Pengaruh Mutasi D802N pada Aktivitas Polimerase DNA Pol I ITB-1
PROC. !TB Sains & Tek. Vol. 38 A, No. 2. 2006, 89-98
89
Pengaruh Mutasi D802N pada Aktivitas Polimerase
DNA Pol I ITB-1
L. Ambarsari1, F. Madayanti1, M. R. Moeis1 & Akhmaloka 1*
1
Biokimia, FMIPA Institut Teknologi Bandung
2
SITH, Institut Teknologi Bandung
n. Ganesha 10 Bandung 40132, Telp. (022)2502103,
Abstrak. Gen mutan D802N DNA Pol I ITB-1 telah dikonstruksi dan
diekspresi secara heterolog di Escherichia coli. Ekstrak enzim kasar dari
mutan ini telah dikarakterisasi dan menunjukkan adanya perbedaan sifat
dibanding dengan ekstrak enzim kasar dari protein wild-type. pH dan suhu
optimilln enzim mutan berturut-turut adalah 9,0 dan 50°C; Sedangkan enzim
wild.:type 7,4 dan 65°C. Perubahan kondisi optimum ini menyebabkan turunnya
aktivitas spesifik enzim mutan hingga 2,7 kali , yaitu dari 3,71 unit/mg protein
untuk enzim wild-type menjadi 1,34 unit/mg protein untuk enzim mutan. Hal
yang sama terjadi pada penentuan nilai Km dan Vmat. terhadap substrat (dNTP),
sehingga effisiensi katalitik ｾＯｋｭＩ＠
enzim mutan menurun ± 2 kali dibanding
enzim wild-type. Mutasi D802N pada gen penyandi DNA Pol I ITB-1
menyebabkan afmitas enzim-substrat berkurang sehingga aktivitas enzim
menurun dan enzim menjadi kurang stabil.
Kata kunci: DNA pol I JTB-1; mutan D802N; karakterisasi; aktivitas spesifik; efzsiensi
katalitik
Abstract. D802N mutant gene of DNA Pol I ITB-1 was constructed and
expressed in Escherichia coli. The crude enzyme was characterized and
compared to that the wild-type. The optimum pH and temperature of the mutant
was slightly differences with those the wild-type. The optimum pH and
temperature of the mutant were 9.0 and 50°C, while the wild-type were 7.4 and
65°C, respectively. The differences of the above properties were followed by
decreasing of specific activities of the mutant (1.34 unit/ffig protein) 2.7 times
lower io that the wild-type (3.71 unit/mg protein). Meanwhile the catalytic
efficiency ｾＮＯｋｭ＠
) of the mutant decreased 2 times lower compared to that the
wild-type. Mutation at D802N of DNA pol I ITB-1 caused decreasing on the
mutant affinity to the substrate and thus loss activity and instability of the
enzyme.
Keywords: DNA pol I !TB-I ; D802N mutant; characterization; specific activity;
catalytic efficiency.
•t>enulis korcspondcnsi : E-mail:
ｬｯｫ｡
｀
｣ｨ
ｾ ｭ
Ｎｩ ｴ｢
Ｎ｡｣
ｩ､＠
Maka!ah diteri ma redaksi tanggal 16 !'v!ei 2005, revisi ditcrima tanggal 7 Juni 2006.
L. Ambarsari, et al.
90
1
Pendahuluan
Secara in vivo, DNA polimerase mempunyai peranan yang sangat penting yaitu
dalam proses replikasi dan perbaikan kesalahan DNA (repair). Fungsi utama
aktivitas enzim tersebut adalah mengkatalisis penambahan unit mononukleotida
dari deoksiribonukleosida 5 '-trifosfat (dNTP) pada ujung 3 '-OH bebas suatu
untaian primer. Dalam reaksi tersebut diperlukan satu untai DNA yang
digunakan sebagai cetakan (template) yang mengarahkan enzim dalam
menyeleksi nukleotida yang masuk {I)_
Beberapa DNA Polimerase telah diidentifikasi dan dikarakterisasi baik dari
eubakteria niaupun archaea termofilik. Taq Pol I (Thermus aquaticus Pol I)
merupakan enzim polimerase yang pertama kali diisolasi dari .eubakteria
termofilik clan Vmab enzim mutan D802N adalah 1,37 µM dan
15,737 x 101 prnol/menit (Gambar 3) .
L. Ambarsari, et al.
96
16
y = 8.S578x + 6.316
R' = 0.8256
12
-1/K.m
y = 4 .7172x + 4.951
R' = 0.9673
-2 -1 . -1
5
-0.
5
0 0.5
1 1.5 2
1/S
Gambar 3
D802N.
Nilai Km(dNTPJ dan Vmaks DNA Pol I ITB-1 wild-type dan mutan
9
(wild-type);
•
(mutan D802N).
SeJain nilai K,,, dapat juga ditentukan nilai kcat enzim yang menggambarkan
jumlah maksimum molekul substrat yang dikonversi menjadi produk (tum over
number). Berdasarkan basil percobaan, mutasi D802N juga memberikan
pengaruh terhadap nilai kcal . Kenaikan nilai Km(dNTPJ menyebabkan nilai kcat
berkurang 13% bila dibandingkan enzim wild-type (Tabel 2). Parameter
kinetika lainnya yaitu kcat/K.,. yruig menggambarkan effisiensi katalitik. Tabel 2
menunjukkan terjadi penurunan nilai kcat!Km untuk enzim mutan D802N ± 2
kali dibanding enzim wild-type.
Perubahan nilai Km dan Vmat. diduga karena terjadinya perubahan pH dan suhu
optimum enzim. Berdasarkan hasil-hasil yang diperoleh, menunjukkan bahwa
perubahan pH dan suhu optimum pada enzim muta..1 D802N menyebabkan. nilai
K,., meningkat l,'i kali dibandingkan euzim wild-type. Peningkatan nilai
menunjukkan per.urunan affinitas enzim terhactap substrat dNTP demikian pula
dengan pembentukan produk (dari data diperoleh nilai Vma.tr menunm). Hasil
pcnelitian yan.g dilakukan oleh Copelalld(l 1) yaitu dengan melakukan mutasi
pada daerah II (motif DFNSL YPSII) menunjukkan bahwa nilai Km enzim muta..n
meningkat bila dibandingkan enzim wild-type. Kelompok peneliti lain juga
telah melaporkan hasii-hasil penelitiannya dengan melakukan mutasi terhadap
rcsidu asam amino yang mengandung gugus karhoksilat, yaitu mutasi (D705E,
D705A); (E7lOD, E710A); (D882E, D882A); dan (E883D, E883A) pada
polimerase yc;ng berasal dari Kienow Fragment (KF). Hasil pe.nclitian
menunjukkan bahwa terjadi penurunan terhadap aktivitas polimerase baik yang
dimutasi menjadi E maapun A dcngan penuruna.n diantara 30-70% cs>.
"
Pengaruh Mutasi D802N pada Aktivitas Polimerase DNA
Tabel 2
Parameter kinetika enzim wild-type clan enzim mutan D802N.
No
Sampel
kc at
Menif1
Relatif
kc at/Km
kc at
M"1.menif1
I
Wild-type
0,64
1,00
6,7 x 103
Mutan
0,56
0,87
4,1 x 103
2
4
97
D802N
Kesirnpulan
Berdasarkan hasil percobaan, enzim mutan D802N DNA Pol ! ITB-1
mempunyai sifat berbeda dengan enzim wild-type. Enzim mutan D802N
mempunyai pH dan suhu optimum pada 9,0 dan 500C dengan aktivitas spesifik
1,34 unit/ mg protein; Sedangkan enzim wild-type mempunyai pH dan suhu
optimum pada 7,4 dan 650C dengan aktivitas spesifik 3,71 unit/ mg protein.
Nilai Km(dNTPJ dan Vmatr enzim mutan D802N 1.37 mM dan 15.832 x 103
pmol/menit; Sedangkan nilai Km(dNTPJ dan Vmats enzim wild-type 0,95 mM dan
20.197 x 103 pmol/menit. Hal ini menyarankan bahwa mutasi 0 802 menjadi
N 802 menyebabkan afinitas enzim terhadap substrat berkurang.
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini tidak dapat dilaksanakan dengan baik tanpa bantuan dana dari
Riset Unggulan Terpadu X, Kementrian Riset dan Teknologi.
Daftar Pustaka
1.
2.
3.
4.
Joyce, C.M., & Steitz, T.A., Function And Structure Relationships In
DNA Polymerases, Annu. Rev. Biochem, 63, 773 - 822 (1994).
Bionda!, T., Thorbjamardottir, S.H., Kieleczawa, J., Hjorrleifsdottir,S.,
Kristjansson, J.K., Einarsson, J.M., Eggertsson, G. (2001). Cloning,
Sequence Analysis and Functional Characterization of DNA Polymerase
I from the Thermophilic Eubacterium Rhodothermus marinus.
Biotechnol. Appl. Biochem. 34:37 - 45.
Pisani, F.M., Felice, M.D., Manco, G., & Rossi, M., Domain
Organization and Biochemical Features of Sulfolobus solfataricus DNA
Poly merase, Extremophile, 2, 171 - 177 ( 1998).
Kiefer, J.R., Mao, C., Hansen, C.L Basehore, SL., Hogrefe, H.H,
Braman, J.C., & Beese, L.S., O ystal Structure of a Thermostable
Bacillus DNA Polymerase I Large Fragment at 2. 1 A" Resolutio,
Structure, 5, 95-108 (1997).
Akhmrubka, Pramoho i-t; Tika I.N., Suharto A., Retnoningrum D.S.,
Sindurifarta ·M.; Padmawinata K., dan Oei B.L. , (2000b). Eksplorasi
potensi bakteri termofilik isolat lokal: Studi kasus DNA polimerase
termostabil, Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi1Il;-C.ibinong 7-9 Maret 2000: 31-39.
6.
Pramono ｩｴ ｾ＠ .ｋｬｏｮｩｾ＠
dan Ekspresi di Escherichia coli Gen DNA
Polimerase . J.. Bakteri LTermofilik Isolat Cimanggu. Disertasi Doktor,
Departemen Kiniia, InstitufTeknologi Bandung (2004).
7.
Ambarsari; L , Pramorto; H., Madayanti,F., Moeis, R.M., & Akhmaloka,
Konstruksi dan Overekspresi Gen Penyandi DNA Polimerase I Mutan
dari Bakteri Termofilik Isolat Lokal, J.Hayati, 11, 115-120 (2004).
8.
Gangurde, R"'" N., Kaushik, Singh, K., & Modak, M.J., A Carboxylate
Triad Is Essential for the Polymerase Activity of Escherichia coli DNA
Polymerase I (Kienow Fragment), J. Biol. Chem, 275, 19685 - 19692
(2000).
9.
Sambrook, J., Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Ed., ke-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001).
10. Bradford, M.M., A Rapid and Sensitive Method for the Quntitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976).
1
11. Copeland, C. , Dong, Q., Wang, T.S.F., Rational/or Mutagenesis ofDNA
Poly merase Active Sites: DNA Polymerase a, Methods in Enzymology,
262, 294-303 (1995).
5.
89
Pengaruh Mutasi D802N pada Aktivitas Polimerase
DNA Pol I ITB-1
L. Ambarsari1, F. Madayanti1, M. R. Moeis1 & Akhmaloka 1*
1
Biokimia, FMIPA Institut Teknologi Bandung
2
SITH, Institut Teknologi Bandung
n. Ganesha 10 Bandung 40132, Telp. (022)2502103,
Abstrak. Gen mutan D802N DNA Pol I ITB-1 telah dikonstruksi dan
diekspresi secara heterolog di Escherichia coli. Ekstrak enzim kasar dari
mutan ini telah dikarakterisasi dan menunjukkan adanya perbedaan sifat
dibanding dengan ekstrak enzim kasar dari protein wild-type. pH dan suhu
optimilln enzim mutan berturut-turut adalah 9,0 dan 50°C; Sedangkan enzim
wild.:type 7,4 dan 65°C. Perubahan kondisi optimum ini menyebabkan turunnya
aktivitas spesifik enzim mutan hingga 2,7 kali , yaitu dari 3,71 unit/mg protein
untuk enzim wild-type menjadi 1,34 unit/mg protein untuk enzim mutan. Hal
yang sama terjadi pada penentuan nilai Km dan Vmat. terhadap substrat (dNTP),
sehingga effisiensi katalitik ｾＯｋｭＩ＠
enzim mutan menurun ± 2 kali dibanding
enzim wild-type. Mutasi D802N pada gen penyandi DNA Pol I ITB-1
menyebabkan afmitas enzim-substrat berkurang sehingga aktivitas enzim
menurun dan enzim menjadi kurang stabil.
Kata kunci: DNA pol I JTB-1; mutan D802N; karakterisasi; aktivitas spesifik; efzsiensi
katalitik
Abstract. D802N mutant gene of DNA Pol I ITB-1 was constructed and
expressed in Escherichia coli. The crude enzyme was characterized and
compared to that the wild-type. The optimum pH and temperature of the mutant
was slightly differences with those the wild-type. The optimum pH and
temperature of the mutant were 9.0 and 50°C, while the wild-type were 7.4 and
65°C, respectively. The differences of the above properties were followed by
decreasing of specific activities of the mutant (1.34 unit/ffig protein) 2.7 times
lower io that the wild-type (3.71 unit/mg protein). Meanwhile the catalytic
efficiency ｾＮＯｋｭ＠
) of the mutant decreased 2 times lower compared to that the
wild-type. Mutation at D802N of DNA pol I ITB-1 caused decreasing on the
mutant affinity to the substrate and thus loss activity and instability of the
enzyme.
Keywords: DNA pol I !TB-I ; D802N mutant; characterization; specific activity;
catalytic efficiency.
•t>enulis korcspondcnsi : E-mail:
ｬｯｫ｡
｀
｣ｨ
ｾ ｭ
Ｎｩ ｴ｢
Ｎ｡｣
ｩ､＠
Maka!ah diteri ma redaksi tanggal 16 !'v!ei 2005, revisi ditcrima tanggal 7 Juni 2006.
L. Ambarsari, et al.
90
1
Pendahuluan
Secara in vivo, DNA polimerase mempunyai peranan yang sangat penting yaitu
dalam proses replikasi dan perbaikan kesalahan DNA (repair). Fungsi utama
aktivitas enzim tersebut adalah mengkatalisis penambahan unit mononukleotida
dari deoksiribonukleosida 5 '-trifosfat (dNTP) pada ujung 3 '-OH bebas suatu
untaian primer. Dalam reaksi tersebut diperlukan satu untai DNA yang
digunakan sebagai cetakan (template) yang mengarahkan enzim dalam
menyeleksi nukleotida yang masuk {I)_
Beberapa DNA Polimerase telah diidentifikasi dan dikarakterisasi baik dari
eubakteria niaupun archaea termofilik. Taq Pol I (Thermus aquaticus Pol I)
merupakan enzim polimerase yang pertama kali diisolasi dari .eubakteria
termofilik clan Vmab enzim mutan D802N adalah 1,37 µM dan
15,737 x 101 prnol/menit (Gambar 3) .
L. Ambarsari, et al.
96
16
y = 8.S578x + 6.316
R' = 0.8256
12
-1/K.m
y = 4 .7172x + 4.951
R' = 0.9673
-2 -1 . -1
5
-0.
5
0 0.5
1 1.5 2
1/S
Gambar 3
D802N.
Nilai Km(dNTPJ dan Vmaks DNA Pol I ITB-1 wild-type dan mutan
9
(wild-type);
•
(mutan D802N).
SeJain nilai K,,, dapat juga ditentukan nilai kcat enzim yang menggambarkan
jumlah maksimum molekul substrat yang dikonversi menjadi produk (tum over
number). Berdasarkan basil percobaan, mutasi D802N juga memberikan
pengaruh terhadap nilai kcal . Kenaikan nilai Km(dNTPJ menyebabkan nilai kcat
berkurang 13% bila dibandingkan enzim wild-type (Tabel 2). Parameter
kinetika lainnya yaitu kcat/K.,. yruig menggambarkan effisiensi katalitik. Tabel 2
menunjukkan terjadi penurunan nilai kcat!Km untuk enzim mutan D802N ± 2
kali dibanding enzim wild-type.
Perubahan nilai Km dan Vmat. diduga karena terjadinya perubahan pH dan suhu
optimum enzim. Berdasarkan hasil-hasil yang diperoleh, menunjukkan bahwa
perubahan pH dan suhu optimum pada enzim muta..1 D802N menyebabkan. nilai
K,., meningkat l,'i kali dibandingkan euzim wild-type. Peningkatan nilai
menunjukkan per.urunan affinitas enzim terhactap substrat dNTP demikian pula
dengan pembentukan produk (dari data diperoleh nilai Vma.tr menunm). Hasil
pcnelitian yan.g dilakukan oleh Copelalld(l 1) yaitu dengan melakukan mutasi
pada daerah II (motif DFNSL YPSII) menunjukkan bahwa nilai Km enzim muta..n
meningkat bila dibandingkan enzim wild-type. Kelompok peneliti lain juga
telah melaporkan hasii-hasil penelitiannya dengan melakukan mutasi terhadap
rcsidu asam amino yang mengandung gugus karhoksilat, yaitu mutasi (D705E,
D705A); (E7lOD, E710A); (D882E, D882A); dan (E883D, E883A) pada
polimerase yc;ng berasal dari Kienow Fragment (KF). Hasil pe.nclitian
menunjukkan bahwa terjadi penurunan terhadap aktivitas polimerase baik yang
dimutasi menjadi E maapun A dcngan penuruna.n diantara 30-70% cs>.
"
Pengaruh Mutasi D802N pada Aktivitas Polimerase DNA
Tabel 2
Parameter kinetika enzim wild-type clan enzim mutan D802N.
No
Sampel
kc at
Menif1
Relatif
kc at/Km
kc at
M"1.menif1
I
Wild-type
0,64
1,00
6,7 x 103
Mutan
0,56
0,87
4,1 x 103
2
4
97
D802N
Kesirnpulan
Berdasarkan hasil percobaan, enzim mutan D802N DNA Pol ! ITB-1
mempunyai sifat berbeda dengan enzim wild-type. Enzim mutan D802N
mempunyai pH dan suhu optimum pada 9,0 dan 500C dengan aktivitas spesifik
1,34 unit/ mg protein; Sedangkan enzim wild-type mempunyai pH dan suhu
optimum pada 7,4 dan 650C dengan aktivitas spesifik 3,71 unit/ mg protein.
Nilai Km(dNTPJ dan Vmatr enzim mutan D802N 1.37 mM dan 15.832 x 103
pmol/menit; Sedangkan nilai Km(dNTPJ dan Vmats enzim wild-type 0,95 mM dan
20.197 x 103 pmol/menit. Hal ini menyarankan bahwa mutasi 0 802 menjadi
N 802 menyebabkan afinitas enzim terhadap substrat berkurang.
Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini tidak dapat dilaksanakan dengan baik tanpa bantuan dana dari
Riset Unggulan Terpadu X, Kementrian Riset dan Teknologi.
Daftar Pustaka
1.
2.
3.
4.
Joyce, C.M., & Steitz, T.A., Function And Structure Relationships In
DNA Polymerases, Annu. Rev. Biochem, 63, 773 - 822 (1994).
Bionda!, T., Thorbjamardottir, S.H., Kieleczawa, J., Hjorrleifsdottir,S.,
Kristjansson, J.K., Einarsson, J.M., Eggertsson, G. (2001). Cloning,
Sequence Analysis and Functional Characterization of DNA Polymerase
I from the Thermophilic Eubacterium Rhodothermus marinus.
Biotechnol. Appl. Biochem. 34:37 - 45.
Pisani, F.M., Felice, M.D., Manco, G., & Rossi, M., Domain
Organization and Biochemical Features of Sulfolobus solfataricus DNA
Poly merase, Extremophile, 2, 171 - 177 ( 1998).
Kiefer, J.R., Mao, C., Hansen, C.L Basehore, SL., Hogrefe, H.H,
Braman, J.C., & Beese, L.S., O ystal Structure of a Thermostable
Bacillus DNA Polymerase I Large Fragment at 2. 1 A" Resolutio,
Structure, 5, 95-108 (1997).
Akhmrubka, Pramoho i-t; Tika I.N., Suharto A., Retnoningrum D.S.,
Sindurifarta ·M.; Padmawinata K., dan Oei B.L. , (2000b). Eksplorasi
potensi bakteri termofilik isolat lokal: Studi kasus DNA polimerase
termostabil, Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi1Il;-C.ibinong 7-9 Maret 2000: 31-39.
6.
Pramono ｩｴ ｾ＠ .ｋｬｏｮｩｾ＠
dan Ekspresi di Escherichia coli Gen DNA
Polimerase . J.. Bakteri LTermofilik Isolat Cimanggu. Disertasi Doktor,
Departemen Kiniia, InstitufTeknologi Bandung (2004).
7.
Ambarsari; L , Pramorto; H., Madayanti,F., Moeis, R.M., & Akhmaloka,
Konstruksi dan Overekspresi Gen Penyandi DNA Polimerase I Mutan
dari Bakteri Termofilik Isolat Lokal, J.Hayati, 11, 115-120 (2004).
8.
Gangurde, R"'" N., Kaushik, Singh, K., & Modak, M.J., A Carboxylate
Triad Is Essential for the Polymerase Activity of Escherichia coli DNA
Polymerase I (Kienow Fragment), J. Biol. Chem, 275, 19685 - 19692
(2000).
9.
Sambrook, J., Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Ed., ke-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001).
10. Bradford, M.M., A Rapid and Sensitive Method for the Quntitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye
Binding, Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976).
1
11. Copeland, C. , Dong, Q., Wang, T.S.F., Rational/or Mutagenesis ofDNA
Poly merase Active Sites: DNA Polymerase a, Methods in Enzymology,
262, 294-303 (1995).
5.