dari
:
www.electrochemsci.org/papers/vol4/4020308.pdf.
Azab EA, Ali MM, Fareed MF. 2005. Studies on uricase in certain bacteria. Egyp
J Biol 7:44-54. Tersedia dari : web.usm.my/mjm/issus/vol5no1/research8.pdf.
Chaplin M. 2004. Biosensor. http ://www.isbuk.ac.uk/biology/enztech/biosensor.
Html [26 Januari 2012].
Coban S. 2008. Development of biosensor determination of the total antioxidant
capacity [thesis]. Izmir (TR) : The Graduate School of Engineering and
Science, Izmir Institut of Technology.
Dmytruk K et al. 2011. Construction of uricase-overproducing strains of
Hansenula polymorpha and its application as biological recognition element
in microbial urate biosensor. Bmc Biotech 11: 50-58. doi : 10.3923
/pjbs.2011.226.231.
Gamella M. 2010. Intregated multienzyme electrochemical biosensors for
monitoring malolactic fermetation in wines [abstract]. In the : Quimica
Analitica, Madrid, 17-25 Januari 2010. http://dx.doi.org/10.1016/j.
talanta.2010.01.038 [21 April 2012].
Gavalas VG, Chaniotakis NA. 2001. Phosphate biosensor based on electrolytestabilized pyruvate oxsidase. Analy Chem Acta 427:271-277. Tersedia dari :
144.206.159.178/ft/38/30149/521370.pdf.
Ginting A, Anggraini D, Indrayati S, Kriswarini R. 2007. Karakteristik komposisi
kimia, luas pori, dan sifat termal zeolit dari daerah Bayah, Tasikmalaya, dan
Lampung. Serpong (ID) : LIPI-BATAN.
Grieshaber D, Mackenzeil A, Voros IJ, Reimhult E. 2008. Riview paper guanin
and adenin biosensor. J Biosen Bioelect 24:591-599. Tersedia dari :
www.mdpi.com/1424-8220/9/4/3122/pdf.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011. Glucose biosensor using selected
Indonesia bacteria. J Microbiol Indones 5:9-14. Tersedia dari :
jurnal.permi.or.id/index.php/mionline/article/viewFile/128/pdf.
Jiang H, Zhao Z. 2010. Enzyme Based Electrochemical Biosensor. Vukavar (HR)