Konstruksi Mutan D802n Pada Gen Dna Pol I Bacillus thermoleovorans Isolat Lokal Dengan PCR Megaprimer
ｾ＠
ｾ Ｎ Ｚｾ ･ｬ ｾ＠ ｍ ｊｾｏ＠
....
ｾ＠
ｾ＠
ｾ＠
ｾ＠
r
0
0
C')
'>"-
.....
INDONESIAH SOCIETY FOR
MICROBIOLOGY ,,_
.r;.,
Ｇ ｙｊＩｏ
ｎｾＤ＠
Ｌ
ｾﾷ＠
-
PERHIMPUNAN MIKROBIOLOGI INDONESIA
(Indonesian Society for Microbiology)
h.
PROSIDI
Volume II
BIDANG
KESEHATAN, lNDUSTRI DAN L
"Peran Mikrobiologi dalam P
Biodiversitas Tropis bagi Pen
lndustri, Pertanian, Ling ,
dan Pengendalian ｐ･ｮｹ
［ :ｾ ＬＮ＠
ﾥ｟ﾷｾＺｲＮ＠
;.:"'
......
-.·.
ｾ＠
KONSTRUKSI MUTAN D802N PADA GEN DNA POL I
Bacillus thermoleovorans ISOLAT LOK.AL DENGAN
PCR MEGAPRIMER
Laksmi Ambarsari, Maelita R. Moeis, Kosasih Padmawinata, dan Akhmaloka
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam - ITB
ABSTRAK
Gen yang mengkode DNA Pol I dari Bacillus thermoleovorans isolat lokal telah diklon dan
ditentukan urutan nukleotidanya. Gen tersebut diekspresikan di E.coli dan mernpunyai
panjang 2631 bp yang mengkode 876 asarn amino dengan berat mokekul 97 KDa. Analisis
homologi menunjukkan homologi yang tinggi dengan gen DNA polimerase pada bakteri
dari kelompok Bacillus caldotenax (99%). Struktur-fungsi gen ini masih belum diketahui.
Oleh sebab itu perlu dilakukan studi mutagenesis. Pada penelitian ini telah dilakukan
mutasi terhadap salah satu asam amino yang Iestari dengan rnenggunakan PCR
megaprimer. Asam amino aspartat pada posisi 802 dirnutasi menjadi asparagin. DNA Pol I
mutan diperoleh setelah melalui dua kali proses PCR. Sedangkan untuk mengetahui
keberhasilan mutasi dilakukan ligasi fragmen DNA hasil PCR ke dalam vector pGEM®-T,
selanjutnya ditentukan urutan nukleotidanya. Dari penelitian ini diperoleh fragmen DNA
dengan ukuran 2631 bp yang merupakan hasil amplifikasi PCR megaprimer. Sedangkan
keberhasilan proses ligasi pada vector pGEM® -T ditunjukkan dengan hasil-hasil analisis
restriksi dan hasil pengurutan nukleotida menunjukkan terjadinya mutasi.
PENDAHULUAN
Penelitian mengcnai bakteri termofilik
dan enzim yang dihasilkan telah mendapat
perhatian pada beberapa tahun terakhir ini,
karena merupakan topik yang menarik dalam
mempelajari filogenetik, struktur-fungsi, serta
terutama
sifat-sifat
protein/enzim
termostabilitas dan termoaktivitasnya. Enzim
termostabil
umumnya
diperoleh
dari
mikroorganisme termofilik. Enzim ini banyak
digunakan di berbagai industri karcna
mempunyai
sifat-sifat
yang
lebih
menguntungkan
dibandingkan
enzirn
termolabil , antara lair. : dapat bekerja pada
suhu cinggi, dapa! mencegah terjadinya
kontaminasi serta men1punyai s!fat ketahanan
yang cukup tinggi le1hadap pciaruc organik
(Zeikus et al., 1998).
Enzim termostabil yang banyak digunakan
dalam teknik biologi molekuler adalah DNA
polimerase. Enzim int digunakan dalam
proses PCR (Polimerase Chain !.s
ekso nuklease 5' ｾ＠ 3' (Joyce dar. Steitz, 1994).
Semua polimerase yang sudah diket.ahui
strukturnya mempur.yai folding yang mirip
367
yaitu menyerupai tangan kanan yang terdiri
atas tiga subdomain, yaitu: subdomain palm,
fingers , dan thumb. Sisi aktif enzim ini
tersusun dari 3 residu asam amino dengan
gugus karboksilat (Asp pada motif A serta
Asp dan Glu pada motif C) yang terletak pada
subdomain palm. Residu asam-asam amino
yang conserved pada motif A terdiri dari
DYSQIELR.
Data
asam-asam
amino
struktural menunjukkan bahwa pada posisi
tersebut residu asam-asam amino berinteraksi
dengan dNTP yang masuk, berikatan dengan
dua ion logam divalen, dan berinteraksi
dengan subdomain fingers selama perubahan
konformasi setelah terikatnya dNTP (Patel
dan Loeb, 2000). Sedangkan residu asamasam amino pada motif C terdiri dari asamasam amino QVHDEL. Atom-atom oksigen
dan nitrogen pada rantai samping dari residu
tersebut sedikitnya akan membentuk satu
ikatan hidrogen atau pasangan ion untuk
menstabilkan konformasi ｾ＠ (Kiefer et al.,
1997).
Dalam penelitian ini akan dilakukan studi
struktur-fungsi DNA polimerase I yang
berasal dari bakteri termofilik isolat lokal.
Bakteri tersebut diisolasi dari kawah
Cimanggu, da!"l diidentifika:>i sebagai Bacillus
thermoleovorans. Gen DNA polimerase yang
berasal dari bakteri ini telah berhasil diklon
dan diekspresikan dalam sel E. coli (Pramono,
komunikasi pribadi) yang terdiri dari 876
residu asam-asam amino dengan massa
molekul sekitar 90 kDa serta mempunyai
hornologi
yang tinggi dengan
DNA
poli:m:rase dari Bacillus caldotenax. Dengan
ｭｾ｢｡ｮ､ｩｧｫ＠
uru tan asam am!nonya
dci;ga n struktur DNA polimerase yang smlah
Jikctah ui (DNA polimcrase dari Bacillus
stearoth erm ophi/;1s, Them111s oquaticus, dan
,1.:/r:now Fra gment dari E. coli),
DNA
nol i111crnse dari ba kt cri tr:rmof!lik lokal
1i.' .-ma;;t•k di cl
ｾ Ｎ Ｚｾ ･ｬ ｾ＠ ｍ ｊｾｏ＠
....
ｾ＠
ｾ＠
ｾ＠
ｾ＠
r
0
0
C')
'>"-
.....
INDONESIAH SOCIETY FOR
MICROBIOLOGY ,,_
.r;.,
Ｇ ｙｊＩｏ
ｎｾＤ＠
Ｌ
ｾﾷ＠
-
PERHIMPUNAN MIKROBIOLOGI INDONESIA
(Indonesian Society for Microbiology)
h.
PROSIDI
Volume II
BIDANG
KESEHATAN, lNDUSTRI DAN L
"Peran Mikrobiologi dalam P
Biodiversitas Tropis bagi Pen
lndustri, Pertanian, Ling ,
dan Pengendalian ｐ･ｮｹ
［ :ｾ ＬＮ＠
ﾥ｟ﾷｾＺｲＮ＠
;.:"'
......
-.·.
ｾ＠
KONSTRUKSI MUTAN D802N PADA GEN DNA POL I
Bacillus thermoleovorans ISOLAT LOK.AL DENGAN
PCR MEGAPRIMER
Laksmi Ambarsari, Maelita R. Moeis, Kosasih Padmawinata, dan Akhmaloka
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam - ITB
ABSTRAK
Gen yang mengkode DNA Pol I dari Bacillus thermoleovorans isolat lokal telah diklon dan
ditentukan urutan nukleotidanya. Gen tersebut diekspresikan di E.coli dan mernpunyai
panjang 2631 bp yang mengkode 876 asarn amino dengan berat mokekul 97 KDa. Analisis
homologi menunjukkan homologi yang tinggi dengan gen DNA polimerase pada bakteri
dari kelompok Bacillus caldotenax (99%). Struktur-fungsi gen ini masih belum diketahui.
Oleh sebab itu perlu dilakukan studi mutagenesis. Pada penelitian ini telah dilakukan
mutasi terhadap salah satu asam amino yang Iestari dengan rnenggunakan PCR
megaprimer. Asam amino aspartat pada posisi 802 dirnutasi menjadi asparagin. DNA Pol I
mutan diperoleh setelah melalui dua kali proses PCR. Sedangkan untuk mengetahui
keberhasilan mutasi dilakukan ligasi fragmen DNA hasil PCR ke dalam vector pGEM®-T,
selanjutnya ditentukan urutan nukleotidanya. Dari penelitian ini diperoleh fragmen DNA
dengan ukuran 2631 bp yang merupakan hasil amplifikasi PCR megaprimer. Sedangkan
keberhasilan proses ligasi pada vector pGEM® -T ditunjukkan dengan hasil-hasil analisis
restriksi dan hasil pengurutan nukleotida menunjukkan terjadinya mutasi.
PENDAHULUAN
Penelitian mengcnai bakteri termofilik
dan enzim yang dihasilkan telah mendapat
perhatian pada beberapa tahun terakhir ini,
karena merupakan topik yang menarik dalam
mempelajari filogenetik, struktur-fungsi, serta
terutama
sifat-sifat
protein/enzim
termostabilitas dan termoaktivitasnya. Enzim
termostabil
umumnya
diperoleh
dari
mikroorganisme termofilik. Enzim ini banyak
digunakan di berbagai industri karcna
mempunyai
sifat-sifat
yang
lebih
menguntungkan
dibandingkan
enzirn
termolabil , antara lair. : dapat bekerja pada
suhu cinggi, dapa! mencegah terjadinya
kontaminasi serta men1punyai s!fat ketahanan
yang cukup tinggi le1hadap pciaruc organik
(Zeikus et al., 1998).
Enzim termostabil yang banyak digunakan
dalam teknik biologi molekuler adalah DNA
polimerase. Enzim int digunakan dalam
proses PCR (Polimerase Chain !.s
ekso nuklease 5' ｾ＠ 3' (Joyce dar. Steitz, 1994).
Semua polimerase yang sudah diket.ahui
strukturnya mempur.yai folding yang mirip
367
yaitu menyerupai tangan kanan yang terdiri
atas tiga subdomain, yaitu: subdomain palm,
fingers , dan thumb. Sisi aktif enzim ini
tersusun dari 3 residu asam amino dengan
gugus karboksilat (Asp pada motif A serta
Asp dan Glu pada motif C) yang terletak pada
subdomain palm. Residu asam-asam amino
yang conserved pada motif A terdiri dari
DYSQIELR.
Data
asam-asam
amino
struktural menunjukkan bahwa pada posisi
tersebut residu asam-asam amino berinteraksi
dengan dNTP yang masuk, berikatan dengan
dua ion logam divalen, dan berinteraksi
dengan subdomain fingers selama perubahan
konformasi setelah terikatnya dNTP (Patel
dan Loeb, 2000). Sedangkan residu asamasam amino pada motif C terdiri dari asamasam amino QVHDEL. Atom-atom oksigen
dan nitrogen pada rantai samping dari residu
tersebut sedikitnya akan membentuk satu
ikatan hidrogen atau pasangan ion untuk
menstabilkan konformasi ｾ＠ (Kiefer et al.,
1997).
Dalam penelitian ini akan dilakukan studi
struktur-fungsi DNA polimerase I yang
berasal dari bakteri termofilik isolat lokal.
Bakteri tersebut diisolasi dari kawah
Cimanggu, da!"l diidentifika:>i sebagai Bacillus
thermoleovorans. Gen DNA polimerase yang
berasal dari bakteri ini telah berhasil diklon
dan diekspresikan dalam sel E. coli (Pramono,
komunikasi pribadi) yang terdiri dari 876
residu asam-asam amino dengan massa
molekul sekitar 90 kDa serta mempunyai
hornologi
yang tinggi dengan
DNA
poli:m:rase dari Bacillus caldotenax. Dengan
ｭｾ｢｡ｮ､ｩｧｫ＠
uru tan asam am!nonya
dci;ga n struktur DNA polimerase yang smlah
Jikctah ui (DNA polimcrase dari Bacillus
stearoth erm ophi/;1s, Them111s oquaticus, dan
,1.:/r:now Fra gment dari E. coli),
DNA
nol i111crnse dari ba kt cri tr:rmof!lik lokal
1i.' .-ma;;t•k di cl