Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1 dengan Gen Peroksidase (PerL) dari Kedelai Kultivar Lumut

REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum KULTIVAR SR1
DENGAN GEN Peroksidase (PerL) DARI KEDELAI KULTIVAR
LUMUT

DESTIK WULANDARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Rekayasa Genetik
Nicotiana tabacum Kultivar SR1 dengan Gen Peroksidase (PerL) dari Kedelai
Kultivar Lumut adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015
Destik Wulandari
NIM G353120151

RINGKASAN
Destik Wulandari. Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1 dengan
Gen Peroksidase (PerL) dari Kedelai Kultivar Lumut. Dibimbing oleh UTUT
WIDYASTUTI dan ARIS TJAHJOLEKSONO.
Peroksidase merupakan enzim golongan oksidoreduktase yang
mengkatalis reaksi oksidasi reduksi. cDNA gen peroksidase (PerL) dari kedelai
kultivar Lumut telah berhasil diisolasi dengan panjang 1100 pb. Kedelai kultivar
Lumut menunjukkan ekspresi gen peroksidase ketika diberi cekaman pH 4+Al 1,6
mM. Peroksidase merubah H2O2, menjadi air dan oksigen ketika mengoksidasi
sejumlah substrat. Tujuan dari penelitian ini adalah merakit vektor ekspresi gen
PerL dan mengintroduksikannya ke dalam genom Nicotiana tabacum kultivar
SR1 menggunakan Agrobacterium tumefaciens. cDNA gen PerL telah berhasil
disisipkan dalam plasmid entry clone pENTRTM/D-TOPO®. cDNA gen PerL
yang dibawa oleh plasmid pENTR-PerL telah berhasil disisipkan ke dalam vektor
ekspresi pGWB502 dengan sistem gateway cloning. Verifikasi keberhasilan

konstruksi plasmid overekspresi pGWB502-PerL dilakukan menggunakan PCR
dengan primer 35S-F dan AtprxCb-R menghasilkan pita berukuran 1500 bp.
Plasmid pGWB502-PerL telah berhasil diintroduksikan ke dalam A.tumefaciens
LBA4404 menggunakan metode triparental mating (TPM) dengan bantuan
plasmid penolong pRK2013. Keberhasilan introduksi plasmid pGWB502-PerL
ke dalam A. tumefaciens dikonfirmasi menggunakan PCR dengan primer 35S-F
dan AtprxCb-R menghasilkan pita berukuran 1500 bp. Transformasi genetik ke
Nicotiana tabacum kultivar SR1 telah berhasil dilakukan dengan bantuan bakteri
A. tumefaciens LBA4404 yang membawa plasmid rekombinan pGWB502-PerL.
Transformasi genetik Nicotiana tabacum kultivar SR1 dilakukan menggunakan
eksplan daun dengan teknik ko-kultivasi dan diseleksi pada media yang
mengandung 30 mg/L higromisin. Integrasi gen PerL di dalam genom tumbuhan
Nocotiana tabacum kultivar SR1 transgenik telah berhasil dikonfirmasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik 35SF dan AtprxCb-R menghasilkan
pita berukuran 1500 bp.
Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, gen Peroxidase (PerL), Nicotiana
tabacum kultivar SR1, pGWB502, pENTRTM/D-TOPO®

SUMMARY
DESTIK WULANDARI Genetic Engineering of Nicotiana tabacum cultivar SR1

with Peroksidase (PerL) gene from soybean cultivar Lumut. Supervised by UTUT
WIDIYASTUTI and ARIS TJAHJOLEKSONO.
Peroxidase is an oxidoreductase enzyme class that catalyze oxidationreduction reactions. cDNA of Peroxsidase (PerL) gene from soybean cv Lumut
has been isolated and contained 1100 bp. The aim of this research was to construct
an overexpression vector of PerL gene and introduce the PerL gene into
Nicotiana tabacum cultivar SR1 genome using Agrobacterium tumefaciens
mediated transformation. Soybean cv Lumut showed the expression of
peroxidase gene when given pH 4+Al 1,6 mM stresses. Peroxidases convert H2O2
into water and oxygen when the enzyme oxidizes a number of organic substrates
PerL gene cDNA was successfully inserted in the entry clone pENTRTM/DTOPO®. cDNA PerL gene that carried by pENTR-PerL plasmid has been
successfully inserted into pGWB502 as a expression vector by using gateway
cloning system. Verify the successfully of construction plasmid pGWB502-PerL
as a overexpression plasmid performed by PCR using primers 35S-F and
AtprxCb-R produces 1500 bp lenght nucleotides. Plasmid pGWB502-PerL
overexpression plasmid has been successfully introduced into A.tumefaciens
LBA4404 by triparental mating method (TPM) with using of a pRK2013 as a
helper plasmid and verified with 35S-F and AtprxCb-R specific primery and
produces 1500 bp lenght nucleotides. Genetic transformation of Nicotiana
tabacum kultivar SR1 using A. tumefacuens LBA4404 carries pGWB502-PerL
plasmid as a mediated transformation has been successfully. The genetic

transformation of Nicotiana tabacum SR1 performed using leaf explants and with
co-cultivation techniques then selected with medium containing 30 mg/L
hygromycin. Integration of cDNA PerL genes in the genome of N.tabacum SR1
transgenic plants have been confirmed using PCR with specific primers 35SF and
AtprxCb-R produces has 1500 bp lenght nucleotides.
Keywords: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, Nicotiana
tabacum cultivar SR1, Peroxidase (PerL) gene, pGWB502
.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk
kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan,
penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak
merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

REKAYASA GENETIK Nicotiana tabacum KULTIVAR

SR1 DENGAN GEN Peroksidase (PerL) DARI KEDELAI
KULTIVAR LUMUT

DESTIK WULANDARI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Judul Tesis : Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1 dengan Gen
Peroksidase (PerL) dari Kedelai Kultivar Lumut
Nama
: Destik Wulandari

NIM
: G353120151

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Ketua

Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biologi Tumbuhan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Miftahudin, MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 6 Februari 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014-oktober 2014
ini ialah rekayasa genetik, dengan judul Rekayasa Genetik Nicotiana tabacum
Kultivar SR1 dengan Gen Peroksidase (PerL) dari Kedelai Kultivar Lumut.
Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan Hibah Penelitian Unggulan
Perguruan tinggi DIKTI 2014 atas nama Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dengan judul
Perbaikan Genetik Tumbuhan Kedelai terhadap Cekaman Asam melalui Teknik
DNA Rekombinan Gen Antioksidan GST (Glutathione S-Transferase) dan Per
(Peroksidase), dengan nomor kontrak: 79/IT3.41.2/L1/SPK/2014 tanggal 28 Mei
2014.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Utut Widyastuti dan Bapak

Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA selaku pembimbing, dan Prof Dr Ir Suharsono,
DEA selaku kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
(PPSHB) IPB yang telah mengijinkan penulis melakukan penelitian di PPSHB
IPB. Terimakasih kepada Dr Diah Ratnadewi selaku dosen penguji luar komisi
atas masukkan dan sarannya sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terimakasih
penulis ucapkan pula kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang telah
memberikan Beasiswa Unggulan Calon Dosen. Terimakasih kepada Ibu Pepi
Elvavina, Ibu Nia Dahniar dan Bapak Abdul Mulya selaku teknisi yang telah
banyak membantu dalam penelitian ini. Ungkapan terimakasih penulis sampaikan
untuk bapak, ibu, kakak, adik dan keluarga untuk semua doa dan semangat yang
luar biasa dalam menyelesaikan tesis ini. Terimakasih juga penulis sampaikan
kepada sahabat dan keluarga plant genetic and engineering 2012; Baso, Mas
Rudi, Tiwi, Mbak Fajri dan Mbak Eva. Terimakasih kepada keluarga besar
Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherland (BIORIN),
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tumbuhan (BMST) PPSHB, dan
keluarga besar Biologi Tumbuhan Departemen Biologi IPB 2012. Semoga karya
ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2015
Destik Wulandari

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian

1
1
2

TINJAUAN PUSTAKA
Peroksidase

Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens
Transformasi Genetik Nicotiana tabacum

2
2
3
4

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan Penelitian
Metode

5
5
5
6

HASIL DAN PEMBAHASAN
10

Introduksi cDNA Gen PerL ke dalam Entry Vector pENTRTM/D-TOPO® 10
Pengklonan cDNA gen PerL ke dalam Vektor Ekspresi pGWB502
11
Introduksi plasmid pGWB502-PerL ke dalam Agrobacterium tumefaciens
LBA4404
13
Transformasi Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1
14
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

16
16
16

DAFTAR PUSTAKA

16

DAFTAR GAMBAR
1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11

Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara (1) PerL dan
(2) Per G. max l78163 dari Genebank (Amirullah 2008)
Peta plasmid pENTRTM/D-TOPO® dengan daerah overhang GTGG dan gen
penyandi ketahanan antibiotik kanamisin
Rekombinasi pada sistem gateway cloning antara situs attL1 dan attL2 yang
mengapit gen PerL (plasmid pENTR-PerL) dengan situs attR1 dan attR2
yang mengapit daerah ccdB (plasmid pGWB502)
Hasil perbanyakan cDNA gen PerL menggunakan PCR dengan primer PerLpENTR-F dan AtprxCb-R
Hasil identifikasi koloni E. coli yang mengandung pENTR-PerL
menggunakan PCR dengan primer PerL pENTR-F dan AtprxCb-R
Peta konstruksi plasmid rekombinan pGWB502 yang membawa cDNA gen
PerL (pGWB502-PerL)
Hasil PCR koloni bakteri E.coli DHSα yang telah ditransformasi dengan
plasmid pGWB502-PerL

3
7
7

10
11
12
12

Hasil pemotongan plasmid pGWB502-PerL dengan enzim restriksi 12
Xba dan Sac1
Identifikasi DNA rekombinan menggunakan PCR koloni dengan primer 13
35SF dan AtprxCb-R
Pertumbuhan dan perkembangan N.tabacum kultivar SR1 hasil transforman. 14
Hasil amplifikasi DNA genom N. tabacum kultivar SR1 transgenik putatif 15
menggunakan primer spesifik 35SF dan AtprxCb-R.

DAFTAR LAMPIRAN
1
2

Alur konstruksi plasmid overekspresi pGWB502-PerL dan perakitan 19
N.tabacum SR1 transgenik
Media untuk transformasi N. tabacum kultivar SR1
20

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cekaman abiotik dan biotik yang dialami tumbuhan dapat meningkatkan
konsentrasi reactive oxygen species (ROS) seperti radikal superoksida (O2-),
hidrogen peroksida (H2O2) (Badawi et al. 2004). Radikal bebas dalam jumlah
normal tidak berbahaya bagi tumbuhan karena berfungsi untuk keberlangsungan
beberapa proses fisiologis pada tumbuhan. Radikal bebas yang berlebihan dapat
berbahaya bagi tumbuhan karena dapat menyebabkan peroksidasi lipid dan
merusak makromolekul seperti karbohidrat, protein dan DNA. Kerusakan
makromolekul pada sel dapat menyebabkan kematian sel (Halliwel dan Gutteridge
1999; Apel dan Hirt 2004). Peroksidasi lipid dapat disebabkan oleh radikal
superoksida, hidrogen peroksida dan radikal hidroksil. Salah satu senyawa radikal
bebas adalah superoksida yang dapat dirubah menjadi hidrogen peroksida (H2O2).
ROS dihasilkan dari rantai transport elektron pada kloroplas dan mitokondria.
Selain itu, ROS juga dihasilkan pada proses fotorespirasi dan dari aktivitas enzim
oksidase dan peroksidase pada dinding sel. Pada kloroplas, oksigen singlet dan
superoksida dihasilkan pada saat fotosistem I dan II. Produk sampingan dari
fotorespirasi yaitu glikolat dioksidasi oleh glikolat oksidase di dalam peroksisom
menghasilkan hidrogen peroksidase. Selain dihasilkan di dalam organel sel, ROS
juga dihasilkan pada membran sel, dinding sel dan apoplas.
Hidrogen peroksida berbahaya bagi organisme karena dapat menyebabkan
kerusakan sel dengan cara memutus ikatan rantai protein, merusak membran lipid
dan bereaksi dengan DNA sehingga menyebabkan terjadinya kerusakan pada sel
(Sgherri dan Navari-Izzo 1995). Secara alamiah tumbuhan mempunyai
mekanisme untuk menanggulangi pembentukan radikal bebas dan mekanisme
untuk mempercepat degradasi senyawa tersebut. Salah satu mekanisme tersebut
adalah dengan sistem pertahanan perventif yang bersifat enzimatis seperti enzim
superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase (Fridovich 1975;
Bowler et al. 1992; Apel dan Hirt 2004; Dong et al. 2008). Tumbuhan
mempunyai mekanisme untuk mengontrol akumulasi senyawa ROS dengan
melibatkan reaksi enzim peroksidase dan senyawa antioksidan (Niyogi 1999).
Peroksidase merupakan salah satu enzim golongan oksidoreduktase, yaitu
enzim yang mengkatalis reaksi oksidasi-reduksi. Enzim peroksidase tersebar luas
pada jaringan tumbuhan dan banyak terdapat pada peroksisom. Enzim ini
berkaitan erat dengan sejumlah proses fisiologis yang meliputi lignifikasi,
penyembuhan luka, oksidasi fenol dan patogen. Lignifikasi berperan secara alami
untuk mekanisme pertahanan terhadap cekaman biotik dan abiotik (Ostergaard et
al. 2000). Tingginya tingkat aktivitas peroksidase pada tumbuhan berhubungan
erat dengan pertahanan tumbuhan terhadap cekaman abiotik seperti cekaman
oksidatif (Hiraga et al. 2001).
Hasil penelitian pada kedelai kultivar Lumut menunjukkan ekspresi gen
peroksidase ketika diberi cekaman pH 4 + Al 1,6 mM (Lubis 2008). Penelitian
Amirullah (2008) menunjukan bahwa cDNA dari gen peroksidase (PerL) dari
kedelai kultivar Lumut mempunyai kemiripan yang sangat tinggi dengan gen
peroksidase (ATPA2) dari Arabidobsis thaliana (X71794). PerL yang diduga

2
termasuk dalam golongan secretory peroxidase kelas III pada tumbuhan diketahui
mempunyai fungsi spesifik seperti menghilangkan hidrogen peroksida pada
kloroplas dan sitosol, mengoksidasi senyawa toksik, berperan dalam biosintesis
dinding sel, respon pertahanan akibat dari pelukaan, katabolisme indole acetic
acid (IAA) dan biosintesis etilen (Welinder 1992). Pentingnya peranan
peroksidase dalam mekanisme pertahanan tumbuhan terhadap cekaman abiotik
menyebabkan peroksidase menjadi kandidat gen untuk merakit tumbuhan
transgenik yang tahan terhadap cekaman abiotik.
Teknologi rekayasa genetika yang berkembang pesat memberikan harapan
baru untuk memanipulasi tumbuhan sehingga diperoleh tumbuhan unggul yang
tahan terhadap cekaman abiotik. Konstruksi plasmid dan metode transfer yang
tepat merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perakitan tumbuhan
transgenik. Metode transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens
sebagai perantara banyak digunakan karena mempunyai pola integrasi yang stabil
di dalam tumbuhan (Zupan dan Zambryski 1995).

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk merakit vektor ekspresi gen PerL
dan melakukan transformasi ke Nicotiana tabacum kultivar SR1 dengan bantuan
bakteri Agrobacterium tumefaciens.

TINJAUAN PUSTAKA

Peroksidase
Peroksidase merupakan enzim yang terlibat dalam beberapa metabolisme
primer dan sekunder termasuk di antaranya regulasi pemanjangan sel, cross
lingking dari polisakarida dinding sel (Fry 1986), lignifikasi, penyembuhan luka
(Espelie et al. 1986 ), pertahanan terhadap patogen (Hammerschmidt et al. 1982)
dan oksidasi fenol (Strivastava dan van Huystee 1977). Lignifikasi berperan
secara alami untuk mekanisme pertahanan terhadap cekaman biotik dan abiotik
(Ostergaard et al. 2000). Tingginya tingkat aktivitas peroksidase pada tumbuhan
berhubungan erat dengan pertahanan tumbuhan terhadap cekaman abiotik seperti
cekaman oksidatif (Hiraga et al. 2001). Cekaman Al diketahui dapat menginduksi
ekspresi gen penyandi peroksidase pada tumbuhan Arabidobsis thaliana (Richard
et al, 1998) yang menunjukkan bahwa gen penyandi peroksidase mempunyai
peranan yang sangat penting dalam sistem toleransi tumbuhan terhadap cekaman
Al.
Enzim peroksidase tersebar di dalam jaringan tumbuhan dan banyak
ditemukan di dalam peroksisom. Peroksidase merupakan enzim golongan
oksidoreduktase yakni enzim yang menggunakan hidrogen peroksida sebagai
akseptor elektron untuk mengkatalis berbagai reaksi oksidatif. Hidrogen peroksida
dapat menyebabkan kerusakan fraksi lipid pada membran yang akan

3
menghasilkan lipid peroksida dan selanjutnya akan terurai menjadi senyawa
produk oksidasi sekunder yang bersifat toksik (Dumet dan Benson 2000).
Mekanisme yang dilakukan tumbuhan untuk membatasi jumlah molekulmolekul toksik tersebut adalah dengan mengekspresikan sejumlah enzim salah
satunya adalah peroksidase. Peroksidase bekerjasama dengan enzim SOD
(Superoksida dismutase) dalam mekanisme menanggulangi terjadinya Reactif
Oksigen Species (ROS). Superoksida akan dipecah oleh SOD menjadi H2O2,
kemudian H2O2 diuraikan oleh peroksidase menjadi air. Peroksidase memecah
H2O2 menjadi air ketika mengoksidasi sejumlah substrat organik. Cekaman yang
disebabkan oleh aluminium juga diketahui dapat menyebabkan terinduksinya
ekspresi gen peroksidase (Richard et al. 1998). Peroksidase membutuhkan
kofaktor dalam melakukan aktivitas enzimatisnya yakni kofaktor heme, sehingga
peroksidase disebut juga heme dependent peroksidase. Heme adalah kompleks
antara ion besi dan molekul protoporphyrin IX (Ferriprotoporphyrin IX).
Berdasarkan kemiripan sekuen dan strukturnya, peroksidase dibedakan
menjadi 2 famili yakni; 1) peroksidase hewan dan 2) peroksidase tumbuhan, fungi
dan bakteri. Famili peroksidase tumbuhan berdasarkan struktur dan fungsi,
dibedakan menjadi 3 kelas, yakni: kelas I meliputi peroksidase intraseluler yang
disebut dengan peroksidase-katalase yang menunjukkan aktivitas peroksidase dan
katalase dalam spektrum yang luas dan bergantung pada kestabilan hidrogen
peroksidase; kelas II meliputi ligninase dan peroksidase ekstraseluler; kelas III
peroksidase ekstraseluler klasik tumbuhan seperti horseperadish peroksidase
(Welinder 1992). Hasil analisis kesejajaran sekuen cDNA gen PerL menunjukkan
nilai kemiripan yang tinggi terhadap sekuen cDNA dari gen Per dari Arabidobsis
thaliana (X71794) yakni sebesar 98%. Penyejajaran dilakukan dengan
menggunakan primer spesifik yang didesain menggunakan sekuen gen Per dari
Arabidopsis thalianan (Amirullah, 2008). Penelusuran daerah domain
terkonservasi urutan asam amino PerL menunjukkan bahwa urutan asam amino
PerL termasuk dalam tipe secretory peroxidase kelas III (Gambar 1).

Gambar 1 Perbandingan daerah domain asam amino terkonservasi antara (1) PerL
dan (2) Per G. max l78163 dari Genebank (Amirullah 2008).

Transformasi Genetik dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang termasuk dalam
famili Rhizobiceae dan bersifat obligat aerob. Bakteri ini mempunyai suhu
optimal tumbuh 30°C. Bakteri ini mempunyai kemampuan menginfeksi sebagian
besar tumbuhan dikotil dan sebagian kecil tumbuhan monokotil yang

4
menyebabkan penyakit tumor (crown gall). Agrobacterium tumefaciens dapat
menyebabkan tumor pada tumbuhan karena adanya gen penginduksi tumor yang
ada di dalam plasmid Ti. Plasmid Ti digunakan sebagai vektor untuk
memindahkan gen asing ke dalam genom tumbuhan. Kemampuan A. tumefaciens
sebagai genetic engineer alami telah banyak dimanfaatkan sebagai media
transformasi genetik ke dalam tumbuhan (Ronald 2007). Agrobacterium
tumefaciens mempunyai tiga komponen genetik yang digunakan ketika
menginfeksi tumbuhan sehingga mampu mentransfer gen asing ke dalam genom
tumbuhan. Komponen pertama adalah daerah T-DNA yang merupakan fragmen
yang ditransfer ke dalam genom tumbuhan dan terletak di dalam plasmid Ti.
Komponen kedua adalah virulen region (vir), gen-gen vir terletak di sebelah batas
kiri T-DNA dan mensintesis protein virulensi yang berperan menginduksi
terjadinya transfer dan integrasi T-DNA ke dalam tumbuhan. Gen vir akan
terinduksi jika terdapat induser yang berupa senyawa monosiklik fenolik seperti
asetosyringone dan monosakarida seperti glukosa dan galaktosa (Ronald 2007).
Proses transfer gen secara alami oleh A.tumefaciens ke dalam genom
tumbuhan melalui empat tahap, yakni: 1) kolonisasi bakteri; 2) induksi sistem
virulensi; 3) perakitan kompleks transfer T-DNA; 4) transfer dan integrasi T-DNA
ke dalam genom tumbuhan (Riva et al. 1998). Transfer T-DNA ke dalam genom
tumbuhan merupakan proses yang kompleks. Proses transfer T-DNA dari A.
tumefaciens ke daam genom tumbuhan dimulai dari adanya luka pada sel
tumbuhan. Luka yang dialami oleh sel tumbuhan ini akan memproduksi senyawa
fenolik seperti asetosiringone. Senyawa asetosiringone akan menarik dan
mengaktifkan gen-gen vir yang diperlukan dalam proses transfer T-DNA.
Gen chromosomal virulence (chv) yakni chvA, chvB, dan pscA merupakan
gen yang terletak pada kromosom Agrobacterium. Gen-gen tersebut mempunyai
fungsi untuk pelekatan bakteri pada sel tumbuhan dengan membentuk senyawa
protein β-1,2-glukan. Ekspresi gen vir juga sangat dipengaruhi oleh senyawa
induser dan kondisi pH dimana pH optimum untuk ekspresinya berkisar antara 55,8 (Hiei et al. 1997). Asetosiringone akan mengaktifkan gen vir A dan
menyebabkan terjadinya fosforilasi yang kemudian mengaktifkan gen vir G. Gen
vir G akan mengaktifkan gen-gen vir lainnya. Gen vir D1 berfungsi mengontrol
pemotongan T-DNA sehingga diperoleh untai tunggal DNA linear, gen vir D
menempel pada ujung 5’ T-DNA lalu membawa DNA ke sitosol sel inang dan TDNA akan terinsersi ke dalam genom tumbuhan (Ciftci 2012).

Transformasi Genetik Nicotiana tabacum
Teknik kultur jaringan tumbuhan membuka peluang untuk menyediakan
sel target yang berasal dari organ tumbuhan (daun, batang, hipokotil dan
kotiledon) yang digunakan untuk rekayasa genetik. Nicotiana tabacum
merupakan tumbuhan yang banyak digunakan sebagai tumbuhan model dalam
teknik transformasi genetik. Nicotiana tabacum secara in vitro mudah
diregenerasi membentuk tumbuhan utuh. Setiap bagian dari tumbuhan tembakau
mempunyai daya totipotensi untuk membentuk tumbuhan yang utuh (QuirosFigueroa et al. 2006). Transformasi genetik pada tembakau dapat dilakukan dalam
berbagai macam bentuk eksplan di antaranya potongan daun (Jones 1996; Su et al.

5
2012) dan sel (An 1985; Mayo et al. 2006). Selanjutnya eksplan ditumbuhkan
pada media regenerasi secara in vitro untuk menghasilkan tanaman transgenik.
Media regenerasi sering berfungsi juga sebagai media seleksi dengan penambahan
agen seleksi seperti antibiotik. Antibiotik yang digunakan sesuai dengan gen
ketahanan terhadap antibiotik yang terdapat di daerah T-DNA (Waluyo 2013;
Rahmawati 2003). Antibiotik yang digunakan bersifat racun bagi eksplan non
transgenik, sehingga digunakan sebagai agen seleksi pertama kali pada perakitan
tumbuhan transgenik. Tunas yang hidup pada media seleksi merupakan tunas
transgenik putatif. Perolehan tumbuhan transgenik yang mengandung gen penanda
seleksi menjadi faktor penting untuk mendapatkan tumbuhan transgenik yang
mengandung gen sasaran (Miki dan McHugh 2004).
Mantell et al (1985) menyatakan bahwa beberapa eksplan hasil
transformasi genetik dengan gen cp-SMV tumbuh menjadi kalus dan mengalami
organogenesis yang ditandai dengan pertambahan tinggi dan jumlah daun yang
nyata. Eksplan yang dikulturkan mengalami morfogenesis organ adventif secara
tidak langsung, yaitu membentuk kalus dan selanjutnya dengan dirangsang pada
media baru, kalus akan mengalami morfogenesis membentuk tunas dan daun.
Kultur in vitro tembakau transgenik cp-SMV pada medium MS yang ditambah
NAA 0,3 mg/L dan BAP 1 mg/L dapat menghasilkan kalus yang kemudian
bertunas (Agung-Astuti et al. 2004).

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biotechnological Research
Indonesia-The Netherland (BIORIN) dan Biologi Molekuler dan Seluler
Tumbuhan (BMST) PPSHB IPB. Waktu pelaksanaan penelitian dimulai bulan
Maret 2014 sampai dengan Oktober 2014.

Bahan Penelitian
Plasmid pGEM-T Easy (Promega) yang membawa sisipan gen PerL
(pGEM-PerL) dalam bakteri E. coli DH5α (Amirullah 2008) digunakan sebagai
sumber cDNA gen PerL. Plasmid pGWB502 dalam bakteri E. coli DH5α
digunakan sebagai vektor ekspresi gen PerL. Plasmid pENTRTM/D-TOPO®
(Invitrogen, USA) sebagai entry clone, Agrobacterium tumefaciens LBA4404
digunakan sebagai perantara transformasi ke Nicotiana tabacum kultivar SR1.
Bakteri E. coli DH1 yang membawa plasmid pRK2013 digunakan untuk
membantu proses transfer plasmid pGWB502 rekombinan ke bakteri A.
tumefaciens. Kultur in vitro N. tabacum kultivar SR1 dari hasil perkecambahan
biji digunakan sebagai sumber eksplan untuk bahan transformasi.

6
Metode
Penelitian ini dilakukan melalui 3 tahapan, yaitu: konstruksi vektor
ekspresi, perakitan tumbuhan transgenik dan analisis tumbuhan transgenik
(Lampiran 1). Tahapan pertama adalah konstruksi vektor ekspresi yang terdiri
dari: a) amplifikasi cDNA gen PerL dari plasmid pGEM-PerL kemudian
dipurifikasi dengan cara elusi, b) cDNA gen PerL yang telah dipurifikasi di
introduksikan ke dalam plasmid pENTRTM/D-TOPO® (pENTR-PerL) dan c)
introduksi cDNA gen PerL ke vektor ekspresi pGWB502 (pGWB502-PerL).
Tahap kedua adalah perakitan tumbuhan transgenik yang terdiri dari introduksi
pGWB502-PerL ke dalam A. tumefaciens LBA4044 dan perakitan N. tabacum
SR1 transgenik dengan teknik ko-kultivasi. Tahap ketiga adalah analisis
tumbuhan transgenik dengan uji integrasi gen PerL di dalam genom N. tabacum
SR1.
Introduksi cDNA gen PerL ke dalam entry vector pENTRTM/D-TOPO®
cDNA gen PerL diperoleh dengan cara mengamplifikasinya dari plasmid
pGEM-PerL dengan primer spesifik yaitu (PerL pENTR-F: 5’CAC CAT GCA
TTT CTC TTC GTC 3’ dan AtprxCb-R: 5’GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA
GAG 3’) yang ditambah situs CACC pada ujung 5’ primer forward. Komposisi
reaksi PCR yang digunakan adalah 0.5 μl DNA template, 1x buffer Tag, 4 mM
dNTP, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Tag
polymerase dan ditambah ddH2O hingga volume akhir menjadi 10μl. PCR
dilakukan pada kondisi pra PCR pada suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi pada
suhu 94°C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55°C selama 30 detik,
dan pemanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit, dilakukan sebanyak 35 siklus,
pasca PCR pada 72°C selama 5 menit dan pendinginan 20°C selama 20 menit.
Hasil PCR (fragmen PerL) dipurifikasi dengan cara elusi dari gel agarosa
mengikuti prosedur kit dari Geneid. Hasil elusi fragmen cDNA gen PerL
direaksikan dengan pENTRTM/D-TOPO® mengikuti protokol dari Invitrogen,
USA.
pENTRTM/D-TOPO® rekombinan diintroduksikan ke dalam sel kompeten
bakteri E.coli TOP10 dengan menggunakan metode heat shock (Sambrook et al.
1989), kemudian disebar pada media Luria Agar (LA) yang mengandung 50 mg/L
kanamisin. Koloni yang tumbuh diverifikasi dengan PCR menggunakan primer
PerL pENTR-F (5’CAC CAT GCA TTT CTC TTC GTC 3’) dan AtprxCb-R
(5’GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA GAG 3’) dengan kondisi PCR sama
seperti pada metode amplifikasi cDNA gen PerL. Plasmid pENTR-D/TOPO
rekombinan (pENTR-PerL) diisolasi dari koloni yang positif (koloni yang
mengandung cDNA gen PerL) dengan menggunakan Geneid Plasmid Miniprep
Kit.

7

Gambar 2 Peta plasmid pENTRTM/D-TOPO® dengan daerah overhang GTGG dan
gen penyandi ketahanan antibiotik kanamisin.

Pengklonan cDNA gen PerL ke dalam vektor ekspresi pGWB502
Plasmid pENTR-PerL direaksikan dengan plasmid biner pGWB502
dengan bantuan enzim LR clonase sesuai dengan protokol gateway cloning
(Gambar 3). Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E.coli DH5α dan ditumbuhkan
pada media Luria Agar (LA) yang mengandung antibiotik spektinomisin 50 mg/L.
Koloni yang tumbuh diverifikasi dengan menggunakan primer spesifik 35S-F
(5’AAA CCT CCT CGG ATT CCA TT 3’) dan AtprxCb-R (5’GTT CTG AAG
TAA ACG TCT TGA GAG 3’). Komposisi reaksi PCR yang digunakan adalah
0.5μl DNA template, 1x buffer Tag, 4mM dNTP, 10 pmol primer forward, 10
pmol primer reverse, 2U enzim Tag polymerase dan ditambah ddH2O hingga
volume akhir menjadi 10μl. PCR dilakukan dengan kondisi sama seperti
sebelumnya. Koloni bakteri E.coli DH5α yang positif membawa plasmid
pGWB502 rekombinan yang mengandung gen PerL (pGWB502-PerL) diisolasi
menggunakan Geneid Plasmid Miniprep Kit. Hasil isolasi berupa plasmid
rekombinan pGWB502-PerL yang kemudian dipotong menggunakan enzim
restriksi Xba dan Sac1.

8
Gambar 3 Rekombinasi pada sistem gateway cloning antara situs attL1 dan attL2
yang mengapit gen PerL (plasmid pENTR-PerL) dengan situs attR1
dan attR2 yang mengapit daerah ccdB (plasmid pGWB502)
Introduksi pGWB502-PerL ke dalam Agrobacterium tumefaciens LBA4044
Introduksi plasmid biner pGWB502 yang mengandung gen PerL ke dalam
bakteri A. tumefaciens LBA4404 dilakukan dengan menggunakan metode
konjugasi triparental mating (Anggraito 2012) dengan bantuan plasmid penolong
pRK2013. Koloni bakteri A. tumefaciens LBA4404 hasil konjugasi ditumbuhkan
pada media Luria Agar (LA) yang mengandung 50 mg/L spektinomisin dan 50
mg/L streptomisin. Bakteri E. coli DH1 yang mengandung plasmid penolong
pRK2013 ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung 50 mg/L
kanamisin, diinkubasi pada suhu 370C selama 16-18 jam dan digoyang dengan
kecepatan 220 rpm. Bakteri A. tumefaciens LBA4404 ditumbuhkan dalam media
LB cair yang mengandung streptomisin 50 mg/L, diinkubasi pada suhu 280C
selama 2 hari atau OD600=1 dan digoyang dengan kecepatan 220 rpm. Biakan dari
masing-masing bakteri diambil sebanyak 20 µl, kemudian diteteskan pada media
LB yang tidak mengandung antibiotik dan diresuspensi agar terjadi konjugasi.
Selanjutnya diinkubasi pada suhu 280C selama dua hari dalam ruangan gelap.
Koloni hasil konjugasi yang tumbuh selanjutnya diambil dan dilarutkan dalam
500 µl LB cair dan dihomogenkan, kemudian sebanyak 5µl kultur bakteri hasil
pengenceran tersebut diencerkan kembali dalam 495 µl LB cair. Hasil
pengenceran diambil sebanyak 80 µl dan disebar pada media LB padat yang
mengandung spektinomisin 50 mg/L dan streptomisin 50 mg/L, selanjutnya kultur
diinkubasi pada suhu 280C selama dua hari. Agrobacterium tumefaciens LBA4404
transforman kemudian di verifikasi dengan PCR menggunakan primer spesifik
35S-F dan AtprxCb-R.
Persiapan eksplan Nicotiana tabacum kultivar SR1
Biji N. tabacum kultivar SR1 disterilisasi dengan cara merendam biji pada
larutan alkohol 70% dan digoyang dengan tangan selama 5 menit. Selanjutnya biji
dicuci dengan air steril lalu direndam pada larutan pemutih-disinfektan Bayclin
(NaClO 5,25%) 20% kemudian digoyang selama 10 menit. Biji dicuci kembali
menggunakan air steril sebanyak enam kali. Biji ditumbuhkan pada media dasar
Murashige dan skoog (MS0) yang mengandung garam MS, Vitamin MS, 30 g/L
sukrosa, dan 0.3% agar. Biji ditumbuhkan pada suhu 26°C-27°C, setelah berumur
1 bulan tanaman yang tumbuh disubkultur untuk perbanyakan. Eksplan yang
digunakan dalam transformasi adalah daun dari tanaman aseptik yang tumbuh dari
biji N. tabacum kultivar SR1 yang berumur 2 bulan.
Transformasi genetik Nicotiana tabacum kultivar SR1
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang membawa plasmid
pGWB502-PerL ditumbuhkan pada media LB yang mengandung antibiotik
spektinomisin 50 mg/L dan streptomisin 50 mg/L. Kultur bakteri A. tumefaciens
LBA4404 transforman yang mempunyai OD =0.5 diencerkan dengan media kokultivasi cair yang mengandung asetosiringone 40 ppm hingga OD=0.5 dan
volume 24 ml. Daun N. tabacum kultivar SR1 dari hasil kultur in vitro yang
berumur 2 bulan dipotong dengan ukuran ± 1x1 cm lalu direndam di dalam biakan
A. tumefaciens transforman pGWB502-PerL selama 10 menit dan digoyang-

9
goyang menggunakan tangan, kemudian dikeringkan dengan tissue steril. Eksplan
ditanam pada media ko-kultivasi padat dengan komposisi garam MS, vitamin MS,
3% sukrosa, 40 mg/L asetosiringone, 0.3% gelrite, 0.5 mg/L IAA dan 0.5mg/L
BA, selama 3 hari dalam ruangan gelap.
Eksplan hasil ko-kultivasi dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali dan
dilanjutkan dengan air steril yang ditambah dengan 200 mg/L cefotaxime,
dikeringkan dengan tissue steril dan kemudian ditanam pada media pengkalusan
(garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.5 mg/L IAA, 0.5 mg/L BA, 200 mg/L
cefotaxime, dan 0.3% gelrite) (lampiran 2) selama 7-10 hari. Setelah itu, eksplan
dipindahkan ke media seleksi (lampiran 2) yang mengandung garam MS, vitamin
MS, 3% sukrosa, 0.5 mg/L BA, 0.5 mg/L IAA, 100 mg/L cefotaxime, 30 mg/L
higromisin dan 0.3% gelrite hingga muncul tunas. Tunas yang panjangnya
mencapai 3-4 cm dipindahkan ke media MS0 hingga terbentuk akar. Tunas yang
sudah menghasilkan akar dipindahkan ke media arang sekam dan dipelihara di
ruang kultur selama satu minggu. Tumbuhan yang mempunyai pertumbuhan baik
dipindahkan ke media tanah dan diletakkan di luar ruangan, kemudian dipelihara
hingga dewasa untuk menghasilkan biji T0.
Identifikasi Nicotiana tabacum SR1 transgenik
DNA genom tanaman N. tabacum kultivar SR1 diisolasi dari daun
tanaman T0 yang merupakan hasil transformasi dengan metode CTAB (Sambrook
et al 1989). Sebanyak 0.1 gr sampel daun digerus menggunakan N2 cair,
kemudian ditambah dengan 600 μl buffer CTAB 2% (20 g/L CTAB, 100 ml 1 M
Tris pH 7.5, 20 ml 0.5 M EDTA pH 8, 140 ml 5 M NaCl) dan ditambah 1,2 μl ßmercapto etanol 0.2% kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit.
Setelah diinkubasi ditambah 600 μl larutan CI (chloroform:isopropanol; 24:1),
selanjutnya disentrifugasi (Jouan centrifuge BR4) pada suhu 25°C selama 10
menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi diambil dan
ditambah dengan 600 μl larutan PCI (phenol:chloroform:isopropanol; 25:24:1),
selanjutnya disentrifugasi kembali pada suhu 25°C selama 10 menit dengan
kecepatan 10000 rpm. Supernatan diambil dan ditambah dengan sodium asetat pH
5.4 sebanyak 0.1 kali volume dan etanol absolut sebanyak 2 kali volume,
kemudian diinkubasi pada suhu -20°C selama 12 jam. Hasil pengendapan
disetrifugasi pada suhu 4°C selama 15 menit dengan kecepatan 10000 rpm.
Supernatan dibuang, endapan (pelet) ditambah dengan etanol 70% sebanyak 500
μl dan disentrifugasi pada suhu 4°C selama 10 menit dengan kecepatan 10000
rpm. Pelet dikeringkan dengan mesin vacuum dryer selama 20 menit. Pelet
kemudian diencerkan dengan 20 μl ddH2O dan ditambah dengan RNAse 1 mg/L
sebanyak 0.2 kali volume, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit
untuk mengaktifkan RNAse. Selanjutnya RNAse di-nonaktifkan pada suhu 70°C
selama 10 menit. Tanaman N. tabacum transgenik putatif diidentifikasi
menggunakan PCR dengan primer spesifik 35SF dan AtprxCb-R. PCR dilakukan
pada kondisi pra PCR pada suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94°C
selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55°C selama 30 detik, dan
pemanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit, dilakukan sebanyak 35 siklus dan
pasca PCR pada 72°C selama 5 menit dan pendinginan 20°C selama 20 menit.

10

HASIL DAN PEMBAHASAN
Introduksi cDNA Gen PerL ke dalam Entry Vector pENTRTM/D-TOPO®
Fragmen cDNA PerL berhasil diamplifikasi dari plasmid pGEM-PerL
dengan primer spesifik yang ditambah situs CACC pada ujung 5’ primer forward
(PerL pENTR-F: 5’CAC CAT GCA TTT CTC TTC GTC’ dan AtprxCb-R:5’GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA GAG-3’). Penambahan situs spesifik
CACC ini bertujuan agar fragmen cDNA PerL dapat disisipkan pada plasmid
pENTRTM/D-TOPO® sebagai vektor pengklonan dengan menggunakan metode
gateway cloning.
Fragmen PerL yang telah berhasil dipurifikasi berukuran 1100 bp sesuai
dengan ukuran cDNA gen PerL (Gambar 4). Hasil purifikasi kemudian
direaksikan dengan plasmid pENTRTM/D-TOPO® mengikuti protokol Invitrogen,
USA. Proses pengklonan dibantu oleh enzim topoisomerase I yang memotong
rantai utas tunggal pada situs CCCTT sehingga plasmid pENTRTM/D-TOPO®
mempunyai daerah overhang GTGG (Gambar 2). Situs CACC yang terdapat pada
fragmen cDNA gen PerL hasil PCR akan berkomplemen dengan situs GTGG
pada pENTRTM/D-TOPO®, sehingga cDNA gen PerL dapat menyisip pada
plasmid pENTRTM/D-TOPO®. Proses ligasi antara vektor dan sisipan terjadi
karena adanya aktivitas enzim Topoisomerase I selama inkubasi. Hasil reaksi
kemudian diintroduksikan ke dalam bakteri E. coli TOP10 dengan metode heat
shock.
M
1

1000bp
1000bp

1100bp

Gambar 4 Hasil perbanyakan cDNA gen PerL menggunakan PCR dengan primer
PerL-pENTR-F dan AtprxCb-R. M= marka 1kb, 1= gen PerL.
Koloni yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung 50 mg/L
kanamisin diduga membawa plasmid pENTRTM/D-TOPO® yang mengandung
cDNA gen PerL. Koloni tersebut diverifikasi menggunakan PCR koloni dengan
primer PerL pENTR-F dan AtprxCb-R untuk memastikan keberadaan cDNA gen
PerL. Hasil PCR berupa fragmen berukuran 1100 bp (Gambar 5). Hal ini
menunjukkan bahwa koloni yang diverifikasi telah mengandung plasmid
pENTRTM/D-TOPO® rekombinan (plasmid pENTRTM/D-TOPO® yang
mengandung cDNA gen PerL). Plasmid pENTR-D/TOPO rekombinan yang
membawa gen PerL diberi nama pENTR-PerL. Selanjutnya plasmid pENTRPerL diisolasi menggunakan Geneid Plasmid Miniprep Kit. pENTRTM/D-TOPO®

11
yang mempunyai situs attP1 dan attP2 sebagai tempat rekombinasi gen PerL.
Adanya situs rekombinasi ini menyebabkan tidak terjadinya kesalahan orientasi
keberadaan cDNA gen PerL pada plasmid pENTRTM/D-TOPO®.
M

1000bp

Gambar 5

1

2

1100bp

Hasil identifikasi koloni E. coli yang mengandung pENTR-PerL
menggunakan PCR dengan primer PerL pENTR-F dan AtprxCb-R.
M= Marka 1kb, 1=koloni non transforman, 2= koloni transforman.

Pengklonan cDNA gen PerL ke dalam Vektor Ekspresi pGWB502
Fragmen PerL yang dibawa oleh plasmid pENTR-PerL telah berhasil
disisipkan ke dalam vektor ekspresi pGWB502 dengan sistem gateway cloning.
Reaksi antara plasmid pENTR-PerL dengan plasmid pGWB502 dibantu oleh
enzim LR clonase (Invitrogen, USA). Enzim LR clonase berfungsi untuk
memindahkan fragmen cDNA gen PerL yang terdapat pada plasmid pENTR-PerL
ke dalam plasmid ekspresi pGWB502. Fragmen PerL dapat menyisip ke dalam
vektor pGWB502 karena terjadinya proses rekombinasi antara situs attL1 dan
attL2 pada pENTR-PerL dengan situs attR1 dan attR2 pada vektor ekspresi
pGWB502. Gen PerL yang diapit situs attL1 dan attL2 akan berpindah pada
daerah ccdB yang diapit oleh situs attR1 dan attR2 sehingga menghasilkan
plasmid rekombinan pGWB502-PerL dengan peta konstruksi LB dan RB seperti
Gambar 6.
Introduksi vektor pGWB502-PerL ke dalam E.coli DH5α telah berhasil
dilakukan dengan teknik heat shock. Koloni bakteri E.coli DH5α yang tumbuh
pada media seleksi yang mengandung spektinomisin 50 mg/L diduga sebagai
koloni bakteri yang membawa plasmid pGWB502-PerL. Koloni bakteri yang
tidak membawa plasmid rekombinan pGWB502-PerL akan mati karena situs
ccdB pada plasmid pGWB502 non rekombinan akan mengekspresikan protein
yang bersifat racun tehadap bakteri E.coli DH5α. Koloni E.coli DH5α yang
tumbuh pada media seleksi selanjutnya diverifikasi dengan PCR menggunakan
primer 35SF dan AtprxCb-R. Hasil PCR berupa fragmen DNA berukuran 1500 bp
(Gambar 6 dan 7). Primer 35SF digunakan untuk mengetahui keberhasilan sisipan
dan membuktikan bahwa rekombinan yang terbentuk akan diekspresikan karena
membawa promoter kuat 35S CaMV. Plasmid pGWB502-PerL berhasil diisolasi
dan dipotong menggunakan enzim restriksi Xba dan Sac1 (Gambar 6 dan 8).

12

Gambar 6 Peta konstruksi plasmid rekombinan pGWB502 yang membawa cDNA
gen PerL (pGWB502-PerL).
1

2

3

4

1500bp

M

1500bp

Gambar 7 Hasil PCR koloni bakteri E.coli DHSα yang telah ditransformasi
dengan plasmid pGWB502-PerL. 1-4= koloni E.coli transforman,
M=Marka 1kb.
M

1

2
vektor

1000bp

1100bp

Gambar 8 Hasil pemotongan plasmid pGWB502-PerL dengan enzim restriksi Xba
dan Sac1. M= Marka, 1= kontrol plasmid pGWB502-PerL tidak
dipotong, 2= plasmid pGWB502-PerL dipotong dengan enzim Xba dan
Sac1.

13
Introduksi plasmid pGWB502-PerL ke dalam Agrobacterium tumefaciens
LBA4404
Plasmid pGWB502-PerL telah berhasil diintroduksikan ke dalam
A.tumefaciens LBA4404 dengan metode triparental mating (TPM). Triparental
mating menggunakanam plasmid penolong pRK2013 konjugatif yang efisien
untuk mentransfer gen ke dalam plasmid nonkonjugatif (Wise et al. 2006).
Plasmid pGWB502-PerL yang terdapat pada E.coli DH5α hasil transformasi
(sebagai donor) dipindahkan ke dalam A.tumefaciens LBA4404 (sebagai resipien)
melalui proses konjugasi dengan bantuan plasmid penolong pRK2013 yang
terdapat pada bakteri E. coli DH1. Koloni A.tumefaciens LBA4404 hasil
konjugasi ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung spektinomisin 50
mg/L dan streptomisin 50 mg/L. Antibiotik spektinomisin digunakan karena
plasmid pGWB502-PerL mempunyai gen ketahanan spektinomisin di luar daerah
T-DNA dan A.tumefaciens mempunyai gen ketahanan terhadap streptomisin.
Koloni bakteri yang tumbuh di media seleksi spektinomisin dan streptomisin
diduga A.tumefaciens transforman yang mengandung plasmid pGWB502-PerL.
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 terduga transforman kemudian diverifikasi
menggunakan PCR koloni dengan primer spesifik 35SF dan AtprxCb-R. PCR
koloni menghasilkan fragmen DNA berukuran 1500 bp (Gambar 9). Hal ini
menunjukkan bahwa koloni yang diverifikasi adalah A. tumefaciens transforman
yang membawa plasmid pGWB502-PerL. Hanum (2012) telah melaporkan
keberhasilan memindahkan plasmid pGWB5-MmCUZn-SOD ke dalam bakteri
A.tumefaciens LBA4404. Anggraito (2012) juga telah berhasil mengintroduksikan
plasmid rekombinan pIG6-MaMt2 ke dalam bakteri A. tumefaciens LBA4404. Ohta
(1990) berhasil mengintroduksikan plasmid pBI121 yang membawa gen reporter ßGlucuronidase (GUS) ke dalam A. tumefaciems LBA4404 dengan bantuan
plasmid penolong pAL4404.
1

1500bp

2

M

1500bp

Gambar 9 Identifikasi DNA rekombinan menggunakan PCR koloni dengan
primer 35SF dan AtprxCb-R. 1-2= A.tumefaciens LBA4404
transforman , M= Marka 1kb

14
Transformasi Genetik Nicotiana tabacum Kultivar SR1
Transformasi genetik Nicotiana tabacum kultivar SR1 telah berhasil
dilakukan dengan bantuan bakteri A. tumefaciens LBA4044 yang membawa
plasmid rekombinan pGWB502-PerL. Transformasi genetik N. tabacum kultivar
SR1 dilakukan melalui eksplan daun dengan teknik ko-kultivasi. Bakteri A.
tumefaciens LBA4404 transforman digunakan sebagai media transformasi gen
PerL ke dalam N.tabacum kultivar SR1. Bakteri ini ditumbuhkan pada media
Luria Bertani (LB) yang mengandung spektinomisin 50 mg/L dan streptomisin 50
mg/L hingga OD=0.5. Pelukaan yang dilakukan pada daun N. tabacum dan
penambahan senyawa fenolik asetosiringone pada media ko-kultivasi
menyebabkan A.tumefaciens terinduksi sehingga menempel pada tumbuhan.
Senyawa asetosiringone juga akan mengaktifkan gen-gen vir pada A. tumefaciens.
Gen vir A akan mengaktifkan gen vir G. Daerah T-DNA akan dipotong oleh
protein yang dihasilkan oleh gen vir D sehingga diperoleh untai tunggal. Gen vir
E bertindak melindungi T-DNA dari degradasi enzim nuklease yang ada pada
tumbuhan sehingga T-DNA berhasil tersisip ke genom tumbuhan. Ko-kultivasi
dilakukan selama tiga hari di ruang gelap, kemudian eksplan dipindahkan ke
dalam media induksi kalus selama 1 minggu. Kalus yang telah terbentuk
selanjutnya dipindahkan ke dalam media seleksi yang mengandung 30 mg/L
higromisin hingga terbentuk tunas. Tunas yang tumbuh pada media seleksi
tersebut diduga sebagai tunas transgenik putatif (Gambar 10). Tunas yang tumbuh
dan sudah membentuk daun kemudian dipisahkan dan dipindahkan ke dalam
media MS0 atau media induksi akar.

1cm

a

1cm

1cm

1cm

b

d

1cm

c

e

Gambar 10 Pertumbuhan dan perkembangan N. tabacum SR1 hasil transformasi.
(a) Daun Nicotiana tabacum kultivar SR1 pada media ko-kultivasi
pasca transformasi, (b) eksplan pada media induksi kalus, (c)
pembentukan tunas pada media seleksi, (d) tunas yang berumur 3
minggu pada media induksi akar, (e) dan tunas yang berumur 5
minggu pada media induksi akar.

15
Integrasi gen PerL di dalam genom tumbuhan N.tabacum kultivar SR1
transgenik putatif telah berhasil dikonfirmasi menggunakan PCR dengan primer
spesifik 35S-F dan AtprxCb-R. Identifikasi akan adanya insersi gen PerL
dilakukan pada 6 sampel daun tumbuhan kultur N. tabacum kultivar SR1. Dari
keenam sampel, dua tanaman adalah transforman (positif terinsersi gen PerL)
sedangkan empat tanaman lainnya adalah non transforman (tidak terinsersi)
sehingga keberhasilan transformasi genetik N. tabacum kultivar SR1 adalah 33%.
Keempat tanaman non tansforman yang mampu bertahan di media seleksi
kemungkinan dapat disebabkan oleh beberapa factor. Faktor pertama adalah
adanya bagian kalus yang tidak menyentuh media seleksi sehingga tunas yang
tumbuh tidak terseleksi oleh higromisin. Faktor kedua yaitu terjadinya variasi
somaklonal yang dikarenakan oleh zat pengatur tumbuh (ZPT) atau terjadinya
tumbuhan yang mempunyai sifat kimera. Dong dan McHughen (1993)
menyatakan bahwa pada media seleksi, sel tumbuhan yang tidak terinsersi T-DNA
dilindungi oleh sel yang berhasil diinsersi oleh T-DNA sehingga ketika
mengalami organogenesis, tunas non transgenik yang dihasilkan juga mampu
bertahan pada media seleksi. Amplifikasi DNA genom tumbuhan N. tabacum SR1
transgenik putatif dengan primer 35S-F dan AtprxCb-R menghasilkan fragmen
DNA berukuran 1500 bp (Gambar 11). Hasil ini menunjukkan bahwa gen PerL
telah berhasil disisipkan ke dalam genom tumbuhan N.tabacum SR1 dengan
perantara bakteri A. tumefaciens. Metode transformasi dengan menggunakan A.
tumefaciens merupakan metode yang banyak digunakan karena menghasilkan
integrasi DNA atau gen yang stabil (Dai et al. 2001). Selain itu, teknik ini juga
menghasilkan tumbuhan transgenik yang stabil pada generasi berikutnya (Travella
et al. 2005). Agarwal et al. (2004) berhasil menyisipkan gen GUS ke dalam
genom tumbuhan Morus alba L dengan perantara A. tumefaciens LBA4404.
Waluyo (2013) melaporkan bahwa gen BtCspB penyandi cold shock protein
berhasil disisipkan ke dalam tanaman tembakau dengan perantara A. tumefaciens
LBA4404. Gen MaMt2 penyandi metallothionein tipe II dari Melastoma
malabathricum L telah berhasil diintroduksikan ke dalam N. benthamiana L
dengan bantuan A. tumefaciens LBA4404 (Anggraito 2012). Gen reporter ßGlucuronidase (GUS) yang mengandung intron berhasil diintroduksikan ke dalam
genom tembakau dengan bantuan A. tumefaciens LBA4404 (Ohta et al. 1990)
M

1

2

3

4

5

6

NT

1500bp

Gambar 11 Hasil amplifikasi DNA genom N. tabacum kultivar SR1 transgenik
putatif menggunakan primer spesifik 35SF dan AtprxR. M= marker 1
Kb; 1-2 = N.tabacum SR1 transgenik, 3-6= N. tabacum kultivar SR1
non-transforman, NT= Non transgenik N.tabacum kultivar SR1

16

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Vektor ekspresi pGWB502-PerL telah berhasil dikonstruksi dengan teknik
gateway cloning. cDNA gen PerL berhasil disisipkan ke dalam genom tumbuhan
N. tabacum SR1 dengan bantuan bakteri A. tumefaciens.

Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui tingkat ekspresi gen
PerL melalui analisis ekspresi dan uji tantang terhadap cekaman abiotik maupun
biotik.

DAFTAR PUSTAKA
Agarwal K, Kanwar K, Saini N, Jain RK. 2004. Agrobacterium tumefaciens
mediated genetic transformation and regeneration of Morus alba L. Sci Hort.
100: 183-191.
Agung-Astuti, Handayani E, Rineksane IA, Fitriyah NA. 2004. Multiplikasi,
induksi planlet dan seleksi tembakau hasil transformasi gen coat protein
SMV secara kultur in vitro. Bioteknologi. 1(2):31-36.
Amirullah A. 2008. Pengklonan dan karakterisasi gen PerL dari kedelai peka
cekaman aluminium [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
An G. 1985. High efficiency transformation of cultured tobacco cell. Plant
Physiol. 79:568-570.
Anggraito YU. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana L. dan kedelai
dengan gen MaMt2 penyandi metallothionein tipe II dari Melastoma
malabathricum L. [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Apel K, Hirt H. 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and
signal transduction. Annu Rev Plant Biol. 55:373–399.
Badawi GH. Yamauchi Y, Shimada E, Sasaki R, Kawano N, Tanaka K. 2004.
Enhanced tolerance to salt stress and water deficit by over expressing
superoxide dismutase in tobacco (Nicotiana tabacum) chloroplasts. Plant
Sci. 166: 919-928.
Bowler C, Montagu MV, Inze D. 1992. Superoxide dismutase and stress tolerance.
Annu Rev Plant Physiol Plant Biol. 43:83-116.
Ciftci YO. 2012. Transgenic Plant Advances and Limitation. Rejeka (CRO):
InTech.
Dai S, Zheng P, Marmey P, Zhang S, Tian W, Chen S, Beachy RN, Fauquet C.
2001. Comparative analysis of transgenic rice plants obtained by
Agrobacterium-mediated transformation and particles bombardment. Mol
Breed. 7:25-33.

17
Dong C, Li G, Li Z, Zhu H, Zhou M, Hu Z. 2008. Molecular cloning and
expression analysis of an Mn-SOD gene from Nelumbo nucifera. Appl
Biochem Biotechnol. 158(3):605-14.
Dong JZ, McHughen A. 1993. Transgenic flax plants from Agrobacterium
mediated transformation incidence of chimeric regenerants and inheritance
of transgenic plants. Plant Sci. 91:139-148.
Dumet D, Benson EE. 2000. The use of physical and biochemical studies to
elucidate and reduce cryopreservation-induced damage in hydrated/
desiccated plant germplasm. Engelmann F and
Takagi H, editor.
Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm: Current Research Progress
and Application. Roma (IT): IPGRI.
Espelie KE, Franceschi VR, Kolattukudy PE. 1986. Immunocytochemical
localization and time course of appearance of an anionic peroxidase
associated with suberization in woundhealing potato tuber tissue. Plant
Physiol. 81: 487-492.
Fridovich I. 1975. Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem. 44:147-159.
Fry SC. 1986. Cross-linking of matrix polymers in the growing cell walls of
angiosperms. Annu Rev Plant Physiol. 37:165-186.
Halliwell, Gutteridge J. 1999. Free Radicals in Biology and Medicine. New York
(US): Oxford Pr.
Hammerschmidt R, Nuckles E, Kuc J. 1982. Association of enhanced peroxidase
activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichlum
lagenarium. Physiol Plant Patho. 20: 73-82.
Hanum S. 2012. Isolasi pengklonan dan analisis ekspresi gen penyandi
copper/zinc superoxidase dismutase (CuZn-SOD) dari Melastoma
malabath