Pengklonan dan Karakterisasi Gen Gst12 Dari Kedelai Kultivar Lumut dan Slamet
1
PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN GST12 DARI
KEDELAI KULTIVAR LUMUT DAN SLAMET
Oleh:
Syahnada Jaya Sy
G34102011
DEPARTMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
2
ABSTRAK
SYAHNADA JAYA SY. Pengklonan dan Karakterisasi gen GST12 dari Kedelai Kultivar Lumut
dan Slamet. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
GST12 diketahui sebagai salah satu gen yang berperan dalam respon ketahanan terhadap
cekaman Alumunium (Al). cDNA LGST12 dan SGST12 telah berhasil diisolasi dari akar tanaman
kedelai kultivar Lumut dan Slamet. Hasil penelitian sebelumnya diketahui bahwa pada kultur air
pH rendah dan Al tinggi LGST12 tidak terinduksi sedangkan SGST12 terinduksi. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi kedua gen tersebut sebagai langkah awal eksplorasi dan isolasi
gen. cDNA kedua kultivar telah dicek keberadaannya kemudian diklon ke dalam pGEM®-T easy.
Plasmid rekombinan dalam Escherichia coli galur DH5 telah berhasil diperoleh. Pengurutan
cDNA LGST12 dan SGST12 dengan DNA sekuenser ABI Prism Model 310 yang masing-masing
menghasilkan 722 pb dan menyandikan 237 asam amino. Analisis kesejajaran lokal kedua cDNA
terhadap bagian GST12 (AF243367) yang berada di GenBank menunjukan persentase kesamaan
sebesar 85 % untuk LGST12 dan 92 % untuk SGST12 dengan Score Bits secara berurutan 908 dan
1146 dan E-value kedua cDNA tersebut 0 (nol). Hasil penelusuran daerah asam amino
terkonservasi menunjukkan bahwa cDNA GST12 memiliki daerah domain asam amino
terkonservasi GST tipe GST_N_Tau sedangkan cDNA SGST12 selain memiliki daerah domain
asam amino terkonservasi GST_N_Tau juga memiliki daerah domain asam amino terkonservasi
GST_C_Tau. Berdasarkan penjajajaran asam amino cDNA LGST12 dan SGST12 terhadap GST12
dari beberapa spesies menggunakan MAFFT v6. 500a diperoleh pohon filogenetik yang
menunjukkan kedekatan kekerabatan kedua cDNA terhadap GST12 dari Glycine max (AF243367).
ABSTRACT
SYAHNADA JAYA SY. Cloning and Characterization of GST12 Gene from Soybean Lumut
Cultivar and Slamet. Supervised by UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO and ARIS
TJAHJOLEKSONO.
GST12 is one of genes that has important role in Aluminum (Al) stress. cDNA LGST12 and
SGST12 are already isolated from soybean root of Lumut cultivar (cv.) and Slamet. The recent
research reported that LGST12 was not induced and SGST12 was induced by low pH and Al
stressed water culture system. The objection of this research is to characterize GST12 genes from
Lumut cv. and Slamet soybean which have difference response against both of stress. Both of
cDNA were re-confirmed by specific primers PCR. Thus, The PCR products are inserted into
pGEM®-T easy and the plasmid was successfully introduced into E. coli DH5. Sequencing of
LGST12 and SGST12 by using ABI Prism 310 automated DNA sequencer showed that LGST12
and SGST12 have 722 base pairs encoding 237 amino acids. Basic local alignment analysis based
on nucleotide with other GST12 from GenBank showed that LGST12 is 85 % identical and
SGST12 is 92% identical to part of GST12 from Glycine max (AF243367) with bit score 908 and
1146 respectively, and E-value is 0 (zero). LGST12 has big similarity with GST_N_Tau
conserved domain type only, however cDNA SGST12 does not only has big similarity on
GST_N_Tau, but it also has big similarity on GST_C_Tau conserved domain type. The amino
acids alignment analysis is used for comparing the sequences with some species using the MAFFT
v6 500a was constructed phylogenetic tree. It showed nearest family relationship among both of
cDNA to part of GST12 from Glycine max (AF243367).
3
PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN GST12 DARI
KEDELAI KULTIVAR LUMUT DAN SLAMET
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh :
Syahnada Jaya Sy
G34102011
DEPARTMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
4
Judul Skripsi
: Pengklonan dan Karakterisasi Gen GST12 dari Kedelai
Kultivar Lumut dan Slamet
: Syahnada Jaya Sy
: G34102011
Nama
NIM
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono
NIP 131851279
Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA
NIP131664392
Mengetahui :
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
5
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis sampaikan kepada Allah SWT karena hanya dengan
rahmat, hidayah dan izin-Nya skripsi ini dapat diselesaikan. Penelitian dilakukan mulai bulan
Februari 2006 sampai Mei 2007, di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research IndonesiaThe Netherlands), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB),
Kampus IPB Darmaga, Bogor.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Utut Widyastuti, MSi. dan Dr. Aris
Tjahjoleksono, DEA. selaku pembimbing yang telah memberi arahan, bantuan dan waktu selama
penelitian. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi. atas masukan
untuk perbaikan karya ilmiah ini dan Dr. Suharsono DEA, selaku kepala PPSHB-IPB yang telah
memberikan kesempatan untuk melakukan penelitian di lab BIORIN serta kepada seluruh staf dan
karyawan atas bantuan yang telah diberikan selama penulis melakukan penelitian. Terima kasih
kepada pak Mulya dan mbak Pepi yang telah turut memberikan arahan dan bantuan selama di
laboratorium.
Ungkapan terima kasih dan rasa hormat yang mendalam juga penulis sampaikan kepada
keluarga besar Abu Senin dan Djamaluddin tercinta: Bapak Syaifullah AS, Ibu Adna Huda
Djamal, Kak Syafrianto Sy dan keluarga, Ayuk Syafrida Sy, S E. Ak dan keluarga. dan Ayuk
Syafrianti Sy, Spd I yang selalu memberikan doa, bantuan, perhatian dan kasih sayang. Juga
kepada para sahabat yang selalu memberi inspirasi dan semangat: Rafli, Odan, Dwi, Kakak yang
selalu mememberi inspirasi dan penyedia jurnal yang sedang berjuang di negeri orang (Bro Fadly
(Korsel-SNU), Abang (Finlandia-Erasmus Mundus), Mas Aqil (Australia), Mas Jaya (JermanErasmus Mundus), Mas Anuraga (Jerman-DAAD), Bro Marwan (Italia-Bologa), Uda Reflinur
(Korsel-SNU) teman-teman SR dan BPA angkatan 2004-2005, teman-teman BEM TPB 2002,
teman-teman Natrium, teman-teman PA 2004, teman-teman Biologi 39, teman-teman Al-izzah,
Kodama-kun, Romone, Kenji-kun, Amirouche, Khalid, Haidir serta adik-adik asrama TPB
angkatan 2004/05 dan 2005/06, juga ditujukan kepada teman-teman kelompok penelitian padi dan
penyakit blast (Mbak Ela, Mbak Rina, Nindya, Dona, Zahro), Melastoma (Uzy, Mas Firda, Mas
Yasier, Mbak Ulfa, Mbak Agustin, Mbak Zendi, Pak Hadi, Mbak Ratna), Kedelai (Mas Huda,
Mbak Muti, Mbak Kiki, Mbah, Ibu Seh), keragaman Jarak dan Nanas (Ibu Panca dan Ibu Puji) dan
Kultur jaringan Cabai, Kedelai dan Kelapa Sawit (Mbak Budi, Hakiim, Popi, Ammay, Sari) serta
para kandidat Doktor (Pak Muzuni, Ibu Sri Lis, Mbak Hanum, Pak Ulung) yang telah meluangkan
waktunya untuk saling menasehati, diskusi sehingga penelitian ini menyenangkan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2007
Syahnada Jaya Sy
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kabupaten Rejang Lebong, Provinsi Bengkulu pada tanggal 16 Juli
1983 dari ayah Syaifullah AS dan ibu Adna Huda Djamal. Penulis merupakan putra keempat dari
empat bersaudara.
Pada tahun 2002 penulis lulus dari SMU I Curup Bengkulu. Pada tahun yang sama penulis
diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut
Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
Pada tahun ajaran 2002/2003 penulis aktif di kelembagaan Badan Eksekutif Mahasiswa
Tingkat Persiapan Bersama (BEM-TPB) sebagai sekretaris umum dan kelembagaan Asrama TPBIPB. Penulis dipercaya menjadi ketua penyambutan mahasiswa baru tingkat IPB pada tahun ajaran
2003/2004 serta ketua penyambutan mahasiswa baru tingkat Departemen Biologi pada tahun
2004/2005. Penulis mendapat beasiswa kerja Senior Residence asrama TPB-IPB selama dua
periode pada tahun ajaran 2004/2005 dan 2005/2006. Penulis sekarang aktif di yayasn Bulan Sabit
Merah Indonesia (BSMI) cabang Bogor. Penulis pernah menjadi finalis presentasi dan poster
dalam ajang kompetisi Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional XIX (PIMNAS) Malang untuk kategori
Program Kreatifitas Mahasiswa Teknologi (PKM-T). Selain itu penulis juga aktif mengikuti
berbagai pelatihan ilmiah dan kepemimpinan. Pada bulan Juni-Agustus 2005 penulis
melaksanakan praktik lapang dengan judul Pembenihan Ikan Bawal Air Tawar (Colossoma
macropomum) Di PT Agung Fish Farm Kecamatan Cibungbulang, Kabupaten Bogor. Pada tahun
2004/2005 penulis aktif sebagai asiten Biologi Dasar untuk mahasiswa TPB dan Genetika Dasar
pada semester ganjil tahun ajaran 2006/2007 untuk mahasiswa Biokimia serta matrikulasi
mahasiswa pasca sarjana Beasiswa Utusan Daerah (BUD) Departemen Agama (DEPAG) pada
tahun ajaran 2007/2008.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................................... vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ................................................................................................................................ 1
BAHAN METODE
Waktu dan tempat ............................................................................................................
Bahan ................................................................................................................................
Metode ..............................................................................................................................
Penentuan Konsentrasi gen GST12 dari Stok Produk PCR ....................................
Pengklonan GST12...................................................................................................
Seleksi E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan .................................
Analisis gen sisipan..................................................................................................
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA ............................................................
2
2
2
2
2
3
3
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil .................................................................................................................................
Konfirmasi GST12 dari Stok cDNA ........................................................................
Pengklonan GST12...................................................................................................
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA ............................................................
Pembahasan .....................................................................................................................
4
4
4
6
6
SIMPULAN .................................................................................................... 8
SARAN................................. ........................................................................... 8
7
UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ 8
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 8
LAMPIRAN .................................................................................................... 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Peta fisik plasmid pGEM®-T Easy yang digunakan sebagai vektor pengklonan ........... 2
cDNA LGST12 (a); cDNA SGST12 (b). 1= LGST12 berukuran sekitar 720 pb, 2= SGST
12 berukuran sekitar 720 pb. Elektroforesis pada 1.5 % (b/v) agarosa. M= 50 ng; M1=
100 ng; M2= marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 ....................................... 4
Penampilan koloni E. coli DH5 yang diduga membawa plasmid rekombinan (koloni putih)
pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG) .............................................................. 4
PCR koloni putih E. coli yang membawa GST12. Elektroforesis pada 1.5 % (b/v) agarosa.
Kultivar Lumut: dari 5 koloni putih hanya dijumpai 1 koloni positif pembawa plasmid
rekombinan (a); kultivar Slamet: dari 6 koloni putih dijumpai 5 koloni positif pembawa
plasmid rekombinan (b). M= Marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 .............. 4
Elektroforesis plasmid utuh rekombinan (a). Elektroforesis produk PCR GST12 dari plasmid
utuh rekombinan (b). 1= LGST12, 2= SGST12. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. M=
Marker 50 ng; M1= Marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 ......................... 4
Penjajaran (alignment) asam amino LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max
(AF243367) ........................................................................................................................ 5
Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino GST dari berbagai spesies ................ 5
Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max (AF243367) dari GenBank ....................................................... 6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Output sekuensing dengan menggunakan mesin sekuensing ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer ...............................................................................................................................
2 Hasil sekuensing dua arah menggunakan primer GST12F dan GST12R menghasilkan
urutan nukleotida GST12 Glycine max (AF243367), cDNA LGST12 dan SGST12 lengkap mengandung kodon ATG dan TGA ..............................................................................
3 Asam amino hasil penerjemahan sekuen GST12 Glycine max (AF243367), LGST12
dan SGST12 menggunakan program expasy translate tool .................................................
11
15
16
8
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai merupakan salah satu komoditi palawija yang digunakan secara luas di Indonesia
sebagai sumber protein nabati. Produksi kedelai tahun 2006 (angka sementara) sekitar 749.04 ribu
ton biji kering, mengalami penurunan sekitar 59.32 ribu ton (7.34 %) dibandingkan dengan
produksi tahun 2005 (BPS 2006). Penurunan produksi kedelai tersebut menurut BPS (2006)
disebabkan oleh adanya penyusutan luas panen dan penurunan produktivitas tanaman kedelai.
Luas panen kedelai tahun 2006 menurun 39.93 ribu hektar (6.42 %) dibandingkan dengan tahun
2005. Sementara produktivitas tahun 2006 turun sebesar 0.13 kuintal/hektar (1.00 %)
dibandingkan dengan tahun 2005. Bahkan pada tahun 2006 Indonesia mengimpor kedelai sebesar
1 370 000 ton (USDA 2007).
Usaha jangka panjang untuk mening-katkan produksi kedelai dapat dilakukan melalui
ekstensifikasi dan perbaikan genetik (Suharsono 2002). Ekstensifikasi telah lama dilakukan di
Indonesia, namun belum mem-berikan hasil yang memuaskan. Tanah asam menjadi salah satu
faktor penghambat ekstensifikasi. Menurut Mulyani et al. (2003), Indonesia masih memiliki lahan
potensial untuk perluasan areal tanam kedelai yang tersebar di Sumatera, Kalimantan, dan Papua.
Lahan seluas 18.2 juta hektar sebagian besar bersifat asam dengan kandungan Alumunium (Al)
tinggi sehingga masih belum dapat dimanfaatkan sebagai lahan produktif hingga diperolehnya
kultivar tanaman yang dapat tumbuh dengan baik pada jenis tanah tersebut.
Pada tanah asam (pH < 5) ion Al3+ men-jadi faktor penghambat pertumbuhan akar tanaman
kedelai sehingga mempengaruhi pertumbuhan kedelai secara keseluruhan (Kochian 1995,
Matsumoto 2000, Srimulyani 2007). Sifat racun ion-ion Al tersebut juga dapat berupa
penghambatan sintesis RNA (Matsumoto et al. 1997), peningkatan perok-sidasi fosfolipid dan
protein pada membran (Cakmak & Horst 1991, Yamamoto et al. 2001). Ion-ion Al juga
menyebabkan peng-hambatan influks ion Ca2+ sehingga meng-ganggu homeostatis Ca2+ pada
apeks akar (Rengel 1992).
Pada Arabidopsis thaliana salah satu gen yang berhubungan dengan sistem pertahanan
terhadap cekaman Al adalah gen GST yang menyandikan Glutathione S-Transferase (Richard et
al. 1998). Glutathione S-Transferase (GST) merupakan kelompok enzim sitoplasmik. Setiap sub
unit GST merupakan suatu dimerik dengan massa molekul sekitar 24-30 kD. Gen GST dapat
dibagi menjadi tiga tipe berdasarkan kemiripan sekuennya yaitu GmGST (Glycine max Glutathione
S-transferase) tipe I, GmGST tipe II dan GmGST tipe III (Droog et al. 1995; Board et al. 1997;
McGonigle et al. 2000). GmGST tipe III atau kelas Tau (Hock & Elstner 2005) memiliki anggota
paling besar dimana GmGST 12 termasuk dalam kelas ini. Berdasarkan hasil uji Expressed
Sequence Taq (EST) diketahui bahwa GmGST tipe III diekspresikan paling melimpah di bagian
akar dan daun kedelai dibandingkan dengan GmGST tipe I dan II (McGonigle et al. 2000).
Pada mamalia dan beberapa tanaman, gen GST ditemukan berperan dalam detoksifikasi
metabolit yang disebabkan oleh cekaman oksidatif melalui peredaman molekul-molekul reaktif
dengan menambah-kan GSH (Wilce et al. 1994; Sheehan et al. 2001). GST juga terlibat dalam
menanggapi berbagai cekaman kimia dan berperan dalam sistem antioksidasi (Ulmasov et al.
1995). Selain fungsi endogenous tersebut, GST juga memiliki peran penting dalam proses
detoksifikasi herbisida yang sebagian besar merupakan kelompok senyawa-senyawa xenobiotik
(Dixon et al. 1998).
cDNA GST12 kedelai kultivar (var.) Lumut yang bersifat peka (Sunarto 1995) dan var.
Slamet yang bersifat toleran terhadap cekaman Al (Jusuf et al. 1999) telah berhasil diisolasi dari
bagian akar. Kedua var. tesebut memiliki pola ekpsresi GST12 yang berbeda selama diberi
perlakuan cekaman Al dan pH rendah di dalam kultur air (Mashuda 2006; Sawitri 2007). LGST12
(gen GST12 yang diisolasi dari akar kedelai var. Lumut) diinduksi pada jam ke-8 hingga jam ke-72
dalam semua jenis cekaman Al (Mashuda 2006), sedangkan SGST12 (gen GST12 yang diisolasi
dari akar kedelai var. Slamet) tidak terinduksi (Sawitri 2007). Oleh karena itu untuk melihat lebih
jauh perbedaan yang ada pada gen GST12 dari kedua var. Lumut dan Slamet perlu dilakukan
pengklonan dan karakterisasi.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi gen GST12 dari tanaman kedelai yang memiliki
respon berbeda terhadap cekaman Al.
9
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai Februari 2006 sampai dengan Mei 2007 di laborato-rium
Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands (BIORIN) dan Genetika Molekular dan
Selular Tanaman (GMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB
Darmaga.
BAHAN
Produk PCR LGST12 (gen GST12 yang diisolasi dari akar kedelai var. Lumut) (Sawitri 2007)
dan produk PCR serta cDNA SGST12 (gen GST12 yang diisolasi dari akar kedelai var. Slamet)
(Mashuda 2006) yang keduanya diisolasi dari akar kedelai yang ditumbuhkan pada kultur air.
Plasmid pGEM®-T Easy (Gambar 1) (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan dan E. coli
galur DH5α sebagai inang vektor rekombinan.
Gambar 1 Peta fisik plasmid pGEM®-T Easy yang digunakan sebagai vektor pengklonan
Primer spesifik gen GST12 didesain berdasarkan GST12 (AF243367). Primer forward
(GST12F) dari gen GST12 terletak pada 8 nukleotida sebelum kodon awal
(5’CCATAGCAATGGCAGAGCAAG3’) dan primer reverse (GST12R) terletak pada 11
nukleotida sebelum kodon akhir sampai 6 nukleotida setelah kodon akhir (5’TATATATCATTCTGTGGCAG3’) (Lampiran 2) digunakan sebagai alat verifikasi keberadaan gen
GST12 dari stok cDNA yang tersedia.
Metode
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu penentuan kosentrasi gen GST12 dari stok
cDNA. Pengklonan gen GST12 ke dalam plasmid pGEM®-T Easy, transformasi genetik E. coli
DH5α dengan vektor rekombinan, analisis urutan nukleotida, dan deduksi asam amino.
Penentuan Konsentrasi gen GST12 dari Stok Produk PCR
cDNA LGST12 dan cDNA SGST12 digunakan sebagai cetakan PCR untuk konfirmasi
keberadaan gen GST12. Komposisi PCR adalah 0.5 l cDNA LGST12 dan SGST12 (stok di lab
BIORIN), 1 l 10x buffer Taq, 0.1 mM dNTP, 10 pmol primer GST12F, 10 pmol primer GST12R,
4% DMSO (Dimethyl Sulfoxide), 1 U enzim Taq DNA polymerase (Gen Scr Inc.) dan ddH2O
hingga volume akhir mencapai 10 l. Kondisi PCR yang digunakan adalah 95 0C selama 5 menit
untuk pra-PCR. Siklus PCR dilakukan sebanyak 37 kali dimulai dengan denaturasi pada suhu 94
0
C selama 30 detik, penempelan primer LGST12 55 0C selama 30 detik (52 0C untuk primer
SGST12), pemanjangan 72 0C selama 2 menit. Kemudian dilanjutkan dengan pasca-PCR pada
suhu 72 0C selama 5 menit dan pendinginan dilakukan pada 15 0C selama 10 menit (Mashuda
2006; Sawitri 2007).
Pengklonan gen GST12
10
Pengklonan gen GST12 menggunakan prosedur promega (1996) yang dimodifikasi dengan
cara mencampurkan 5 l 2x buffer rapid ligasi, 1 l vektor pGEM®-T Easy (10 ng), 1 l T4 DNA
ligase (3 U/ l), dan 0.7 l (10 ng/ l) cDNA LGST12 (0.35 l (20ng/ l) cDNA SGST12).
Kemudian diinkubasi pada suhu 4 0C. Untuk mendapatkan hasil pengklonan yang optimal jumlah
insert (cDNA LGST12 atau SGST12) yang dibutuhkan dihitung dengan menggunakan rumus
berikut:
Jumlah insert (ng)=
vektor (ng) x ukuran insert (Kb)
×3/1
ukuran vektor (Kb)
Produk ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α melalui transformasi dengan
prosedur Suharsono (2002). Transformasi diawali dengan pembuatan bakteri kompeten dengan
membiakkan satu koloni E. coli DH5α dalam 2 ml LB (Lauria Broth) (1% (b/v) bakto tripton,
0.5% (b/v) bakto ekstrak khamir, 1% NaCl (b/v)) dan diinkubasi pada suhu 37 0C dan digoyang
dengan kecepatan 250 rpm selama semalam di dalam inkubator bergoyang, ES-20 (Biosan).
Kemudian sebanyak 100 l E. coli DH5α disubkulturkan dalam 30 ml LB dengan kondisi yang
sama hingga mencapai densitas bakteri 4-7 x 107 sel/ml (OD600 = 0.4-0.5). Sel bakteri dipanen
dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 3 000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit dengan
menggunakan tabung falkon 15 ml. Pelet yang diperoleh selanjutnya ditambahkan buffer
transformasi TB (Transformation Buffer) (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H20, 250 mM KCl, 55
mM MnCl2.4H2O, pH 6.7) sebanyak 0.033 x volume larutan biakan. Pelet diresuspensi dengan
menggunakan pipet dan diinkubasi dalam es selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan
kecepatan 3 000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan
kembali dengan penambahan buffer TB 41,25 l TB (0.5 x volume larutan biakan). Setelah benarbenar tersuspensikan kemudian ditambah 60 l DMSO dan diinkubasi di dalam es selama 10
menit sehingga diperoleh suspensi sel bakteri kompeten. Sebanyak 50 l suspensi sel kompeten
ditambah dengan 10 l (50-100 ng) produk ligasi kemudian diinduksi dalam es selama 20-25
menit. Selanjutnya diberi perlakukaan kejutan panas 42 0C selama 45 detik dan segera dimasukan
kembali ke dalam es selam 5 menit. Kemudian ditambah 100 l media YT (Yeast Tripton) (16 g/l
bakto tripton, 10 g/l bakto ekstrak khamir, 5 g/l NaCl, pH 7.0). Setelah diinkubasi dalam
inkubator bergoyang pada suhu 37 0C selama 20 menit, suspensi tersebut disebar secara merata
pada media LB padat yang mengandung 100 mg/l ampisilin dan 10 l 100 mM IPTG (Isopropiltioβ-galaktosida) serta 50 l 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3-indoly-β-D-galactoside),
kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama semalam.
Seleksi E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan
E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi berdasarkan warna koloninya.
Koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung ampisilin tersebut berpotensi sebagai
koloni yang mengandung vektor rekombinan. Adanya sisipan gen GST12 di dalam plasmid
rekombinan yang terdapat dalam koloni putih dideteksi secara cepat dengan melakukan PCR
koloni. Pada PCR tersebut, sejumlah kecil koloni bakteri putih digunakan sebagai bagian dari
campuran di dalam tabung PCR. Lisis sel bakteri untuk menghasilkan DNA cetakan terjadi di
dalam tabung PCR. Untuk itu, koloni putih diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril
kemudian disuspensikan ke dalam tabung PCR yang telah berisi 6.5 l ddH2O. Kemudian tusuk
gigi tersebut dioleskan pada media LA (Lauria agar) (1 g/l bakto tripton, 0.5 g/l bakto ekstrak
khamir, 1 g/l NaCl, Agar 25g/l) + ampisilin (50 g/ml) sebagai replika koloni. Selanjutnya pada
suspensi ditambah campuran PCR (komposisi dan kondisi PCR sama dengan tahap penentuan
kosentrasi gen GST12 dari stok cDNA). Selanjutnya campuran dalam tabung PCR dipanaskan
pada suhu 95 0C selama 10 menit dan diinkubasi pada suhu 15 0C selama 5 menit, kemudian
diamplifikasi dengan mesin PCR.
Analisis gen sisipan
Plasmid pGEM®-T Easy rekombinan di dalam E. coli DH5α di isolasi dengan mengikuti
prosedur Suharsono (2002). Satu koloni E. coli DH5α ditumbuhkan dalam 30 ml LB yang
ditambah dengan 60 l ampisilin (50 g/ml) pada inkubator bergoyang (250 rpm) selama 16 jam
pada suhu 37 0C. Kultur bakteri dimasukan ke dalam tabung falkon 15 ml, kemudian disentrifugasi
(Jouan BR-4i) pada suhu 4 0C dengan kecepatan 4 000 rpm selama 10-15 menit. Endapan
ditambah dengan 600 l larutan buffer suspensi sel (50 mM Tri-HCl pH 7.5 dan 10 mM EDTA).
Suspensi sel ditambah dengan 400 l buffer lisis (0.2 M NaOH dan 1% SDS) dan dibolak-balik
11
secara perlahan beberapa kali kemudian segera ditambah dengan 400 l larutan buffer netralisasi
(1.32 M natrium asetat pH 4.8), divorteks dan disentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan 10
000 rpm selama 10 menit. Supernatan diekstrak dengan penambahan PCI (fenol-kloroformisoamilalkohol dengan perbandingan 25:24:1) sebanyak 1x volume supernatan. Kemudian
divorteks dan disentrifugasi pada suhu 20 0C dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit. Fase
jernih (bagian di atas PCI) diendapkan dengan penambahan natrium asetat 2 M pH 5.2 sebanyak
0.1x volume dan etanol absolut sebanyak 2x volume awal (fase jernih). Larutan diinkubasi pada
suhu -20 0C selama 2 jam kemudian diendapkan dengan sentrifugasi 10 000 rpm pada suhu 4 0C
selama 25 menit. Endapan (DNA plasmid) dibilas dengan menggunakan alkohol 70% (v/v) dengan
bantuan sentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Endapan dikeringkan dan
disuspensikan dengan ddH2O. Suspensi DNA palsmid ditambah RNAse (100 g/ml) sebanyak 0.1
x volume suspensi dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama semalam. Kemudian ditambah dengan
ddH2O hingga volume akhir menjadi 500 l. Plasmid hasil isolasi tersebut akan digunakan sebagai
cetakan PCR untuk mendapatkan gen LGST12 dan SGST12 yang digunakan dalam analisis
selanjutnya.
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA
Pengurutan DNA (DNA sequencing) dilakukan menggunakan DNA sequencer ABI PRISM
310 Genetic Analyzer Urutan nukleotida dari gen GST12 dianalisis kemiripan dan homologinya
dengan
gen
GST12
lainnya
dengan
menggunakan
program
BLAST2(Basic_Local_Alignment_Search_Tools) (http://www.ebiac.uk/blast2). Analisis kesamaan
dan filogenetik berdasarkan deduksi asam amino GST12 dari spesies lain dilakukan dengan
menggunakan program MAFFT (Multiple Alignment Fast Fourier Transform) ver.5.8 (Katoh et al.
2005). Analisis daerah terkonservasi dan domain dilakukan dengan menggunakan program
conserved domain NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Konfirmasi GST 12 dari Stok cDNA
Konfirmasi keberadaan GST12 dari stok cDNA dan produk PCR dari penelitian sebelumnya
(Mashuda 2006; Sawitri 2007) dengan menggunakan primer spesifik GST12 (AF243367)
menunjukan hasil positif, ukuran pita yang diperoleh sekitar 720 pb (Gambar 1).
M M 1 M2 1
M M 1 M2 1 2
720pb
(a)
(b)
Gambar 2 cDNA LGST12 (a); cDNA SGST12 (b). 1= LGST12 berukuran sekitar 720 pb, 2=
SGST12 berukuran sekitar 720 pb. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. M= 50
ng; M1= 100 ng; M2= Marker 100 bp (RBC) Tanda panah: gen GST12
Pengklonan gen GST12
Setelah amplikon GST12 diligasikan dengan plasmid pGEM®-T Easy dan kemudian
diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α serta diinkubasi overnight, dijumpai dua jenis koloni yaitu
koloni putih dan biru.
Koloni
putih
Koloni
biru
12
Gambar 3 Penampilan koloni E. coli DH5α yang diduga membawa plasmid rekombinan (koloni
putih) pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG)
PCR koloni dilakukan untuk memastikan adanya sisipan amplikon di dalam beberapa koloni
E. coli putih yang tumbuh pada media seleksi. Koloni putih yang produk PCR-nya berupa
amplikon yang berukuran sama dengan hasil konfirmasi keberadaan GST12 sebelum-nya yaitu
sekitar 720 pb akan dipilih sebagai koloni yang akan digunakan pada proses analisi selanjutnya
(Gambar 4).
M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4 5 6
720 pb
(a)
(b)
Gambar 4 PCR koloni putih E. coli yang membawa GST12. Elektroforesis pada 1.5% (b/v)
agarosa. Kultivar Lumut: dari 5 koloni putih hanya dijumpai 1 koloni positif
pembawa plasmid rekombinan (a); kultivar Slamet: dari 6 koloni putih dijumpai 5
koloni positif pembawa plasmid rekombinan (b). M= Marker 100 bp (RBC). Tanda
panah: gen GST12
DNA plasmid rekombinan telah diisolasi dari koloni putih yang terpilih melalui PCR koloni.
Keberadaan amplikon sisipan kembali dipastikan dengan PCR menggunakan plasmid hasil isolasi
sebagai cetakan. Hasil elektroforesis menunjukkan hal yang sama dengan elektroforesis hasil PCR
koloni (Gambar 4) yaitu menunjukkan amplikon yang berukuran sekitar 720 pb (Gambar 5).
M
1
M1 1
2
plasmid
720 pb
13
(a)
(b)
Gambar 6 Penjajaran (alignment) asam amino LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max (AF243367)
Keterangan: Size = 12 sequences × 76 sites; Method = NJ ÆConserved sites (76 aa) with un-rooted tree ; Model = JTT ;
Alpha = ∞; Bootstrap re-sampling = 100 (50-1000)Æ The number of sequences must be LGST12
CCATAGCAAT
GGCAGAGCAA
TCCTACACGG
GACAAGGTGA
GATGTGGGCC
AGCCCTTATG
CCAAGAGGGT
GGGATTGGCC
CTTAATTTTA
AGGGCATACC
CTATGAGTAT
GTTGAAGAAG
ACTTGAGAAA
TAAGAGTGAT
TTGCTTCTAA
AGTACAACCC
TGTTCACAAG
AAGGTTCCTG
TACTATGTTC
ATATATGGAA
AAGGCCATTG
CTGAATCCAT
GGTGATCCTT
GAGTATATAT
TGAATGGAAA
CCATGGAATT
ATTTTAAAAA
CGACCCCAAG
TTTTGTTTTT
TGGTTTTCAT
TTTTCCCAGG
ATCAGTTAAT
TGGGAGAGCA
CTTTTTTAGT
AGTCAAAACT
GATGGGAGAA
GCCCCAACCA
AAAGGCCCAT
TGTCCACCTT
GTATGAGAAA
ACTGAAAGTG
GCTAGAAGGA
TGGGAAGGAA
GGCCCTTTCT
GGGAGAGGGC
AATGCTATTA
TCTCTGGGTG
TTGAAAAACA
ACTTAGGAAT
CCTTGACGTG
TATGTGCTTT
TATATGGTGC
CTACAAGGCT
CATGACAGAT
ATTGGCCTCA
AGTTCATAGT
GCCAGAAAAG
TTTTCCCTGT
GTTGTCTTCT
TGGTTGATGG
CTATTGCTGA
GGTTGACAGC
GTGTGCAAAT
TGCAACTCCT
CCACATGAAA
AAACAGTGGG
AACTCTTCAG
TTGTTCACAG
GCTGTCTGCA
CTCTGAATCT
CTCTGCCACA GAATGAAAAA TG
>SGST12
20
CCATAGCAAT
GGCAGAGCAA
MTMAEQDKVI
LHGMWASPYA
GACAAGGTGA
TCCTACACGG 61 KRVGLALNFK
GIPYEYVEED
GACGTGGTCC
AGCCCTTATG 121LRNKSDLLLK
YNPVHKKVPV
CCAAGAGGGT
GGGATTGGCC 181 LCSYMEKAIA
ESMVILEYIL
CTTAATTTTA
AGGGCATACC
NGNHGIILKT
TPSFVFWFSF
CTATGAGTAT
GTTGAAGAAG
FPGSVNWEST
FLVVKTDGRS
ACTTGAGAAA
TAAGAGTGAT
PNQKAHCPPC
MRKLKVARRM
TTGCTTCTAA
AGTACAACCC
GRKALSGRGQ
CYYLWVLKNN
TGTTCACAAG
AAGGTTCCTG
LGILDVYVLL
YGAYKAHDRY
TACTTGTTCA
TAATGGAAAG
WPQVHSARKV
FPVLSSWLMA
GCCATTGCTG
AATCCCATGG
IAEVDSVCKL
QLLHMKKQWE
TGATCCTTTG
AGTTATATTG
LFSCSQAVCT LNLSATE
ATGAAGACAT
GGAAAGATGG
ATCCTAAACT
GCTTCCAAGT
>aaSGST12
GATTCTTAAC
AAACGAGGGC 1 MTMAEQDKVI
LHGTWSSPYA
CATCGATTTA
TGGATGTTAT
GIPYEYVEED
Keterangan: ATG: Penyandi kodon
AWAL (Metionin);
TGA: Penyandi kodon STOP;
61 KRVGLALNFK
ATTCTATCCA
TGGATCAACT
LRNKSDLLLK
YNPVHKKVPV
121
(Primer
GST12F)
AAGGGGACAA
GCCTTTTTCT
LVHNGKAIAE(Primer GST12R) SHGDPLSYID
181
ATAATCCTGA
TGGAGAAGCA
EDMERWILNC
FQVILNKRGP
CAACAAAAGG
CCATTGACCA
SIYGCYILSM
DQLRGQAFFY
CGTGTATGAG
AAACTGAAAG
NPDGEAQQKA
IDHVYEKLKV
TGCTAGAAGA
TGGAATGAAG
LEDGMKTYLG
EGNAVLKTTL
ACCTATCTGG
GAGAGGGCAA
ESLTLCFVLY
MVPTRLMKKL
TGCGGTGTTG
AAAACAACTT
LAFKFIVPEK
FPVLSFLVDG
TGGAATCCTT
GACATTGTGT
YCMRFEAVKI
ATPPHEKTVG
TTTGTGCTTT
ATATGGTGCC
ILQLFRLSAL KSSSATE
TACAAGGCTC
ATGAAGAAGT
TATTGGCCTT
CAAGTTCATA
GTGCCAGAAA
AGTTTCCTGT
GTTGTCTTTC
TTGGTTGATG
GCTATTGCAT
GAGGTTTGAA
GCTGTGAAAA
TTGCAACTCC
TCCACATGAA
AAAACAGTGG
GAATTCTTCA
GTTGTTCAGG
CTGTCTGCAC
TGAAATCTTC
TTCTGCCACA GAATGATATA TA
Lampiran 3 Asam amino hasil terjemahan
sekuen GST12 Glycine max
(AF243367),
LGST12
dan
SGST12 menggunakan program
expasy translate tool
>aaGST12
GMWASPYAKR
1 MAEQDKVILH
PYEYVEEDLR
61 VELALNFKGI
PVHKKVPVLV
121 NKSDLLLKYN
181 HNGKAIAESM
VILEYIDETW
KDGPKLLPSD
SYKRAQARFW
CHFIQDQLME
STFLVVKTDG
EAQQKAIDHV
YEKLKVLEDG
MKTYLGEGNA
IISGVENNFG
ILDIVFCALY
GAYKAHEEVI
GLKFIVPEKF
PVLFSWLMAI
AEVEAVKIAT
PPHEKTVGIL
QLFRLSALKS SSATE
>aaLGST
1
21
1
PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN GST12 DARI
KEDELAI KULTIVAR LUMUT DAN SLAMET
Oleh:
Syahnada Jaya Sy
G34102011
DEPARTMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
2
ABSTRAK
SYAHNADA JAYA SY. Pengklonan dan Karakterisasi gen GST12 dari Kedelai Kultivar Lumut
dan Slamet. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
GST12 diketahui sebagai salah satu gen yang berperan dalam respon ketahanan terhadap
cekaman Alumunium (Al). cDNA LGST12 dan SGST12 telah berhasil diisolasi dari akar tanaman
kedelai kultivar Lumut dan Slamet. Hasil penelitian sebelumnya diketahui bahwa pada kultur air
pH rendah dan Al tinggi LGST12 tidak terinduksi sedangkan SGST12 terinduksi. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi kedua gen tersebut sebagai langkah awal eksplorasi dan isolasi
gen. cDNA kedua kultivar telah dicek keberadaannya kemudian diklon ke dalam pGEM®-T easy.
Plasmid rekombinan dalam Escherichia coli galur DH5 telah berhasil diperoleh. Pengurutan
cDNA LGST12 dan SGST12 dengan DNA sekuenser ABI Prism Model 310 yang masing-masing
menghasilkan 722 pb dan menyandikan 237 asam amino. Analisis kesejajaran lokal kedua cDNA
terhadap bagian GST12 (AF243367) yang berada di GenBank menunjukan persentase kesamaan
sebesar 85 % untuk LGST12 dan 92 % untuk SGST12 dengan Score Bits secara berurutan 908 dan
1146 dan E-value kedua cDNA tersebut 0 (nol). Hasil penelusuran daerah asam amino
terkonservasi menunjukkan bahwa cDNA GST12 memiliki daerah domain asam amino
terkonservasi GST tipe GST_N_Tau sedangkan cDNA SGST12 selain memiliki daerah domain
asam amino terkonservasi GST_N_Tau juga memiliki daerah domain asam amino terkonservasi
GST_C_Tau. Berdasarkan penjajajaran asam amino cDNA LGST12 dan SGST12 terhadap GST12
dari beberapa spesi
PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN GST12 DARI
KEDELAI KULTIVAR LUMUT DAN SLAMET
Oleh:
Syahnada Jaya Sy
G34102011
DEPARTMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
2
ABSTRAK
SYAHNADA JAYA SY. Pengklonan dan Karakterisasi gen GST12 dari Kedelai Kultivar Lumut
dan Slamet. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
GST12 diketahui sebagai salah satu gen yang berperan dalam respon ketahanan terhadap
cekaman Alumunium (Al). cDNA LGST12 dan SGST12 telah berhasil diisolasi dari akar tanaman
kedelai kultivar Lumut dan Slamet. Hasil penelitian sebelumnya diketahui bahwa pada kultur air
pH rendah dan Al tinggi LGST12 tidak terinduksi sedangkan SGST12 terinduksi. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi kedua gen tersebut sebagai langkah awal eksplorasi dan isolasi
gen. cDNA kedua kultivar telah dicek keberadaannya kemudian diklon ke dalam pGEM®-T easy.
Plasmid rekombinan dalam Escherichia coli galur DH5 telah berhasil diperoleh. Pengurutan
cDNA LGST12 dan SGST12 dengan DNA sekuenser ABI Prism Model 310 yang masing-masing
menghasilkan 722 pb dan menyandikan 237 asam amino. Analisis kesejajaran lokal kedua cDNA
terhadap bagian GST12 (AF243367) yang berada di GenBank menunjukan persentase kesamaan
sebesar 85 % untuk LGST12 dan 92 % untuk SGST12 dengan Score Bits secara berurutan 908 dan
1146 dan E-value kedua cDNA tersebut 0 (nol). Hasil penelusuran daerah asam amino
terkonservasi menunjukkan bahwa cDNA GST12 memiliki daerah domain asam amino
terkonservasi GST tipe GST_N_Tau sedangkan cDNA SGST12 selain memiliki daerah domain
asam amino terkonservasi GST_N_Tau juga memiliki daerah domain asam amino terkonservasi
GST_C_Tau. Berdasarkan penjajajaran asam amino cDNA LGST12 dan SGST12 terhadap GST12
dari beberapa spesies menggunakan MAFFT v6. 500a diperoleh pohon filogenetik yang
menunjukkan kedekatan kekerabatan kedua cDNA terhadap GST12 dari Glycine max (AF243367).
ABSTRACT
SYAHNADA JAYA SY. Cloning and Characterization of GST12 Gene from Soybean Lumut
Cultivar and Slamet. Supervised by UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO and ARIS
TJAHJOLEKSONO.
GST12 is one of genes that has important role in Aluminum (Al) stress. cDNA LGST12 and
SGST12 are already isolated from soybean root of Lumut cultivar (cv.) and Slamet. The recent
research reported that LGST12 was not induced and SGST12 was induced by low pH and Al
stressed water culture system. The objection of this research is to characterize GST12 genes from
Lumut cv. and Slamet soybean which have difference response against both of stress. Both of
cDNA were re-confirmed by specific primers PCR. Thus, The PCR products are inserted into
pGEM®-T easy and the plasmid was successfully introduced into E. coli DH5. Sequencing of
LGST12 and SGST12 by using ABI Prism 310 automated DNA sequencer showed that LGST12
and SGST12 have 722 base pairs encoding 237 amino acids. Basic local alignment analysis based
on nucleotide with other GST12 from GenBank showed that LGST12 is 85 % identical and
SGST12 is 92% identical to part of GST12 from Glycine max (AF243367) with bit score 908 and
1146 respectively, and E-value is 0 (zero). LGST12 has big similarity with GST_N_Tau
conserved domain type only, however cDNA SGST12 does not only has big similarity on
GST_N_Tau, but it also has big similarity on GST_C_Tau conserved domain type. The amino
acids alignment analysis is used for comparing the sequences with some species using the MAFFT
v6 500a was constructed phylogenetic tree. It showed nearest family relationship among both of
cDNA to part of GST12 from Glycine max (AF243367).
3
PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN GST12 DARI
KEDELAI KULTIVAR LUMUT DAN SLAMET
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Oleh :
Syahnada Jaya Sy
G34102011
DEPARTMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
4
Judul Skripsi
: Pengklonan dan Karakterisasi Gen GST12 dari Kedelai
Kultivar Lumut dan Slamet
: Syahnada Jaya Sy
: G34102011
Nama
NIM
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono
NIP 131851279
Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA
NIP131664392
Mengetahui :
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
5
PRAKATA
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis sampaikan kepada Allah SWT karena hanya dengan
rahmat, hidayah dan izin-Nya skripsi ini dapat diselesaikan. Penelitian dilakukan mulai bulan
Februari 2006 sampai Mei 2007, di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research IndonesiaThe Netherlands), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB (PPSHB-IPB),
Kampus IPB Darmaga, Bogor.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Utut Widyastuti, MSi. dan Dr. Aris
Tjahjoleksono, DEA. selaku pembimbing yang telah memberi arahan, bantuan dan waktu selama
penelitian. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi. atas masukan
untuk perbaikan karya ilmiah ini dan Dr. Suharsono DEA, selaku kepala PPSHB-IPB yang telah
memberikan kesempatan untuk melakukan penelitian di lab BIORIN serta kepada seluruh staf dan
karyawan atas bantuan yang telah diberikan selama penulis melakukan penelitian. Terima kasih
kepada pak Mulya dan mbak Pepi yang telah turut memberikan arahan dan bantuan selama di
laboratorium.
Ungkapan terima kasih dan rasa hormat yang mendalam juga penulis sampaikan kepada
keluarga besar Abu Senin dan Djamaluddin tercinta: Bapak Syaifullah AS, Ibu Adna Huda
Djamal, Kak Syafrianto Sy dan keluarga, Ayuk Syafrida Sy, S E. Ak dan keluarga. dan Ayuk
Syafrianti Sy, Spd I yang selalu memberikan doa, bantuan, perhatian dan kasih sayang. Juga
kepada para sahabat yang selalu memberi inspirasi dan semangat: Rafli, Odan, Dwi, Kakak yang
selalu mememberi inspirasi dan penyedia jurnal yang sedang berjuang di negeri orang (Bro Fadly
(Korsel-SNU), Abang (Finlandia-Erasmus Mundus), Mas Aqil (Australia), Mas Jaya (JermanErasmus Mundus), Mas Anuraga (Jerman-DAAD), Bro Marwan (Italia-Bologa), Uda Reflinur
(Korsel-SNU) teman-teman SR dan BPA angkatan 2004-2005, teman-teman BEM TPB 2002,
teman-teman Natrium, teman-teman PA 2004, teman-teman Biologi 39, teman-teman Al-izzah,
Kodama-kun, Romone, Kenji-kun, Amirouche, Khalid, Haidir serta adik-adik asrama TPB
angkatan 2004/05 dan 2005/06, juga ditujukan kepada teman-teman kelompok penelitian padi dan
penyakit blast (Mbak Ela, Mbak Rina, Nindya, Dona, Zahro), Melastoma (Uzy, Mas Firda, Mas
Yasier, Mbak Ulfa, Mbak Agustin, Mbak Zendi, Pak Hadi, Mbak Ratna), Kedelai (Mas Huda,
Mbak Muti, Mbak Kiki, Mbah, Ibu Seh), keragaman Jarak dan Nanas (Ibu Panca dan Ibu Puji) dan
Kultur jaringan Cabai, Kedelai dan Kelapa Sawit (Mbak Budi, Hakiim, Popi, Ammay, Sari) serta
para kandidat Doktor (Pak Muzuni, Ibu Sri Lis, Mbak Hanum, Pak Ulung) yang telah meluangkan
waktunya untuk saling menasehati, diskusi sehingga penelitian ini menyenangkan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2007
Syahnada Jaya Sy
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kabupaten Rejang Lebong, Provinsi Bengkulu pada tanggal 16 Juli
1983 dari ayah Syaifullah AS dan ibu Adna Huda Djamal. Penulis merupakan putra keempat dari
empat bersaudara.
Pada tahun 2002 penulis lulus dari SMU I Curup Bengkulu. Pada tahun yang sama penulis
diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut
Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
Pada tahun ajaran 2002/2003 penulis aktif di kelembagaan Badan Eksekutif Mahasiswa
Tingkat Persiapan Bersama (BEM-TPB) sebagai sekretaris umum dan kelembagaan Asrama TPBIPB. Penulis dipercaya menjadi ketua penyambutan mahasiswa baru tingkat IPB pada tahun ajaran
2003/2004 serta ketua penyambutan mahasiswa baru tingkat Departemen Biologi pada tahun
2004/2005. Penulis mendapat beasiswa kerja Senior Residence asrama TPB-IPB selama dua
periode pada tahun ajaran 2004/2005 dan 2005/2006. Penulis sekarang aktif di yayasn Bulan Sabit
Merah Indonesia (BSMI) cabang Bogor. Penulis pernah menjadi finalis presentasi dan poster
dalam ajang kompetisi Pekan Ilmiah Mahasiswa Nasional XIX (PIMNAS) Malang untuk kategori
Program Kreatifitas Mahasiswa Teknologi (PKM-T). Selain itu penulis juga aktif mengikuti
berbagai pelatihan ilmiah dan kepemimpinan. Pada bulan Juni-Agustus 2005 penulis
melaksanakan praktik lapang dengan judul Pembenihan Ikan Bawal Air Tawar (Colossoma
macropomum) Di PT Agung Fish Farm Kecamatan Cibungbulang, Kabupaten Bogor. Pada tahun
2004/2005 penulis aktif sebagai asiten Biologi Dasar untuk mahasiswa TPB dan Genetika Dasar
pada semester ganjil tahun ajaran 2006/2007 untuk mahasiswa Biokimia serta matrikulasi
mahasiswa pasca sarjana Beasiswa Utusan Daerah (BUD) Departemen Agama (DEPAG) pada
tahun ajaran 2007/2008.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................................... vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................................................. 1
Tujuan ................................................................................................................................ 1
BAHAN METODE
Waktu dan tempat ............................................................................................................
Bahan ................................................................................................................................
Metode ..............................................................................................................................
Penentuan Konsentrasi gen GST12 dari Stok Produk PCR ....................................
Pengklonan GST12...................................................................................................
Seleksi E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan .................................
Analisis gen sisipan..................................................................................................
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA ............................................................
2
2
2
2
2
3
3
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil .................................................................................................................................
Konfirmasi GST12 dari Stok cDNA ........................................................................
Pengklonan GST12...................................................................................................
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA ............................................................
Pembahasan .....................................................................................................................
4
4
4
6
6
SIMPULAN .................................................................................................... 8
SARAN................................. ........................................................................... 8
7
UCAPAN TERIMA KASIH ............................................................................ 8
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 8
LAMPIRAN .................................................................................................... 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
Peta fisik plasmid pGEM®-T Easy yang digunakan sebagai vektor pengklonan ........... 2
cDNA LGST12 (a); cDNA SGST12 (b). 1= LGST12 berukuran sekitar 720 pb, 2= SGST
12 berukuran sekitar 720 pb. Elektroforesis pada 1.5 % (b/v) agarosa. M= 50 ng; M1=
100 ng; M2= marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 ....................................... 4
Penampilan koloni E. coli DH5 yang diduga membawa plasmid rekombinan (koloni putih)
pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG) .............................................................. 4
PCR koloni putih E. coli yang membawa GST12. Elektroforesis pada 1.5 % (b/v) agarosa.
Kultivar Lumut: dari 5 koloni putih hanya dijumpai 1 koloni positif pembawa plasmid
rekombinan (a); kultivar Slamet: dari 6 koloni putih dijumpai 5 koloni positif pembawa
plasmid rekombinan (b). M= Marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 .............. 4
Elektroforesis plasmid utuh rekombinan (a). Elektroforesis produk PCR GST12 dari plasmid
utuh rekombinan (b). 1= LGST12, 2= SGST12. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. M=
Marker 50 ng; M1= Marker 100 bp (RBC). Tanda panah: gen GST12 ......................... 4
Penjajaran (alignment) asam amino LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max
(AF243367) ........................................................................................................................ 5
Pohon filogenetik berdasarkan urutan asam amino GST dari berbagai spesies ................ 5
Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max (AF243367) dari GenBank ....................................................... 6
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Output sekuensing dengan menggunakan mesin sekuensing ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer ...............................................................................................................................
2 Hasil sekuensing dua arah menggunakan primer GST12F dan GST12R menghasilkan
urutan nukleotida GST12 Glycine max (AF243367), cDNA LGST12 dan SGST12 lengkap mengandung kodon ATG dan TGA ..............................................................................
3 Asam amino hasil penerjemahan sekuen GST12 Glycine max (AF243367), LGST12
dan SGST12 menggunakan program expasy translate tool .................................................
11
15
16
8
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kedelai merupakan salah satu komoditi palawija yang digunakan secara luas di Indonesia
sebagai sumber protein nabati. Produksi kedelai tahun 2006 (angka sementara) sekitar 749.04 ribu
ton biji kering, mengalami penurunan sekitar 59.32 ribu ton (7.34 %) dibandingkan dengan
produksi tahun 2005 (BPS 2006). Penurunan produksi kedelai tersebut menurut BPS (2006)
disebabkan oleh adanya penyusutan luas panen dan penurunan produktivitas tanaman kedelai.
Luas panen kedelai tahun 2006 menurun 39.93 ribu hektar (6.42 %) dibandingkan dengan tahun
2005. Sementara produktivitas tahun 2006 turun sebesar 0.13 kuintal/hektar (1.00 %)
dibandingkan dengan tahun 2005. Bahkan pada tahun 2006 Indonesia mengimpor kedelai sebesar
1 370 000 ton (USDA 2007).
Usaha jangka panjang untuk mening-katkan produksi kedelai dapat dilakukan melalui
ekstensifikasi dan perbaikan genetik (Suharsono 2002). Ekstensifikasi telah lama dilakukan di
Indonesia, namun belum mem-berikan hasil yang memuaskan. Tanah asam menjadi salah satu
faktor penghambat ekstensifikasi. Menurut Mulyani et al. (2003), Indonesia masih memiliki lahan
potensial untuk perluasan areal tanam kedelai yang tersebar di Sumatera, Kalimantan, dan Papua.
Lahan seluas 18.2 juta hektar sebagian besar bersifat asam dengan kandungan Alumunium (Al)
tinggi sehingga masih belum dapat dimanfaatkan sebagai lahan produktif hingga diperolehnya
kultivar tanaman yang dapat tumbuh dengan baik pada jenis tanah tersebut.
Pada tanah asam (pH < 5) ion Al3+ men-jadi faktor penghambat pertumbuhan akar tanaman
kedelai sehingga mempengaruhi pertumbuhan kedelai secara keseluruhan (Kochian 1995,
Matsumoto 2000, Srimulyani 2007). Sifat racun ion-ion Al tersebut juga dapat berupa
penghambatan sintesis RNA (Matsumoto et al. 1997), peningkatan perok-sidasi fosfolipid dan
protein pada membran (Cakmak & Horst 1991, Yamamoto et al. 2001). Ion-ion Al juga
menyebabkan peng-hambatan influks ion Ca2+ sehingga meng-ganggu homeostatis Ca2+ pada
apeks akar (Rengel 1992).
Pada Arabidopsis thaliana salah satu gen yang berhubungan dengan sistem pertahanan
terhadap cekaman Al adalah gen GST yang menyandikan Glutathione S-Transferase (Richard et
al. 1998). Glutathione S-Transferase (GST) merupakan kelompok enzim sitoplasmik. Setiap sub
unit GST merupakan suatu dimerik dengan massa molekul sekitar 24-30 kD. Gen GST dapat
dibagi menjadi tiga tipe berdasarkan kemiripan sekuennya yaitu GmGST (Glycine max Glutathione
S-transferase) tipe I, GmGST tipe II dan GmGST tipe III (Droog et al. 1995; Board et al. 1997;
McGonigle et al. 2000). GmGST tipe III atau kelas Tau (Hock & Elstner 2005) memiliki anggota
paling besar dimana GmGST 12 termasuk dalam kelas ini. Berdasarkan hasil uji Expressed
Sequence Taq (EST) diketahui bahwa GmGST tipe III diekspresikan paling melimpah di bagian
akar dan daun kedelai dibandingkan dengan GmGST tipe I dan II (McGonigle et al. 2000).
Pada mamalia dan beberapa tanaman, gen GST ditemukan berperan dalam detoksifikasi
metabolit yang disebabkan oleh cekaman oksidatif melalui peredaman molekul-molekul reaktif
dengan menambah-kan GSH (Wilce et al. 1994; Sheehan et al. 2001). GST juga terlibat dalam
menanggapi berbagai cekaman kimia dan berperan dalam sistem antioksidasi (Ulmasov et al.
1995). Selain fungsi endogenous tersebut, GST juga memiliki peran penting dalam proses
detoksifikasi herbisida yang sebagian besar merupakan kelompok senyawa-senyawa xenobiotik
(Dixon et al. 1998).
cDNA GST12 kedelai kultivar (var.) Lumut yang bersifat peka (Sunarto 1995) dan var.
Slamet yang bersifat toleran terhadap cekaman Al (Jusuf et al. 1999) telah berhasil diisolasi dari
bagian akar. Kedua var. tesebut memiliki pola ekpsresi GST12 yang berbeda selama diberi
perlakuan cekaman Al dan pH rendah di dalam kultur air (Mashuda 2006; Sawitri 2007). LGST12
(gen GST12 yang diisolasi dari akar kedelai var. Lumut) diinduksi pada jam ke-8 hingga jam ke-72
dalam semua jenis cekaman Al (Mashuda 2006), sedangkan SGST12 (gen GST12 yang diisolasi
dari akar kedelai var. Slamet) tidak terinduksi (Sawitri 2007). Oleh karena itu untuk melihat lebih
jauh perbedaan yang ada pada gen GST12 dari kedua var. Lumut dan Slamet perlu dilakukan
pengklonan dan karakterisasi.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi gen GST12 dari tanaman kedelai yang memiliki
respon berbeda terhadap cekaman Al.
9
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai Februari 2006 sampai dengan Mei 2007 di laborato-rium
Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands (BIORIN) dan Genetika Molekular dan
Selular Tanaman (GMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB
Darmaga.
BAHAN
Produk PCR LGST12 (gen GST12 yang diisolasi dari akar kedelai var. Lumut) (Sawitri 2007)
dan produk PCR serta cDNA SGST12 (gen GST12 yang diisolasi dari akar kedelai var. Slamet)
(Mashuda 2006) yang keduanya diisolasi dari akar kedelai yang ditumbuhkan pada kultur air.
Plasmid pGEM®-T Easy (Gambar 1) (Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan dan E. coli
galur DH5α sebagai inang vektor rekombinan.
Gambar 1 Peta fisik plasmid pGEM®-T Easy yang digunakan sebagai vektor pengklonan
Primer spesifik gen GST12 didesain berdasarkan GST12 (AF243367). Primer forward
(GST12F) dari gen GST12 terletak pada 8 nukleotida sebelum kodon awal
(5’CCATAGCAATGGCAGAGCAAG3’) dan primer reverse (GST12R) terletak pada 11
nukleotida sebelum kodon akhir sampai 6 nukleotida setelah kodon akhir (5’TATATATCATTCTGTGGCAG3’) (Lampiran 2) digunakan sebagai alat verifikasi keberadaan gen
GST12 dari stok cDNA yang tersedia.
Metode
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu penentuan kosentrasi gen GST12 dari stok
cDNA. Pengklonan gen GST12 ke dalam plasmid pGEM®-T Easy, transformasi genetik E. coli
DH5α dengan vektor rekombinan, analisis urutan nukleotida, dan deduksi asam amino.
Penentuan Konsentrasi gen GST12 dari Stok Produk PCR
cDNA LGST12 dan cDNA SGST12 digunakan sebagai cetakan PCR untuk konfirmasi
keberadaan gen GST12. Komposisi PCR adalah 0.5 l cDNA LGST12 dan SGST12 (stok di lab
BIORIN), 1 l 10x buffer Taq, 0.1 mM dNTP, 10 pmol primer GST12F, 10 pmol primer GST12R,
4% DMSO (Dimethyl Sulfoxide), 1 U enzim Taq DNA polymerase (Gen Scr Inc.) dan ddH2O
hingga volume akhir mencapai 10 l. Kondisi PCR yang digunakan adalah 95 0C selama 5 menit
untuk pra-PCR. Siklus PCR dilakukan sebanyak 37 kali dimulai dengan denaturasi pada suhu 94
0
C selama 30 detik, penempelan primer LGST12 55 0C selama 30 detik (52 0C untuk primer
SGST12), pemanjangan 72 0C selama 2 menit. Kemudian dilanjutkan dengan pasca-PCR pada
suhu 72 0C selama 5 menit dan pendinginan dilakukan pada 15 0C selama 10 menit (Mashuda
2006; Sawitri 2007).
Pengklonan gen GST12
10
Pengklonan gen GST12 menggunakan prosedur promega (1996) yang dimodifikasi dengan
cara mencampurkan 5 l 2x buffer rapid ligasi, 1 l vektor pGEM®-T Easy (10 ng), 1 l T4 DNA
ligase (3 U/ l), dan 0.7 l (10 ng/ l) cDNA LGST12 (0.35 l (20ng/ l) cDNA SGST12).
Kemudian diinkubasi pada suhu 4 0C. Untuk mendapatkan hasil pengklonan yang optimal jumlah
insert (cDNA LGST12 atau SGST12) yang dibutuhkan dihitung dengan menggunakan rumus
berikut:
Jumlah insert (ng)=
vektor (ng) x ukuran insert (Kb)
×3/1
ukuran vektor (Kb)
Produk ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α melalui transformasi dengan
prosedur Suharsono (2002). Transformasi diawali dengan pembuatan bakteri kompeten dengan
membiakkan satu koloni E. coli DH5α dalam 2 ml LB (Lauria Broth) (1% (b/v) bakto tripton,
0.5% (b/v) bakto ekstrak khamir, 1% NaCl (b/v)) dan diinkubasi pada suhu 37 0C dan digoyang
dengan kecepatan 250 rpm selama semalam di dalam inkubator bergoyang, ES-20 (Biosan).
Kemudian sebanyak 100 l E. coli DH5α disubkulturkan dalam 30 ml LB dengan kondisi yang
sama hingga mencapai densitas bakteri 4-7 x 107 sel/ml (OD600 = 0.4-0.5). Sel bakteri dipanen
dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 3 000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit dengan
menggunakan tabung falkon 15 ml. Pelet yang diperoleh selanjutnya ditambahkan buffer
transformasi TB (Transformation Buffer) (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H20, 250 mM KCl, 55
mM MnCl2.4H2O, pH 6.7) sebanyak 0.033 x volume larutan biakan. Pelet diresuspensi dengan
menggunakan pipet dan diinkubasi dalam es selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan
kecepatan 3 000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan
kembali dengan penambahan buffer TB 41,25 l TB (0.5 x volume larutan biakan). Setelah benarbenar tersuspensikan kemudian ditambah 60 l DMSO dan diinkubasi di dalam es selama 10
menit sehingga diperoleh suspensi sel bakteri kompeten. Sebanyak 50 l suspensi sel kompeten
ditambah dengan 10 l (50-100 ng) produk ligasi kemudian diinduksi dalam es selama 20-25
menit. Selanjutnya diberi perlakukaan kejutan panas 42 0C selama 45 detik dan segera dimasukan
kembali ke dalam es selam 5 menit. Kemudian ditambah 100 l media YT (Yeast Tripton) (16 g/l
bakto tripton, 10 g/l bakto ekstrak khamir, 5 g/l NaCl, pH 7.0). Setelah diinkubasi dalam
inkubator bergoyang pada suhu 37 0C selama 20 menit, suspensi tersebut disebar secara merata
pada media LB padat yang mengandung 100 mg/l ampisilin dan 10 l 100 mM IPTG (Isopropiltioβ-galaktosida) serta 50 l 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3-indoly-β-D-galactoside),
kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama semalam.
Seleksi E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan
E. coli DH5α yang mengandung vektor rekombinan diseleksi berdasarkan warna koloninya.
Koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung ampisilin tersebut berpotensi sebagai
koloni yang mengandung vektor rekombinan. Adanya sisipan gen GST12 di dalam plasmid
rekombinan yang terdapat dalam koloni putih dideteksi secara cepat dengan melakukan PCR
koloni. Pada PCR tersebut, sejumlah kecil koloni bakteri putih digunakan sebagai bagian dari
campuran di dalam tabung PCR. Lisis sel bakteri untuk menghasilkan DNA cetakan terjadi di
dalam tabung PCR. Untuk itu, koloni putih diambil dengan menggunakan tusuk gigi steril
kemudian disuspensikan ke dalam tabung PCR yang telah berisi 6.5 l ddH2O. Kemudian tusuk
gigi tersebut dioleskan pada media LA (Lauria agar) (1 g/l bakto tripton, 0.5 g/l bakto ekstrak
khamir, 1 g/l NaCl, Agar 25g/l) + ampisilin (50 g/ml) sebagai replika koloni. Selanjutnya pada
suspensi ditambah campuran PCR (komposisi dan kondisi PCR sama dengan tahap penentuan
kosentrasi gen GST12 dari stok cDNA). Selanjutnya campuran dalam tabung PCR dipanaskan
pada suhu 95 0C selama 10 menit dan diinkubasi pada suhu 15 0C selama 5 menit, kemudian
diamplifikasi dengan mesin PCR.
Analisis gen sisipan
Plasmid pGEM®-T Easy rekombinan di dalam E. coli DH5α di isolasi dengan mengikuti
prosedur Suharsono (2002). Satu koloni E. coli DH5α ditumbuhkan dalam 30 ml LB yang
ditambah dengan 60 l ampisilin (50 g/ml) pada inkubator bergoyang (250 rpm) selama 16 jam
pada suhu 37 0C. Kultur bakteri dimasukan ke dalam tabung falkon 15 ml, kemudian disentrifugasi
(Jouan BR-4i) pada suhu 4 0C dengan kecepatan 4 000 rpm selama 10-15 menit. Endapan
ditambah dengan 600 l larutan buffer suspensi sel (50 mM Tri-HCl pH 7.5 dan 10 mM EDTA).
Suspensi sel ditambah dengan 400 l buffer lisis (0.2 M NaOH dan 1% SDS) dan dibolak-balik
11
secara perlahan beberapa kali kemudian segera ditambah dengan 400 l larutan buffer netralisasi
(1.32 M natrium asetat pH 4.8), divorteks dan disentrifugasi pada suhu 4 0C dengan kecepatan 10
000 rpm selama 10 menit. Supernatan diekstrak dengan penambahan PCI (fenol-kloroformisoamilalkohol dengan perbandingan 25:24:1) sebanyak 1x volume supernatan. Kemudian
divorteks dan disentrifugasi pada suhu 20 0C dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit. Fase
jernih (bagian di atas PCI) diendapkan dengan penambahan natrium asetat 2 M pH 5.2 sebanyak
0.1x volume dan etanol absolut sebanyak 2x volume awal (fase jernih). Larutan diinkubasi pada
suhu -20 0C selama 2 jam kemudian diendapkan dengan sentrifugasi 10 000 rpm pada suhu 4 0C
selama 25 menit. Endapan (DNA plasmid) dibilas dengan menggunakan alkohol 70% (v/v) dengan
bantuan sentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Endapan dikeringkan dan
disuspensikan dengan ddH2O. Suspensi DNA palsmid ditambah RNAse (100 g/ml) sebanyak 0.1
x volume suspensi dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama semalam. Kemudian ditambah dengan
ddH2O hingga volume akhir menjadi 500 l. Plasmid hasil isolasi tersebut akan digunakan sebagai
cetakan PCR untuk mendapatkan gen LGST12 dan SGST12 yang digunakan dalam analisis
selanjutnya.
Pengurutan DNA dan analisis urutan DNA
Pengurutan DNA (DNA sequencing) dilakukan menggunakan DNA sequencer ABI PRISM
310 Genetic Analyzer Urutan nukleotida dari gen GST12 dianalisis kemiripan dan homologinya
dengan
gen
GST12
lainnya
dengan
menggunakan
program
BLAST2(Basic_Local_Alignment_Search_Tools) (http://www.ebiac.uk/blast2). Analisis kesamaan
dan filogenetik berdasarkan deduksi asam amino GST12 dari spesies lain dilakukan dengan
menggunakan program MAFFT (Multiple Alignment Fast Fourier Transform) ver.5.8 (Katoh et al.
2005). Analisis daerah terkonservasi dan domain dilakukan dengan menggunakan program
conserved domain NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Konfirmasi GST 12 dari Stok cDNA
Konfirmasi keberadaan GST12 dari stok cDNA dan produk PCR dari penelitian sebelumnya
(Mashuda 2006; Sawitri 2007) dengan menggunakan primer spesifik GST12 (AF243367)
menunjukan hasil positif, ukuran pita yang diperoleh sekitar 720 pb (Gambar 1).
M M 1 M2 1
M M 1 M2 1 2
720pb
(a)
(b)
Gambar 2 cDNA LGST12 (a); cDNA SGST12 (b). 1= LGST12 berukuran sekitar 720 pb, 2=
SGST12 berukuran sekitar 720 pb. Elektroforesis pada 1.5% (b/v) agarosa. M= 50
ng; M1= 100 ng; M2= Marker 100 bp (RBC) Tanda panah: gen GST12
Pengklonan gen GST12
Setelah amplikon GST12 diligasikan dengan plasmid pGEM®-T Easy dan kemudian
diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α serta diinkubasi overnight, dijumpai dua jenis koloni yaitu
koloni putih dan biru.
Koloni
putih
Koloni
biru
12
Gambar 3 Penampilan koloni E. coli DH5α yang diduga membawa plasmid rekombinan (koloni
putih) pada media seleksi (ampisilin, X-gal, dan IPTG)
PCR koloni dilakukan untuk memastikan adanya sisipan amplikon di dalam beberapa koloni
E. coli putih yang tumbuh pada media seleksi. Koloni putih yang produk PCR-nya berupa
amplikon yang berukuran sama dengan hasil konfirmasi keberadaan GST12 sebelum-nya yaitu
sekitar 720 pb akan dipilih sebagai koloni yang akan digunakan pada proses analisi selanjutnya
(Gambar 4).
M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4 5 6
720 pb
(a)
(b)
Gambar 4 PCR koloni putih E. coli yang membawa GST12. Elektroforesis pada 1.5% (b/v)
agarosa. Kultivar Lumut: dari 5 koloni putih hanya dijumpai 1 koloni positif
pembawa plasmid rekombinan (a); kultivar Slamet: dari 6 koloni putih dijumpai 5
koloni positif pembawa plasmid rekombinan (b). M= Marker 100 bp (RBC). Tanda
panah: gen GST12
DNA plasmid rekombinan telah diisolasi dari koloni putih yang terpilih melalui PCR koloni.
Keberadaan amplikon sisipan kembali dipastikan dengan PCR menggunakan plasmid hasil isolasi
sebagai cetakan. Hasil elektroforesis menunjukkan hal yang sama dengan elektroforesis hasil PCR
koloni (Gambar 4) yaitu menunjukkan amplikon yang berukuran sekitar 720 pb (Gambar 5).
M
1
M1 1
2
plasmid
720 pb
13
(a)
(b)
Gambar 6 Penjajaran (alignment) asam amino LGST12 dan SGST12 terhadap GST12 Glycine max (AF243367)
Keterangan: Size = 12 sequences × 76 sites; Method = NJ ÆConserved sites (76 aa) with un-rooted tree ; Model = JTT ;
Alpha = ∞; Bootstrap re-sampling = 100 (50-1000)Æ The number of sequences must be LGST12
CCATAGCAAT
GGCAGAGCAA
TCCTACACGG
GACAAGGTGA
GATGTGGGCC
AGCCCTTATG
CCAAGAGGGT
GGGATTGGCC
CTTAATTTTA
AGGGCATACC
CTATGAGTAT
GTTGAAGAAG
ACTTGAGAAA
TAAGAGTGAT
TTGCTTCTAA
AGTACAACCC
TGTTCACAAG
AAGGTTCCTG
TACTATGTTC
ATATATGGAA
AAGGCCATTG
CTGAATCCAT
GGTGATCCTT
GAGTATATAT
TGAATGGAAA
CCATGGAATT
ATTTTAAAAA
CGACCCCAAG
TTTTGTTTTT
TGGTTTTCAT
TTTTCCCAGG
ATCAGTTAAT
TGGGAGAGCA
CTTTTTTAGT
AGTCAAAACT
GATGGGAGAA
GCCCCAACCA
AAAGGCCCAT
TGTCCACCTT
GTATGAGAAA
ACTGAAAGTG
GCTAGAAGGA
TGGGAAGGAA
GGCCCTTTCT
GGGAGAGGGC
AATGCTATTA
TCTCTGGGTG
TTGAAAAACA
ACTTAGGAAT
CCTTGACGTG
TATGTGCTTT
TATATGGTGC
CTACAAGGCT
CATGACAGAT
ATTGGCCTCA
AGTTCATAGT
GCCAGAAAAG
TTTTCCCTGT
GTTGTCTTCT
TGGTTGATGG
CTATTGCTGA
GGTTGACAGC
GTGTGCAAAT
TGCAACTCCT
CCACATGAAA
AAACAGTGGG
AACTCTTCAG
TTGTTCACAG
GCTGTCTGCA
CTCTGAATCT
CTCTGCCACA GAATGAAAAA TG
>SGST12
20
CCATAGCAAT
GGCAGAGCAA
MTMAEQDKVI
LHGMWASPYA
GACAAGGTGA
TCCTACACGG 61 KRVGLALNFK
GIPYEYVEED
GACGTGGTCC
AGCCCTTATG 121LRNKSDLLLK
YNPVHKKVPV
CCAAGAGGGT
GGGATTGGCC 181 LCSYMEKAIA
ESMVILEYIL
CTTAATTTTA
AGGGCATACC
NGNHGIILKT
TPSFVFWFSF
CTATGAGTAT
GTTGAAGAAG
FPGSVNWEST
FLVVKTDGRS
ACTTGAGAAA
TAAGAGTGAT
PNQKAHCPPC
MRKLKVARRM
TTGCTTCTAA
AGTACAACCC
GRKALSGRGQ
CYYLWVLKNN
TGTTCACAAG
AAGGTTCCTG
LGILDVYVLL
YGAYKAHDRY
TACTTGTTCA
TAATGGAAAG
WPQVHSARKV
FPVLSSWLMA
GCCATTGCTG
AATCCCATGG
IAEVDSVCKL
QLLHMKKQWE
TGATCCTTTG
AGTTATATTG
LFSCSQAVCT LNLSATE
ATGAAGACAT
GGAAAGATGG
ATCCTAAACT
GCTTCCAAGT
>aaSGST12
GATTCTTAAC
AAACGAGGGC 1 MTMAEQDKVI
LHGTWSSPYA
CATCGATTTA
TGGATGTTAT
GIPYEYVEED
Keterangan: ATG: Penyandi kodon
AWAL (Metionin);
TGA: Penyandi kodon STOP;
61 KRVGLALNFK
ATTCTATCCA
TGGATCAACT
LRNKSDLLLK
YNPVHKKVPV
121
(Primer
GST12F)
AAGGGGACAA
GCCTTTTTCT
LVHNGKAIAE(Primer GST12R) SHGDPLSYID
181
ATAATCCTGA
TGGAGAAGCA
EDMERWILNC
FQVILNKRGP
CAACAAAAGG
CCATTGACCA
SIYGCYILSM
DQLRGQAFFY
CGTGTATGAG
AAACTGAAAG
NPDGEAQQKA
IDHVYEKLKV
TGCTAGAAGA
TGGAATGAAG
LEDGMKTYLG
EGNAVLKTTL
ACCTATCTGG
GAGAGGGCAA
ESLTLCFVLY
MVPTRLMKKL
TGCGGTGTTG
AAAACAACTT
LAFKFIVPEK
FPVLSFLVDG
TGGAATCCTT
GACATTGTGT
YCMRFEAVKI
ATPPHEKTVG
TTTGTGCTTT
ATATGGTGCC
ILQLFRLSAL KSSSATE
TACAAGGCTC
ATGAAGAAGT
TATTGGCCTT
CAAGTTCATA
GTGCCAGAAA
AGTTTCCTGT
GTTGTCTTTC
TTGGTTGATG
GCTATTGCAT
GAGGTTTGAA
GCTGTGAAAA
TTGCAACTCC
TCCACATGAA
AAAACAGTGG
GAATTCTTCA
GTTGTTCAGG
CTGTCTGCAC
TGAAATCTTC
TTCTGCCACA GAATGATATA TA
Lampiran 3 Asam amino hasil terjemahan
sekuen GST12 Glycine max
(AF243367),
LGST12
dan
SGST12 menggunakan program
expasy translate tool
>aaGST12
GMWASPYAKR
1 MAEQDKVILH
PYEYVEEDLR
61 VELALNFKGI
PVHKKVPVLV
121 NKSDLLLKYN
181 HNGKAIAESM
VILEYIDETW
KDGPKLLPSD
SYKRAQARFW
CHFIQDQLME
STFLVVKTDG
EAQQKAIDHV
YEKLKVLEDG
MKTYLGEGNA
IISGVENNFG
ILDIVFCALY
GAYKAHEEVI
GLKFIVPEKF
PVLFSWLMAI
AEVEAVKIAT
PPHEKTVGIL
QLFRLSALKS SSATE
>aaLGST
1
21
1
PENGKLONAN DAN KARAKTERISASI GEN GST12 DARI
KEDELAI KULTIVAR LUMUT DAN SLAMET
Oleh:
Syahnada Jaya Sy
G34102011
DEPARTMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
2
ABSTRAK
SYAHNADA JAYA SY. Pengklonan dan Karakterisasi gen GST12 dari Kedelai Kultivar Lumut
dan Slamet. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
GST12 diketahui sebagai salah satu gen yang berperan dalam respon ketahanan terhadap
cekaman Alumunium (Al). cDNA LGST12 dan SGST12 telah berhasil diisolasi dari akar tanaman
kedelai kultivar Lumut dan Slamet. Hasil penelitian sebelumnya diketahui bahwa pada kultur air
pH rendah dan Al tinggi LGST12 tidak terinduksi sedangkan SGST12 terinduksi. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi kedua gen tersebut sebagai langkah awal eksplorasi dan isolasi
gen. cDNA kedua kultivar telah dicek keberadaannya kemudian diklon ke dalam pGEM®-T easy.
Plasmid rekombinan dalam Escherichia coli galur DH5 telah berhasil diperoleh. Pengurutan
cDNA LGST12 dan SGST12 dengan DNA sekuenser ABI Prism Model 310 yang masing-masing
menghasilkan 722 pb dan menyandikan 237 asam amino. Analisis kesejajaran lokal kedua cDNA
terhadap bagian GST12 (AF243367) yang berada di GenBank menunjukan persentase kesamaan
sebesar 85 % untuk LGST12 dan 92 % untuk SGST12 dengan Score Bits secara berurutan 908 dan
1146 dan E-value kedua cDNA tersebut 0 (nol). Hasil penelusuran daerah asam amino
terkonservasi menunjukkan bahwa cDNA GST12 memiliki daerah domain asam amino
terkonservasi GST tipe GST_N_Tau sedangkan cDNA SGST12 selain memiliki daerah domain
asam amino terkonservasi GST_N_Tau juga memiliki daerah domain asam amino terkonservasi
GST_C_Tau. Berdasarkan penjajajaran asam amino cDNA LGST12 dan SGST12 terhadap GST12
dari beberapa spesi