Activity and stability of glucose biosensor based on Escherichia coli immobilized on zeolite-glutaraldehyde
AKTIVITAS DAN STABILITAS BIOSENSOR GLUKOSA
BERBASIS Escherichia coli YANG DIIMOBILISASI PADA
ZEOLIT-GLUTARALDEHIDA
LUKMAN LA GIA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas dan Stabilitas
Biosensor Glukosa Berbasis Escherichia coli yang Diimobilisasi pada ZeolitGlutaraldehida adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2012
Lukman La Gia
NIM G44080119
ABSTRAK
LUKMAN LA GIA. Aktivitas dan Stabilitas Biosensor Glukosa Berbasis
Escherichia coli yang Diimobilisasi pada Zeolit-Glutaraldehida. Dibimbing oleh
DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, dan TRIVADILA.
Biosensor glukosa berbasis Escherichia coli hingga saat ini telah
dikembangkan. Pengembangan ini memiliki beberapa kelemahan, yaitu aktivitas
glukosa dehidrogenase (GDH) dan stabilitas elektrode rendah. Penggunaan zeolit
pada biosensor dapat meningkatkan aktivitas enzim, sedangkan penggunaan
glutaraldehida (GA) sebagai bahan taut-silang dapat meningkatkan stabilitas
elektrode. Perancangan percobaan optimisasi dilakukan menggunakan metode
permekaan respons (RSM). Kondisi optimum aktivitas biosensor ini ialah suhu 30
o
C, pH 6, konsentrasi glukosa 15 mM, konsentrasi pirolokuinolina kuinon (PQQ)
3.5 µM, zeolit 150 mg/mL, dan konsentrasi GA 14.05%. GDH sel E. coli
terimobilisasi dapat mendeteksi konsentrasi glukosa hingga 50 mM. Reaksi
kinetika GDH sel E. coli terimobilisasi mengikuti persamaan Lineweaver-Burk.
Nilai KM app dan Imaks app biosensor ini secara berturut-turut adalah 2.69 mM dan
3.73 µA. Aktivitas GDH sel bakteri relatif stabil sebesar 70–80% selama 4 hari.
Oleh karena itu, penggunaan zeolit-GA sebagai matriks imobilisasi dapat
meningkatkan aktivitas GDH sel bakteri E. coli yang relatif stabil.
Kata kunci: biosensor glukosa, Escherichia coli, glutaraldehida, zeolit.
ABSTRACT
LUKMAN LA GIA. Activity and Stability of Glucose Biosensor Based on
Escherichia coli Immobilized on Zeolite-Glutaraldehyde. Supervised by DYAH
ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT and TRIVADILA.
Glucose biosensor based on Escherichia coli have been developed recently.
Despite of some drawbacks, such as the activity of glucose dehydrogenase (GDH)
and the lower electrode stability. The use of zeolite in biosensors can increase the
enzyme activity, while the use of glutaraldehyde (GA) as a cross-link can improve
the electrode stability. The design optimization employed response surface
methods (RSM). The optimum conditions activity of GDH cells with E. coli
immobilized was at temperature 30 °C, pH 6, glucose 15 mM, pyrroloquinoline
quinone (PQQ) 3.5 μM, zeolite 150 mg/mL, and GA 14.05%. This biosensor was
able to detect up to 50 mM glucose concentration. The reaction kinetics followed
Lineweaver-Burk equation. KM app value and Imaks app GDH cells E. coli
immobilized in a row is 2.69 mM and 3.73 µA. The biosensor was relatively
stable at 70–80% for 4 days. Therefore, the use of zeolite-GA as an
immobilization matrix can enhance the activity of the stable bacterial cell of
GDH-E. coli.
Keywords: Escherichia coli, glucose biosensor, glutaraldehyde, zeolite.
AKTIVITAS DAN STABILITAS BIOSENSOR GLUKOSA
BERBASIS Escherichia coli YANG DIIMOBILISASI PADA
ZEOLIT-GLUTARALDEHIDA
LUKMAN LA GIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Aktivitas dan Stabilitas Biosensor Glukosa Berbasis Escherichia
coli yang Diimobilisasi pada Zeolit-Glutaraldehida
Nama
: Lukman La Gia
NIM
: G44080119
Disetujui oleh
Pembimbing I
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MScAgr
NIP 19670730 1999103 2 001
Pembimbing II
Pembimbing III
Dr Novik Nurhidayat
NIP 19771029 200502 2 001
Trivadila, SSi, MSi
Diketahui oleh
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini ialah biosensor, dengan
judul Aktivitas dan Stabilitas Biosensor Glukosa Berbasis Escherichia coli yang
Diimobilisasi pada Zeolit-Glutaraldehida.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Dyah Iswantini Pradono,
MScAgr, Bapak Dr Novik Nurhidayat dan Ibu Trivadila, SSi, MSi selaku
pembimbing, serta Bapak La Eddy, Dirwan, Bapak Ammar, Raudhatul Fadhilah,
Dian, Okik, Yuanita, Liyonawati, dan Dinie yang telah banyak memberi saran. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Ai dan Bapak Mail, staf
Laboratorium Kimia Fisik, Ibu Dr Henny Purwaningsih selaku Kepala
Laboratorium Bersama Kimia, Bapak Wawan dan Bapak Eko, staf Laboratoriun
Bersama Kimia. Apresiasi juga penulis sampaikan kepada Ibu Neri, Ibu Erna, Ibu
Ratih, dan Bapak Acun di Laboratorium Genetika Mikrobiologi, Puslit Biologi
LIPI yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada Pemda Halmahera Selatan atas beasiswa BUD IPB yang
telah diberikan. Tak lupa pula, ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayah,
Ibu, seluruh keluarga, dan Nurfajriana atas segala doa dan kasih sayangnya, serta
teman-teman seperjuangan di mayor Kimia angkatan 2008.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2012
Lukman La Gia
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
TINJAUAN PUSTAKA
2
Biosensor
2
Glukosa Dehidrogenase
3
Escherichia coli
3
Zeolit
4
Glutaraldehida
5
Imobilisasi Enzim
5
Metode Voltammetri
6
METODE
7
Alat dan Bahan
7
Metode Penelitian
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
9
9
Kinetika GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
10
Aktivitas dan Stabilitas GDH Sel E. coli Terimobilisasi
14
SIMPULAN DAN SARAN
16
Simpulan
16
Saran
16
DAFTAR PUSTAKA
16
LAMPIRAN
19
RIWAYAT HIDUP
27
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Ilustrasi tiga generasi perkembangan biosensor
Escherichia coli
Plot kontur hubungan antara faktor peubah bebas terhadap arus anode
Hubungan konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GDH
Alur Lineweaver-Burk GDH sel E. coli terimobilisasi
Voltammogram siklis GDH sel E. coli terimobilisasi
Stabilitas biosensor glukosa berbasis E. coli
2
4
12
13
13
154
145
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Bagan alir umum penelitian
Bagan alir pembutan media
Bagan alir kerja
Bagan alir elektrode pasta karbon dan imobilisasi
Hasil kombinasi faktor-faktor peubah bebas.
Hasil optimasi Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
Kinetika enzim GDH sel bakteri E. coli terimobilisasi
Stabilitas elektrode biosensor glukosa berbasis E. coli terimobilisasi
19
20
21
22
23
24
25
26
PENDAHULUAN
Penyakit diabetes melitus (DM) disebabkan oleh timbulnya masalah dalam
produksi dan suplai hormon insulin dalam tubuh (IDF 2009). Dewasa ini,
penderita DM menggunakan biosensor sebagai alat pengukur gula darah.
Umumnya digunakan enzim sebagai biosensor yang bekerja berdasarkan reaksi
enzimatik. Biosensor adalah sensor yang mengombinasikan komponen hayati
dengan komponen elektronik (transduser) yang mengubah sinyal dari komponen
hayati menjadi luaran yang terukur (Castillo et al. 2004; Witarto 2007).
Enzim memiliki peran yang penting dalam biosensor, tetapi harganya, serta
stabilitas dan aktivitas enzimnya rendah. Menurut Ohfuji et al. (2004),
mikroorganisme dapat digunakan sebagai biosensor glukosa. Mikrob penghasil
enzim sebagai sensor untuk mengukur kadar glukosa ini merupakan alternatif baru
(Trivadila 2006). Keuntungan sensor mikrob dibandingkan dengan sensor enzim
adalah lebih tahan lama, lebih murah karena tidak diperlukan isolasi dan
pemurnian enzim aktif, serta lebih stabil (Iswantini et al. 2011).
Biosensor pertama kali dikembangkan oleh Leland Clark (1956). Enzim
glukosa oksidase (GOD) yang digunakan Clark mekanisme kerjanya bergantung
pada keberadaan oksigen. Akibatnya, alat pengukur ini dapat memberikan hasil
yang berbeda dari individu yang sama. Hal tersebut mendorong penggantian
enzim GOD dengan enzim glukosa dehidrogenase (GDH). Enzim GDH spesifik
terhadap substrat glukosa dan aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh kadar oksigen.
Enzim pirolokuinolina kuinon glukosa dehidarogenase (PQQGDH) merupakan
alternatif baru yang digunakan sebagai komponen pengenal analit pada biosensor
glukosa. Struktur kristal PQQ diketahui merupakan gugus prostetik enzim GDH.
Menurut Witarto (2007), enzim PQQGDH yang berasal dari bakteri Gram negatif
seperti Escherichia coli dapat mengatalisis reaksi redoks glukosa dan dianggap
memenuhi syarat biosensor.
Penggunaan mikrob sebagai penghasilan enzim, yaitu E. coli KRGL dan
Bacillus subtilis KRGS. E. coli telah diketahui menghasilkan GDH-A. Enzim
PQQGDH-A telah dimanfaatkan dan diaplikasikan sebagai biosensor glukosa
(Iswantini et al. 2011). Aktivitas GDH yang dihasilkan oleh sel bakteri E. coli
KRGS terbesar dibandingkan dengan B. subtilis KRGL baik dengan metode
spektrofotometri maupun metode elektrokimia (Trivadila 2006).
Penelitian tentang penggunaan zeolit untuk sensor telah dilakukan. Balal et
al. (2009) melaporkan bahwa elektrode pasta karbon yang termodifikasi zeolit Y
dengan mediator Fe3+ dapat menghasilkan arus yang lebih tinggi serta sensitivitas,
selektivitas, dan kestabilan yang tinggi. Penggunaan glutaraldehida (GA) sebagai
bahan taut-silang dengan enzim juga sangat populer pada biosensor. Teknik
imobilisasi dengan taut-silang GA dapat meningkatkan stabilitas dan sensitivitas
biosensor (Othman et al. 2006; Goriushkina et al. 2010). Keuntungan
menggunakan GA ialah harganya relatif murah dan lazim digunakan secara
komersial (Mateo et al. 2004). Penelitian yang telah dilakukan, penggunaan GA
sebagai bahan taut-silang sel E. coli diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta
karbon dapat meningkatkan aktivitas dan stabilitas GDH pada biosensor glukosa
sebesar 68% (Hapsari 2011). Hingga saat ini, penelitian biosensor berbasis E. coli
masih memiliki berberapa kelemahan, yaitu aktivitas enzim GDH dan stabilitas
2
elektrode kerja yang rendah. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan zeolit
untuk meningkatkan aktivitas enzim dan GA sebagai bahan biofungsional yang
dapat meningkatkan kestabilan biosensor glukosa.
Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas dan stabilitas enzim GDH
yang dihasilkan oleh isolat bakteri E. coli ATCC25922 yang diimobilisasi pada
zeolit-GA.
TINJAUAN PUSTAKA
Biosensor
Biosensor didefinisikan sebagai suatu kesatuan turunan dari sensor kimia
yang menggabungkan unsur hayati dengan transduser atau kombinasi reseptor
senyawa biologi dan transduser fisik atau fisiokimia. Komponen pengenal hayati
sebuah biosensor berinteraksi secara interaktif dan selektif terhadap analat,
sedangkan transduser mengubah respon hayati menjadi sinyal yang dapat diukur
sebagai sinyal dari biosensor (Castilo et al. 2004; Rana et al. 2010).
Perkembangan biosensor dibagi menjadi tiga generasi, yaitu: biosensor
generasi pertama, kedua dan ketiga (Gambar 1). Biosensor generasi pertama
melibatkan oksigen dalam pengukuran. Elektrode yang digunakan adalah
elektrode oksigen. Reaksi redoks yang terjadi, melibatkan oksigen dan enzim
diantaranya ialah oksigenase dan oksidase. Kelemahan dari biosensor generasi
pertama ialah data yang dihasilkan tidak akurat karena pengaruh oksigen bebas
dari lingkungan. Biosensor generasi kedua merupakan generasi biosensor yang
menggunakan mediator untuk menghubungkan reaksi oksidasi substrat dengan
elektrode. Sedangkan biosensor generasi ketiga mulai meningkatkan integrasi
mediator dengan elektrode (Liu dan Wang 2000).
Perancangan biosensor yang lebih inovatif terus dilakukan karena memiliki
Gambar 1 Ilustrasi tiga generasi dalam perkembangan
biosensor generasi pertama (a), kedua (b),
dan ketiga (c).
3
kelemahan, yaitu tidak dapat digunakan secara berulang, daya variasi kurang
tinggi, waktu respon yang relatif rendah, rentang linear sempit, sensitivitas rendah
dan kurang stabil serta presisi dan deteksi yang masih rendah (Wang et al. 2008).
Biosensor glukosa merupakan salah satu dari aplikasi biosensor yang berkembang
dengan cepat bahkan telah dimanfaatkan secara komersial (Fiorito dan Torresi
2001; Castillo et al. 2004). Biosensor glukosa pertama kali dikembangkan pada
tahun 1956 oleh Leland Clark, seorang ahli fisiologi dan biokimia dari Amerika
Serikat. Saat itu Clark menggunakan enzim GOD yang spesifik terhadap glukosa
dan dapat dihasilkan secara alamiah dari jamur Aspergillus niger.
Perkembangan biosensor glukosa hingga sekarang telah diarahkan pada
penggunaan pengenal hayati menggunakan mikrob. Iswantini et al. (2011)
melakukan penelitian mengenai pemilihan bakteri asal Indonesia sebagai
biosensor glukosa. Berdasarkan uji enzim GDH menggunakan metode
spektrofotometer dan elektrokimia, bakteri E. coli asal Indonesia dapat
dikembangkan sebagai biosensor glukosa.
Glukosa Dehidrogenase
Glukosa dehidrogenase (GDH) merupakan enzim yang aktif dalam
pengambilan atom hidrogen dari substrat dan berperan dalam reaksi oksidasi
langsung glukosa membentuk asam glukonat (Winarno 2010). Enzim GDH
spesifik terhadap substrat glukosa dan aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh kadar
oksigen (Turner 2002). Kristal PQQ diketahui merupakan gugus prostetik enzim
GDH. Pengikatan PQQ terhadap enzim GDH terjadi melalui interaksi polar.
PQQGDH merupakan alternatif baru yang digunakan sebagai biosensor glukosa.
PQQGDH sendiri ditemukan pada berbagai bakteri gram negatif. PQQGDH tidak
dipengaruhi kadar oksigen, juga memiliki aktivitas yang tinggi. Menurut Witarto
(2007), penggunaan enzim GDH dalam biosensor glukosa untuk merekayasa
protein enzim PQQGDH sebagai alat ukur gula darah dapat mengunakan enzim
PQQGDH-A dan PQQGDH-B sebagai komponen biosensor glukosa.
Escherichia coli
Escherichia coli (Gambar 2) termasuk dalam superdomain Phylogenetica,
filum Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales,
genus Escherichia, dan spesies E. coli. Bakteri ini merupakan suatu organisme
yang tidak berbahaya, biasanya hidup didalam saluran usus manusia dan hewan
tingkat tinggi lainnya. Sel E. coli berukuran panjang 2 µm dan berdiameter
sedikitnya 5.0 µA) dan
menghasilkan kondisi optimum di sekitar suhu 30 oC, pH 6, konsentrasi glukosa
15 mM, konsentrasi PQQ 3.5 μM, zeolit 150 mg/mL, dan konsentrasi GA 12.5%.
Hasil optimum yang dihasilkan pada alur kontur digunakan sebagai nilai
awal penentuan kondisi optimum menggunakan Response Optimizer pada RSM.
10
Kondisi optimum aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi adalah suhu 30 oC, pH
6, konsentrasi glukosa 15 mM, konsentrasi PQQ 3.5 μM, zeolit 150 mg/mL, dan
konsentrasi GA 14.05%. Hapsari (2011) melaporkan kondisi suhu dan pH
optimum yang sama, yaitu 30 oC dan pH 6, sedangkan kondisi optimum
konsentrasi PQQ, glukosa, dan GA berturut-turut adalah 3.05 µM, 10.25 mM, dan
12.5 µL (GA 25%). Hasil ini membuktikan kondisi bahwa optimum arus puncak
anode sangat dipengaruhi oleh proses imobilisasi. Saiapina et al. (2011)
menggunakan zeolit klinoptilolit pada biosensor enzim untuk menentukan urea
dan menghasilkan kondisi optimum pada PBS pH 7.
Parameter kondisi optimum puncak arus oksidasi dipengaruhi oleh nilai pH.
Enzim terimobilisasi menunjukkan kebergantungan pada perubahan nilai pH dan
kekuatan ionik, terutama jika parameter ini diubah oleh reaksi enzim (Bisswanger
2008). Pergeseran nilai pH terjadi karena enzim terimobilisasi pada matriks yang
memiliki perbedaan muatan (Trivadila 2011).
Alur kontur hasil optimasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi (Gambar
3) sulit diduga kondisi optimumnya. Hal ini disebabkan penggunaan faktor
peubah bebas yang lebih besar dari 5 (6 faktor). Menurut Tiera (2003),
berdasarkan aturan statistik, jika jumlah faktor ≥5 perlu dilakukan penapisan
menggunakan metode faktorial fraksional atau metode Plackett-Burman.
Kinetika GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
Kinetika imobilisasi enzim pada sistem biosensor umumnya melihat
parameter tetapan Michaelis-Menten (KM app) dan laju reaksi maksimum (Vmaks app)
yang diasumsikan sebagai arus maksimum (Imaks app). Tetapan Michaelis-Menten
(KM) merupakan konsentrasi yang menghasilkan setengah aktivitas maksimum,
sedangkan Imaks merupakan aktivitas maksimum. Parameter kinetika ditentukan
dengan mengukur aktivitas GDH sel bakteri E. coli terimobilisasi dengan variasi
konsentrasi substrat (glukosa) 0.5–70 mM pada kondisi optimum. Data aktivitas
enzim GDH sel bakteri E.coli terimobilisasi ditunjukkan pada Lampiran 7.
Gambar 4a menunjukkan bahwa hubungan konsentrasi substrat dengan
aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi sesuai dengan persamaan MichaelisMenten: v = Vmaks[S]/(KM + [S]). Bentuk kurva menunjukan aktivitas GDH terjadi
dalam 2 tahap, yaitu (1) ketika konsentrasi substrat di bawah 50 mM, belum
semua tapak aktif enzim mengikat substrat dan aktivitas GDH semakin
meningkat; (2) ketika konsentrasi substrat mencapai 50 mM kondisi aktivitas
maksimum dan semua tapak aktif enzim telah mengikat substrat. Menurut Murray
et al. (2003), aktivitas enzim akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
substrat hingga tercapai suatu keadaan enzim jenuh terhadap substrat. Aktivitas
yang terukur akan mencapai suatu nilai maksimum dan tidak lagi dipengaruhi
oleh peningkatan konsentrasi substrat.
11
7.0
25
Arus
< -1
-1 –
0 –
0
1
1 –
2 –
3 –
2
3
4
6.5
3.5
150
[ GA]
12.5
Glukosa
pH
PQQ
zeolit
5.5
3
4
5
5
H old V alues
pH
6
PQ Q 3.5
15
zeolit 150
[GA ] 12.5
10
27.5
30.0
(a)
32.5
35.0
5
25. 0
Suhu
4.8
4.0
32. 5
35. 0
Ar us
< -4
-4 – -2
-2 –
0 –
0
2
>
2
200
Hold Values
Hold Values
pH
6
Glukosa
15
zeolit
150
[ GA]
12.5
3.2
30. 0
250
Arus
< 1.0
1.0 – 1.5
1.5 – 2.0
2.0 – 2.5
2.5 – 3.0
3.0 – 3.5
3.5 – 4.0
> 4.0
5.6
27. 5
(b) Suhu
zeolit
5.0
25.0
PQQ
2 –
3 –
4 –
>
20
>
4
Hold Values
Glukosa
15
6.0
A rus
< 1
1 – 2
pH
Glukosa
PQQ
[ GA]
150
6
15
3.5
12.5
2.4
100
1.6
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
50
25.0
(c) Suhu
20.0
27.5
30.0
32.5
35.0
(d) Suhu
Ar us
25
Arus
< -3
-3 – -2
17.5
-2 – -1
-1 –
0
0 –
1 –
1
2
2 –
3
>
3
20
pH
6
Glukosa
10.0
15
PQQ
3.5
zeolit
150
4
4 –
5 –
5
6
>
6
Hold
Hold Values
12.5
2
3
3 –
Values
Glukosa
[ GA ]
15.0
<
2 –
Suhu
15
30
PQQ
3.5
zeolit
150
10
7.5
27.5
30.0
32.5
5
5.0
35.0
(e ) Suhu
5.6
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.8
5.5
6.0
(f)
6.5
7.0
pH
250
Ar us
< 1.5
– 2.0
– 2.5
– 3.0
– 3.5
– 4.0
– 4.5
> 4.5
4.0
PQQ
Hold Values
Suhu
30
Glukosa 15
3.2
zeolit
[ GA]
Hold Values
Suhu
30
Glukosa
15
PQQ
3.5
[ GA]
12.5
150
150
12.5
100
2.4
Arus
< -2
-2 – -1
-1 –
0
0 –
1
1 –
2
2 –
3
>
3
200
zeolit
5.0
25.0
1.6
50
5.0
5.0
5.5
6.0
(g)
pH
6.5
7.0
5.5
6.0
(h)
pH
6.5
7.0
12
20.0
Arus
17.5
<
-2
-2 –
-1 –
-1
0
0 –
1
1 –
2
2 –
3
>
3
15.0
Ar us
4.8
30
Glukosa
15
PQQ
[ GA]
4.0
Suhu
PQQ
3.5
zeolit
3.5
4.0
4.5
4.5 –
Hold Values
12.5
<
3.5 –
4.0 –
5.6
5.5
5.5 –
>
6.0
6.0
Hold Values
3.2
150
5.0
5.0 –
Suhu
30
pH
zeolit
6
150
[ GA]
12.5
10.0
2.4
7.5
1.6
5.0
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
5
(i) pH
250
15
20
25
(j) Gluk osa
20.0
Ar us
200
10
<
0
0 –
1
1 –
2
2 –
3
3 –
>
4
4
Ar us
< 1
1 – 2
2 – 3
3 – 4
17.5
> 4
Hol d Values
Suhu 30
pH
6
15.0
Suhu
30
pH
[GA]
zeolit
Hol d Values
150
6
PQQ
[ GA]
3.5
12.5
PQQ 3.5
zeolit 150
12.5
10.0
100
7.5
50
5
10
15
20
5.0
25
5
Gluk osa
(k )
250
200
1
1 –
2
2 –
3
3 –
4
>
4
15
(l)
20
25
Ar us
17.5
15.0
30
pH
6
Glukosa
15
[ GA]
1
2
2 –
3
3 –
4
>
4
Suhu
[ GA ]
zeolit
Suhu
<
1 –
Hold Values
Hold Values
150
Glukosa
20.0
Ar us
< 0
0 –
10
pH
12.5
Glukosa
zeolit
30
6
15
150
12.5
10.0
100
7.5
5.0
50
1.6
2.4
3.2
4.0
4.8
5.6
20.0
2.4
3.2
(n) P Q Q
4.0
4.8
5.6
Ar us
17.5
<
-4 –
-2 –
-4
-2
0
0 –
>
2
2
Hol d Val ues
Suhu
30
15.0
[ GA]
1.6
(m) P Q Q
pH
Glukosa
12.5
PQQ
6
15
3.5
10.0
7.5
5.0
50
100
150
ze olit
(o)
200
250
Gambar 3 Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan [glukosa] (b),
suhu dan [PQQ] (c), suhu dan zeolit (d), suhu dan [glutaraldehida] (e), pH
dan [glukosa] (f), pH dan [PQQ] (g), pH dan zeolit (h), pH dan [GA] (i),
[glukosa] dan [PQQ] (j), [glukosa] dan zeolit (k), [glukosa] dan [GA] (l),
[PQQ] dan zeolit (m), [PQQ] dan [GA] (n), zeolit dan [GA] terhadap
puncak arus oksidasi (o).
13
8
8
7
7
Aktivitas GDH (µA)
Aktivitas GDH (µA)
Hubungan linear antara konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GDH sel
E. coli terimobilisasi (Gambar 4b) yang terjadi hingga konsentrasi glukosa
mencapai 50 mM, mengikuti persamaan regresi y = 0.1301x + 0.8299 dengan R2 =
99.10%. Penentuan linearitas pengukuran bertujuan menentukan daerah kerja
maksimum dari elektrode. Jika dibandingkan dengan hasil yang diperoleh Hapsari
(2011), aktivitas maksimum enzim GDH sel E. coli yang ditaut-silang dengan GA
diperoleh pada konsentrasi substrat 20 mM. Konsentrasi substrat yang lebih tinggi
dari 20 mM menghasilkan aktivitas yang cenderung konstan (Hapsari 2011). Hasil
penelitian ini menunjukan dearah kerja maksimum dari elektrode lebih baik yaitu
50 mM.
6
5
4
3
2
1
6
5
y = 0.1301x + 0.8299
R² = 0.9910
4
3
2
1
0
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80
0
20
[glukosa] (mM)
40
60
[glukosa] (mM)
(a)
(b)
Ip-1 (µA-1)
Gambar 5 Hubungan konsentrasi substrat glukosa dengan aktivitas (a), rentang
antara linear substrat glukosa dan aktivitas GDH E. coli
terimobilisasi (b).
Penentuan parameter kinetika menggunakan persamaan Lineweaver-Burk.
Gambar 5 menunjukan kurva alur Lineweaver-Burk dengan persamaan garis y =
0.7211x + 0.278 dan R2 = 93.28%. Dari persamaan garis yang diperoleh, dapat
ditentukan nilai KM app dan Imaks app secara berturut-turut adalah 2.6927 mM dan
3.7341 µA. Hapsari (2011) melaporkan nilai KM app GDH sel E. coli tanpa dan
taut-silang GA berturut-turut sebesar 1.9007 mM dan 1.1162 mM, Nilai KM app
lebih kecil dibandingkan dengan hasil penelitian ini. Akan tetapi, nilai KM
penelitian ini masih lebih kecil dari hasil yang dilaporkan oleh Gaikwad et
al.(2007) dalam imobilisasi enzim GOD pada film PANNI tertaut-silang GA
untuk menentukan glukosa secara potensiometri, yaitu sebesar 7.14 mM.
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y = 0.7211x + 0.2678
R² = 0.9328
0.00
0.50
1.00
1.50
[glukosa]-1 (mM-1)
2.00
2.50
Gambar 4 Alur Lineweaver-Burk GDH sel E. coli terimobilisasi.
14
Nilai KM merupakan ukuran kuat atau lemahnya enzim mengikat substrat.
Semakin besar nilai KM, semakin lemah enzim mengikat substrat dan semakin
kecil nilai KM, semakin kuat pula enzim mengikat substrat atau semakin tinggi
afinitasnya. Nilai KM app yang tinggi pada penelitian ini dapat bekerja dalam
kisaran konsentrasi glukosa jauh lebih lebar, yaitu 0.5–50 mM. Selain itu, nilai
Imaks app yang dilaporkan Hapsari (2011) untuk GDH sel E. coli tanpa dan tautsilang GA, yaitu berturut-turut 1.7931µA dan 2.1404 µA, lebih kecil jika
dibandingkan dengan hasil penelitian ini. Nilai Imaks app merupakan indikator
aktivitas enzim. Semakin besar nilai Imaks app, semakin tinggi aktivitas enzim dan
sebaliknya. Hasil ini menunjukan penggunaan zeolit-GA sebagai matriks
imobilisasi sel E. coli pada biosensor glukosa dapat meningkatkan aktivitas GDH,
walaupun masih memiliki afinitas yang rendah.
Aktivitas dan Stabilitas GDH Sel E. coli Terimobilisasi
Metode voltammetri siklis digunakan untuk mengukur aktivitas GDH.
Elektron dihasilkan dari reaksi oksidasi substrat glukosa dengan katalis GDH
(Trivadila 2006). Oleh karena itu, aktivitas GDH dapat diamati dari perubahan
arus yang terukur akibat reaksi oksidasi ini (puncak anode). Gambar 6
menunjukkan perbedaan puncak anode dan katode pada voltammogram siklis
pasta karbon sel E. coli terimobilisasi.
Larutan bufer fosfat pH 6 (-) tidak menghasilkan puncak anode dan katode.
Hal ini, menunjukkan tidak ada aktivitas GDH sel bakteri. Penambahan Qo 5 mM
sebagai mediator (-) dan glukosa 15 mM sebagai substrat (-) menghasilkan
puncak anode dan katode. Penggunaan Qo sebagai mediator, karena bersifat cepat
bereaksi dengan enzim maupun elektrode, stabil, potensial redoks yang baik, dan
tidak bergantung pada nilai pH (Trivadila 2006). Perubahan puncak anode dan
katode secara signifikan terjadi setelah penambahan PQQ 3.5 µM (-) dan MgSO4
10 mM sebagai aktivator (-). Hasil ini, menunjukan sel E. coli menghasilkan
enzim apo-GDH (GDH inaktif) dan setelah panambahan PQQ dan MgSO4, GDH
berubah menjadi holo-GDH (GDH aktif) sehingga menghasilkan puncak arus
yang signifikan. penambahan PQQ dan MgSO4 merupakan koenzim dan kofaktor
dari gugus prostetik enzim GDH.
Arus, I (µA)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
Puncak anode
burfer fosfat (a)
a + Qo 5 mM (b)
b + glukosa (c)
c + PQQ (d)
Puncak katode
-1
-0.5
0
E (V vs Ag/AgCl)
0.5
d + MgSO4 10 mM
1
Gambar 6 Voltammogram siklis larutan bufer fosfat pH 6.5 (-), + Qo 5 mM (-), +
glukosa 15 mM (-), + PQQ 3.5 µM (-) dan + MgSO4 (-).
15
Aktivitas GDH dipengaruhi oleh stabilitas, yang merupakan faktor penting
dalam biosensor. Stabilitas elektrode kerja ditentukan dengan mengukur puncak
anode selama 7 hari. Gambar 7 menunjukan stabilitas elektrode yang di simpan
pada suhu 4 oC dan suhu kamar. Stabilitas elektrode yang di simpan pada suhu 4
o
C cenderung turun hingga hari ke-2 dan stabil hingga dihari ke-5 kemudian
aktivitas GDH turun pada 63.34% setelah 7 hari. Sedangkan stabilitas elektrode
yang di simpan pada suhu ruang turun secara drastis 23.40% pada hari pertama
dan cenderung stabil hingga hari ke-5. Aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi
turun setelah 7 hari. Menurut Trivadila (2006), aktivitas GDH sel E. coli turun
setelah 6 jam dan menurut Hapsari (2011), aktivitas GDH sel E. coli taut-silang
GA turun setah 10 jam. Hasil penelitian ini, aktivitas GDH sel E. coli
terimobilisasi relatif stabil 70–80% selama 4 hari. Hasil ini menunjukkan
penggunaan zeolit-GA sebagai matriks imobilisasi dapat meningkatkan aktivitas
GDH sel E. coli sebagai biosensor glukosa.
Menurut Sudjadi et al. (2004), penggunaan gliserol dan BSA dapat
mengurangi denaturasi protein karena kekentalannya menyerupai cairan sel.
Gliserol dapat membentuk ikatan hidrogen dengan molekul air. Pembentukan
ikatan hidrogen ini menghilangkan pergerakan air bebas yang mudah
mendenaturasi protein. Penggunan gliserol dan BSA pada penelitian ini,
menambah umur hidup E. coli pada permukaan elektrode, yang menghasilkan
aktivitas GDH yang lebih stabil selama 4 hari. Hapsari (2011) melaporkan dengan
penambahan BSA dapat menghasilkan aktivitas relatif GDH sel E. coli stabil
selama 10 jam. Dari uji stabilitas, dapat disimpulkan penggunaan zeolit-GA
sebagai matriks imobilisasi dapat meningkatkan aktivitas GDH sel E. coli relatif
stabil sebesar 70-80% selama 4 hari.
Aktivitas GDH (%)
120
100
100
86.35
80
73.98
60
78.32 77.70 76.09 75.83
69.49
71.43 71.12 70.28 69.69
63.34
41.84
40
31.22
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Waktu (hari)
Gambar 7 Stabilitas biosensor glukosa berbasis E. coli disimpan pada
suhu 4 oC (
) dan suhu ruang (
).
16
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penggunaan zeolit-GA sebagai matriks imobilisasi sel E. coli ATC25922
dapat meningkatkan aktivitas GDH pada biosensor glukosa berdasarkan nilai Imaks.
Penggunaan zeolit-GA menghasilkan aktivitas GDH relatif stabil sebesar 70–80%
selama 4 hari, elektrode yang disimpan pada suhu 4 oC maupun suhu ruang. Nilai
KM yang tinggi menunjukan afinitas yang rendah. Akan tetapi, nilai KM yang
tinggi dapat bekerja dalam kisaran konsentrasi glukosa yang lebih tinggi.
Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan uji keterulangan, ketepatan, limit
deteksi, dan pembuatan alat biosensor glukosa berbasis E. coli untuk
pengembangan ke arah aplikatif.
DAFTAR PUSTAKA
Apriliani R. 2009. Studi peggunaan kurkumin sebagai modifier elektroda pasta
karbon untuk analisis timbal(II) secara stripping voltammetry [skripsi].
Surakarta: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sebelas Maret Surakarta.
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media
pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen. [tesis]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Balal K, Mohammad H, Bahareh, Ali BMH, Mozhgam Z. 2009. Zeolite
nonoparticle modified carbon paste electrode as a biosensor for simultaneous
determination of dopamine and tryptophan. J Chim Chem 56: 789-796.
Bradley N. 2007. The response surface methodology. [thesis]. Indiana:
Department of Mathematical Sciences, Indiana University of South Bend
Castillo J et al. 2004. Biosensors for life quality design, development
andapplications. Sensors and Actuators B 102:179-194.
Chalova VI, Sirsat SA, O’Bryan CA, Crandall PG, Ricke SC. 2009. Escherichia
coli, an intestinal microorganism, as a biosensor for quantification of amino
acid bioavailability. Sensors 9: 7038-7057.
Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytocchrome c immobilizated
on a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. Electro Acta 49:
2139-2144
Fiorito P, Torresi S. 2001. Glucose amperometric biosensor based on the coimmobilization of glucose oxidase (GOx) and ferrocene in poly(pyrrole)
generated from ethonol/water mixtures. J Brazilian Chem Soc12(6):729-733.
Ginting AB, Anggraini D, Indaryati S, Kriswarini R. 2007. Karakterisasi
komposisi kimia, luas permukaan pori dan sifat termal dari zeolit bayah,
tasikmalaya, dan lampung. J. Tek. Bhn. Nukl. 3(1): 1-48.
17
Goriushkina TB, Kurç BA, Jr. AS, Dzyadevych AV. 2010. Application of zeolites
for immobilization of glucose oxidase in amperometric biosensors. Sensor
Electronics and Microsystem Technologies 1: 36-42.
Grieshalber D, MacKenziel R, Vorosl J, Reimhult E. 2008. Review paper guanine
and adenine biosensor. J Biosen Bioelect 24: 591-599.
Hapsari RP. 2011. Stabilitas dan efektifitas biosensor glukosa berbasis
Escherichia coli menggunakan imobilisasi glutaraldehida. [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis antihistamin setirizin dihidroklorida
dan deksklorfeniramin maleat dalam medium surfaktan menggunakan
electrode pasta karbon. [disertasi]. Bandung. Program Pascasarjana, Institut
Teknologi Bandung.
Hawlaoui ML, Bouyahi N, Jafferzic-Renault N. 2008. Development of a urea
biosensor based on a polymeric membrane including zeolite. Sciences &
Technologie B: 51-55.
[IDF] International Diabetes Federation. 2009. What is Diabetes?. [terhubung
berkala]. http://www.idf.org/diabetesatlas/what-is-diabetes [5 Jul 2012].
Ikeda T, Iswantini D, Yosuke I, Kono K. 2001. Electrochemical analysis of
glucose dehydrogenase activity exhibted by escherichia coli cell. Anal Sci 17:
i285-i286.
Iswantini D, Kato K, Ikeda T, 1998. Electrochemical measurements of glucose
dehydrogenase activity exhibited by Escherichia coli cells; effectsof the
addition of pyrroloquinoline quinone, magnesium or calcium ions and
ethylenediaminetetraacetic acid. Bioelectrochem and Bioenerg 46: 249- 254.
Iswantini D, Kano K, IkedaT. 2000. Kinetics and thermodynamic of activation of
quinoprotein apoenzyme in vivo and catalytic activity of the activated enzyme
in Escherichia coli cells. Biochem J 350: 917-923.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011. Glucose biosensor selected Indonesia
bacteria. Microbiology Indonesia 5(1): 9-14.
Khuri AI, Mukhopadhyay S. 2010. Response surface methodology. WIREs
Computational Statistics 2: 128-149.
Lapėnaitė I et al. 2003. Application of PQQ-GDH based polymeric layer in design
of biosensor far detection of heavy metals. Material Sci 9(4): 431-435.
Laurinavicius V, Razumiene J, RamanaviciusA, Ryabov AD. 2004. Wiring of
PQQ dehydrogenase. Biosensors and Bioelectronics 20:1217-1222.
Lui B, Yan F, Kong J, Deng J. 1999. Reagentless amperometric biosensor based
on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene green in a
modified zeolite matrix. Anal Chem Acta 386: 31-39.
Liu J, Wang J. 2000. A novel improved design for the first-generation glucose
biosensor. Food Technology Biotechnology 39(1): 55-58.
Mateo C, Palomo JM, van Langen LM, van Rantwijk F, dan Sheldon RA. 2004. A
new, mild crosslinking methodology to prepare crosslinked enzyme aggregates.
Biotech Bioeng 86 (3): 273-276.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Ed
ke-25. Hartono A, penerjemah; Bani AP, Sikumbang TMN, editor. Jakarta:
EGC . Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.Ed ke-25.
BERBASIS Escherichia coli YANG DIIMOBILISASI PADA
ZEOLIT-GLUTARALDEHIDA
LUKMAN LA GIA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Aktivitas dan Stabilitas
Biosensor Glukosa Berbasis Escherichia coli yang Diimobilisasi pada ZeolitGlutaraldehida adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2012
Lukman La Gia
NIM G44080119
ABSTRAK
LUKMAN LA GIA. Aktivitas dan Stabilitas Biosensor Glukosa Berbasis
Escherichia coli yang Diimobilisasi pada Zeolit-Glutaraldehida. Dibimbing oleh
DYAH ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT, dan TRIVADILA.
Biosensor glukosa berbasis Escherichia coli hingga saat ini telah
dikembangkan. Pengembangan ini memiliki beberapa kelemahan, yaitu aktivitas
glukosa dehidrogenase (GDH) dan stabilitas elektrode rendah. Penggunaan zeolit
pada biosensor dapat meningkatkan aktivitas enzim, sedangkan penggunaan
glutaraldehida (GA) sebagai bahan taut-silang dapat meningkatkan stabilitas
elektrode. Perancangan percobaan optimisasi dilakukan menggunakan metode
permekaan respons (RSM). Kondisi optimum aktivitas biosensor ini ialah suhu 30
o
C, pH 6, konsentrasi glukosa 15 mM, konsentrasi pirolokuinolina kuinon (PQQ)
3.5 µM, zeolit 150 mg/mL, dan konsentrasi GA 14.05%. GDH sel E. coli
terimobilisasi dapat mendeteksi konsentrasi glukosa hingga 50 mM. Reaksi
kinetika GDH sel E. coli terimobilisasi mengikuti persamaan Lineweaver-Burk.
Nilai KM app dan Imaks app biosensor ini secara berturut-turut adalah 2.69 mM dan
3.73 µA. Aktivitas GDH sel bakteri relatif stabil sebesar 70–80% selama 4 hari.
Oleh karena itu, penggunaan zeolit-GA sebagai matriks imobilisasi dapat
meningkatkan aktivitas GDH sel bakteri E. coli yang relatif stabil.
Kata kunci: biosensor glukosa, Escherichia coli, glutaraldehida, zeolit.
ABSTRACT
LUKMAN LA GIA. Activity and Stability of Glucose Biosensor Based on
Escherichia coli Immobilized on Zeolite-Glutaraldehyde. Supervised by DYAH
ISWANTINI PRADONO, NOVIK NURHIDAYAT and TRIVADILA.
Glucose biosensor based on Escherichia coli have been developed recently.
Despite of some drawbacks, such as the activity of glucose dehydrogenase (GDH)
and the lower electrode stability. The use of zeolite in biosensors can increase the
enzyme activity, while the use of glutaraldehyde (GA) as a cross-link can improve
the electrode stability. The design optimization employed response surface
methods (RSM). The optimum conditions activity of GDH cells with E. coli
immobilized was at temperature 30 °C, pH 6, glucose 15 mM, pyrroloquinoline
quinone (PQQ) 3.5 μM, zeolite 150 mg/mL, and GA 14.05%. This biosensor was
able to detect up to 50 mM glucose concentration. The reaction kinetics followed
Lineweaver-Burk equation. KM app value and Imaks app GDH cells E. coli
immobilized in a row is 2.69 mM and 3.73 µA. The biosensor was relatively
stable at 70–80% for 4 days. Therefore, the use of zeolite-GA as an
immobilization matrix can enhance the activity of the stable bacterial cell of
GDH-E. coli.
Keywords: Escherichia coli, glucose biosensor, glutaraldehyde, zeolite.
AKTIVITAS DAN STABILITAS BIOSENSOR GLUKOSA
BERBASIS Escherichia coli YANG DIIMOBILISASI PADA
ZEOLIT-GLUTARALDEHIDA
LUKMAN LA GIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Aktivitas dan Stabilitas Biosensor Glukosa Berbasis Escherichia
coli yang Diimobilisasi pada Zeolit-Glutaraldehida
Nama
: Lukman La Gia
NIM
: G44080119
Disetujui oleh
Pembimbing I
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MScAgr
NIP 19670730 1999103 2 001
Pembimbing II
Pembimbing III
Dr Novik Nurhidayat
NIP 19771029 200502 2 001
Trivadila, SSi, MSi
Diketahui oleh
Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS
NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini ialah biosensor, dengan
judul Aktivitas dan Stabilitas Biosensor Glukosa Berbasis Escherichia coli yang
Diimobilisasi pada Zeolit-Glutaraldehida.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr Dyah Iswantini Pradono,
MScAgr, Bapak Dr Novik Nurhidayat dan Ibu Trivadila, SSi, MSi selaku
pembimbing, serta Bapak La Eddy, Dirwan, Bapak Ammar, Raudhatul Fadhilah,
Dian, Okik, Yuanita, Liyonawati, dan Dinie yang telah banyak memberi saran. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Ai dan Bapak Mail, staf
Laboratorium Kimia Fisik, Ibu Dr Henny Purwaningsih selaku Kepala
Laboratorium Bersama Kimia, Bapak Wawan dan Bapak Eko, staf Laboratoriun
Bersama Kimia. Apresiasi juga penulis sampaikan kepada Ibu Neri, Ibu Erna, Ibu
Ratih, dan Bapak Acun di Laboratorium Genetika Mikrobiologi, Puslit Biologi
LIPI yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih
juga disampaikan kepada Pemda Halmahera Selatan atas beasiswa BUD IPB yang
telah diberikan. Tak lupa pula, ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayah,
Ibu, seluruh keluarga, dan Nurfajriana atas segala doa dan kasih sayangnya, serta
teman-teman seperjuangan di mayor Kimia angkatan 2008.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2012
Lukman La Gia
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
TINJAUAN PUSTAKA
2
Biosensor
2
Glukosa Dehidrogenase
3
Escherichia coli
3
Zeolit
4
Glutaraldehida
5
Imobilisasi Enzim
5
Metode Voltammetri
6
METODE
7
Alat dan Bahan
7
Metode Penelitian
7
HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
9
9
Kinetika GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
10
Aktivitas dan Stabilitas GDH Sel E. coli Terimobilisasi
14
SIMPULAN DAN SARAN
16
Simpulan
16
Saran
16
DAFTAR PUSTAKA
16
LAMPIRAN
19
RIWAYAT HIDUP
27
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Ilustrasi tiga generasi perkembangan biosensor
Escherichia coli
Plot kontur hubungan antara faktor peubah bebas terhadap arus anode
Hubungan konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GDH
Alur Lineweaver-Burk GDH sel E. coli terimobilisasi
Voltammogram siklis GDH sel E. coli terimobilisasi
Stabilitas biosensor glukosa berbasis E. coli
2
4
12
13
13
154
145
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Bagan alir umum penelitian
Bagan alir pembutan media
Bagan alir kerja
Bagan alir elektrode pasta karbon dan imobilisasi
Hasil kombinasi faktor-faktor peubah bebas.
Hasil optimasi Aktivitas GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
Kinetika enzim GDH sel bakteri E. coli terimobilisasi
Stabilitas elektrode biosensor glukosa berbasis E. coli terimobilisasi
19
20
21
22
23
24
25
26
PENDAHULUAN
Penyakit diabetes melitus (DM) disebabkan oleh timbulnya masalah dalam
produksi dan suplai hormon insulin dalam tubuh (IDF 2009). Dewasa ini,
penderita DM menggunakan biosensor sebagai alat pengukur gula darah.
Umumnya digunakan enzim sebagai biosensor yang bekerja berdasarkan reaksi
enzimatik. Biosensor adalah sensor yang mengombinasikan komponen hayati
dengan komponen elektronik (transduser) yang mengubah sinyal dari komponen
hayati menjadi luaran yang terukur (Castillo et al. 2004; Witarto 2007).
Enzim memiliki peran yang penting dalam biosensor, tetapi harganya, serta
stabilitas dan aktivitas enzimnya rendah. Menurut Ohfuji et al. (2004),
mikroorganisme dapat digunakan sebagai biosensor glukosa. Mikrob penghasil
enzim sebagai sensor untuk mengukur kadar glukosa ini merupakan alternatif baru
(Trivadila 2006). Keuntungan sensor mikrob dibandingkan dengan sensor enzim
adalah lebih tahan lama, lebih murah karena tidak diperlukan isolasi dan
pemurnian enzim aktif, serta lebih stabil (Iswantini et al. 2011).
Biosensor pertama kali dikembangkan oleh Leland Clark (1956). Enzim
glukosa oksidase (GOD) yang digunakan Clark mekanisme kerjanya bergantung
pada keberadaan oksigen. Akibatnya, alat pengukur ini dapat memberikan hasil
yang berbeda dari individu yang sama. Hal tersebut mendorong penggantian
enzim GOD dengan enzim glukosa dehidrogenase (GDH). Enzim GDH spesifik
terhadap substrat glukosa dan aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh kadar oksigen.
Enzim pirolokuinolina kuinon glukosa dehidarogenase (PQQGDH) merupakan
alternatif baru yang digunakan sebagai komponen pengenal analit pada biosensor
glukosa. Struktur kristal PQQ diketahui merupakan gugus prostetik enzim GDH.
Menurut Witarto (2007), enzim PQQGDH yang berasal dari bakteri Gram negatif
seperti Escherichia coli dapat mengatalisis reaksi redoks glukosa dan dianggap
memenuhi syarat biosensor.
Penggunaan mikrob sebagai penghasilan enzim, yaitu E. coli KRGL dan
Bacillus subtilis KRGS. E. coli telah diketahui menghasilkan GDH-A. Enzim
PQQGDH-A telah dimanfaatkan dan diaplikasikan sebagai biosensor glukosa
(Iswantini et al. 2011). Aktivitas GDH yang dihasilkan oleh sel bakteri E. coli
KRGS terbesar dibandingkan dengan B. subtilis KRGL baik dengan metode
spektrofotometri maupun metode elektrokimia (Trivadila 2006).
Penelitian tentang penggunaan zeolit untuk sensor telah dilakukan. Balal et
al. (2009) melaporkan bahwa elektrode pasta karbon yang termodifikasi zeolit Y
dengan mediator Fe3+ dapat menghasilkan arus yang lebih tinggi serta sensitivitas,
selektivitas, dan kestabilan yang tinggi. Penggunaan glutaraldehida (GA) sebagai
bahan taut-silang dengan enzim juga sangat populer pada biosensor. Teknik
imobilisasi dengan taut-silang GA dapat meningkatkan stabilitas dan sensitivitas
biosensor (Othman et al. 2006; Goriushkina et al. 2010). Keuntungan
menggunakan GA ialah harganya relatif murah dan lazim digunakan secara
komersial (Mateo et al. 2004). Penelitian yang telah dilakukan, penggunaan GA
sebagai bahan taut-silang sel E. coli diimobilisasi pada permukaan elektrode pasta
karbon dapat meningkatkan aktivitas dan stabilitas GDH pada biosensor glukosa
sebesar 68% (Hapsari 2011). Hingga saat ini, penelitian biosensor berbasis E. coli
masih memiliki berberapa kelemahan, yaitu aktivitas enzim GDH dan stabilitas
2
elektrode kerja yang rendah. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan zeolit
untuk meningkatkan aktivitas enzim dan GA sebagai bahan biofungsional yang
dapat meningkatkan kestabilan biosensor glukosa.
Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas dan stabilitas enzim GDH
yang dihasilkan oleh isolat bakteri E. coli ATCC25922 yang diimobilisasi pada
zeolit-GA.
TINJAUAN PUSTAKA
Biosensor
Biosensor didefinisikan sebagai suatu kesatuan turunan dari sensor kimia
yang menggabungkan unsur hayati dengan transduser atau kombinasi reseptor
senyawa biologi dan transduser fisik atau fisiokimia. Komponen pengenal hayati
sebuah biosensor berinteraksi secara interaktif dan selektif terhadap analat,
sedangkan transduser mengubah respon hayati menjadi sinyal yang dapat diukur
sebagai sinyal dari biosensor (Castilo et al. 2004; Rana et al. 2010).
Perkembangan biosensor dibagi menjadi tiga generasi, yaitu: biosensor
generasi pertama, kedua dan ketiga (Gambar 1). Biosensor generasi pertama
melibatkan oksigen dalam pengukuran. Elektrode yang digunakan adalah
elektrode oksigen. Reaksi redoks yang terjadi, melibatkan oksigen dan enzim
diantaranya ialah oksigenase dan oksidase. Kelemahan dari biosensor generasi
pertama ialah data yang dihasilkan tidak akurat karena pengaruh oksigen bebas
dari lingkungan. Biosensor generasi kedua merupakan generasi biosensor yang
menggunakan mediator untuk menghubungkan reaksi oksidasi substrat dengan
elektrode. Sedangkan biosensor generasi ketiga mulai meningkatkan integrasi
mediator dengan elektrode (Liu dan Wang 2000).
Perancangan biosensor yang lebih inovatif terus dilakukan karena memiliki
Gambar 1 Ilustrasi tiga generasi dalam perkembangan
biosensor generasi pertama (a), kedua (b),
dan ketiga (c).
3
kelemahan, yaitu tidak dapat digunakan secara berulang, daya variasi kurang
tinggi, waktu respon yang relatif rendah, rentang linear sempit, sensitivitas rendah
dan kurang stabil serta presisi dan deteksi yang masih rendah (Wang et al. 2008).
Biosensor glukosa merupakan salah satu dari aplikasi biosensor yang berkembang
dengan cepat bahkan telah dimanfaatkan secara komersial (Fiorito dan Torresi
2001; Castillo et al. 2004). Biosensor glukosa pertama kali dikembangkan pada
tahun 1956 oleh Leland Clark, seorang ahli fisiologi dan biokimia dari Amerika
Serikat. Saat itu Clark menggunakan enzim GOD yang spesifik terhadap glukosa
dan dapat dihasilkan secara alamiah dari jamur Aspergillus niger.
Perkembangan biosensor glukosa hingga sekarang telah diarahkan pada
penggunaan pengenal hayati menggunakan mikrob. Iswantini et al. (2011)
melakukan penelitian mengenai pemilihan bakteri asal Indonesia sebagai
biosensor glukosa. Berdasarkan uji enzim GDH menggunakan metode
spektrofotometer dan elektrokimia, bakteri E. coli asal Indonesia dapat
dikembangkan sebagai biosensor glukosa.
Glukosa Dehidrogenase
Glukosa dehidrogenase (GDH) merupakan enzim yang aktif dalam
pengambilan atom hidrogen dari substrat dan berperan dalam reaksi oksidasi
langsung glukosa membentuk asam glukonat (Winarno 2010). Enzim GDH
spesifik terhadap substrat glukosa dan aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh kadar
oksigen (Turner 2002). Kristal PQQ diketahui merupakan gugus prostetik enzim
GDH. Pengikatan PQQ terhadap enzim GDH terjadi melalui interaksi polar.
PQQGDH merupakan alternatif baru yang digunakan sebagai biosensor glukosa.
PQQGDH sendiri ditemukan pada berbagai bakteri gram negatif. PQQGDH tidak
dipengaruhi kadar oksigen, juga memiliki aktivitas yang tinggi. Menurut Witarto
(2007), penggunaan enzim GDH dalam biosensor glukosa untuk merekayasa
protein enzim PQQGDH sebagai alat ukur gula darah dapat mengunakan enzim
PQQGDH-A dan PQQGDH-B sebagai komponen biosensor glukosa.
Escherichia coli
Escherichia coli (Gambar 2) termasuk dalam superdomain Phylogenetica,
filum Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales,
genus Escherichia, dan spesies E. coli. Bakteri ini merupakan suatu organisme
yang tidak berbahaya, biasanya hidup didalam saluran usus manusia dan hewan
tingkat tinggi lainnya. Sel E. coli berukuran panjang 2 µm dan berdiameter
sedikitnya 5.0 µA) dan
menghasilkan kondisi optimum di sekitar suhu 30 oC, pH 6, konsentrasi glukosa
15 mM, konsentrasi PQQ 3.5 μM, zeolit 150 mg/mL, dan konsentrasi GA 12.5%.
Hasil optimum yang dihasilkan pada alur kontur digunakan sebagai nilai
awal penentuan kondisi optimum menggunakan Response Optimizer pada RSM.
10
Kondisi optimum aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi adalah suhu 30 oC, pH
6, konsentrasi glukosa 15 mM, konsentrasi PQQ 3.5 μM, zeolit 150 mg/mL, dan
konsentrasi GA 14.05%. Hapsari (2011) melaporkan kondisi suhu dan pH
optimum yang sama, yaitu 30 oC dan pH 6, sedangkan kondisi optimum
konsentrasi PQQ, glukosa, dan GA berturut-turut adalah 3.05 µM, 10.25 mM, dan
12.5 µL (GA 25%). Hasil ini membuktikan kondisi bahwa optimum arus puncak
anode sangat dipengaruhi oleh proses imobilisasi. Saiapina et al. (2011)
menggunakan zeolit klinoptilolit pada biosensor enzim untuk menentukan urea
dan menghasilkan kondisi optimum pada PBS pH 7.
Parameter kondisi optimum puncak arus oksidasi dipengaruhi oleh nilai pH.
Enzim terimobilisasi menunjukkan kebergantungan pada perubahan nilai pH dan
kekuatan ionik, terutama jika parameter ini diubah oleh reaksi enzim (Bisswanger
2008). Pergeseran nilai pH terjadi karena enzim terimobilisasi pada matriks yang
memiliki perbedaan muatan (Trivadila 2011).
Alur kontur hasil optimasi aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi (Gambar
3) sulit diduga kondisi optimumnya. Hal ini disebabkan penggunaan faktor
peubah bebas yang lebih besar dari 5 (6 faktor). Menurut Tiera (2003),
berdasarkan aturan statistik, jika jumlah faktor ≥5 perlu dilakukan penapisan
menggunakan metode faktorial fraksional atau metode Plackett-Burman.
Kinetika GDH Sel Bakteri E. coli Terimobilisasi
Kinetika imobilisasi enzim pada sistem biosensor umumnya melihat
parameter tetapan Michaelis-Menten (KM app) dan laju reaksi maksimum (Vmaks app)
yang diasumsikan sebagai arus maksimum (Imaks app). Tetapan Michaelis-Menten
(KM) merupakan konsentrasi yang menghasilkan setengah aktivitas maksimum,
sedangkan Imaks merupakan aktivitas maksimum. Parameter kinetika ditentukan
dengan mengukur aktivitas GDH sel bakteri E. coli terimobilisasi dengan variasi
konsentrasi substrat (glukosa) 0.5–70 mM pada kondisi optimum. Data aktivitas
enzim GDH sel bakteri E.coli terimobilisasi ditunjukkan pada Lampiran 7.
Gambar 4a menunjukkan bahwa hubungan konsentrasi substrat dengan
aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi sesuai dengan persamaan MichaelisMenten: v = Vmaks[S]/(KM + [S]). Bentuk kurva menunjukan aktivitas GDH terjadi
dalam 2 tahap, yaitu (1) ketika konsentrasi substrat di bawah 50 mM, belum
semua tapak aktif enzim mengikat substrat dan aktivitas GDH semakin
meningkat; (2) ketika konsentrasi substrat mencapai 50 mM kondisi aktivitas
maksimum dan semua tapak aktif enzim telah mengikat substrat. Menurut Murray
et al. (2003), aktivitas enzim akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi
substrat hingga tercapai suatu keadaan enzim jenuh terhadap substrat. Aktivitas
yang terukur akan mencapai suatu nilai maksimum dan tidak lagi dipengaruhi
oleh peningkatan konsentrasi substrat.
11
7.0
25
Arus
< -1
-1 –
0 –
0
1
1 –
2 –
3 –
2
3
4
6.5
3.5
150
[ GA]
12.5
Glukosa
pH
PQQ
zeolit
5.5
3
4
5
5
H old V alues
pH
6
PQ Q 3.5
15
zeolit 150
[GA ] 12.5
10
27.5
30.0
(a)
32.5
35.0
5
25. 0
Suhu
4.8
4.0
32. 5
35. 0
Ar us
< -4
-4 – -2
-2 –
0 –
0
2
>
2
200
Hold Values
Hold Values
pH
6
Glukosa
15
zeolit
150
[ GA]
12.5
3.2
30. 0
250
Arus
< 1.0
1.0 – 1.5
1.5 – 2.0
2.0 – 2.5
2.5 – 3.0
3.0 – 3.5
3.5 – 4.0
> 4.0
5.6
27. 5
(b) Suhu
zeolit
5.0
25.0
PQQ
2 –
3 –
4 –
>
20
>
4
Hold Values
Glukosa
15
6.0
A rus
< 1
1 – 2
pH
Glukosa
PQQ
[ GA]
150
6
15
3.5
12.5
2.4
100
1.6
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
50
25.0
(c) Suhu
20.0
27.5
30.0
32.5
35.0
(d) Suhu
Ar us
25
Arus
< -3
-3 – -2
17.5
-2 – -1
-1 –
0
0 –
1 –
1
2
2 –
3
>
3
20
pH
6
Glukosa
10.0
15
PQQ
3.5
zeolit
150
4
4 –
5 –
5
6
>
6
Hold
Hold Values
12.5
2
3
3 –
Values
Glukosa
[ GA ]
15.0
<
2 –
Suhu
15
30
PQQ
3.5
zeolit
150
10
7.5
27.5
30.0
32.5
5
5.0
35.0
(e ) Suhu
5.6
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.8
5.5
6.0
(f)
6.5
7.0
pH
250
Ar us
< 1.5
– 2.0
– 2.5
– 3.0
– 3.5
– 4.0
– 4.5
> 4.5
4.0
PQQ
Hold Values
Suhu
30
Glukosa 15
3.2
zeolit
[ GA]
Hold Values
Suhu
30
Glukosa
15
PQQ
3.5
[ GA]
12.5
150
150
12.5
100
2.4
Arus
< -2
-2 – -1
-1 –
0
0 –
1
1 –
2
2 –
3
>
3
200
zeolit
5.0
25.0
1.6
50
5.0
5.0
5.5
6.0
(g)
pH
6.5
7.0
5.5
6.0
(h)
pH
6.5
7.0
12
20.0
Arus
17.5
<
-2
-2 –
-1 –
-1
0
0 –
1
1 –
2
2 –
3
>
3
15.0
Ar us
4.8
30
Glukosa
15
PQQ
[ GA]
4.0
Suhu
PQQ
3.5
zeolit
3.5
4.0
4.5
4.5 –
Hold Values
12.5
<
3.5 –
4.0 –
5.6
5.5
5.5 –
>
6.0
6.0
Hold Values
3.2
150
5.0
5.0 –
Suhu
30
pH
zeolit
6
150
[ GA]
12.5
10.0
2.4
7.5
1.6
5.0
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
5
(i) pH
250
15
20
25
(j) Gluk osa
20.0
Ar us
200
10
<
0
0 –
1
1 –
2
2 –
3
3 –
>
4
4
Ar us
< 1
1 – 2
2 – 3
3 – 4
17.5
> 4
Hol d Values
Suhu 30
pH
6
15.0
Suhu
30
pH
[GA]
zeolit
Hol d Values
150
6
PQQ
[ GA]
3.5
12.5
PQQ 3.5
zeolit 150
12.5
10.0
100
7.5
50
5
10
15
20
5.0
25
5
Gluk osa
(k )
250
200
1
1 –
2
2 –
3
3 –
4
>
4
15
(l)
20
25
Ar us
17.5
15.0
30
pH
6
Glukosa
15
[ GA]
1
2
2 –
3
3 –
4
>
4
Suhu
[ GA ]
zeolit
Suhu
<
1 –
Hold Values
Hold Values
150
Glukosa
20.0
Ar us
< 0
0 –
10
pH
12.5
Glukosa
zeolit
30
6
15
150
12.5
10.0
100
7.5
5.0
50
1.6
2.4
3.2
4.0
4.8
5.6
20.0
2.4
3.2
(n) P Q Q
4.0
4.8
5.6
Ar us
17.5
<
-4 –
-2 –
-4
-2
0
0 –
>
2
2
Hol d Val ues
Suhu
30
15.0
[ GA]
1.6
(m) P Q Q
pH
Glukosa
12.5
PQQ
6
15
3.5
10.0
7.5
5.0
50
100
150
ze olit
(o)
200
250
Gambar 3 Alur kontur hubungan antara suhu dan pH (a), suhu dan [glukosa] (b),
suhu dan [PQQ] (c), suhu dan zeolit (d), suhu dan [glutaraldehida] (e), pH
dan [glukosa] (f), pH dan [PQQ] (g), pH dan zeolit (h), pH dan [GA] (i),
[glukosa] dan [PQQ] (j), [glukosa] dan zeolit (k), [glukosa] dan [GA] (l),
[PQQ] dan zeolit (m), [PQQ] dan [GA] (n), zeolit dan [GA] terhadap
puncak arus oksidasi (o).
13
8
8
7
7
Aktivitas GDH (µA)
Aktivitas GDH (µA)
Hubungan linear antara konsentrasi substrat glukosa dan aktivitas GDH sel
E. coli terimobilisasi (Gambar 4b) yang terjadi hingga konsentrasi glukosa
mencapai 50 mM, mengikuti persamaan regresi y = 0.1301x + 0.8299 dengan R2 =
99.10%. Penentuan linearitas pengukuran bertujuan menentukan daerah kerja
maksimum dari elektrode. Jika dibandingkan dengan hasil yang diperoleh Hapsari
(2011), aktivitas maksimum enzim GDH sel E. coli yang ditaut-silang dengan GA
diperoleh pada konsentrasi substrat 20 mM. Konsentrasi substrat yang lebih tinggi
dari 20 mM menghasilkan aktivitas yang cenderung konstan (Hapsari 2011). Hasil
penelitian ini menunjukan dearah kerja maksimum dari elektrode lebih baik yaitu
50 mM.
6
5
4
3
2
1
6
5
y = 0.1301x + 0.8299
R² = 0.9910
4
3
2
1
0
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80
0
20
[glukosa] (mM)
40
60
[glukosa] (mM)
(a)
(b)
Ip-1 (µA-1)
Gambar 5 Hubungan konsentrasi substrat glukosa dengan aktivitas (a), rentang
antara linear substrat glukosa dan aktivitas GDH E. coli
terimobilisasi (b).
Penentuan parameter kinetika menggunakan persamaan Lineweaver-Burk.
Gambar 5 menunjukan kurva alur Lineweaver-Burk dengan persamaan garis y =
0.7211x + 0.278 dan R2 = 93.28%. Dari persamaan garis yang diperoleh, dapat
ditentukan nilai KM app dan Imaks app secara berturut-turut adalah 2.6927 mM dan
3.7341 µA. Hapsari (2011) melaporkan nilai KM app GDH sel E. coli tanpa dan
taut-silang GA berturut-turut sebesar 1.9007 mM dan 1.1162 mM, Nilai KM app
lebih kecil dibandingkan dengan hasil penelitian ini. Akan tetapi, nilai KM
penelitian ini masih lebih kecil dari hasil yang dilaporkan oleh Gaikwad et
al.(2007) dalam imobilisasi enzim GOD pada film PANNI tertaut-silang GA
untuk menentukan glukosa secara potensiometri, yaitu sebesar 7.14 mM.
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
y = 0.7211x + 0.2678
R² = 0.9328
0.00
0.50
1.00
1.50
[glukosa]-1 (mM-1)
2.00
2.50
Gambar 4 Alur Lineweaver-Burk GDH sel E. coli terimobilisasi.
14
Nilai KM merupakan ukuran kuat atau lemahnya enzim mengikat substrat.
Semakin besar nilai KM, semakin lemah enzim mengikat substrat dan semakin
kecil nilai KM, semakin kuat pula enzim mengikat substrat atau semakin tinggi
afinitasnya. Nilai KM app yang tinggi pada penelitian ini dapat bekerja dalam
kisaran konsentrasi glukosa jauh lebih lebar, yaitu 0.5–50 mM. Selain itu, nilai
Imaks app yang dilaporkan Hapsari (2011) untuk GDH sel E. coli tanpa dan tautsilang GA, yaitu berturut-turut 1.7931µA dan 2.1404 µA, lebih kecil jika
dibandingkan dengan hasil penelitian ini. Nilai Imaks app merupakan indikator
aktivitas enzim. Semakin besar nilai Imaks app, semakin tinggi aktivitas enzim dan
sebaliknya. Hasil ini menunjukan penggunaan zeolit-GA sebagai matriks
imobilisasi sel E. coli pada biosensor glukosa dapat meningkatkan aktivitas GDH,
walaupun masih memiliki afinitas yang rendah.
Aktivitas dan Stabilitas GDH Sel E. coli Terimobilisasi
Metode voltammetri siklis digunakan untuk mengukur aktivitas GDH.
Elektron dihasilkan dari reaksi oksidasi substrat glukosa dengan katalis GDH
(Trivadila 2006). Oleh karena itu, aktivitas GDH dapat diamati dari perubahan
arus yang terukur akibat reaksi oksidasi ini (puncak anode). Gambar 6
menunjukkan perbedaan puncak anode dan katode pada voltammogram siklis
pasta karbon sel E. coli terimobilisasi.
Larutan bufer fosfat pH 6 (-) tidak menghasilkan puncak anode dan katode.
Hal ini, menunjukkan tidak ada aktivitas GDH sel bakteri. Penambahan Qo 5 mM
sebagai mediator (-) dan glukosa 15 mM sebagai substrat (-) menghasilkan
puncak anode dan katode. Penggunaan Qo sebagai mediator, karena bersifat cepat
bereaksi dengan enzim maupun elektrode, stabil, potensial redoks yang baik, dan
tidak bergantung pada nilai pH (Trivadila 2006). Perubahan puncak anode dan
katode secara signifikan terjadi setelah penambahan PQQ 3.5 µM (-) dan MgSO4
10 mM sebagai aktivator (-). Hasil ini, menunjukan sel E. coli menghasilkan
enzim apo-GDH (GDH inaktif) dan setelah panambahan PQQ dan MgSO4, GDH
berubah menjadi holo-GDH (GDH aktif) sehingga menghasilkan puncak arus
yang signifikan. penambahan PQQ dan MgSO4 merupakan koenzim dan kofaktor
dari gugus prostetik enzim GDH.
Arus, I (µA)
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
Puncak anode
burfer fosfat (a)
a + Qo 5 mM (b)
b + glukosa (c)
c + PQQ (d)
Puncak katode
-1
-0.5
0
E (V vs Ag/AgCl)
0.5
d + MgSO4 10 mM
1
Gambar 6 Voltammogram siklis larutan bufer fosfat pH 6.5 (-), + Qo 5 mM (-), +
glukosa 15 mM (-), + PQQ 3.5 µM (-) dan + MgSO4 (-).
15
Aktivitas GDH dipengaruhi oleh stabilitas, yang merupakan faktor penting
dalam biosensor. Stabilitas elektrode kerja ditentukan dengan mengukur puncak
anode selama 7 hari. Gambar 7 menunjukan stabilitas elektrode yang di simpan
pada suhu 4 oC dan suhu kamar. Stabilitas elektrode yang di simpan pada suhu 4
o
C cenderung turun hingga hari ke-2 dan stabil hingga dihari ke-5 kemudian
aktivitas GDH turun pada 63.34% setelah 7 hari. Sedangkan stabilitas elektrode
yang di simpan pada suhu ruang turun secara drastis 23.40% pada hari pertama
dan cenderung stabil hingga hari ke-5. Aktivitas GDH sel E. coli terimobilisasi
turun setelah 7 hari. Menurut Trivadila (2006), aktivitas GDH sel E. coli turun
setelah 6 jam dan menurut Hapsari (2011), aktivitas GDH sel E. coli taut-silang
GA turun setah 10 jam. Hasil penelitian ini, aktivitas GDH sel E. coli
terimobilisasi relatif stabil 70–80% selama 4 hari. Hasil ini menunjukkan
penggunaan zeolit-GA sebagai matriks imobilisasi dapat meningkatkan aktivitas
GDH sel E. coli sebagai biosensor glukosa.
Menurut Sudjadi et al. (2004), penggunaan gliserol dan BSA dapat
mengurangi denaturasi protein karena kekentalannya menyerupai cairan sel.
Gliserol dapat membentuk ikatan hidrogen dengan molekul air. Pembentukan
ikatan hidrogen ini menghilangkan pergerakan air bebas yang mudah
mendenaturasi protein. Penggunan gliserol dan BSA pada penelitian ini,
menambah umur hidup E. coli pada permukaan elektrode, yang menghasilkan
aktivitas GDH yang lebih stabil selama 4 hari. Hapsari (2011) melaporkan dengan
penambahan BSA dapat menghasilkan aktivitas relatif GDH sel E. coli stabil
selama 10 jam. Dari uji stabilitas, dapat disimpulkan penggunaan zeolit-GA
sebagai matriks imobilisasi dapat meningkatkan aktivitas GDH sel E. coli relatif
stabil sebesar 70-80% selama 4 hari.
Aktivitas GDH (%)
120
100
100
86.35
80
73.98
60
78.32 77.70 76.09 75.83
69.49
71.43 71.12 70.28 69.69
63.34
41.84
40
31.22
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Waktu (hari)
Gambar 7 Stabilitas biosensor glukosa berbasis E. coli disimpan pada
suhu 4 oC (
) dan suhu ruang (
).
16
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penggunaan zeolit-GA sebagai matriks imobilisasi sel E. coli ATC25922
dapat meningkatkan aktivitas GDH pada biosensor glukosa berdasarkan nilai Imaks.
Penggunaan zeolit-GA menghasilkan aktivitas GDH relatif stabil sebesar 70–80%
selama 4 hari, elektrode yang disimpan pada suhu 4 oC maupun suhu ruang. Nilai
KM yang tinggi menunjukan afinitas yang rendah. Akan tetapi, nilai KM yang
tinggi dapat bekerja dalam kisaran konsentrasi glukosa yang lebih tinggi.
Saran
Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan uji keterulangan, ketepatan, limit
deteksi, dan pembuatan alat biosensor glukosa berbasis E. coli untuk
pengembangan ke arah aplikatif.
DAFTAR PUSTAKA
Apriliani R. 2009. Studi peggunaan kurkumin sebagai modifier elektroda pasta
karbon untuk analisis timbal(II) secara stripping voltammetry [skripsi].
Surakarta: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sebelas Maret Surakarta.
Arif Z. 2011. Karakterisasi dan modifikasi zeolit alam sebagai bahan media
pendeteksi studi kasus: kromium heksavalen. [tesis]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Balal K, Mohammad H, Bahareh, Ali BMH, Mozhgam Z. 2009. Zeolite
nonoparticle modified carbon paste electrode as a biosensor for simultaneous
determination of dopamine and tryptophan. J Chim Chem 56: 789-796.
Bradley N. 2007. The response surface methodology. [thesis]. Indiana:
Department of Mathematical Sciences, Indiana University of South Bend
Castillo J et al. 2004. Biosensors for life quality design, development
andapplications. Sensors and Actuators B 102:179-194.
Chalova VI, Sirsat SA, O’Bryan CA, Crandall PG, Ricke SC. 2009. Escherichia
coli, an intestinal microorganism, as a biosensor for quantification of amino
acid bioavailability. Sensors 9: 7038-7057.
Dai Z, Liu S, Ju H. 2004. Direct electron transfer of cytocchrome c immobilizated
on a NaY zeolite matrix and its application in biosensing. Electro Acta 49:
2139-2144
Fiorito P, Torresi S. 2001. Glucose amperometric biosensor based on the coimmobilization of glucose oxidase (GOx) and ferrocene in poly(pyrrole)
generated from ethonol/water mixtures. J Brazilian Chem Soc12(6):729-733.
Ginting AB, Anggraini D, Indaryati S, Kriswarini R. 2007. Karakterisasi
komposisi kimia, luas permukaan pori dan sifat termal dari zeolit bayah,
tasikmalaya, dan lampung. J. Tek. Bhn. Nukl. 3(1): 1-48.
17
Goriushkina TB, Kurç BA, Jr. AS, Dzyadevych AV. 2010. Application of zeolites
for immobilization of glucose oxidase in amperometric biosensors. Sensor
Electronics and Microsystem Technologies 1: 36-42.
Grieshalber D, MacKenziel R, Vorosl J, Reimhult E. 2008. Review paper guanine
and adenine biosensor. J Biosen Bioelect 24: 591-599.
Hapsari RP. 2011. Stabilitas dan efektifitas biosensor glukosa berbasis
Escherichia coli menggunakan imobilisasi glutaraldehida. [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Hattu N. 2009. Studi voltametri dan analisis antihistamin setirizin dihidroklorida
dan deksklorfeniramin maleat dalam medium surfaktan menggunakan
electrode pasta karbon. [disertasi]. Bandung. Program Pascasarjana, Institut
Teknologi Bandung.
Hawlaoui ML, Bouyahi N, Jafferzic-Renault N. 2008. Development of a urea
biosensor based on a polymeric membrane including zeolite. Sciences &
Technologie B: 51-55.
[IDF] International Diabetes Federation. 2009. What is Diabetes?. [terhubung
berkala]. http://www.idf.org/diabetesatlas/what-is-diabetes [5 Jul 2012].
Ikeda T, Iswantini D, Yosuke I, Kono K. 2001. Electrochemical analysis of
glucose dehydrogenase activity exhibted by escherichia coli cell. Anal Sci 17:
i285-i286.
Iswantini D, Kato K, Ikeda T, 1998. Electrochemical measurements of glucose
dehydrogenase activity exhibited by Escherichia coli cells; effectsof the
addition of pyrroloquinoline quinone, magnesium or calcium ions and
ethylenediaminetetraacetic acid. Bioelectrochem and Bioenerg 46: 249- 254.
Iswantini D, Kano K, IkedaT. 2000. Kinetics and thermodynamic of activation of
quinoprotein apoenzyme in vivo and catalytic activity of the activated enzyme
in Escherichia coli cells. Biochem J 350: 917-923.
Iswantini D, Nurhidayat N, Trivadila. 2011. Glucose biosensor selected Indonesia
bacteria. Microbiology Indonesia 5(1): 9-14.
Khuri AI, Mukhopadhyay S. 2010. Response surface methodology. WIREs
Computational Statistics 2: 128-149.
Lapėnaitė I et al. 2003. Application of PQQ-GDH based polymeric layer in design
of biosensor far detection of heavy metals. Material Sci 9(4): 431-435.
Laurinavicius V, Razumiene J, RamanaviciusA, Ryabov AD. 2004. Wiring of
PQQ dehydrogenase. Biosensors and Bioelectronics 20:1217-1222.
Lui B, Yan F, Kong J, Deng J. 1999. Reagentless amperometric biosensor based
on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene green in a
modified zeolite matrix. Anal Chem Acta 386: 31-39.
Liu J, Wang J. 2000. A novel improved design for the first-generation glucose
biosensor. Food Technology Biotechnology 39(1): 55-58.
Mateo C, Palomo JM, van Langen LM, van Rantwijk F, dan Sheldon RA. 2004. A
new, mild crosslinking methodology to prepare crosslinked enzyme aggregates.
Biotech Bioeng 86 (3): 273-276.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Ed
ke-25. Hartono A, penerjemah; Bani AP, Sikumbang TMN, editor. Jakarta:
EGC . Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.Ed ke-25.