Stability and Effectiveness of Glucose Biosensor Based on Escherichia coli Using Immobilized Glutaraldehyde

STABILITAS DAN EFEKTIVITAS BIOSENSOR GLUKOSA
BERBASIS Escherichia coli MENGGUNAKAN IMOBILISASI
GLUTARALDEHIDA

RARAS PUNGKI HAPSARI

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

ABSTRAK

RARAS PUNGKI HAPSARI. Stabilitas dan Efektivitas Biosensor Glukosa
Berbasis Escherichia coli Menggunakan Imobilisasi Glutaraldehida. Dibimbing
oleh DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, dan
TRIVADILA
Penelitian ini menganalisis glukosa dehidrogenase (GDH) yang terimobilisasi
pada elektrode pasta karbon sel bakteri Escherichia coli. Voltametri siklik
digunakan untuk mengkaji perilaku katalitik dari biosensor. Analisis yang

digunakan untuk pengoptimuman aktivitas glukosa dehidrogenase adalah metode
permukaan respons. Kondisi optimum aktivitas GDH sel bakteri E. coli tanpa
taut-silang glutaraldehida ialah , suhu 30 oC, pH 6, konsentrasi glukosa 10,25
mM, dan konsentrasi pirolokuinolina kuinon (PQQ) 3,05 µM. Di sisi lain, kondisi
optimum aktivitas GDH sel bakteri E. coli taut-silang glutaraldehida ialah , suhu
30 oC, pH 6, konsentrasi glukosa 10,25 mM, konsentrasi PQQ 3,05 µM, dan
glutaraldehida 12,5 µL. Reaksi kinetika GDH yang dikatalisis oleh glukosa
mengikuti kinetika Lineweaver-Burk. Nilai KM app sel bakteri E. coli taut-silang
glutaraldehida lebih kecil sebesar 1,1162 mM dibandingkan dengan tanpa tautsilang glutaraldehida sebesar 1,9007 mM. Stabilitas aktivitas GDH sel bakteri E.
coli taut-silang glutaraldehida lebih tinggi 68% dibandingkan dengan tanpa tautsilang glutaraldehida.

ABSTRACT

RARAS PUNGKI HAPSARI. Stability and Effectiveness of Glucose Biosensor
Based on Escherichia coli Using Immobilized Glutaraldehyde. Supervised by
DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, and TRIVADILA
The immobilization glucose dehydrogenase (GDH) cells from Escherichia coli
cross-linking glutaraldehyde on a carbon paste electrode were studied. Cyclic
voltammetry are employed to investigate the catalytic behavior of the biosensor.
The analysis used for the optimization of GDH activity was response surface

method. Optimum conditions for GDH activity was at temperature 30 oC, pH 6,
glucose 10.25 mM, and pyrroloquinoline quinone (PQQ) 3.05µM for E. coli cells
without cross-link with glutaraldehyde. On the other hand, the optimum
conditions for GDH activity of E. coli cells cross-linked with glutaraldehyde was
at temperature 30 oC, pH 6, glucose 10.25 mM, PQQ 3.05 µM, and glutaraldehyde
12.5 µL. Dehydrogenase reaction kinetics of GDH catalyzed by glucose followed
the Lineweaver-Burk kinetics. KM app value of bacterial E. coli cells cross-linked
with glutaraldehyde at 1.1162 mM was smaller than without cross-link, which
was 1.9007 mM. Stability of activity GDH E. coli cells cross-linked with
glutaraldehyde was 68% higher than that without cross-link.

STABILITAS DAN EFEKTIVITAS BIOSENSOR GLUKOSA
BERBASIS Escherichia coli MENGGUNAKAN IMOBILISASI
GLUTARALDEHIDA

RARAS PUNGKI HAPSARI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul : Stabilitas dan efektivitas biosensor glukosa berbasis Escherichia coli
menggunakan imobilisasi glutaraldehida
Nama : Raras Pungki Hapsari
NIM : G44070021

Disetujui

Pembimbing I

Dr. Dyah Iswantini Pradono, M. Agr
NIP 19670730 199103 2 001

Pembimbing II

Pembimbing III

Dr. Novik Nurhidyat
NIP 19771029 200502 2 001

Diketahui
Ketua Departemen Kimia

Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, M.S.
NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal Lulus:

Trivadila, S. Si, M. Si

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 6 Agustus 1988 dari ayah Harun

dan bunda Lestari Rahayu. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara.
Tahun 2005 penulis lulus dari SLTPN 178 Jakarta Selatan. Tahun 2007
penulis lulus dari SMAN 47 Jakarta Selatan dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur minat dan bakat (USMI). Penulis memilih mayor
Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Kimia
Lingkungan pada tahun ajaran 2010/2011, serta mata kuliah Kimia Fisik pada
tahun ajaran 2011/2012. Penulis juga pernah mengikuti kegiatan Praktik
Lapangan di UPT BPP Biomaterial, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)
Cibinong dari bulan Juni hingga Agustus 2010.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan
karunia-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret adalah Biosensor, dengan judul
Stabilitas dan efektivitas biosensor glukosa berbasis Escherichia coli
menggunakan imobilisasi glutaraldehida.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Dyah Iswantini Pradono, M. Agr,
Dr. Novik Nurhidayat, dan Trivadilla, S. Si, M.Si selaku pembimbing, serta

Weniarti, M.Si yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Ibu Ai, Bapak Nano, dan Bapak Mail, Staf
Laboratorium Kimia Fisik. Ibu Heny Purwaningsih selaku kepala Laboratorium
Bersana kimia, Bapak Wawan, Bapak Eko, staf Laboratoriun Bersama Kimia. Ibu
Neri, Ibu Erna, Ibu Ratih, dan Bapak Acun di PUSLIT Biologi LIPI yang telah
membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada Ayah, Bunda, kakak serta seluruh keluarga atas doa dan kasih sayangnya
serta teman-teman seperjuangan di mayor Kimia angkatan 2007.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, November 2011

Raras Pungki Hapsari

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
Latar Belakang ............................................................................................... 1
Tujuan ............................................................................................................ 2
Tempat dan Waktu Penelitian........................................................................ 2
METODOLOGI ...................................................................................................... 2
Bahan dan Alat .............................................................................................. 2
Lingkup Kerja ................................................................................................ 2
Media Luria Broth (LB) ................................................................................ 2
Isolat Bakteri E. coli ...................................................................................... 3
Elektrode Pembanding Ag/AgCl ................................................................... 3
Elektrode Pasta Karbon ................................................................................. 3
Imobilisasi Enzim .......................................................................................... 3
Tanpa Glutaraldehida ................................................................................ 3
Taut-silang Glutaraldehida ........................................................................ 3
Pengukuran Elektrokimia .............................................................................. 3
Pengoptimuman Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi ............ 4
Parameter Kinetika ........................................................................................ 4
Stabilitas Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli ................................................. 5
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 5

Pengoptimuman Aktivitas GDH Terimobilisasi............................................ 5
Sel Bakteri E. coli ..................................................................................... 5
Sel Bakteri E. coli taut-silang Glutaraldehida........................................... 7
Kinetika Enzim Glukosa Dehidrogenase Imobilisasi .................................... 8
Stabilitas Enzim Glukosa Dehidrogenase Sel Bakteri E. coli ....................... 9
SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................. 10
Simpulan ..................................................................................................... 10
Saran ............................................................................................................ 10
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10
LAMPIRAN .......................................................................................................... 13

vii 

 

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Pengoptimuman aktivitas GDH sel bakteri E. coli ........................................... 4

2 Pengoptimuman aktivitas GDH sel bakteri E. coli taut-silang glutaraldehida .. 4
3 Nilai parameter kinetika sel bakteri E. coli ....................................................... 9

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1
2
3
4
5
6
7
8

Reaksi oksidasi dengan katalis PQQGDH dan mediator Qo .............................. 5
Alur kontur aktivitas GDH sel bakteri E. coli .................................................... 6
Alur kontur aktivitas GDH taut-silang glutaraldehida ....................................... 7
Hubungan konsentrasi glukosa dengan aktivitas GDH ...................................... 8

Linearitas konsentrasi glukosa dengan aktivitas GDH ...................................... 8
Alur Lineweaver-Burk sel bakteri E. coli imobilisasi ........................................ 8
Taut-silang enzim pada gugus asam amino dengan glutaraldehida ................... 9
Stabilitas sel bakteri E. coli .............................................................................. 10

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1
2
3
4
5
6
7
8
9
 
 

 

Bagan alir umum penelitian ............................................................................ 14
Bagan alir kerja ................................................................................................ 15
Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi sel bakteri E. coli ........ 16
Voltamogram siklik sel bakteri E. coli terimobilisasi ...................................... 17
Voltamogram siklik taut-silang dengan glutaraldehida terimobilisasi............. 18
Pengoptimuman sel bakteri E. coli .................................................................. 19
Pengoptimuman sel bakteri E. coli taut-silang glutaraldehida ......................... 20
Kinetika enzim glukosa dehidrogenase sel bakteri E. coli............................... 21
Stabilitas sel bakteri E. coli .............................................................................. 22
 

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Diabetes melitus (DM) adalah penyakit
metabolik yang ditandai dengan tingginya
kadar glukosa darah yang mengakibatkan
kerusakan sekresi insulin. Insulin merupakan
hormon yang dilepaskan pankreas yang
bertanggung jawab dalam mempertahankan
kadar gula dalam darah secara normal. Insulin
kemudian masuk ke dalam sel sehingga dapat
berguna sebagai energi atau disimpan sebagai
cadangan energi. Ketika sekresi hormon
insulin ke dalam darah terganggu, maka kadar
glukosa di dalam darah tinggi sehingga
melewati
batas
normal
dan
dapat
menyebabkan penyakit DM.
Batas kadar glukosa yang dianggap normal
dalam darah ialah 80_110 mg/dLpada saat
puasa dan setelah makan sebesar 110_160
g/dL. Data statistik dari
International
Diabetes Federation (IDF) menyatakan
bahwa saat ini terdapat 230 juta penderita
diabetes. Angka ini diperkirakan akan terus
meningkat hingga 3% atau sekitar 7 juta orang
setiap tahunnya. Menurut WHO (2006),
jumlah penderita DM mencapai 194 juta jiwa
dan diperkirakan meningkat menjadi 333 juta
pada tahun 2025. Indonesia menempati urutan
keempat jumlah penderita diabetes terbesar di
dunia setelah India, Cina, dan Amerika
Serikat, dengan prevalensi 8,6% dari total
penduduk. Terapi yang dapat digunakan untuk
penyakit DM adalah suntik insulin atau
pemakaian obat. Penyuntikan insulin harus
dilakukan secara hati-hati, sedangkan terapi
dengan latihan jasmani biasanya dilakukan
bagi pasien yang gagal meregulasi darahnya.
Kelebihan dosis insulin yang disuntikkan
dapat mengakibatkan shock bahkan kerusakan
otak secara permanen (Desriani 2003). Oleh
karena itu, dibutuhkan suatu alat pengukur
kadar glukosa darah yang dapat menetapkan
konsentrasi gula darah, sehingga dosis insulin
yang akan diinjeksi dapat ditentukan.
Awalnya, gula darah yang berbentuk
glukosa diukur secara kimiawi menggunakan
paper strip yang dapat berubah warna karena
reaksi kimia dengan glukosa. Produk tersebut
banyak mengandung kelemahan seperti
akurasi rendah, kecepatan pengukuran lambat,
serta ukurannya relatif besar. Untuk mengatasi
kelemahan ini, digunakan mikrob penghasil
enzim sebagai sensor untuk mengukur kadar
glukosa yang disebut sensor mikrob. Alat
pengukur atau sensor yang berbasis pada
molekul biologis dikenal dengan istilah

biosensor (Desriani 2003). Keuntungan sensor
mikrob antara lain biaya yang lebih murah
karena tidak diperlukan isolasi dan pemurnian
enzim aktif serta lebih stabil.
Biosensor di dunia pertama kali
dikembangkan oleh Leland Clark tahun 1956.
Clark menggunakan enzim glukosa oksidase
(GOD) yang bereaksi spesifik dengan glukosa
dan secara alamiah dihasilkan dari jamur
Aspergillus niger. Mekanisme kerja enzim ini
sangat bergantung pada keberadaan oksigen.
Akibatnya, alat pengukur kadar gula dalam
darah memberikan hasil yang berbeda dari
individu yang sama. Hal tersebut, mendorong
penggantian enzim GOD dengan enzim
glukosa dehidrogenase (GDH). Enzim GDH
spesifik terhadap substrat glukosa dan
aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh kadar
oksigen (Turner 2002). PQQGDH merupakan
alternatif baru yang digunakan sebagai
biosensor
glukosa.
PQQGDH
tidak
dipengaruhi kadar oksigen, juga memiliki
aktivitas yang
tinggi. Struktur kristal
pirolokuinolina kuinon (PQQ) diketahui
merupakan gugus prostetik enzim GDH.
Pengikatan PQQ terhadap enzim GDH terjadi
melalui interaksi polar (Ourbrie et al. 1999).
Perkembangan biosensor hingga saat ini,
biosensor glukosa berbasis nanotabung karbon
(CNT) ensembel nanoelektrode (NEEs).
Glukosa oksidase terimobilisasi pada CNT
NEEs melalui ikatan kovalen kimia
karbodiimida dengan membentuk hubungan
antara residu amina amida dan gugus asam
karboksilat di ujung CNT (Lin et al. 2004).
Penelitian
yang
telah
dilakukan
menggunakan mikrob sebagai sumber utama,
yaitu Escherichia coli KRGL dan Bacillus
subtilis KRGS. E. coli telah diketahui
menghasilkan GDH-A. Enzim PQQGDH-A
merupakan enzim yang dimanfaatkan dan
diaplikasikan sebagai biosensor glukosa
(Witarto dan Sode 2001). Namun, enzim
GDH yang ada pada E. coli berada dalam
bentuk apo-GDH (enzim yang belum aktif)
dan tidak memiliki kemampuan menghasilkan
PQQ.
Oleh
karena
itu,
diperlukan
penambahan PQQ dari luar untuk mengubah
apo-GDH menjadi holo-GDH, yaitu enzim
yang aktif. Holo-GDH yang dihasilkan
mempunyai aktivitas yang besar (Matsushita
et al. 1997; Iswantini et al. 1998). Aktivitas
GDH yang dihasilkan oleh sel bakteri E. coli
KRGS
memiliki
aktivitas
terbesar
dibandingkan B. subtilis KRGL baik dengan
metode spektrofotometri maupun metode
elektrokimia (Trivadila 2006).

2

Metode elektrokimia digunakan dalam
pengoptimuman aktivitas enzim GDH (Ikeda
et al. 1998) yang terdiri dari voltametri dan
amperometri. Keunggulan metode ini adalah
lebih sensitif, jumlah contoh yang sedikit
dapat terdeteksi dengan baik. Selain itu,
jumlah enzim yang dihasilkan oleh suatu
isolat bakteri E. coli dapat ditentukan
(Iswantini et al. 1998).
Menurut Trivadila (2006) setelah 6 jam,
aktivitas GDH yang dihasilkan oleh sel E. coli
KRGS mencapai keadaan tunak selama 120
detik setelah ditambahkan glukosa dan
mencapai 58% dari aktivitas maksimum.
Kestabilannya lebih rendah dibandingkan
dengan kestabilan aktivitas GDH yang
dihasilkan oleh E. coli K-12 (IFO3301) yang
mencapai 70% (Iswantini et al. 2000).
Kestabilan aktivitas GDH yang menurun
memerlukan pengoptimuman terhadap proses
imobilisasi enzim. Salah satu faktor penurun
aktivitas adalah pengaruh logam berat.
Imobilisasi enzim menggunakan tautsilang oleh glutaraldehida sangat populer
(Ramanavičius et al. 1997). Imobilisasi enzim
dengan taut-silang antarmolekul telah banyak
digunakan dalam biosensor (Divya et al.
1998). Taut-silang dengan glutaraldehida
digunakan dalam kombinasi dengan teknik
imobilisasi lainnya. Hal ini meningkatkan
stabilitas biosensor (Khan & Wernet 1997).
Teknik imobilisasi langsung menggunakan
glutaraldehida memberikan sensitivitas lebih
tinggi bila dibandingkan dengan imobilisasi
pada membran poli(hidroksietil metakrilat),
pHEMA (Othman et al. 2006). Konsentrasi
glutaraldehida
memengaruhi
proses
imobilisasi enzim tersebut secara optimum.
Penaut-silang paling umum digunakan adalah
glutaraldehid kelompok aldehida yang
bereaksi dengan gugus amin dari rantai
samping protein. Keuntungan menggunakan
glutaraldehida sebagai reagen biofungsional,
yaitu harganya relatif murah dan sering
digunakan secara komersial (Mateo et al.
2004). Oleh karena itu, penelitian ini
menggunakan imobilisasi glutaraldehida
untuk meningkatkan kestabilan dan efektivitas
biosensor glukosa berbasis E. coli.
Tujuan Penelitian
Penelitian
bertujuan
menentukan
kestabilan
aktivitas
enzim
glukosa
dehidrogenase yang dihasilkan oleh isolat
bakteri E. coli KRGS dan efektivitas
biosensor glukosa menggunakan imobilisasi
glutaraldehida.

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Maret sampai Agustus 2011 di Laboratorium
Kimia Fisik, Laboratorium Bersama Kimia,
Departemen Kimia, kampus IPB Darmaga dan
Pusat Penelitian Biologi, Cibinong Science
Center.

METODOLOGI
Bahan dan Alat
Alat-alat yang digunakan adalah eDAQ
potensiostat-galvanostat yang dilengkapi
perangkat lunak Echem v2.1.0, laminar air
flow, inkubator, high speed refrigated
centrifuge KUBOTA 6500, autoklaf, pipet
mikro, sel elektrokimia, serta alat-alat kaca
yang lazim di laboratorium.
Bahan-bahan yang digunakan ialah mikrob
sel E. coli KRGS yang diperoleh dari koleksi
LIPI Mikrobiologi, tripton, ekstrak khamir,
agar, akuades, alkohol 70%, NaCl, MgSO4,
glukosa, PQQ, 2,3-dimetoksi-5-metil-1,4
benzokuinon (Qo), larutan bufer fosfat, gas N2
larutan glutaraldehida (GA, 50% dalam H2O),
larutan albumin serum sapi (BSA) 5%.
Lingkup kerja
Penelitian terdiri atas pembuatan media,
peremajaan bakteri, pembuatan elektrode
pembanding Ag/AgCl, pembuatan elektrode
pasta karbon, dan imobilisasi enzim. Lingkup
kerja secara lengkap dapat dilihat pada
Lampiran 1-3.
Media Luria Broth (LB) (Trivadila 2006)
Media LB agar miring dibuat dari tripton,
ekstrak khamir, NaCl, dan agar. Sebanyak 1 L
media dibuat dengan 10 g tripton, 5 g ekstrak
khamir, 5 g NaCl, dan 15 g agar serta
ditambahkan akuades hingga 1 L. Media
dipanaskan hingga homogen dan mencair,
kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi
masing-masing 5 mL. Tabung reaksi ditutup
dengan sumbat, lalu disterilisasi dengan
autoklaf selama ± 2 jam. Setelah itu, tabung
diletakkan pada rak miring hingga dingin dan
padat. Media selanjutnya digunakan untuk
meremajakan sel bakteri. Pembuatan media
LB cair sama seperti LB agar miring, tetapi
tanpa diberikan agar.

3

Isolat Bakteri E. coli (Trivadila 2006)
Bakteri E. coli ditumbuhkan pada media
LB agar miring, diinkubasi selama 1 hari pada
suhu 37 oC. Bakteri yang tumbuh selanjutnya
ditanam ke 10 mL media LB cair sebagai
starter, diinkubasi hingga mencapai nilai
OD610= 0,5. Sebanyak 0,5 mL starter
diinokulasi ke dalam 50 mL media LB cair
dan diikunbasi. E. coli dipanen dengan
disentrifugasi pada kecepatan 10 000 rpm
selama 15 menit. Pelet dipisahkan dari
supernatan, dicuci 2 kali dengan air distilasi,
dan diresuspensikan dengan NaCl 0,85%.
Elektrode Pembanding Ag/AgCl
Proses elektrolisis dilakukan pada kawat
perak (Ag) dalam larutan NaCl 3 M. Kawat
Ag yang telah terlapisi dengan AgCl
selanjutnya dimasukkan ke dalam badan
elektrode yang telah terisi larutan KCl 3 M.
Elektrode pembanding Ag/AgCl yang dibuat
selanjutnya dikualifikasi kinerjanya dengan
elektrolit pendukung KMnO4 0,1 M
menggunakan teknik voltametri siklik.
Pengukuran ini menggunakan elektrode kerja
platinum dan elektrode bantu kawat platinum.

Elektrode Pasta Karbon (Trivadila 2006)
Elektrode pasta karbon dibuat dari
campuran grafit dengan parafin cair (2:1)
hingga membentuk pasta. Kemudian pasta
karbon dimasukkan ke dalam badan elektrode
hingga memadat sampai ke permukaan kaca.
Permukaan kaca elektrode dihaluskan dan
dibersihkan dengan ampelas dan kertas
minyak.
Imobilisasi enzim
Tanpa Glutaraldehida (Trivadila 2006)
Isolat bakteri E. coli yang telah
diresuspensikan
dengan
NaCl
0,85%
dihomogenkan. Sebanyak 5 µL larutan sel
bakteri diteteskan pada permukaan elektrode
pasta karbon, didiamkan hingga pelarutnya
menguap. Selanjutnya, permukaan elektrode
dilapisi dengan membran dialisis, ditutup
dengan jaring nilon, dan diikat dengan
parafilm. Elektrode kemudian direndam dalam
larutan garam (NaCl fisiologis) pada suhu 5
o
C ketika tidak digunakan, untuk memberikan
keadaan yang sama dengan lingkungan
sebenarnya. Elektrode dapat langsung

digunakan untuk pengukuran aktivitas GDH
secara elektrokimia.
Taut-silang Glutaraldehida
Sebanyak 5, 9, 13, 16, dan 20 µL
glutaraldehida 5% (diencerkan dengan 0,1 M
bufer fosfat, pH 6,5) dicampurkan dengan 1
µL 5% BSA dan dengan 35, 31, 27, 24, dan
20 µL dari larutan sel bakteri (sel bakteri E.
coli yang telah diresuspensikan dengan NaCl
0,85%). Setelah pencampuran menyeluruh,
sebanyak 5 µL larutan campuran sel bakteri
diteteskan pada permukaan elektrode pasta
karbon,
didiamkan hingga pelarutnya
menguap. Selanjutnya, permukaan elektrode
dilapisi dengan membran dialisis, ditutup
dengan jaring nilon, dan diikat dengan
parafilm. Elektrode kemudian direndam dalam
larutan garam (NaCl fisiologis) pada suhu 5
o
C ketika tidak digunakan, untuk memberikan
keadaan yang sama dengan lingkungan
sebenarnya. Elektrode dapat langsung
digunakan untuk pengukuran aktivitas GDH
secara elektrokimia.
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran
elektrokimia
dilakukan
dengan menggunakan seperangkat alat eDAQ
potensiostat-galvanostat yang dilengkapi
perangkat lunak Echem v2.1.0. Elektrode
yang digunakan ialah elektrode Ag/AgCl
sebagai elekrode rujukan, platinum sebagai
counter, dan elektrode pasta karbon-sel
bakteri tanpa glutaraldehida serta taut-silang
dengan glutaraldehida sebagai elektrode kerja.
Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut:
Mode
Initial
Final
Rate
Step W
Upper E
Lower E
Range

: Cyclic
: -400 mV
: -400 mV
: 250 mV/s
: 20 ms
: 500 mV
: -400 mV
:5V

Sebanyak 1 mL larutan bufer fosfat
ditambahkan ke dalam sel elektrokimia dan
puncak arus anode yang terbentuk diamati
sebagai blangko. Selanjutnya, ditambahkan
100 µL Qo 5 mM, glukosa, PQQ, dan MgSO4
10 mM. Sebelum dilakukan pengukuran,
larutan dideaerasi dengan mengalirkan gas
nitrogen selama ± 1 menit. Setelah
penambahan setiap zat ke dalam larutan,
perubahan arus yang terjadi diamati hingga
mencapai arus keadaan tunak secara runut.

4

Pengoptimuman Aktivitas GDH Sel
Bakteri E. coli Terimobilisasi
Optimasi yang dilakukan adalah optimasi
suhu (25-35 oC), pH (5-7), konsentrasi
glukosa (0,5-20 mM), konsentrasi PQQ (0,1-6
µM), dan glutaraldehida (5-20 µL). Metode
permukaan respons (RSM) digunakan untuk
pengoptimuman aktivitas GDH. Metode ini
dilakukan
dengan
cara
memasukkan
kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada
perangkat
lunak
statistika
Minitab.v.15English. Selanjutnya percobaan
dilakukan sesuai dengan kombinasi yang
dihasilkan untuk mendapatkan nilai aktivitas
optimumnya. Tabel 1 dan 2 menampilkan
kombinasi faktor-faktor peubah bebas untuk
pengoptimuman aktivitas GDH sel bakteri E.
coli yang terimobilisasi tanpa glutaraldehida
dan dengan taut-silang glutaraldehida.
Tabel 1

Kombinasi suhu, pH, [glukosa],
[PQQ] untuk pengoptimuman
aktivitas GDH sel bakteri E. coli
terimobilisasi
Suhu
(oC)
28
33
28
33
28
33
28
33
28
33
28
33
28
33
28
33
25
35
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30

pH
5,5
5,5
6,5
6,5
5,5
5,5
6,5
6,5
5,5
5,5
6,5
6,5
5,5
5,5
6,5
6,5
6,0
6,0
5,0
7,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0
6,0

[Glukosa]
(mM)
5,4
5,4
5,4
5,4
15,1
15,1
15,1
15,1
5,4
5,4
5,4
5,4
15,1
15,1
15,1
15,1
10,3
10,3
10,3
10,3
0,5
20,0
10,3
10,3
10,3
10,3
10,3
10,3
10,3
10,3
10,3

[PQQ]
(µM)
1,6
1,6
1,6
1,6
1,6
1,6
1,6
1,6
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
3,1
3,1
3,1
3,1
3,1
3,1
0,1
6,0
3,1
3,1
3,1
3,1
3,1
3,1
3,1

Tabel 2

Kombinasi suhu, pH, [glukosa],
[PQQ], dan glutaraldehida untuk
pengoptimuman aktivitas GDH
sel bakteri E. coli taut-silang
glutaraldehida terimobilisasi

Suhu
(oC)

pH

[Glukosa]
(mM)

[PQQ]
(µM)

GA
(µL)

28

5,5

5,4

1,6

16

33

5,5

5,4

1,6

9

28

6,5

5,4

1,6

9

33

6,5

5,4

1,6

16

28

5,5

15,1

1,6

9

33

5,5

15,1

1,6

16

28

6,5

15,1

1,6

16

33

6,5

15,1

1,6

9

28

5,5

5,4

4,5

9

33

5,5

5,4

4,5

16

28

6,5

5,4

4,5

16

33

6,5

5,4

4,5

9

28

5,5

15,1

4,5

16

33

5,5

15,1

4,5

9

28

6,5

15,1

4,5

9

33

6,5

15,1

4,5

16

25

6,0

10,3

3,1

13

35

6,0

10,3

3,1

13

30

5,0

10,3

3,1

13

30

7,0

10,3

3,1

13

30

6,0

0,5

3,1

13

30

6,0

20,0

3,1

13

30

6,0

10,3

0,1

13

30

6,0

10,3

6,0

13

30

6,0

10,3

3,1

5

30

6,0

10,3

3,1

20

30

6,0

10,3

3,1

13

30

6,0

10,3

3,1

13

30

6,0

10,3

3,1

13

30

6,0

10,3

3,1

13

30

6,0

10,3

3,1

13

30

6,0

10,3

3,1

13

Parameter Kinetika
Penentuan parameter kinetika dilakukan
setelah diperoleh kondisi optimum aktivitas
GDH. Parameter kinetika enzim GDH sel
bakteri E. coli yang diimobilisasi ditentukan
dengan menggunakan persamaan MichaelisI maks [ glukosa ]
Menten:
K m + [ glukosa ]

5

Imaks adalah respon arus maksimum yang
terukur, KM adalah tetapan Michaelis-Menten,

dan [glukosa] adalah konsentrasi glukosa.
Persamaan Michaelis-Menten yang
didapat dibuat turunannya, yaitu alur
Lineweaver-Burk. Prosedur pengukurannya
sama, namun pada uji kinetika konsentrasi
substrat glukosa divariasikan, yaitu antara 0,520 mM.
Stabilitas Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli
Stabilitas
aktivitas
enzim
GDH
ditentukan setelah didapatkan kondisi
optimum aktivitas GDH. Penentuan stabilitas
dilakukan pada bakteri E. coli tanpa
glutaraldehida dan taut-silang dengan
glutaraldehida. Proses pengukuran sama
seperti tahap pengoptimuman. Namun,
pengukuran dilakukan setiap 2 jam sekali
hingga 48 jam.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengoptimuman Aktivitas GDH
Terimobilisasi
Pengoptimuman Aktivitas GDH Sel
Bakteri E. coli
Hasil pengoptimuman aktivitas GDH
ditunjukkan dengan voltamogram siklik pada
Lampiran 4 dan 5 (tanpa maupun dengan
taut-silang glutaraldehida). Voltamogram
siklik yang diperoleh lalu dianalisis sehingga
kenaikan puncak arus oksidasi didapatkan.
Gambar 1 menunjukkan reaksi yang terjadi
antara glukosa dengan Qo sebagai mediator.
Arus yang dihasilkan berasal dari elektron
yang dihasilkan pada proses oksidasi langsung
glukosa membentuk asam glukonat dengan
GDH sebagai katalis (Trivadila 2006). Enzim
glukosa akan teroksidasi, elektron yang

Gambar 1 Reaksi oksidasi dengan katalis
PQQGDH dan mediator Qo.

dilepaskan akan ditangkap oleh Qo. Fungsi Qo
sebagai mediator. Enzim yang teroksidasi
membentuk asam glukonat dan elektron yang
terlepas (tereduksi) merupakan nilai arus yang
terbaca. Hasil tersebut, kemudian diolah
dengan menggunakan rancangan percobaan
RSM seperti terlihat dalam Lampiran 6.
Parameter-parameter yang dioptimumkan,
yaitu pH (5-7), suhu (25-35 oC), konsentrasi
glukosa (0,5-20 mM), dan konsentrasi PQQ
(0,1-6,0 µM). Gambar 2 menunjukkan alur
kontur hubungan antara berbagai faktor dan
puncak arus oksidasi yang dihasilkan.
Berdasarkan hasil pengoptimuman didapatkan
bahwa kondisi optimum aktivitas GDH sel
bakteri E. coli adalah suhu 30 oC, pH 6,
konsentrasi glukosa 10,25 mM, dan
konsentrasi PQQ 3,05 µM.
Jika dibandingkan dengan penelitian
yang dilakukan oleh Iswantini et al. (2011),
aktivitas GDH sel bakteri E. coli optimum
pada pH 6,5 larutan bufer fosfat, konsentrasi
PQQ 4,6 µM, dan konsentrasi glukosa 20
mM. Hal ini membuktikan bahwa hasil
pengoptimuman
puncak
arus
sangat
dipengaruhi oleh proses imobilisasi yang
dilakukan. Ito et al. (2002), melaporkan hasil
optimasi pH larutan bufer fosfat terhadap
aktivitas GDH yang dihasilkan oleh sel E. coli
K-12 (IFO3301), dengan pH optimum pada
6,5-7. Parameter yang sangat mempengaruhi
dalam pengoptimuman puncak arus yang
dihasilkan adalah pH dan suhu. Pergeseran pH
terjadi karena enzim terimobilisasi pada
matriks yang memiliki perbedaan muatan
(Trivadila 2011). Selain itu, adanya perlakuan
suhu juga mempengaruhi terhadap puncak
arus yang dihasilkan. Pergeseran suhu terjadi
karena imobilisasi enzim mengakibatkan
ketidakhomogenan
sehingga
terjadi
penyimpangan
pada
Plot
Arrhenius
(Bisswanger
2008).

6

4

kenaik an
arus
< 0,4
0,4 – 0,6
0,6 – 0,8
0,8 – 1,0
> 1,0

3

Hold Values
Suhu
30
[ Gluk osa] 10,25

3

2

1

1

5,5

6,0

6,5

Hold Values
Suhu 30
pH
6

7,0

5

10

pH

[Glukosa]

(a)

(b)

6

k enaik an
arus
< 0,0
0,0 – 0,1
0,1 – 0,2
0,2 – 0,3
0,3 – 0,4
0,4 – 0,5
0,5 – 0,6
> 0,6

5

4

[ PQQ]

4

2

5,0

kenaikan
arus
< 0,0
0,0 – 0,1
0,1 – 0,2
0,2 – 0,3
0,3 – 0,4
0,4 – 0,5
0,5 – 0,6
> 0,6

5

3

Hold Values
pH
6
[ Gluk osa] 10,25

2

15

20

20

kenaikan
arus
< 0,0
0,0 – 0,2
0,2 – 0,4
0,4 – 0,6
0,6 – 0,8
> 0,8

15

[ Glu k o s a ]

[ PQQ]

5

6

[ PQQ]

6

Hold Values
Suhu
30
[ PQQ] 3,05

10

5

1

25,0

27,5

30,0

32,5

5,0

35,0

5,5

Hold Values
[ Glukosa] 10,25
[ PQQ]
3,05

6,0

kenaikan
arus
< -0,3
-0,3 – -0,2
-0,2 – -0,1
-0,1 – 0,0
0,0 – 0,1
0,1 – 0,2
0,2 – 0,3
> 0,3

15

[ Glu k o s a ]

kenaikan
arus
< 0,0
0,0 – 0,2
0,2 – 0,4
0,4 – 0,6
0,6 – 0,8
> 0,8

6,5

pH

7,0

20

7,0

10

Hold Values
pH
6
[ PQQ] 3,05

5

5,5

27,5

30,0

Suhu

(e)
Gambar 2

6,5

(d)

(c)

5,0
25,0

6,0

pH

Suhu

32,5

35,0

25,0

27,5

30,0

32,5

35,0

Suhu

(f)

Alur kontur hubungan antara pH dan konsentrasi PQQ (a), konsentrasi glukosa dan
konsentrasi PQQ (b), suhu dan konsentrasi PQQ (c), suhu dan pH (d), pH dan
konsentrasi glukosa (e), suhu dan konsentrasi glukosa terhadap puncak arus oksidasi
(f).

7

et al. (2006) terhadap imobilisasi GOD pada
film PANI (polianilina) dengan taut-silang
glutaraldehida dalam penentuan glukosa
secara elektrokimia, hasil pengoptimuman
larutan bufer fosfat pada pH 5,8. Arus yang
dihasilkan cenderung konstan jika pH di atas
5,8. Menaut-silangkan sel bakteri E. coli
dengan larutan bufer fosfat pH 6,5 sangat
memengaruhi pergeseran nilai pH optimum.
Hal ini disebabkan oleh sel bakteri E. coli
ditaut-silangkan terlebih dahulu dengan
glutaraldehida yang telah dilarutkan dengan
bufer fosfat pH 6,5 sebelum proses imobilisasi
sel bakteri. Oleh karena itu, sel bakteri telah
terstabilkan pada proses taut-silang.

Pengoptimuman Aktivitas GDH sel Bakteri
E. coli Taut-silang dengan Glutaraldehida
Parameter yang dioptimumkan untuk
aktivitas sel bakteri E. coli taut-silang dengan
glutaraldehida meliputi suhu (25-35 oC), pH
(5-7), konsentrasi glukosa (0,5-20 mM),
konsentrasi PQQ (0,1-6,0 µM),
dan
glutaraldehida
(5-20
µL).
Data
pengoptimuman ditunjukkan pada Lampiran
7, dan alur kontur hubungan antara berbagai
faktor dan puncak arus oksidasi yang
dihasilkan ditunjukkan pada Gambar 3.
Daerah pengoptimuman yang dihasilkan
oleh sel bakteri E. coli dengan taut-silang
glutaraldehida tidak berbeda dengan daerah
pengoptimuman sel bakteri E. coli, yaitu suhu
30 oC, pH 6, konsentrasi glukosa 10,25 mM,
konsentrasi PQQ 3,05 µM, dan glutaraldehida
12,5 µL. Penelitian yang dilakukan Gaikwad

(a)

(b)

pH* Suhu

7

(c)

[Glukosa]* Suhu

6

18

[Glutaraldehida]* Suhu

18
4

12

6

(d)

[PQQ]* Suhu

12
2

6

6

5
25

30

(e

35

[Glukosa]* pH

25

35

25 (g

[PQQ]* pH

6

18

30

(f

30

35

[Glutaraldehida]* pH

25
6

30

(h

35

[PQQ]* [Glukosa]

Kenaik an
Arus
< -0,5
-0,5 –
0,0
0,0 –
0,5
0,5 –
1,0
1,0 –
1,5
> 1,5

18
4

12

4
12

2

6

2
6

5

6

7

5

[Glutaraldehida]* [Glukosa]

18

18

12

12

6

6

7

[Glutaraldehida]* [PQQ]

5

6

7

6

12

18

Hold Values
Suhu
30
pH
6
[ Gluk osa]
10,25
[ PQQ]
3,05
Glutaraldehida
12,5

6
6

12

(i)

18

2

4

6

(j)

Gambar 3 Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan konsentrasi glukosa (b), suhu
dan konsentrasi PQQ terhadap puncak arus oksidasi (c), suhu dan volume
glutaraldehida (d), pH dan konsentrasi glukosa (e), pH dan konsentrasi PQQ (f), pH
dan volume glutaraldehida (g), konsentrasi glukosa dan konsentrasi PQQ (h),
konsentrasi glukosa dan volume glutaraldehida (i), konsentrasi PQQ dan volume
glutaraldehida
terhadap
puncak
arus
oksidasi
(j).

8

Jika
dibandingkan
dengan
hasil
pengoptimuman sel bakteri E. coli tanpa tautsilang glutaraldehida pH optimum, yang
dihasilkan sama. Oleh karena itu, penambahan
glutaraldehida,
serta
diduga
adanya
keberadaan protein-protein lain dalam ekstrak
tidak memengaruhi kekuatan ionik dan nilai
pI bersihnya sehingga tidak menggeser nilai
pH optimumnya.

glutaraldehida memiliki linearitas yang lebih
tinggi dibandingkan yang dengan taut-silang
dengan glutaraldehida. Namun, nilai R2
keduanya tidak jauh berbeda. Hal ini
menunjukkan bahwa sel bakteri E. coli yang
terimobilisasi
taut-silang
dengan
glutaraldehida pada permukaan elektrode
pasta karbon berpotensi sebagai reagen
biofungsional untuk menaut-silangkan enzim.

Kinetika Enzim Glukosa Dehidrogenase
Imobilisasi
Kespesifikan enzim GDH dapat dilihat
dengan melakukan penentuan parameter
kinetika enzim, yaitu tetapan MichaelisMenten nyata (KM app) dan laju reaksi nyata
(Vmaks app) yang dianalogikan dengan arus
maksimum nyata (Imaks app). Parameter kinetika
enzim ini ditentukan dengan mengukur
aktivitas enzim GDH dengan variasi
konsentrasi substrat glukosa 0,5-20 mM pada
kondisi optimum masing-masing enzim. Data
pengukuran aktivitas enzim GDH ditunjukkan
pada Lampiran 8.
Gambar 4 mempelihatkan hubungan
konsentrasi substrat dengan aktivitas GDH sel
bakteri E. coli tanpa maupun dengan tautsilang
glutaraldehida.
Bentuk
kurva
menunjukkan aktivitas GDH yang dihasilkan
sesuai dengan persamaan Michaelis-Menten.

Gambar 5

Linearitas konsentrasi glukosa
dengan aktivitas GDH.

Penentuan parameter-parameter kinetika
enzim, yaitu KM app dan Imaks app menggunakan
metode
Lineweaver-Burk.
Gambar
6
menunjukkan kurva Lineweaver-Burk, yaitu

1 / I pa dengan 1/[glukosa].

Gambar 6 Alur Lineweaver-Burk sel bakteri
E. coli imobilisasi.
Gambar 4

Hubungan konsentrasi glukosa
dengan aktivitas GDH.

Reaksi terjadi dalam 2 tahap: pada kisaran
konsentrasi 0,5-20 mM reaksi berada pada
fase pertama, yaitu tidak semua sisi aktif
GDH mengikat substrat glukosa. Sementara,
fase kedua terjadi pada kisaran 20-30 mM,
tapak aktif GDH telah mengikat substrat
glukosa. Penambahan konsentrasi glukosa
yang lebih tinggi tidak memengaruhi aktivitas
GDH.
Gambar 5 memperlihatkan linearitas
hubungan antara konsentrasi glukosa dan
aktivitas enzim GDH. Aktivitas GDH tanpa

Nilai KM app ditampilkan pada Tabel 3.
Nilai KM app sel bakteri E. coli taut-silang
glutaraldehida lebih kecil dibandingkan
dengan KM app tanpa taut-silang glutaraldehida.
Namun, nilai Imaks app taut-silang glutaraldehida
lebih besar dibandingkan dengan tanpa
glutaraldehida. Nilai KM app dan Imaks app yang
kecil membuktikan bahwa laju reaksi katalitik
dari GDH yang dihasilkan oleh sel bakteri E.
coli lebih lambat dibandingkan yang dengan
taut-silang glutaraldehida.
Perbedaan nilai KM app yang dihasilkan
disebabkan oleh imobilisasi taut-silang
dengan glutaraldehida terjadi antar molekul.

9

Proses reaksi yang terjadi ialah glutaraldehida
bereaksi dengan hidroksil organik pembawa
dan dengan residu asam amino di dalam lisin.
Tabel 3 Nilai parameter kinetika sel bakteri E. coli
Metode
GDH sel bakteri E.
Taut-silang
coli
Glutaraldehida
Imaks app
KM app
Imaks app
KM app
(µA)
(mM)
(µA)
(mM)
Lineweaver
1,7931
1,9007
2,1404
1,1162
-Burk

Nilai KM app yang dihasilkan oleh Gaikwad
et al. (2006) dalam imobilisasi GOD pada
film PANI taut-silang glutaraldehida dengan
penentuan glukosa secara elektrokimia
sebesar 11,11 mM. Nilai KM tersebut lebih
besar dari penelitian ini. Nilai KM merupakan
ukuran kuat dan lemahnya enzim mengikat
substrat. Jika KM kecil, enzim mengikat kuat
substrat sehingga dengan substrat yang sedikit
cukup untuk menjenuhkan enzim. Sebaliknya,
nilai KM besar berarti enzim tidak terlalu
mengikat kuat substrat sehingga substrat yang
dibutuhkan untuk menjenuhkan enzim lebih
banyak. Dari hasil penelitian ini, dapat
disimpulkan bahwa keberadaan glutaraldehida
dapat meningkatkan puncak arus anodik
sehingga memiliki potensi sebagai reagen
biofungsional untuk meningkatkan efektivitas
biosensor glukosa berbasis E. coli.
Stabilitas Enzim Glukosa Dehidrogenase
sel Bakteri E. coli

Stabilitas dan selektivitas
sangat
diperlukan dalam imobilisasi enzim. Faktor
yang dipengaruhi terhadap enzim yang
terimobilisasi,
yaitu
substrat,
metode
imobilisasi, dan reagen biofungsional yang
digunakan. Enzim sangat sensitif oleh pH dan
suhu yang ekstrim sehingga mudah
terdenaturasi. Hal yang perlu diperhatikan
dalam proses imobilisasi adalah sifat dari
enzim bebas, jenis materi pendukung yang
digunakan, metode aktivasi pendukung, dan
perekatan enzim. Keuntungan enzim yang
diimobilisasi dibandingkan dengan enzim
bebas adanya peningkatan stabilitas dan
pemisahan produk mudah dari media reaksi
sehingga tidak perlu dilakukan proses lebih
lanjut seperti penginaktifan atau penghilangan
enzim, dan penurunan biaya produksi
(Norouzian
2003).
Aktivitas
enzim
dipengaruhi oleh stabilitasnya. Bakteri E. coli
merupakan bakteri gram negatif. Kebanyakan
sel-sel bakteri gram negatif memiliki
glutathione (tripeptida sistein) sistem buffer
yang memungkinkan untuk memodulasi

perubahan oksidasi/reduksi oleh rangsangan
eksternal atau internal dalam sel (Sode et al.
2000). Enzim dapat distabilkan dengan
menggunakan suatu pengikat taut-silang
berupa
glutaraldehida.
Taut-silang
glutaraldehida telah digunakan secara luas
untuk menghindari penurunan aktivitas enzim.
Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan
imobilisasi
taut-silang dengan
reagen
biofungsional glutaraldehida.
Senyawa-senyawa aldehida reaksi pada
kedua ujung glutaraldehida bereaksi dengan
kelompok amino bebas (kelompok ε-amino,
kelompok amino N-terminal) enzim. Gambar
7 menunjukkan reaksi yang terjadi pada enzim
dengan glutaraldehida.

Gambar 7 Taut-silang enzim pada gugus
asam amino dengan
glutaraldehida.
Penelitian yang dilakukan oleh Gaikwad et
al. (2007), imobilisasi GOD (glukosa
oksidase) pada film komposit polyanilinpolivinil sulfonat (Pani-PVS) menggunakan
taut-silang glutaraldehida memiliki stabilitas
yang lebih besar. Stabilisasi sel bakteri E. coli
dilakukan pada 0 jam hingga 12 jam setiap 2
jam lalu 24 jam dan 48 jam. Gambar 8
menunjukkan stabilitas sel bakteri E. coli baik
tanpa maupun taut-silang glutaraldehida
hingga 48 jam. Gambar tersebut menunjukkan
presentase stabilitas sel bakteri E. coli baik
tanpa maupun taut-silang glutaraldehida
memiliki aktivitas yang tinggi saat waktu 0
jam sebesar 100%. Saat waktu 2 jam aktivitas
GDH tanpa glutaraldehida turun hingga
58,92% sedangkan taut-silang glutaraldehida
masih mencapai 100%.
Aktivitas GDH sel bakteri E. coli tanpa
glutaraldehida setelah 4 jam tidak ada puncak
arus oksidasi yang dihasilkan. Jika
dibandingkan sel bakteri yang ditautsilangkan dengan glutaraldehida puncak arus
oksidasi yang dihasilkan masih ada hingga 48
jam. Menurut Trivadila (2006), aktivitas GDH
turun setelah 6 jam. Hal ini membuktikan
bahwa adanya glutaraldehida yang ditaut-

10

silangkan dengan sel bakteri E. coli dapat
meningkatkan stabilitas enzim.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan

Gambar 8 Stabilisasi E. coli.
Adanya
penambahan
BSA
dapat
mengurangi denaturasi enzim. Prosesnya,
dengan cara menggunakan
BSA untuk
memblok kelebihan gugus fungsional yang
aktif. Dengan demikian, gugus fungsional
yang aktif dari permukaan komplementer
tanpa adanya penambahan aktivitas (Cao
2005). Adanya ikatan taut-silang intramolekul
yang berlebihan di dalam enzim dapat
dihindari sehingga taut-silang antarmolekul
enzim dan stabilisasi dapat ditingkatkan.
Penggunaan larutan bufer fosfat dalam proses
taut-silang dengan glutaraldehida juga
menyebabkan enzim mengalami stabilisasi.
Menurut Tanriseven dan Dogan (2002),
metode baru imobilisasi untuk β-galactosidase
yang berasal dari Aspergillus oryzae
menghasilkan aktivitas relatif 56% dan
stabilitas hingga 35 hari tanpa penurunan
aktivitas. Jika dibandingkan dengan penelitian
ini, stabilitas aktivitas sel bakteri E. coli tautsilang glutaraldehida nilainya lebih kecil. Hal
ini disebabkan penambahan gelatin dan
gliserol yang memiliki fungsi yang sama
seperti BSA. Penelitian ini hanya dilakukan
penambahan BSA sebanyak 1 µL sedangkan
Tanriseven dan Dogan (2002) penambahan
gelatin sebanyak 1 gram dan 4 mL gliserol.
Oleh karena itu, stabilitas yang dihasilkan
cukup berbeda. Dari uji stabilisasi, dapat
disimpulkan bahwa taut-silang menggunakan
glutaraldehida dapat meningkatkan stabilisasi
aktivitas GDH sel bakteri E. coli sebesar
68%.

Penggunaan glutaraldehida sebagai reagen
biofungsional taut-silang untuk sel bakteri E.
coli yang diimobilisasi pada permukaan
elektrode pasta karbon dapat meningkatkan
aktivitas dan stabilitas GDH dalam biosensor
glukosa. Adanya glutaraldehida sebagai
reagen biofungsional menghasilkan aktivitas
relatif GDH sel bakteri E. coli sebesar 68%.
Nilai KM sel bakteri E. coli taut-silang dengan
glutaraldehida lebih kecil daripada nilai KM
tanpa taut-silang glutaraldehida. Hal ini
menunjukkan afinitas sel bakteri E. coli tanpa
taut-silang glutaraldehida lebih rendah
dibandingkan
dengan
taut-silang
glutaraldehida. Stabilitas aktivitas GDH yang
ditaut-silangkan dengan glutaraldehida lebih
stabil
daripada
tanpa
taut-silang
glutaraldehida hingga 48 jam.
Saran

Penelitian lanjutan perlu dilakukan pada
parameter
analtik,
yaitu
keterulangan
(repeatibility). Sebab penelitian ini, nilai
keterulangan yang dihasilkan rentangnya
cukup lebar.
DAFTAR PUSTAKA

Bisswanger H. 2008. Enzyme Kinetics
Principles and Methods. Weinheim:
Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.
KGaA.
Cao LQ. 2005. Immobilized enzyme: science
or art Current Opinion. Chem Biol 9:
217-226.
Desriani. 2003. PQQGDH (piroloquinoline
quinone glucose dehidroginase) sebagai
biosensor glukosa pada pengobatan
penyakit diabetes mellitus [Makalah].
Bogor: Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Divya PS, Savitri D dan Mitra CK. 1998.
Covalent immobilization onto glassy
carbon matrix-implications in biosensor
design. J Bioscien 23: 131-136.
Gaikwad et al. 2006. Immobilization of GOD
on electrochemically synthesized PANI
film by cross-linking via glutaraldehyde

11

for determination of glucose. Int J
Electrochem Scien 1: 425-434.
Gaikwad et al. 2007. Development of PANIPVS-GOD electrode by potentiometric
method for determination of glucose. Int
J Electrochem Scien 2: 488 – 497.
Ikeda et al. 1998. Electrochemical monitoring
of in vivo reconstitution of glucose
dehydrogenase in Escherichia coli cells
with externally added pyrroloquinoline
quinone. J Electroanal Chem 449: 219224.
Iswantini D, Kato K, Ikeda T, 1998.
Electrochemical
measurements
of
glucose dehydrogenase activity exhibited
by Escherichia coli cells; effectsof the
addition of pyrroloquinoline quinone,
magnesium or calcium ions and
ethylenediaminetetraacetic
acid.
Bioelectrochem and Bioenerg 46: 249254.
Iswantini D, Kano K, IkedaT. 2000. Kinetics
and thermodynamic of activation of
quinoprotein apoenzyme in vivo and
catalytic activity of the activated enzyme
in Escherichia coli cells. Biochem J
350: 917-923.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011.
Glucose biosensor using selected
Indonesian bacteria. Microbiol Indones
5: p9-14.
Itoh Y, Yamazaki S, Karno K, Ikeda T. 2002.
Escherichia coli and its application in a
mediated amperometric glucose sensor.
Biosens Bioelect 17: 993-998.
Khan GF, Wernet W. 1997. Design of
enzyme electrodes for extended use and
storage life. Anal. Chem. 69: 26822687.
Lin Y, Lu F, Tu Y, dan Ren Z. 2004. Glucose
biosensors based on carbon nanotube
nanoelectrode ensembles. Nano Letters
4: 2.
Matsushita K et al. 1997. Escherichia coli is
unable to produce pyrroloquinoline
quinine (PQQ). Microbiol 143: 31493156.
Mateo C, Palomo JM, van Langen LM, van
Rantwijk F, dan Sheldon RA. 2004. A

new, mild crosslinking methodology to
prepare crosslinked enzyme aggregates.
Biotech Bioeng 86 (3): 273-276.
Norouzian D. 2003. Enzyme immobilization:
the state of art in biotechnology. Iranian
J Biotech 1 (4): 197-206.
Othman N, Abu Bakar F, Salleh AB, Heng
LY, Wagiran R. 2006. Preliminary
investigation on a histamine biosensor
constructed
from diamine oxidase
immobilised onto an oxygen probe.
Malaysia J Anal Scienc 10: 137-142.
Ourbrie A, Rozeboom H, Kaulk K, Dijksrtra
B. 1999. Crystal structure of the
biosensor
glucose
dehydrogenase.
[terhubung
berkala].
http://www.xray.c2/ecm/abstract/d/4/371
_htm. [4 Febuari 2011].
Ramanavičius A, Meškys R, Laurinavičius
V.
1997.
Immobilization
and
investigation of sarcosine oxidase and
creatine amidinohydrolase. Biol 1 : 77
– 80.
Sode K et al. 2000. Increasing the thermal
stability
of
the
water-soluble
pyrroloquiniline
quinone
glucose
dehydrogenase by single amino acid
replacement. Enzyme Microbial Tech 26:
491-498.
Tanriseven A, Dogan S. 2002. A novel
method for the immobilization of βgalactosidase. Proc Biochem 38: 27-30.
Trivadila.
2006.
Aktivitas
glukosa
dehidrogenase pada tiga isolat bakteri
Indonesia terpilih yang diimobilisasi
untuk pengembangan biosensor glukosa
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Trivadila. 2011. Biosensor antioksidan
menggunakan superoksida dismutase
Deinococus radiodurans diimobilisasi
pada permukaan elektrode pasta karbon
dan parameter kinetikanya [tesis].
Bogor: Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor.
Turner APF. 2002. Biosensor: past, present,
and
future.
[terhubung
berkala].
http://www.cranfield.ac.uk/health/resear

12

chareas/biosensorsdiagnostics/page1879
5.html. [4 Februari 2011].
[WHO] World Health Organization. 2006.
Witarto AB, Sode K. 2001. Increasing the
hydrophobic
interaction
between
terminal W-motifs enhances the stabiliy
of salmonella thypimurium sialidase: a
general strategy for the stabilization of
β-propeller protein fold. Protein Eng 14:
891-896.

LAMPIRAN

14

Lampiran 1 Bagan alir umum penelitian

Penanaman dan peremajaan bakteri E. coli

Pemanenan bakteri E. coli

Uji aktivitas GDH sel bakteri E. coli
(metode elektrokimia)
Pengoptimuman tanpa glutaraldehida

Pengoptimuman taut-silang glutaraldehida

Uji stabilitas GDH sel bakteri E. coli
(metode elektrokimia)

15

Lampiran 2 Bagan alir kerja
Sel bakteri E. coli

Ditanam pada media LB
agar miring
(inkubasi 1 hari, suhu 37 oC)

Ditanam pada 10 mL media
LB cair (starter)
(inkubasi 1 hari, suhu 37 oC)

Inokulasi pada 250 mL
media LB cair (inkubasi
suhu 37 oC, 1 hari)

Pemanenan (sentrifugasi
kecepatan 1000 rpm suhu 5
o
C, 15 menit)

Pelet (sel)
Resuspensi ditambahkan
1 mL NaCl 0,85%
Metode Elektrokima

Uji aktivitas GDH sel
bakteri E. coli

Pengoptimuman tanpa
glutaraldehida

Pengoptimuman tautsilang glutaraldehida

Uji stabilitas GDH sel
bakteri E. coli

Supernatan

16

Lampiran 3 Pembuatan elektrode pasta karbon dan imobilisasi sel bakteri E. coli

Parafin cair: grafit (1:2)

Campuran digerus hingga membentuk
pasta dan dimasukkan ke dalam badan
elektrode hingga padat permukannya

Permukaan karbon dihaluskan dengan
amplas dan kertas minyak

Sebanyak 5 µL suspensi sel bakteri E.
coli diimobilisasi (tanpa dan taut-silang
glutaraldehida) pada permukaan elektrode

Permukaan dikeringudarakan lalu
dilapisi dengan membran dialisis

Ditutup dengan jaring nilon dengan
parafin

Elektrode disimpan dalam larutan NaCl
0,85%, suhu 5 oC (tidak digunakan)

17

Lampiran 4 Voltamogram siklik sel bakteri E. coli terimobilisasi
11.efwdat : Page 42
11.efwdat : Page 40
11.efwdat : Page 29
11.efwdat : Page 7

20
2020

20

10
10
1010

10

A)

i 1 ( μA)

?(A)
A)A)1
i?(
?( ?( 1
i
i 1i 1

0
0
00

0

0

-10

-20
-20
-20

-0,6

-20

-0,4

-0,2

0

-0,6
-0,4
-0,2
0 E (V)
-0,4
-0,4
-0,2
-0,2
0 0(15 E
-0,6 Initial E: -400mV, Final E: -400mV,
Mode:-0,6
Cyclic,
Rate: 250mV/s, Step W: 20ms, Upper
E: 500mV, Lower E: -400mV, Cycles: 100
Jul(V)
2011, 21:53:26)
-0,6
-0,4
-0,2
0E E(V)(V)

0,2

0,4

0,6

0,2
0,2
0,2

0,4
0,4
0,4

0,6
0,6
0,6

E (V)

0,2

0,4

0,6

ode:
Mode:
Cyclic,
Cyclic,
Initial
Initial
E: -400mV,
E: -400mV,
FinalFinal
E: -400mV,
E: -400mV,
Rate:
Rate:
250mV/s,
250mV/s,
StepStep
W: 20ms,
W: 20ms,
Upper
Upper
E: 500mV,
E: 500mV,
Lower
Lower
E: -400mV,
E: -400mV,
Cycles:
Cycles:
10 (15
10 (15
Jul 2011,
Jul 2011,
21:48:26)
21:50:01)

Mode: Cyclic, Initial E: -400mV, Final E: -400mV, Rate: 250mV/ s, Step W: 20ms, Upper E: 500mV, Lower E: -400mV, Cycles: 10 (15 Jul 2011, 21:46:49)

Bufer fosfat (a)

a + Qo (b)

b + Glukosa (c)

c + PQQ (d)

Lampiran 5 Voltamogram siklik taut-silang dengan glutaraldehida terimobilisasi

d + MgSO4

18

Lampiran 5 Voltamogram siklik taut-silang dengan glutaraldehida terimobilisasi
1.efwdat : Page 4
40
40
40
40

40

20
20
20
20

20

A)

i 1 ( μA)

?(
A)
?i(1A)
iA)1?(
?( i 1
i1

0
0
0
0

0

-20
-20
-20
-20

-20

-40
-40
-40
-40

-40

-0,6
-0,4
-0,2
0
E (V)
-0,6
-0,4
-0,2
0
E (V)
Mode: Cyclic,
500mV, Lower E: -400mV, Cycles: 100 (22
-0,6 Initial E: -400mV, Final E: -400mV, Rate:
-0,4 250mV/s, Step W: 20ms, Upper E:-0,2
0 Jul 2011, 17:36:48)
-0,6

-0,6

-0,4

-0,4

-0,2

0

-0,2

0

E (V)
E (V)

E (V)

0,2

0,4

0,6

0,2

0,4

0,6

0,2

0,4

0,2

0,4

0,2

0,4

0,6
0,6

0,6

Mode: Cyclic, Initial E: -400mV, Final E: -400mV, Rate: 250mV/ s, Step