Induksi Dan Karakter Pertumbuhan Kalus Triploid Dari Kultur Endosperma Avokad (Persea Americana Mill.).

INDUKSI DAN KARAKTER PERTUMBUHAN KALUS
TRIPLOID DARI KULTUR ENDOSPERMA
AVOKAD (Persea americana Mill.)

EDY SUKMARA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Induksi dan Karakter
Pertumbuhan Kalus Triploid dari Kultur Endosperma Avokad (Persea americana
Mill.) benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada

Institut Pertanian Bogor dan Puslit Biologi LIPI.

Bogor, Januari 2015

Edy Sukmara
NIM G 851110051

RINGKASAN
EDY SUKMARA. Induksi dan Karakter Pertumbuhan Kalus Triploid dari Kultur
Endosperma Avokad (Persea americana Mill.). Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan LAZARUS AGUS SUKAMTO.
Buah avokad memiliki ukuran biji yang lebih dari seperempat volume
daging buahnya, hal ini dapat menurunkan tingkat kepuasan konsumen.
Salah satu inovasi dalam teknologi kultur jaringan dapat menjawab masalah
tersebut dengan menghasilkan tanaman triploid. Kelebihan tanaman triploid
adalah mampu tumbuh lebih cepat dan dapat menghasilkan buah tanpa biji.
Tanaman triploid dapat dihasilkan dari persilangan tanaman diploid dan tanaman
tetraploid, tetapi cara ini tidak praktis dan memerlukan waktu lama.
Kultur in vitro endosperma avokad adalah cara alternatif untuk menghasilkan
avokad triploid secara langsung. Penelitian ini merupakan tahap awal untuk

mendapatkan tanaman avokad triploid, dan merupakan laporan ilmiah pertama
tentang kultur endosperma avokad.
Diameter buah avokad dikelompokan menjadi empat kelompok, masingmasing: A=0,30-0,50 cm; B=0,51-1,00 cm; C=1,01-1,50 cm dan D=1,51-2,20 cm.
Rancangan acak lengkap dengan pola faktorial antara faktor zat pengatur
tumbuh (ZPT) dan diameter digunakan dalam penelitian ini. Media Murashige dan
Skoog (MS) digunakan dengan tambahan ZPT picloram dan 2,4-D masingmasing dengan konsentrasi : 0,5; 1,0; 2,0; dan 4.0 dalam mg/l. Kultur
endosperma avokad hanya dapat membentuk kalus apabila dalam kultur disertai
dengan embrionya. Hasil penelitian menunjukan ukuran diameter buah avokad
yang paling cepat membentuk kalus adalah kelompok B, dengan waktu tumbuh
kalus tercepat 7,67 minggu setelah kultur (MSK). ZPT yang memiliki respon
tumbuh kalus tercepat adalah picloram 2 mg/l yaitu 5,1 MSK. Interaksi antara
ukuran diameter buah dan ZPT yang paling cepat untuk menumbuhkan kalus
endosperma avokad adalah ukuran diameter buah kelompok A dan ZPT Picloram
2,0 mg/l. Pengaruh sitokinin yang diujikan terhadap induksi pertumbuhan dan
diferensiasi kalus menunjukkan, secara berurutan dari yang memberikan
pengaruh tinggi ke rendah adalah Thidiazuron, Benzyl Adenin, dan Kinetin,
tetapi sampai 10 MSK diferensiasi kalus tidak terbentuk. Kalus endosperma
avokad dibagi tiga bagian yaitu, atas, tengah dan bawah. Hasil pengukuran ploidi
dengan flow cytometer menunjukkan kalus bagian tengah bersifat triploid,
sementara bagian atas dan bawah bersifat diploid.

Tujuan penelitian ini adalah mencari ukuran diameter buah avokad
yang tepat, pengaruh penyertaan embrio, dan ZPT untuk kultur endosperma
avokad, begitu juga pengukuran ploidi dari kalus endosperma yang
terbentuk.

Kata kunci: avokad, kultur endosperma, Picloram, 2,4-D, induksi kalus

SUMMARY
EDY SUKMARA. Induction and Growth Characteristics of Triploid Callus of
Avocado (Persea americana Mill.) Endosperm Culture. Supervised by MARIA
BINTANG an d LAZARUS AGUS SUKAMTO.
Avocado fruit has a seed size that is more than a quarter of the size of the
volume of the flesh. This can reduce the level of consumer satisfaction. One of
the innovations in the technology of tissue culture can answer these problems by
producing triploid plants. The advantages of triploid plants are able to grow
faster and can produce fruit without seeds. Triploid plants can be produced by
crossing of diploid and tetraploid plants, but this is not practical and takes a
long time. In vitro culture of endosperm avocado is an alternative way to
produce triploid avocados directly. This study is an initial step to produce
avocado triploid plants. It is the first scientific report on endosperm culture of

avocados.
The diameter of avocado fruits were classified to four groups. These
groups were A=0.30-0.50 cm, B=0.51-1.00 cm, C=1.01-1.50 cm and D=1.512.20 cm. The experiment was arranged in a completely randomized design.
Treatments were a factorial combination of regulator (PGR) and fruits
diameters. Murashige and Skoog (MS) medium was used with additional PGR of
picloram and 2,4-D each at concentration : 0.5; 1.0; 2.0; and 4.0 mg/l. The
avocado endosperm could produce callus only with the enclosure of
avocados embryos. The most responsive diameter fruit size was B group , and
the fastest callus growth occured 7,67 weeks after culture (WAC). The most
responsive medium for endosperm callus induction were picloram 2 mg/l on
5,1 WAC. The fastest growing avocado endosperm callus was interaction of
diameter A and picloram 2,0 mg/l. The most effective cytokinin to induce
callus growth and differentiation was Thidiazuron, followed by Benzyl adenine,
and Kinetin consecutively, but callus differentiation did not occurred. The
ploidy level of endosperm callus was checked by using a flow cytometer,
showing the middle layer of endosperm callus as triploid, whereas the upper
and lower layers were diploid.
The aims of this study are to find out the suitable fruit diameter,
enclosured embryo effect, and PGR to the avocado endosperm culture, as well
as ploidy of the calli.

Keywords: avocado, endosperm culture, Picloram, 2,4-D, callus induction

© Hak Cipta Milik IPB dan Puslit Biologi LIPI, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB dan Puslit Biologi LIPI
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB dan Puslit Biologi LIPI

INDUKSI DAN KARAKTER PERTUMBUHAN KALUS
TRIPLOID DARI KULTUR ENDOSPERMA
AVOKAD (Persea americana Mill.)

EDY SUKMARA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Syamsul Falah, Shut MSc

Judul Tesis : Induksi dan Karakter Pertumbuhan Kalus Triploid Pada Kultur
Endosperma Avokad (Persea americana Mill.)
Nama
: Edy Sukmara
NIM
: G 851110051

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Prof Dr drh Maria Bintang, MS
Ketua

Prof Dr Ir Lazarus Agus Sukamto, MSc
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian:
27 Oktober 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Ilahi Rabi atas segala rahmat,
berkah, dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Sholawat
dan salam semoga selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, sahabat
dan para pengikutnya hingga akhir zaman.
Tema tesis ini tentang kultur in vitro jaringan endosperma avokad, karena dari
berbagai eksplan yang dikultur saat ini, hanya eksplan endosperma yang dapat
menghasilkan tanaman triploid, dan umumnya tanaman triploid tanpa biji. Langkah
awal untuk mendapatkan avokad triploid adalah mengeksplorasi karakter kultur
endosperma avokad secara in vitro. Penelitian ini bertujuan mendapatkan
informasi
ilmiah
faktor-faktor
yang mempengaruhi keberhasilan kultur
endosperma avokad, yang nantinya diharapkan dapat menjadi referensi untuk
penelitian khususnya tentang kultur endosperma avokad.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang, MS dan

Bapak Prof Dr Ir Lazarus Agus Sukamto, MSc selaku pembimbing, serta rekanrekan di Laboratorium kultur jaringan dan laboratorium genetik Puslit Biologi LIPI
Cibinong yang telah banyak memberi saran dan masukan yang sangat bermanfaat.
Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Syabar Suwardiman
selaku Kepala SMA Bina Bangsa Sejahtera Bogor (periode 2008-2014) dan rekanrekan guru yang selalu memberikan dorongan semangat untuk menyelesaikan
penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Istri, anak-anak
tercinta, ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan dorongan semangat
untuk menyelesaikan penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2014
Edy Sukmara

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
DAFTAR SINGKATAN
1
PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
2
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan dan Alat
Prosedur percobaan
Sterilisasi
Pembuatan Media
Penanaman
Pengamatan
Pengujian Ploidi
Rancangan Percobaan dan analisis data
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyertaan embrio terhadap induksi dan pertumbuhan
endosperma
Ukuran diameter buah terhadap pertumbuhan kalus

ZPT auksin terhadap pertumbuhan kalus
Interaksi diameter buah dan ZPT terhadap pertumbuhan kalus
ZPT sitokinin terhadap pertumbuhan dan diferensiasi kalus
Morfologi kalus
Ploidi kalus endosperma avokad
4
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP

kalus

xi
xi
xi
xii
1
1
3
3
4
4
4
4
4
5
5
6
6
7
7
8
9
10
11
12
13
15
15
17
17
17
17
20
29

DAFTAR TABEL
1
2

3
4

5

Pertumbuhan
eksplan embrio, endosperma serta
gabungan
embrio dan endosperma terhadap pertumbuhan kalus 15 MSK.
Pengaruh ukuran diameter buah terhadap pertumbuhan kalus
endosperma avokad secara in vitro pada 15 minggu setelah
kultur (MSK)
Pengaruh ZPT terhadap waktu pertumbuhan kalus pada
eksplan buah avokad kelompok A,B,C, dan D
Pengaruh beberapa ZPT sitokinin terhadap rerata pertambahan
berat basah kalus eksplan gabungan embrio+endosperma diukur
setiap 2 minggu selama 10 minggu ( gram).
Hasil pengukuran ploidi embrio, daun, dan kalus endosperma
avokad menggunakan flow cytometer

9
11

12
14

16

DAFTAR GAMBAR
1
2
3

4
5

Perubahan ukuran endosperma dan embrio pada avokad kelompok
A,B,C dan D
Perbedaan respon pertumbuhan kalus berdasarkan perbedaan
eksplan yang digunakan, pengamatan sampai 15 MSK
Kultur kalus endosperma avokad pada media dengan ZPT Kinetin
2 mg/l (K2), Thidiazuron 2 mg/l (T2) dan Benzyl adenin 2 mg/l
(B2).
Struktur dan warna kalus gabungan endosperma dan embrio avokad
Kurva hasil pengukuran kalus avokad triploid
menggunakan
flow cytometer

9
10
14

15
16

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Skema penelitian
Komposisi medium Murashige and Skoog (MS)
Pengolahan data statistik analisis ragam diameter, ZPT dan
interaksi keduanya
Uji Duncan diameter buah
Uji Duncan pengaruh ZPT auksin
Uji Duncan interaksi diameter buah dan ZPT
Analisis ragam ZPT sitokinin (Kinetin)
Analisis ragam ZPT sitokinin (BA)
Analisis ragam ZPT sitokinin (TDZ)

21
22
23
24
24
25
26
27
28

DAFTAR SINGKATAN

2,4-D
BA
Kinetin
LAF
MS
MSK
PGR
PI
Picloram
SPSS
TDZ/ Thidiazuron
WAC
ZPT

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

2,4- Dichlorophenoxyacetic acid
6-Benzylaminopurin
6-Furfurilaminopurin
laminar air flow
Murashige and Skoog
minggu setelah kultur
plant growth regulator
Propidium iodide
4-Amino-3,5,6- tri-chloropicolinic acid
Statistical Product and Service Solution
N-Phenyl-N1-1,2,3,-thiadiazol-5-ylurea
weeks after culture
zat pengatur tumbuh

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Avokad (Persea americana Mill.) merupakan buah bergizi tinggi dan
banyak diminati, karena rasa yang enak, kandungan nilai nutrisi yang tinggi,
dan beragam manfaatnya. Kandungan nutrisi alam avokad meliputi: karbohidrat,
lemak, protein, serat, vitamin A, B, C, dan E, serta mengandung mineral besi,
kalsium, fospor, natrium, kalium, folat, lutein, beta-sitosterol (Pieterse et al.
2003). Beberapa manfaat buah avokad untuk kesehatan antara lain: menurunkan
resiko jantung koroner, meningkatkan kinerja mata, meningkatkan daya tahan
terhadap penyakit, agen anti kolesterolemia (Pieterse et al. 2003). Kandungan gizi
yang tinggi menyebabkan avokad sangat baik untuk kesehatan, akibatnya
permintaan buah avokad terus meningkat.
Avokad umumnya memiliki biji yang besar, yaitu lebih dari seperempat
volume daging buahnya. Hal ini dapat menurunkan tingkat kepuasan konsumen
dalam mengkonsumsi buah avokad. Perakitan tanaman avokad triploid
diharapkan akan menghasilkan buah avokad tanpa biji. Keuntungan yang
didapat dari avokad tanpa biji adalah meningkatkan daya tarik konsumen
(Pardal 2009). Keuntungan lain yang diperoleh dari tanaman triploid yaitu
pertumbuhan vegetatif lebih vigor dibandingkan tanaman diploidnya (Thomas
and Chaturvedi 2008).
Secara terminologi, yang dimaksud tanaman triploid adalah tanaman
yang inti selnya memiliki tiga set kromosom. Ini berbeda dengan tanaman
diploid (normal), yang memiliki dua set kromosom. Secara teknis tanaman
triploid dapat dihasilkan melalui beberapa cara yaitu: persilangan tanaman
diploid dengan tetraploid (hasil penggandaan kromosom), kultur endosperma,
fusi protoplas haploid dengan diploid, kultur tepung sari, induksi radiasi sinar
gamma, dan induksi kolkisin dan oryzalin. Diantara keenam teknik tersebut,
kultur endosperma adalah metode yang lebih efisien untuk mendapatkan
tanaman
triploid (Sukamto 2013). Kultur in vitro endosperma avokad
memerlukan waktu yang lebih singkat dibandingkan penyilangan antara
tanaman tetraploid dengan diploid. Waktu juvenil avokad yang cukup lama,
serta tingkat gugur bunga dan buah sangat tinggi mencapai lebih dari 98%
(Sedgley 1980), merupakan kendala untuk mendapatkan avokad triploid dengan
cara penyilangan. Salah satu tahapan untuk mendapatkan avokad triploid
adalah induksi dan diferensiasi kalus endosperma avokad.
Salah satu inovasi baru dalam kultur jaringan adalah dengan
memanfaatkan eksplan berbagai tanaman. Sampai saat ini, dari berbagai eksplan
yang sudah dikultur, hanya eksplan endosperma yang dapat menghasilkan
tanaman triploid (Sukamto 2013). Beberapa penelitian kultur in vitro endosperma
telah menghasilkan tanaman triploid seperti: Citrus spp. (Gmitter et al. 1990),
Acacia nilotica (Garg et al. 1996), Mallotus philippensis (Sehgal and Abbas
1996), Actinidia spp. (Machno and Przywara 1997), Morus alba (Thomas et al.
2000), Azadirachta indica (Chaturvedi et al. 2003), Actinidia deliciosa
(Góralski et al. 2005), dan Lonicera caerulea (Miyashita et al. 2009).

2

Menurut Sukamto (2010), keberhasilan kultur endosperma secara in vitro
dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya umur endosperma, penyertaan
embrio dalam kultur, pencoklatan (browning), dan umur kultur. Berdasarkan hal
tersebut, metode penelitian ini juga dilakukan dengan pengujian faktor-faktor
tersebut, khususnya dalam melakukan kultur in vitro endosperma avokad.
Setiap tanaman buah memiliki umur endosperma tertentu yang memilki
respon terbaik ketika dikultur, Menurut Gmitter et al. (1990), respon terbaik
endosperma buah jeruk (Citrus sinensis) adalah buah umur 12-14 minggu
setelah penyerbukan, sedangkan endosperma buah mangga gedong gincu
terjadi pada umur 3 minggu setelah pembentukan buah (Hanayanti 2011).
Dalam penelitian inipun diujikan juga penyertaan embrio dalam kultur
endosperma. Beberapa penelitian melaporkan bahwa kultur endosperma ada
yang berhasil tanpa penyertaan embrio pada buah Citrus grandis dan C.
sinesis (Wang and Chang 1978), pir (Zhao 1988), sedangkan pada penelitian
lain kultur endosperma hanya berhasil jika ada penyertaan embrio pada kultur
endosperma Croton, Ricinus, dan Putranjiva (Srivastava 1982). Adapun
kultur endosperma cendana dapat tumbuh dengan atau tanpa penyertaan
embrio (Lakhsmi 1987). Pada kultur in vitro endosperma avokad, belum ada
informasi yang menjelaskan umur endosperma yang tepat serta penyertaan
embrio untuk induksi kalus endospermanya.
Tanaman avokad di Indonesia umumnya masih sebagai tanaman
pekarangan, khususnya di daerah Bogor, tanaman avokad belum ditanam
dalam perkebunan yang luas. Hal ini menjadi kendala yang cukup berarti
dalam mengumpulkan sampel endosperma buah avokad dalam jumlah banyak
dengan umur tertentu. Selain itu, tingginya tingkat gugur buah pada avokad,
menyebabkan penandaan umur pembungaan sering tidak bisa dilakukan,
karena buahnya telah gugur lebih dahulu. Untuk itu dalam penelitian ini
digunakan ukuran diameter buah yang merepresentasikan umur endosperma.
Pada penelitian ini digunakan media Murashige dan Skoog (MS),
karena merupakan media yang banyak digunakan dalam kultur in vitro
endosperma (Hoshino et al. 2011). Senyawa 4-Amino-3,5,6- tri-chloropicolinic
acid (picloram), digunakan dalam kultur in vitro embrio avokad (Witjaksono and
Litz 1999), dan Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) yang sama digunakan dalam
penelitian. Alasan penggunaaan picloram karena ada persamaan eksplan yang
digunakan dalam penelitian ini yaitu menggunakan embrio buah avokad. Adapun
penggunaan asam 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) sebagai pembanding
dari ZPT yang digunakan, karena 2,4-D merupakan ZPT yang umum digunakan
dalam menginduksi kalus endosperma tanaman dikotil (Suryowinoto 1996).
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorf yang belum terdiferensiasi, terjadi
dari sel-sel jaringan yang membelah diri terus menerus secara in vitro, dan tidak
terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagai massa sel yang
bentuknya tidak teratur. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh
ZPT auksin dan sitokinin endogen (Dodds and Roberts 1983). Secara in vivo,
kalus pada umumnya terbentuk pada bekas-bekas luka akibat serangan infeksi
mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau tusukan
serangga dan nematoda.

3

Dalam kultur jaringan, menginduksi terbentuknya kalus merupakan
langkah yang penting. Setelah terbentuknya kalus, kemudian diberikan
perlakuan atau rangsangan untuk berdiferensiasi membentuk akar atau tunas.
Kalus avokad dapat diperoleh dengan menggunakan berbagai eksplan, misalnya :
tunas muda, daun, ujung akar, buah, bagian bunga (Yassen 1993). Penelitian ini
mencoba menginduksi kalus dari eksplan endosperma avokad. Kultur
endosperma avokad memiliki potensi besar untuk diteliti, karena dapat
dikembangkan untuk memperoleh tanaman avokad triploid.
Pengukuran
ploidi kalus yang terbentuk dapat menggunakan flow
cytometer. Pada dasarnya alat ini merupakan penghitung fluorosensi partikel,
yang mengukur intensitas fluorosensi dalam inti, intensitas fluorosensi sebanding
dengan kandungan inti yang terukur dalam DNA. Nilai puncak intensitas
fluorosensi (nilai tengah -X), mencerminkan rata-rata kandungan inti dalam DNA.
Pada tahap awal dilakukan pengukuran standar. Sampel uji berupa daun dan
embrio yang akan memiliki nilai flourosensi tertentu, dan nilai ini ditetapkan
sebagai nilai standar sampel diploid. Berdasarkan nilai standar sampel diploid,
jika nilai hasil pengukuran kalus dari eksplan gabungan embrio dan endosperma
1,5 kali lipat dari kandungan inti sampel diploid, maka sampel kalus yang diukur
tersebut tergolong triploid.

Perumusan Masalah
Penelitian kultur jaringan dengan menggunakan berbagai eksplan dari
avokad telah banyak dilaporkan, namun kultur in vitro menggunakan eksplan
endosperma avokad, belum ada laporan. Penelitian ini diarahkan untuk
mengeksplorasi faktor-faktor yang menentukan keberhasilan kultur in vitro
endosperma avokad. Penelitian ini diharapkan bisa menjawab pengaruh dari
penyertaan embrio, ukuran diameter buah avokad, ZPT dan konsentrasi
terhadap respon kecepatan tumbuhnya kalus endosperma avokad. Kalus hasil
kultur endosperma yang terbentuk diukur plodinya menggunakan flow
cytometer, untuk mengetahui apakah kalus endosperma tersebut bersifat
triploid.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan :
1. Mengetahui pengaruh penyertaan embrio dalam kultur in vitro endosperma
avokad.
2. Mendapatkan ukuran diameter buah avokad dengan endosperma paling
cepat menumbuhkan kalus jika dikultur secara in vitro.
3. Mengetahui ZPT dan konsentrasinya yang terbaik untuk menginduksi dan
diferensiasi kalus endosperma avokad secara in vitro.
4. Membuktikan kalus yang tumbuh dari kultur endosperma avokad bersifat
triploid dengan menggunakan alat ukur ploidi flow cytometer.

4

Manfaat Penelitian
Penelitian tentang induksi dan karakter pertumbuhan kalus triploid
endosperma avokad, merupakan tahapan awal untuk mendapatkan avokad
triploid. Pengembangan dari penelitian ini, dapat menghasilkan buah avokad
tanpa biji. Buah tanpa biji umumnya memiliki harga yang lebih mahal, dan
memiliki daya saing lebih tinggi dibanding buah yang memiliki biji. Selain
itu, penelitian ini dapat memberikan tambahan informasi ilmiah khususnya
tentang kultur in vitro endosperma avokad.

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium kultur jaringan dan
laboratorium genetik Puslit Biologi LIPI Cibinong, mulai bulan Oktober 2012
sampai dengan bulan Desember 2013.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah avokad
varietas ijo bulat, yang berasal dari daerah Cikembang, kabupaten Sukabumi,
Jawa Barat. Ukuran diameter buah yang digunakan dalam penelitian ini
dibagi menjadi empat kelompok, yaitu kelompok A : 0,30-0,50 cm;
B:
0,51-1,00 cm; C : 1,01- 1,50 cm dan D : 1,51- 2,20 cm.
Media yang digunakan adalah formulasi Murashige dan Skoog (MS)
1962, yang meliputi unsur hara makro, hara mikro, vitamin (Lampiran 2). ZPT
terdiri
dari : picloram, 2,4-D, 6-furfurilaminopurin (Kinetin), 6-Benzyl
aminopurin (BA) dan N-Phenyl-N1-1,2,3,-thiadiazol-5-ylurea (Thidiazuron/TDZ).
Sebagai sumber karbon dalam media digunakan sukrosa dan sebagai bahan
pemadat digunakan agar-agar. Pengaturan pH media menggunakan HCl 1N dan
KOH 1N. Bahan-bahan desinfektan yang digunakan adalah alkohol 70% dan
95% serta larutan clorox atau sunclean (Natrium hipoklorit). Bahan untuk
pengujian ploidi meliputi : buffer staining, larutan Propidium Iodida (PI), larutan
RNAse.
Alat
Alat-alat yang digunakan diantaranya peralatan gelas (gelas ukur, labu ukur,
gelas piala, erlenmeyer, cawan petri, pipet, alat pengaduk dan botol kultur),
timbangan analitik, pH-meter, autoklaf, laminar air flow cabinet, peralatan
diseksi (pinset, gunting, skalpel, dan mata pisau), bunsen, rak kultur dan lampu.
Pengukuran ploidi menggunakan flow cytometer (Partec GmbH, Jerman).
Prosedur Percobaan
Metode penelitian ini berupa percobaan laboratorium, dan penelitian
terdiri dari 2 tahap. Tahap pertama berupa pengujian viabilitas endosperma

5

avokad dalam kultur in vitro. Tahap ini terdiri dari 4 faktor yang diamati,
yaitu penyertaan embrio dalam kultur endosperma avokad, penentuan diameter
buah avokad, pemilihan ZPT auksin dan konsentrasinya yang paling cepat
menumbuhkan kalus, dan ZPT sitokinin terhadap pertambahan berat kalus
endosperma dan diferensiasinya. Tahap kedua adalah pengukuran ploidi kalus
endosperma yang terbentuk dengan menggunakan alat flow cytometer
Sterilisasi
Sterilisasi dilakukan terhadap alat, air dan media kultur, lingkungan kerja
dan bahan tanaman. Alat- alat yang berasal dari logam ( pinset, scalpel, dan
lain-lain) serta petridish dan botol kultur terlebih dahulu disterilisasi dengan
autoklaf. Alat- alat dibungkus dengan kertas atau alumunium foil, kemudian
di autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 psi selama 30 menit. Sterilisasi botol
kultur dilakukan dengan pencucian terlebih dahulu dengan detergen, kemudian
dibilas dengan menggunakan air bersih, selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan
clorox selama 24 jam, terakhir dibilas dengan air bersih. Sterilisasi untuk botol
yang terkontaminasi, terlebih dahulu harus diautoklaf , dibersihkan dari media
dan sisa eksplan yang ada di dalamnya, kemudian direndam detergen, dicuci dan
dibilas air bersih. Setelah itu direndam dengan larutan clorox selama 24 jam, lalu
botol dibilas dan dikeringkan. Sebelum digunakan dalam penanaman, alat tanam
seperti scalpel dan pinset disterilisasi kembali dengan dicelup ke dalam
alkohol 95% dan dibakar di atas api spiritus.
Air dan media kultur disterilisasi dalam autoklaf sebelum digunakan.
Media kultur cair yang sudah disiapkan, dimasukkan ke dalam erlemeyer dan
ditutup dengan alumunium foil, kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf selama
30 menit pada suhu 121°C dan tekanan 15 psi. Sterilisasi lingkungan kerja
dilakukan di lingkungan umum maupun lingkungan khusus. Kebersihan
lingkungan umum dilakukan dengan membatasi keluar masuk orang, dan
membersihkan ruangan secara teratur. Sebelum dan sesudahnya tempat kerja
disemprot alkohol 70% dan dilap dengan kertas tissue. Laminar air flow (LAF)
cabinet dinyalakan lampu ultravioletnya selama 0,5-1 jam sebelum penanaman.
Selama penanaman, lampu ultraviolet dimatikan, sedangkan peniup udara
(blower) dan lampu neon dalam keadaan menyala.
Buah avokad dicuci dengan air mengalir sampai kotoran atau debu yang
menempel pada permukaan buah hilang. Sterilisasi dilakukan dengan merendam
buah dalam klorox 10% selama 10 menit, klorox 5% selama 5 menit,
kemudian buah dibilas dengan aquades steril sebanyak tiga kali (Sunyoto,
2010). Sebelum dikultur buah dicelup dalam alkohol 95%, dan dibakar pada
api bunsen, kemudian masuk tahap selanjutnya yaitu penanaman eksplan.
Pembuatan media
Media yang digunakan adalah MS. Langkah awal pembuatan media ini
yaitu membuat larutan stok yang terdiri dari stok makro (NH4NO3 82,5 g/l,
KNO3 95 g/l, KH2PO4 34g/l, CaCl2.2H2O 88 g/l, MgSO4.7H2O 74 g/l) masingmasing dibuat secara terpisah, larutan stok mikro H3BO3 1,24 g/l,
NaMoO4.2H2O 0,05 g/l, KI 0,166 g/l, CoCl.6H2O 0,005 g/l, ZnSO4.7H2O 1,72 g/l,
CuSO4.5H2O 0,005 g/l, MnSO4.H2O 3,38 g/l (semua komponen dicampurkan),
larutan
stok
Fe-EDTA
yang
berasal
dari
campuran
senyawa

6

C10H14N2Na2O82H2O (Na-EDTA 3,72 g/l), dan FeSO4 7H2O 2,78 g/l, larutan
stok ZPT picloram , 2,4-D, BA, TDZ dan Kinetin, serta stok larutan vitamin
( tiamin HCl 0,01 g/l, niasin 0,05 g/l, piridoksin HCl 0,05 g/l, glisin 0,2 g/l).
Media MS dibuat dengan memasukkan larutan stok makro sebanyak
10 ml ke dalam gelas kimia yang telah diisi aquades sebanyak 400 ml. Larutan
stok mikro dimasukkan sebanyak 10 ml. Larutan stok Fe-EDTA dimasukkan
sebanyak 10 ml dan larutan stok vitamin 5 ml, kemudian ditambahkan myoinositol sebanyak 0,1 g, gula pasir sebanyak 30 g, dan agar-agar sebanyak 7 gr.
Larutan ini ditambah aquades menjadi 1000 ml. Media ini digunakan sebagai
media formulasi dasar sebagai kontrol. Untuk perlakuan induksi kalus
ditambahkan ZPT auksin picloram atau 2,4-D, dengan konsentrasi 0,5 mg/l,
1,0 mg/l, 2,0 mg/l dan 4,0 mg/l. Untuk merangsang diferensiasi kalus
ditambahkan ZPT sitokinin (BA, TDZ, atau Kinetin) dengan konsentrasi 1,0 mg/l,
2,0 mg/l, dan 4,0 mg/l. Sebelum memasukkan agar-agar, terlebih dahulu pH
larutan disesuaikan pH nya supaya berkisar pada pH 5,7- 5,8, kemudian
ditambahkan aquades sampai mencapai volume 1 liter.
Penanaman
Buah avokad dibelah membujur, bagian embrio, endosperma atau
gabungan keduanya diambil sebagai eksplan. Eksplan kemudian ditanam dalam
media inisiasi kalus. Suhu ruangan yang sesuai inkubasi diatur pada suhu 25 0C.
Eksplan ditanam di botol kultur, dan disimpan dalam plastik kontainer (tempat
gelap) dan sebagian pada rak kultur (tempat terang). Subkultur dilakukan
sebulan sekali pada media yang sama. Proses penanaman dilakukan dalam
LAF cabinet.
Eksplan ditanam dalam media MS. ZPT yang diujikan masing-masing
dengan picloram dan 2,4-D dengan variasi konsentrasi masing-masing 0,5; 1,0;
2,0; dan 4,0 mg/l. Kalus yang terbentuk pada tahap inisiasi kemudian
diregenerasikan dalam media kultur MS yang mengandung ZPT sitokinin yaitu
BA, Kinetin, dan TDZ dengan konsentrasi : 1,0; 2,0; dan 4,0 mg/l.
Pengamatan
Peubah yang diukur dalam penelitian ini meliputi : waktu pembentukan
kalus, persentase terbentuknya kalus, dan pertambahan berat basah kalus.
Pengamatan dilakukan meliputi beberapa aspek yaitu :
1. Membandingkan respon pertumbuhan kalus pada kultur eksplan embrio,
endosperma dan gabungan embrio dan endosperma avokad. Pengamatan
dilakukan
tiap minggu sampai minggu ke 15.
2. Pengaruh ukuran diameter buah avokad terhadap respon pertumbuhan
kalus. Pengamatan dilakukan terhadap kecepatan munculnya kalus
3. Pengaruh Picloram dan 2,4-D dengan konsentrasi 0,5; 1,0; 2,0; dan 4,0 mg/l
terhadap pertumbuhan kalus. Pengamatan dilakukan mulai minggu ke-1
sampai minggu ke-16. Parameter yang diamati yaitu waktu terbentuknya
kalus, dan persentase terbentuknya kalus.
4. Pengaruh sitokinin (BA, Kinetin, dan TDZ) terhadap peningkatan massa
kalus endosperma avokad. Parameter yang diamati yaitu pertambahan
berat kalus diukur setiap 2 minggu selama 10 minggu.

7

Pengujian ploidi
Kalus endosperma avokad yang terbentuk pada penelitian tahap pertama,
digunakan pada penelitian tahap ke dua. Pada tahap ini dilakukan pengukuran
ploidi kalus endosperma menggunakan flow cytometer. Persiapan pengukuran
meliputi pembuatan larutan staining dan tahap persiapan sampel.
Pembuatan larutan staining sebagai berikut : sebanyak 2 ml buffer
staining dicampurkan dengan 12 µl larutan stok PI dan 6 µl larutan stok
RNAse. Adapun tahap persiapan sampel tanaman yaitu kurang lebih sebanyak
0,5 cm2 kalus atau dari standar (daun muda avokad) disimpan dalam cawan
Petri ukuran 55 mm2 (partec kode 04-2005), kemudian ditambahkan 500 µl
ekstrak buffer. Sampel uji dicacah menggunakan silet selama 30 sampai 60
detik, diinkubasi selama 30-90 detik dalam ekstrak buffer, setelah itu sampel
disaring menggunakan partec 50 µl cell trics disposable filter. Ditambahkan 2
ml larutan staining (dengan PI dan RNAse) dalam tabung tes, kemudian sampel
diinkubasi selama 30-60 menit dan dijaga supaya tidak terkena cahaya, setelah
itu dilakukan pengukuran.
Pengukuran ploidi dilakukan sebanyak 22 kali, meliputi sampel embrio
sebanyak 4 ulangan, endosperma 3 ulangan, daging buah 2 ulangan, daun 2
ulangan, dan kalus yang terbentuk sebanyak 11 ulangan. Penentuan sampel
kalus diambil berdasarkan bagian lapisan dari kalus (dibagi tiga, yaitu kalus
bagian atas, tengah dan bawah). Untuk mendapatkan hasil pengukuran yang
optimal selalu digunakan standar. Untuk tanaman diploid digunakan embrio
atau daun avokad sebagai standar, sedangkan untuk standar tanaman triploid
digunakan jaringan endosperma avokad yang langsung diambil dari buah yang
masih muda dengan ukuran diameter buah 1 cm.
Rancangan percobaan dan analisis data
Penelitian tahap pertama menggunakan rancangan acak lengkap dengan
dua faktor. Faktor A yaitu ukuran diameter buah avokad, terdiri dari 4 taraf.
Faktor B yaitu konsentrasi ZPT yang terdiri dari 9 taraf. Keterangan
mengenai faktor-faktor yang terlibat dalam rancangan yang digunakan adalah
sebagai berikut :
Faktor A : ukuran diameter buah avokad
A1 : 0,30 - 0,50 cm
A2 : 0,51 - 1,00 cm
A3 : 1,01 - 1,50 cm
A4 : 1,51 – 2,20 cm
Faktor B : konsentrasi ZPT
Bo : MS0
B1 : Picloram 0,5 mg/l
B2 : Picloram 1,0 mg/l
B3 : Picloram 2,0 mg/l
B4 : Picloram 4,0 mg/l
B5 : 2,4-D
0,5 mg/l
B6 : 2,4-D
1,0 mg/l
B7 : 2,4-D
2,0 mg/l
B8 : 2,4-D
4.0 mg/l

8

Model umum rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut :
Yijk = µ + Ai + Bj + (AB)ij
Yijk

:

µ
Ai
Bj
(AB)ij

:
:
:
:

Hasil pengamatan terhadap pertumbuhan kalus pada pengaruh
kombinasi ukuran diameter dan ZPT ke-i dan kelompok ke- k
Nilai tengah umum (rata-rata populasi)
Pengaruh diameter buah ke-i
Pengaruh ZPT ke-j
Pengaruh interaksi kombinasi diameter buah dan ZPT

Untuk mengetahui pengaruh yang diberikan, dilakukan uji F. Jika sidik
ragam memberikan hasil pengaruh berbeda nyata, selanjutnya dilakukan uji
Duncan untuk mengetahui beda perlakuan.
Pengolahan data dilakukan
menggunakan Statistical Product and Service Solution (SPSS) versi 22.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Perkembangan endosperma umumnya dimulai sebelum perkembangan
embrio. Endosperma pada tanaman Angiospermae terbentuk dari hasil
pembuahan ganda (double fertilization), yaitu penyatuan dua sel sperma dengan
sel-sel yang berbeda dalam kantung embrio. Satu sel sperma membuahi sel
telur untuk membentuk zigot diploid (2n). Sel sperma yang lain menyatu dengan
kedua inti polar membentuk endosperma triploid (3n). Endosperma tersebut
mengandung banyak zat-zat makanan untuk pertumbuhan embrio, hingga
endosperma habis ketika embrio tumbuh maksimal pada tanaman tergolong
Dikotil, termasuk tanaman avokad.
Pada permulaan pembentukan buah avokad, dengan bertambahnya ukuran
diameter buah, volume endosperma lebih besar dari embrio, kemudian menurun
dengan meningkatnya ukuran buah (Gambar 1). Pada buah kelompok A, volume
endosperma lebih besar dibandingkan embrionya. Pada buah kelompok B, volume
endosperma dan embrio hampir sama, sedangkan pada buah kelompok C dan D,
volume endospermanya lebih kecil dibandingkan embrionya. Pada buah avokad,
pada tahap awal (buah kelompok A), rasio (nisbah) volume endosperma
dibandingkan embrio adalah yang terbesar, diikuti kelompok B, C, dan D secara
berurutan. Peristiwa ini terjadi karena pertumbuhan embrio memerlukan nutrisi
makanan yang disediakan oleh endosperma. Perubahan yang terjadi, buah
kelompok A memiliki volume endosperma terbesar dan makin lama makin
mengecil (kelompok D), kebalikannya terjadi pada embrio, pada tahap awal
volume embrio kelompok A adalah terkecil, kemudian semakin membesar
dan embrio terbesar terjadi pada kelompok D.

9

D

C
4

B

3

A

2
1

Gambar 1. Perubahan ukuran endosperma dan embrio pada avokad kelompok A, B,
C dan D (ket. 1 = embrio; 2 = endosperma; 3 = nuselus ; 4 = daging
buah)
Penyertaan embrio terhadap induksi dan pertumbuhan kalus endosperma
Eksplan yang digunakan adalah embrio, endosperma atau gabungan
embrio dan endosperma. Eskplan endosperma tidak membentuk kalus (0%),
tetapi membentuk kalus dengan penyertaan embrio (44,85%), sedangkan eksplan
embrio sendiri (tanpa disertai endosperma) dapat membentuk kalus 27,77%
(Tabel 1).
Tabel 1. Pertumbuhan eksplan embrio, endosperma serta gabungan embrio
dan endosperma terhadap waktu pertumbuhan kalus dalam MSK.

Jenis eksplan

Jumlah
kultur

Jumlah
eksplan
tumbuh kalus

%
Tumbuh

Waktu
tercepat
tumbuh kalus
4

Waktu
terlama
tumbuh kalus
9

Embrio

18

5

27,77

Endosperma

22

0

0,00

0

0

Embrio+
Endosperma

107

48

44,85

4

11

Eksplan endosperma avokad tidak dapat membentuk kalus, tetapi
membentuk kalus jika disertai dengan embrionya. Hasil yang sama juga terjadi
pada kultur endosperma tanaman Azadirachta indica (Chaturvedi et al. 2003) dan
Morus alba (Thomas et al. 2000), yang memerlukan penyertaan embrio untuk
pembentukan kalusnya. Sedangkan pada tanaman jenis lain seperti kelapa, dapat
membentuk kalus tanpa disertai embrionya (Sukamto 2011). Peristiwa ini
menunjukkan, pengujian penyertaan embrio pada kultur endosperma perlu
dilakukan pada tahap awal, karena jenis tanaman yang berbeda memberikan
respon tumbuh kalus yang berbeda pula.

10

Kultur gabungan endosperma dan embrio membentuk kalus tertinggi
karena adanya endosperma dapat memberikan nutrisi tambahan yang dapat
meningkatkan pertumbuhan kalus embrio. Eksplan embrio atau gabungan
embrio dan endosperma avokad memerlukan waktu tumbuh kalus tercepat yang
sama, yaitu masing-masing 4 MSK, sedangkan waktu terlama tumbuh kalus
terjadi pada eksplan gabungan embrio dan endosperma, yaitu 11 MSK
dibandingkan pada eksplan embrio, yaitu 9 MSK
(Tabel 1). Ilustrasi
pembentukan kalus dari ketiga macam eksplan (Gambar 2).

B
C

A

Gambar 2. Perbedaan respon pertumbuhan kalus berdasarkan perbedaan eksplan
yang digunakan, pengamatan sampai 15 MSK (keterangan:
A=endosperma, B=embrio, C=gabungan endosperma dan embrio dalam
media yang mengandung picloram 0,5 mg/l, tanda elip menunjukan
eksplan endosperma yang tidak membentuk kalus )

Ukuran diameter buah terhadap pertumbuhan kalus
Persentase tumbuh kalus meningkat dari kelompok A ke B dan C,
kemudian menurun pada kelompok D. Persentase tertinggi dicapai kelompok
C yaitu 55,55%. Hal ini ada kaitannya dengan nisbah volume endosperma dan
embrio buah avokad, dimana kelompok A memiliki nisbah tertinggi, yaitu
volume endosperma lebih besar dibandingkan volume embrio, sehingga respon
tumbuh kalus paling kecil. Adapun nisbah endosperma dan embrio optimal
terjadi pada kelompok C, sehingga memiliki persentase tumbuh kalus paling
tinggi.
Umur endosperma saat dikultur, umumnya sangat berpengaruh terhadap
respon pertumbuhannya secara in vitro. Eksplan endosperma yang terlalu muda,
atau telah melewati fase meristematisnya, tidak respon bila dikultur. Tiga aspek
utama yang harus diperhatikan dalam seleksi bahan eksplan, yaitu genotipe, umur,
dan kondisi fisiologis tanaman tersebut (Pierik, 1997). Umur endosperma
dalam penelitian ini, direpresentasikan dengan ukuran diameter buah, yaitu
makin besar ukuran diameter, berarti makin tua umur endosperma. Umumnya
makin muda endosperma, makin respon membentuk kalus bila dikultur.

11

Rerata respon tumbuh kalus tercepat diperoleh dari buah kelompok B
yaitu 7,67 MSK diikuti oleh kelompok C dan D, sedangkan yang paling
lambat adalah buah kelompok A yaitu 9,42 MSK. Hal ini ada kaitannya
dengan umur endosperma, yaitu kelompok A memiliki endosperma yang terlalu
muda, sehingga sel-selnya belum respon ketika dikultur, sedangkan umur optimal
terdapat pada diameter buah kelompok B (Tabel 2).
Tabel 2. Pengaruh ukuran diameter buah terhadap pertumbuhan kalus
endosperma avokad secara in vitro pada 15 MSK

Kelompok

Diameter
buah (cm)

Jumlah
eksplan
yang
dikultur

Jumlah
eksplan
Tumbuh
Kalus

Persentase
tumbuh
kalus (%)

Rerata
Waktu
Tumbuh
Kalus
(MSK)

A

0,30-0,50

28

4

14,29

9,42

B

0,51-1,00

42

10

23,81

7,67

C

1,01-1,50

27

15

55,55

8,75

D

1,51-2,20

50

19

38,00

8,83

147

48

Total

Hasil analisis ragam menunjukkan diameter buah berpengaruh sangat
nyata terhadap pertumbuhan kalus (lampiran 3). Uji lanjut menggunakan uji
Duncan untuk diameter buah, kelompok B memiliki pengaruh beda nyata
terhadap respon tumbuhnya kalus, sedangkan tiga kelompok lainya tidak
berbeda nyata (lampiran 4). Hal ini sejalan dengan rerata waktu tumbuh kalus
kelompok B, yang memiliki waktu tercepat dibandingkan tiga kelompok
lainnya.
ZPT auksin terhadap pertumbuhan kalus
Respon tumbuh kalus tercepat terjadi pada ZPT picloram pada konsentrasi
2,0 mg/l, yaitu 5,1 MSK, sedangkan pada ZPT 2,4-D terjadi pada konsentrasi 0,5
mg/l, yaitu 7,4 MSK. Ini menunjukkan ZPT auksin picloram lebih cepat
dibandingkan 2,4-D, dalam pembentukan kalus endosperma avokad. Respon
tumbuh kalus terlama terjadi pada konsentrasi 4,0 mg/l baik pada picloram
maupun 2,4-D (Tabel 3).
Uji lanjut pengaruh ZPT terhadap tumbuhnya kalus dapat dilihat di
lampiran 5. Waktu tumbuh kalus tercepat dicapai oleh picloram 2,0 mg/l. Secara
keseluruhan jika diurutkan dari yang tercepat ke yang terlambat adalah picloram
2,0 mg/l > picloram 1,0 mg/l > picloram 0,5 mg/l = 2,4-D 0,5 mg/l > picloram 4,0
mg/l > 2,4-D 1,0 mg/l > 2,4-D 2,0 mg/l > 2,4-D 4,0 mg/l.

12

Tabel. 3 Pengaruh ZPT auksin terhadap waktu pertumbuhan kalus pada
eksplan buah avokad kelompok A,B,C, dan D.
Waktu Tumbuh Kalus (MSK)
ZPT (mg/l)

picloram
picloram
picloram
picloram

0,5
1,0
2,0
4,0

A

B

C

D

7,0
6,3
4,0
8,6

5,6
4,6
4,3
5,6

8,6
6,3
5,3
9,6

8,3
7,3
6,6
9,0

total rerata
2,4-D
2,4-D
2,4-D
2,4-D

0,5
1,0
2,0
4,0

total rerata

rerata

7,4
6,2
5,1
8,2
6.8

7,3
9,3
16,3
16,3

8,0
9,0
11,3
12,6

7,0
9,3
10,6
13,0

7,3
8,3
10,6
13,0

7,4
8,9
12,2
13,7
10,6

Penggunaan ZPT picloram lebih efektif dibandingkan 2,4-D ditinjau dari
waktu yang diperlukan untuk tumbuhnya kalus endosperma avokad. Beyl and
Sharma (1983) mendapatkan hasil yang sama, yaitu picloram lebih cepat
menumbuhkan kalus dibandingkan 2,4-D pada tanaman Gasteria dan Haworthia,
tetapi Fitch et al. (1983) mendapatkan hasil sebaliknya yaitu picloram lebih
lambat menumbuhkan kalus dibandingkan 2,4-D pada tanaman tebu. Peristiwa
ini menunjukkan penggunaan eksplan tanaman yang berbeda memberikan
pengaruh yang berbeda pula walaupun ZPT yang digunakan sama.
Pada induksi kalus endosperma avokad, penggunaan ZPT 2,4-D memiliki
respon lebih cepat pada konsentrasi terendah. Respon tumbuh kalus tercepat pada
semua kelompok buah terjadi pada konsentrasi 2,4-D 0,5 mg/l, yang merupakan
konsentrasi terendah dalam penelitian ini. Semakin tinggi konsentrasi 2,4-D,
maka semakin lama respon tumbuh kalusnya. Hasil yang berbeda terjadi pada
induksi kalus remah dari daun ramin (Gonystylus bancanus), dimana dari kisaran
konsentrasi 3,0 mg/l sampai dengan 5,0 mg/l, respon tumbuh kalus tertinggi
terjadi pada konsentrasi 2,4-D yang tertinggi yaitu 5 mg/l (Yelnititis 2012).
Peristiwa ini menunjukkan, perbedaan jenis tanaman pada kultur in vitro,
memerlukan konsentrasi optimal yang berbeda.
Interaksi diameter buah dan ZPT terhadap pertumbuhan kalus
Interaksi ukuran diameter buah dan ZPT auksin terhadap respon
pertumbuhan kalus, menunjukkan kombinasi diameter dan ZPT yang cepat
dalam menumbuhkan kalus adalah diameter buah kelompok A dan kelompok
B masing-masing dengan picloram 2,0 mg/l. Respon tercepat tumbuh kalus
dihasilkan
oleh ZPT yang sama, yaitu picloram 2,0 mg/l, sedangkan
berdasarkan ukuran diameter buah terdapat dua kelompok yang memiliki
respon cepat dalam menumbuhkan kalus (lampiran 6).
Terdapat tiga kombinasi diameter dan ZPT yang dapat menumbuhkan
kalus dalam waktu sekitar 4 MSK, yaitu diameter buah kelompok A dengan

13

picloram 2,0 mg/l (d1Z3), diameter buah kelompok B dengan picloram 2,0 mg/l
(d2Z3), dan diameter buah kelompok B dengan picloram 1,0 mg/l (d2Z2),
sedangkan kombinasi yang menumbuhkan waktu terlama adalah diameter buah
kelompok C dengan picloram 4,0 mg/l d3Z4 (lampiran 6) .
Interaksi antara diameter buah dan ZPT 2,4-D dapat menumbuhkan
kalus tercepat dalam waktu 7 MSK, yaitu diameter buah kelompok A dengan
2,4-D 0,5 mg/l (d1Z5) dan diameter buah kelompok C dan 2,4-D 0,5 mg/l (d3Z5).
Waktu tumbuh kalus terlama terjadi pada diameter buah kelompok A dengan
2,4-D 2,0 mg/l (d1Z7) dan dengan 2,4-D 4,0 mg/l (d1Z8) .
Berdasarkan hasil interaksi antara diameter kelompok buah dan ZPT
yang digunakan, disimpulkan bahwa untuk mendapatkan respon tumbuh kalus
yang cepat dapat menggunakan kombinasi dengan peringkat sebagai berikut :
picloram 2,0 mg/l dan diameter buah kelompok A, picloram 2,0 mg/l dan
diameter buah kelompok B, 2,4-D 0,5 mg/l dengan diameter buah kelompok A,
2,4-D 0,5 mg/l dengan diameter buah kelompok C.
ZPT sitokinin terhadap pertumbuhan dan diferensiasi kalus.
ZPT sitokinin adalah senyawa yang dapat meningkatkan pembelahan sel
pada jaringan tanaman. Pemberian sitokinin ke dalam medium kultur jaringan
diperlukan untuk menginduksi pertumbuhan dan perkembangan eksplan.
Senyawa ini dapat meningkatkan pembelahan sel dan proliferasi pucuk, bahkan
apabila ketersediaan sitokinin dalam jaringan terbatas, maka pembelahan sel
dalam jaringan yang dikulturkan akan terhambat
Untuk memperoleh diferensiasi kalus endosperma avokad yang tumbuh
hasil induksi dengan ZPT picloram dan 2,4-D, kalus dikultur dalam media yang
ditambahkan ZPT sitokinin. Sitokinin yang diujikan yaitu : kinetin, Benzyl adenin,
dan thidiazuron, dengan masing-masing konsentrasi 1,0 mg/l, 2,0 mg/l, dan 4,0
mg/l. Pengujian kultur kalus dengan penambahan ZPT sitokinin sampai minggu
kesepuluh tidak menghasilkan diferensiasi kalus, hanya menghasilkan
pertambahan berat basah kalus saja. Rerata pertambahan berat kalus tertinggi
dicapai oleh TDZ 2,0 mg/l yaitu 0,1410 gram dan berat terendah pada Kinetin
2 mg/l yaitu 0,0886 gram. Pada kelompok kinetin, rerata pertambahan berat
kalus tertinggi terjadi pada kinetin 1,0 mg/l, dan terendah adalah kinetin 2,0
mg/l, sedangkan rerata pertambahan berat kalus untuk kelompok BA untuk
ketiga konsentrasi yang diujikan mendapatkan hasil yang hampir sama. Hal ini
sesuai dengan uji statistik konsentrasi BA terhadap pertambahan berat kalus
yang tidak berbeda nyata. Adapun untuk kelompok TDZ rerata pertambahan
berat kalus tertinggi dicapai oleh TDZ 2,0 mg/l dan terendah TDZ 1,0 mg/l
(Tabel 4).
Jika dibandingkan, maka pengaruh jenis sitokinin yang diujikan terhadap
pertambahan berat kalus endosperma avokad, secara berurutan dari tertinggi
ke rendah adalah TDZ  BA  Kinetin. Secara umum jika dibandingkan dari
ketiga sitokinin yang diujikan, pengaruh yang berbeda nyata terjadi pada ZPT
Kinetin (lampiran 7) dan TDZ (lampiran 9), sedangkan pada BA dengan
konsentrasi yang berbeda, pengaruhnya tidak berbeda nyata (lampiran 8).

14

Tabel 4. Pengaruh beberapa ZPT sitokinin terhadap rerata pertambahan berat
basah kalus eksplan gabungan embrio+endosperma diukur setiap 2
minggu selama 10 minggu ( gram).
ZPT
(mg/l)

Minggu
ke 2

Minggu
ke 4

Minggu
ke 6

Minggu
ke 8

Minggu
ke 10

Rerata pertambahan
berat kalus

K1

0,0709

0,1105

0,1219

0,1338

0,1419

0,1158

K2

0,0388

0,0668

0,0891

0,1168

0,1315

0,0886

K4

0,0344

0,0693

0,0971

0,1141

0,1438

0,0917

B1

0,0565

0,0932

0,1097

0,1429

0,1639

0,1132

B2

0,0676

0,1104

0,1160

0,1382

0,1650

0,1194

B4

0,0713

0,1095

0,1227

0,1469

0,1772

0,1255

T1

0,0751

0,1140

0,1267

0,1429

0,1455

0,1208

T2

0,0854

0,1326

0,1522

0,1652

0,1694

0,1410

T4

0,0908

0,1321

0,1411

0,1508

0,1764

0,1382

Keterangan

:

K1= Kinetin 1 mg/l; K2=Kinetin 2 mg/l; K4=kinetin 4 mg/l
B1=Benzyl adenin 1 mg/l; B2=Benzyl adenin 2 mg/l;
B4=Benzyl adenin 4 mg/l ; T1= Thidiazuron 1 mg/l;
T2= Thidiazuron 2 mg/l; T4= Thidiazuron 4 mg/l

Hasil yang menunjukkan TDZ paling tinggi pengaruhnya terhadap
pertambahan berat kalus endosperma avokad, sejalan dengan penelitian lainnya.
Huetteman and Preece (1993) menyebutkan TDZ paling aktif dalam menginduksi
tunas
dalam kultur jaringan beberapa tanaman dikotil. Menginduksi
pertumbuhan tunas lebih baik dibandingkan sitokinin lainnya pada tanaman
Pterocarpus marsupium. (Husain et al. 2007). Induksi kalus endosperma avokad
dengan ZPT sitokinin yang diujikan pada penelitian ini, tidak membentuk
somatik embrio atau organ dengan perlakuan tersebut di atas sampai 10
MSK. Pertumbuhan kalus dengan perlakuan ZPT sitokinin dapat dilihat di
gambar 3.

Gambar 3. Kultur kalus endosperma avokad pada media dengan ZPT Kinetin
2 mg/l (K2), Thidiazuron 2 mg/l (T2) dan Benzyl adenin 2 mg/l (B2).

15

Morfologi kalus
Struktur kalus dalam penelitian ini ada dua jenis, yaitu remah dan
kompak. Kalus kompak terbentuk karena kalus mengalami lignifikasi
sehinggga kalus tersebut mempunyai struktur keras dan kompak. Adapun
kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi bagian-bagian kecil dinamakan kalus
remah. Berdasarkan warna, kalus endosperma avokad memiliki warna yang
berbeda-beda, yaitu putih, kuning, krem dan hijau. Morfologi pembentukan
kalus dari endosperma avokad dapat dilihat pada Gambar 4.
A

B

C

D

Gambar 4. Struktur dan warna kalus gabungan endosperma dan embrio avokad
Keterangan : (A) struktur kalus remah (B) Struktur kalus kompak
(C) warna kalus kuning (D) warna kalus campuran krem dan putih

Setelah kalus endosperma avokad terbentuk, tahap selanjutnya adalah
pembentukan embriogenesis somatik. Proses ini merupakan pembentukan embrio
dari sel somatik tanpa melalui fusi gamet, sehingga tanaman yang terbentuk
mempunyai sifat yang sama dengan tetuanya. Keuntungan dari embriogenesis
somatik adalah embrio-embrio somatik yang dihasilkan bersifat bipolar, yakni
memiliki ujung akar dan pucuk yang diperlukan bagi pertumbuhan tanaman
lengkap. Pada penelitian ini belum diperoleh embrio somatik dari kultur kalus
yang terbentuk, karena kalus yang dihasilkan, tidak memiliki ciri-ciri kalus
embriogenik, dan sampai akhir kultur, tidak ada kalus yang mengalami
diferensiasi. Kalus yang embriogenik dicirikan dengan warna kalus yang
putih kekuningan dan mengkilat (Peterson and Smith, 1991). Shimizu et al.
(1997) menemukan kalus yang berwarna putih atau kekuningan dengan tekstur
remah merupakan kalus yang kompeten membentuk embrio somatik.
Ploidi kalus endosperma avokad
Pada penelitian tahap ke dua, kalus yang terbentuk pada penelitian
tahap satu diukur tingkat ploidinya menggunakan flow cytometer. Sebagai
standar digunakan daun dan daging buah avokad yang bersifat diploid. Kalus
endosperma avokad hanya dapat tumbuh dari penyertaan dengan embrio, maka
kalus yang terbentuk berasal kedua jenis eksplan. Kalus tersebut dipisahkan
secara horizontal menjadi tiga bagian, yaitu bagian atas, bagian tengah dan
bagian bawah, diukur tingkat ploidinya menggunakan flow cytometer.
Hasilnya pengukuran menunjukkan kalus bagian atas (nilai tengah-x
=237,27) dan bagian bawah (nilai tengah-x = 199,91) bersifat diploid, sedangkan

16

bagian tengah (nilai tengah-x=301,97; 296,86; dan 298,51) ketiganya bersifat
triploid. Kalus yang triploid berarti berasal dari endosperma sedangkan yang
diploid berasal dari embrio. Secara alami embrio adalah diploid, karena
merupakan penggabungan dari sel gamet jantan dan sel gamet betina. Adapun
endosperma, secara alami adalah triploid, karena terbentuk dari fertilisasi ganda,
yaitu merupakan hasil penggabungan satu sel sperma dengan dua inti polar,
sehingga dihasilkan jaringan triploid. Hasil pengukuran ploidi sampel avokad
dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil pengukuran ploidi embrio, daun, dan kalus endosperma avokad
menggunakan flow cytometer
No.

Nama sampel

Nilai tengah-x

CV%

tingkat ploidi

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Embrio
Daun
Kalus bagian atas
Kalus bagian tengah
Kalus bagian tengah
Kalus bagian tengah

207,33
196,76
237,27
301,97
296,86
298,51

8,93
11,71
11,20
9,76
10,73
9,73

Diploid
Diploid
Diploid
Triploid
Triploid
Triploid

7.

Kalus bagian bawah

199,91

13,11

Diploid

Keterangan : Mean-X = Nilai tengah dari kurva
CV % = Persentase koifisien varian adalah pengukur
keragaman atau
fluktuasi data pengamatan. Makin kecil nilai CV% berarti
variasi data semakin kecil.

Hasil pengukuran flow cytometer menunjukkan kalus en