AMPLIFIKASI LINTAS SPESIES MARKA SSR

68

BAB V AMPLIFIKASI LINTAS SPESIES MARKA SSR

JARAK PAGAR Jatropha curcas L. DALAM GENUS: POLIMORFISME ALEL DAN DERAJAT HUBUNGAN Abstrak Marka SSR mempunyai sifat transferable sehingga dapat digunakan untuk mengakses keragaman genetik spesies lain di luar spesies di mana marka tersebut dikembangkan. Di Indonesia ada empat kerabat dekat Jatropha curcas yang potensial untuk dimanfaatkan sebagai sumber keragaman baru melalui persilangan insterspesies. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan amplifikasi lintas spesies marka SSR yang telah dikembangkan dari J. curcas kepada spesies kerabatnya J. integerrima, J. multifida, J. gossypifolia, J. podagrica dan mengetahui derajat hubungan antara spesies-spesies tersebut. Dari 28 primer yang digunakan 11 primer dapat diamplifikasi pada semua spesies yang diuji. Pasangan primer EU099519, EU099528 dan EU099525 tidak dapat diamplifikasi kecuali pada J. curcas . Persentase polimorfisme keseluruhan di antara semua spesies yang diuji adalah 95 dengan rerata kesamaan genetik sebesar 0.34. Persentase polimorfisme paling rendah 17.35 dengan kesamaan genetik paling tinggi 0.60 didapatkan antara J. podagrica vs J. multifida. Korelasi antara persentase polimorfisme dengan kesamaan genetik cukup baik yaitu bernilai 0.75. Analisis dendrogram menunjukkan bahwa jarak paling jauh ditemukan antara J. curcas dengan J. gossypifolia dan jarak paling dekat ditemukan antara J. podagrica dan J. multifida . Marka yang digunakan dapat diandalkan untuk membedakan antar spesies dan dapat digunakan untuk identifikasi hasil persilangan interspesifik secara molekuler. Kata kunci : spesies kerabat, J. integerrima Jacq., jarak genetik 69 Cross-Species Amplification of Physic Nut Jatropha curcas L. Simple Sequence Repeats SSRs Within the Genus: Allelic Polymorphism and Degree of Relationship Abstract The transferability of SSR markers can be used to access the genetic diversity of other related species in which the markers were developed. In Indonesia there are four close relatives of Jatropha curcas which has potential to be used as a source of new diversity through insterspecific crossing. This research was conducted to determine the ability of cross-species amplification of SSR markers developed from J. curcas to the relatives of species J. integerrima, J. multifida, J. gossypifolia, J. podagrica and study the relationship between these species. Out of 28 primers checked 11 primers showed cross species amplification in all the species tested. Primer pairs EU099519, EU099528 EU099525 amplified in J. curcas but did not show cross species amplification. Overall percentage of polymorphism PP among all species tested was 95 and the mean genetic similarity GS was found to be 0.34. Least PP 17.35 and highest GS 0.60 was found between J. podagrica and J. multifida. The correlation between the PP with GS was good enough 0.75. Dendrogram analysis showed that the farthest distance was found between J. curcas and J. gossypifolia and the closest distance found between J. podagrica and J. multifida. SSR markers used in this study reliable to distinguish between species and can be used to identify the interspecific hybrid based on molecular marker. Keywords: relative species, Jatropha integerrima Jacq., genetic distance 70 Pendahuluan Pada studi genom modern, marka molekuler berbasis DNA menjadi alat yang efektif yang dapat diaplikasikan untuk pemetaan genom, analisis sidik jari DNA, analisis keragaman genetik serta studi filogeni dan evolusi Semagn et al., 2006. Di antara beberapa kelas marka molekuler, marka SSR adalah marka molekuler yang menguntungkan karena bersifat kodominan, multi alel, bersifat reproducible , relatif berlimpah dan memiliki cakupan luas dalam genom serta mempunyai kemampuan cukup tinggi untuk dapat ditransfer ke lain spesies atau genus transferable Gupta et al., 1999; Varsney et al., 2005. Pengembangkan marka SSR berdasarkan genom J. curcas telah dilaporkan oleh beberapa peneliti Sudheer et al., 2011; Yadav et al., 2011; Sun et al., 2008; Zubieta et al. 2009 dan telah dimanfaatkan untuk evaluasi keragaman genetik jarak pagar. Marka SSR tersebut selain sangat berguna untuk diaplikasikan dalam studi genetik jarak pagar dapat juga diaplikasikan untuk studi genetik pada taksa yang berbeda Sudheer et al ., 2011; Yadav et al., 2011; Rossetto et al., 1999; Barbara et al., 2007. Pemanfaatan marka yang sudah dikembangkan untuk mengakses informasi genetik spesies lain akan menghemat waktu dan biaya dalam studi genetik spesies yang bersangkutan. Jatropha adalah sebuah genus besar yang mempunyai keragaman dalam bentuk pertumbuhan serta merupakan tanaman monoecious atau dioecious yang menarik. Terdiri dari 150-175 spesies tanaman berkayu atau semak yang biasanya tumbuh di daerah tropis Dehgan, 1982. Jatropha terbagi dalam dua subgenus yaitu subgenus Jatropha dan subgenus Curcas Dehgan dan Webster, 1979 dalam Heller, 1996. J. curcas menjadi tanaman penting sebagai penghasil biodiesel karena kandungan minyak bijinya tinggi Heller, 1996. Beberapa studi berbasis marka molekuler telah dilakukan untuk mengakses keragaman genetik J. curcas Ganesh et al., 2008; Basha dan Sujatha, 2007; Basha dan Sujatha, 2009, Ikbal et al. , 2010; Jubera et al., 2009; Rosado et al., 2010 dengan RAPD; Ranade et al., 2008 dengan SPAR; Sun et al., 2008 dengan SSR dan AFLP; Tatikonda et al. 2009; Zhang et al., 2011 dengan AFLP; Basha dan Sujatha, 2007; Basha dan Sujatha, 2009 dengan ISSR. Semua studi yang telah dilakukan tersebut di atas 71 dan studi yang telah dilakukan sebelumnya terhadap plasma nutfah J. curcas Indonesia menunjukan tingkat keragaman genetik yang rendah. Diperlukan langkah-langkah untuk meningkatkan keragaman genetik pada J. curcas sehingga program pemuliaan J. curcas dapat dilakukan dengan lebih optimal. Peningkatan keragaman genetik dapat ditempuh melalui persilangan interspesies dengan spesies-spesies kerabatnya. Informasi genetik spesies kerabat J. curcas perlu dipelajari untuk dapat melakukan persilangan interspesies yang terencana dan mendapatkan hasil optimal. Informasi genetik kerabat J. curcas dapat diakses dengan memanfaatkan marka SSR yang telah dikembangkan pada J. curcas. Beberapa studi telah dilakukan dalam memanfaatkan sifat transferability marka SSR untuk mengakses keragaman genetik J. curcas dan kerabatnya dalam genus Jatropa Yadav et al., 2011; Sudheer et al., 2011; Whankaew et al., 2011; Wen et al ., 2010 dan terbukti bermanfaat. Di Indonesia dan Thailand ada lima spesies Jatropha yang dijumpai yaitu: J. curcas L. dan J. gossypifolia L. yang digunakan sebagai tanaman obat serta J. integerrima Jacq., J. multifida L. and J. podagrica Hook. digunakan sebagai tanaman hias Hasnam, 2006b; Soontornchainaksaeng dan Jenjittikul, 2003. J multifida, J. podagrica, J. gossypifolia dan J. integerrima termasuk dalam subgenus Jatropha sedangkan J. curcas masuk dalam subgenus Curcas Dehgan, 1982. J. curcas, J. glandulifera, J. gossipifolia, J. integerrima, J. multifida , J. multifida, J. podagrica dan J. tanjorensis tersebar luas di India. J. curcas, J. integerrima dan J. glanduifera asli dari Amerika Sunita et al., 2005. J. podagrica adalah tanaman semak yang multiguna yang umum ditemukan di Afrika, Asia dan Amerika Latin Olapeju et al., 2008. J. tanjorensis dilaporkan asli dari India dan hanya ada di wilayah yang terbatas di Tamil Nadu umumnya ditanam sebagai pagar dan dilaporkan sebagai hasil persilangan alami antara J. curcas L. dan J. gossypifolia L. Pabakaran dan Sujatha, 1999. J. gossypifolia sering disebut dengan bellyache bush merupakan gulma utama di Australia Oduola et al., 2005; Csurhes, 1999. J. multifida ditemukan secara alami di Meksiko dan digunakan sebagai tanaman taman di Florida Selatan Dehgan, 1982. 72 Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari kemampuan marka SSR yang didapatkan dari J. curcas untuk dapat diamplifikasi pada spesies kerabat J. curcas yaitu J. multifida, J. integerrima bunga merah dan merah muda, J. podagrica dan J. gossypifolia serta untuk mengetahui derajat hubungan antara spesies- spesies Jatropha. Bahan dan Metode Analisis molekuler dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, IPB. Penelitian dilakukan dari bulan Nopember 2009 sampai dengan bulan April 2010. Bahan tanaman untuk percobaan semua berasal dari Bogor yang terdiri dari lima spesies Jatropha yaitu J. curcas L., J. multifida L. J. intergerrima Jack. bunga merah dan bunga merah muda, J. gossypifolia L. dan J. podagrica Hook Lampiran 5 yang masing-masing berjumlah 2 tanaman. Beberapa karakter morfologi spesies-spesies ini dapat dilihat pada lampiran 5. Marka yang digunakan adalah 28 pasang marka SSR yang telah dikembangkan pada penelitian sebelumnya. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dengan metode ekstraksi DNA jarak pagar yang digunakan pada penelitian sebelumnya Sudheer et al. 2009. Sebanyak 0.1 g daun muda berukuran ± 3 cm dari tanaman yang tumbuh di lapangan, digerus dengan 500 µL buffer ekstraksi CTAB 2, 100 mM Tris HCl pH 8, 3.5 M NaCl, 0.5 M EDTA dan 1 polyvinylpolypyrolydone PVP. Ekstrak daun kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro berukuran 2.000 µL, ditambahkan 1. 5 β- merkaptoetanol dan diinkubasi pada suhu 65 o Campuran disentrifugasi 8.000 rpm selama 8 menit pada suhu ruang. Fase cair bagian atas dipindahkan ke tabung yang baru dan ditambahkan 2M NaCl dengan volume sebanding. Ke dalam campuran tersebut ditambahkan isopropanol C selama 90 menit. Setelah inkubasi ditambahkan kloroform:isoamil alkohol 24:1 dengan volume sebanding dan dikocok perlahan selama 10 menit. 73 sebanyak 0.6 kali volume akhir dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Alkohol 80 sebanyak 2 x dari volume akhir ditambahkan pada campuran tersebut dan campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya campuran disentrifugasi 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Pelet dicuci dengan alkohol 70 kemudian dikeringkan dan dilarutkan pada 200 µL buffer TE. Kuantifikasi DNA dilakukan dengan spektrofotometer maupun dengan running pada gel agarosa. Amplifikasi DNA dan separasi hasil amplifikasi Volume reaksi amplifikasi PCR yang digunakan adalah 25 µL, masing- masing terdiri atas 1X buffer reaksi, 0.1 µM dNTPs, 1 unit Real Taq DNA Polymerase Real Biotech Corporation dan 20 ng templat DNA. Reaksi amplifikasi PCR dilakukan menggunakan GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer dengan denaturasi awal pada 95 o C selama 5 menit; diikuti dengan 35 siklus yang masing-masing siklus terdiri atas tahapan denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, penempelan primer primer annealing pada suhu yang sesuai untuk masing-masing primer selama 1 menit, pemanjangan primer primer elongation pada suhu 72 o C selama 1 menit. Pada akhir reaksi ditambahkan satu siklus final extension dengan suhu 72 o Skoring pita DNA hasil amplifikasi dilakukan secara individual dan dianalisis statistik sehingga mendapatkan nilai kesamaan genetik genetic similarity sesuai dengan Nei dan Li 1979 dengan definisi sebagai berikut Sij = 2a2a+b+c, di mana Sij adalah kesamaan genetik antara 2 individu i dan j, a adalah jumlah pita yang muncul di i maupun j, b adalah jumlah pita yang muncul di i tetapi tidak muncul di j dan c adalah jumlah pita yang tidak muncul di i tetapi C selama 5 menit. DNA hasil amplifikasi diseparasi dengan PAGE 40 akrilamidebis- akrilamid, 10 amonium persulfat, 5X buffer TBE, urea dan TEMED pada Dedicated Height Sequencer Cole-Parmer menggunakan buffer TBE 1X pada tegangan konstan 1.100 V selama 3 jam. Volume hasil PCR yang dianalisis adalah 1.8 µL dengan 60 sampel per gel. Hasil PAGE divisualisasi dengan pewarnaan menggunakan pewarnaan perak silver staining. Analisis data 74 muncul di j. Persentase polimorfisme PP dihitung dengan formula PP = jumlah total lokus polimorfjumlah total lokus dikalikan 100. Pohon filogenetik dibuat berdasarkan Unweight Pair Group Method Arithmetic UPGMA dengan bantuan perangkat lunak NTSYSpc 2.02 Rohlf, 1998. Analisis boostrap antar lokus dengan mengambil ulangan 2000 dilakukan dengan program Winboot Yap dan Nelson, 1996. Persentase transferability dihitung dengan membandingkan marka yang dapat diamplifikasi pada satu spesies dengan keseluruhan marka yang digunakan dikalikan 100. Hasil Dua puluh delapan primer yang digunakan dalam percobaan ini adalah primer terpilih yang yang dikembangkan berdasarkan basis data DNA J. curcas dan telah terbukti dapat teramplifikasi pada templat DNA jarak pagar. Primer- primer digunakan untuk menguji kemampuan amplifikasi lintas spesies pada 4 spesies yaitu J. multifida, J. podagrica, J. gossypifolia dan J. integerrima bunga merah muda dan bunga merah Tabel 12, Lampiran 5. Dari 28 primer yang digunakan, 11 primer 39.3 dapat teramplifikasi pada semua 4 spesies lain, 8 primer 28.57 hanya teramplifikasi pada 3 spesies lain dan masing-masing 3 primer 10.71 yang teramplifikasi pada 2, dan 1 spesies lain. Tiga primer sisanya EU099519, EU099528, EU099525 10.71 tidak dapat teramplifikasi pada genom spesies lain. Rerata jumlah primer yang dapat diamplifikasi oleh masing-masing spesies adalah 18.2 65. Tabel 12 Daftar lima spesies Jatropha yang digunakan untuk penelitian Spesies Jml kromosom Pusat keragaman 1 Jatropha curcas L. 2n = 22 Meksiko, Amerika tengah 2 Jatropha multifida L. 2n = 22 Barbados Jatropha podagrica L. 3 2n = 22 Panama, Honduras, Guatemala Jatropha gossypiifolia Hook 3 2n = 22 Amerika Selatan Jatropha integerrima Jacq. 3 2n = 22 Persilangan alam kompleks, dari Kuba 3 Keterangan: 1 Soontornchainaksaeng dan Jenjittikul, 2003; 2 Heller, 1996; 3 Dehgan, 1982; belum jelas 75 Satu primer EU586346 menghasilkan pita monomorf pada semua spesies yang diuji. Persentase kemampuan amplifikasi lintas spesies terbesar ditemukan pada J. podagrica 75.00 dan terrendah pada J. multifida 57.14 Tabel 13; Gambar 11. Jumlah total alel yang didapatkan dari 12 individu termasuk J. curcas menggunakan 28 primer SSR adalah 98 alel. Jumlah alel per lokus bervariasi antara 1 sampai 8 dengan rata-rata jumlah alel 3.5. Tabel 13 Data hasil amplifikasi 28 marka SSR menggunakan templat DNA dari 5 spesies Jatropha yang berbeda Marka Spesies Jml. alel JM JIM JIP JG JP EU586348 - + + + + 8 EU586340 + + + + + 5 EU586346 + + + + + 2 EU586347 + + + + + 6 EU586343 + + + + + 5 EU586344 + - - + + 4 EU586345 + + + + + 2 EF612741 - + - + + 5 EF612739 - - - + + 4 EU099518 - - - + + 2 EU099519 - - - - - 1 EU099520 + + - + - 5 EU099521 + + + - + 3 EU099522 + - + - + 4 EU099523 - + - - - 4 EU099524 + + + + + 4 EU099525 - - - - - 1 EU099526 + - + - - 5 EU099527 - - - - + 3 EU099528 - - - - - 2 EU099529 - + + + + 3 EU099530 - + - - - 4 EU099531 + + + + + 3 EU099533 + + + + + 6 AF469003 - - + + + 4 EU586351 + + + + + 3 EU586349 + + + + + 2 EU099534 + + + + + 2 TA 57.14 64.29 60.71 67.86 75.00 Jumlah alel 21 27 22 22 28 Keterangan : “+” teramplifikasi, “-“ tidak teramplifikasi; JM : J. multifida, JIM : J. integerrima berbunga merah, JIP : J. integerrima berbunga merah muda, JG : J. gossypifolia, JP : J. podagrica; TA : Persentase Transferability 76 Lokus yang menghasilkan jumlah alel paling banyak 8 alel adalah EU586348. Jumlah alel paling sedikit 1 alel dijumpai pada lokus EU099519 dan EU099525. Jumlah alel pada lokus lainnya bervariasi antara 1 sampai 6 Tabel 14. Pada semua lokus, jumlah alel yang ditemukan pada masing-masing spesies variasinya kecil yaitu paling sedikit 21 pada J. multifida dan paling banyak 28 pada J. gossypifolia. Persentase lokus polimorf pada 4 spesies yang diuji sangat variatif berkisar antara paling rendah 17.35 J. podagrica vs J.multifida dan paling tinggi 62.24 J. curcas vs J. gossypifolia dengan rerata 38.30. Koefisien kesamaan genetik paling rendah adalah antara J. curcas dengan J. gossypifolia 0.19 sedangkan kesamaan genetik paling tinggi adalah antara J. podagrica dengan J. multifida 0.60 dengan rerata 0.34. Persentase polimorfisme paling rendah dengan kesamaan genetik paling tinggi didapatkan pada perbandingan antara J. podagrica vs J. multifida Tabel 14. Korelasi antara persentase polimorfisme dengan kesamaan genetik cukup baik yaitu bernilai 0.75. Gambar 11 Elektroferogram hasil amplifikasi lintas spesies 5 marka SSR EU586348, EU586347, EU586346, EU586344, EU586340 pada 5 spesies Jatropha yang berbeda 1 = J. curcas, 2 = J. integerrima bunga merah muda, 3 = J. integerrima bunga merah, 4 = J. gossypifolia, 5 = J. multifida, 6 = J. podagrica M = marka DNA 100 bp. 77 Tabel 14 Persentase polimorfisme dan koefisien kesamaan genetik yang dihitung dari data amplifikasi lintas spesies dengan marka SSR pada spesies Jatropha yang berbeda JC JM JG JP JIP PP GS PP GS PP GS PP GS PP GS JIM 48.98 0.37 33.67 0.33 45.92 0.18 32.65 0.36 24.49 0.52 JIP 50.00 0.29 33.67 0.23 35.71 0.29 28.57 0.36 JP 48.98 0.31 17.35 0.60 31.63 0.37 JG 62.24 0.19 30.61 0.38 JM 50.00 0.29 Keterangan : JC = J. curcas; JM = J. multifida; JIM = J. integerrima berbunga merah; JIP = J. integerrima berbunga merah muda; JG = J. gossypifolia; JP = J. podagrica; PP = Persentase Polimorfisme; GS = Genetic Similarity Berdasarkan dendrogram yang terbentuk, pada tingkat kesamaan di atas 60. tidak ada klaster yang terbentuk. Jarak paling jauh ditemukan antara J. curcas dengan J. gossypifolia dan jarak paling dekat ditemukan antara J. podagrica dan J. multifida. Spesies yang mempunyai hubungan paling dekat dengan J. curcas adalah J. integerrima Gambar 12. Gambar 12 Dendrogram dibuat berdasarkan data analisis amplifikasi marka SSR pada 5 spesies Jatropha yaitu JC = J. curcas, JIP = J. integerrima bunga merah muda, JIM = J. integerrima bunga merah, JM = J. multifida, JP = J. podagrica dan JG = J. gossypifolia 78 Pembahasan Marka SSR mempunyai sifat reproducible, kodominan, polimorfisme tinggi dan dapat ditransfer kepada spesies kerabat sehingga dapat digunakan untuk menganalisis keragaman genetik dan struktur populasi Ishii et al., 2001; Varshney et al., 2005. Informasi sekuen DNA diperlukan dalam penggunaan marka SSR tetapi sayangnya informasi sekuen ini masih sangat jarang keberadaannya terutama untuk spesies liar atau minor. Marka SSR yang dikembangkan pada satu spesies dapat digunakan untuk mengungkapkan polimorfisme pada spesies-spesies yang berkerabat dekat dengan spesies tersebut untuk menghemat biaya dan tenaga Dayanandan et al., 2007; Varshney et al., 2005. Studi tentang marka molekuler untuk mengakses keragaman genetik pada J. curcas masih sedikit Yadav et al., 2011. Marka SSR yang telah ditemukan pada kegiatan penelitian sebelumnya digunakan pada penelitian ini untuk mengakses informasi genetik kerabat J. curcas penting yang ada di Indonesia yaitu J. integerrima bunga merah dan bunga merah muda, J. podagrica, J. multifida dan J. gossypifolia. Beberapa studi tentang kemampuan transfer marka SSR telah dilakukan di antara banyak tingkatan taksa. Whankaew et al. 2011 melaporkan keberhasilan transfer marka SSR antar genus dalam Euphorbiaceae yaitu pada singkong M. esculenta , karet H. brasiliensis dan jarak pagar J. curcas. Marka SSR dari singkong dapat ditransfer pada karet sebesar 59.18. SSR dari H. vulgare dapat ditransfer ke H. chilense dengan tingkat 26 Castillo et al., 2008 dan ke H. bulbosum dengan persentase 77 Thiel et al., 2003 sedangkan marka SSR dari serealia tercatat dapat ditransfer ke ryegrass Lolium spp. dengan tingkat 67. Pada spesies-spesies pohon seperti kopi Coffea spp. Poncet et al., 2004 mencatat tingkat transfer marka SSR dengan kisaran 72.7 – 86.4; pada genus Pinus berkisar antara 46.8 – 94.1 Chagne et al. 2004 dan SSR dari Eucaliptus dapat diamplifikasi pada famili Casuarinaceae dengan tingkat hingga 30 Yasodha et al., 2005. Beberapa penelitian tentang amplifikasi lintas spesies dan lintas genera marka SSR telah dilakukan berkaitan dengan Jatropha curcas. SSR dari singkong 79 M. esculenta dapat diamplifikasi pada jarak pagar dengan persentase 19.09 Whankaew et al., 2011. Wen et al. 2010 mencoba mengakses keragaman genetik J. curcas menggunakan marka SSR yang dikembangkan dari M. esculenta dan mendapatkan tingkat kemampuan transfer marka sebesar 44.63 EST-SSRs dan 29.67 G-SSRs. Persentase kemampuan amplifikasi lintas spesies dari marka SSR jarak pagar pada penelitian ini adalah masing-masing sebesar 57.14 ke J. multifida, 62.5 ke J. integerrima, 67.86 ke J. gossypifolia, 75.00 ke J. podagrica. Angka ini agak berbeda dengan yang ditemukan Yadav 2011 yaitu 76.00 ke J. multifida ; 95.6; ke J. integerrima; 66.6 ke J. gossipifolia dan 57 ke J. podagrica . Secara umum nilai kemampuan transfer marka ini cukup besar. Penjelasan yang dapat dikemukakan adalah bahwa semua spesies yang diuji mempunyai daerah asal penyebaran yang sama yaitu dari Amerika tropis sehingga kekerabatannya diduga masih dekat. Hal ini bersesuaian dengan hasil penelitian tentang konservasi lokus SSR pada beberapa spesies tanaman yang menyatakan bahwa peningkatan keberhasilan amplifikasi lintas spesies beriringan dengan penurunan jarak genetik Roa et al., 2000. Rerata persentase nilai kemampuan transfer marka SSR dalam penelitian ini G-SSRs yaitu sebesar 65, lebih kecil daripada yang ditemukan oleh Yadav et al. 2011 yaitu sebesar 73.65 EST- SSRs. Tingkat transfer lebih tinggi pada EST-SSRs dibandingkan dengan G- SSRs merefleksikan konservasi alami dari sekuen tersandi coding sequence bila dibandingkan dengan sekuen tidak tersandi non-coding sequence dan fakta bahwa frekuensi mutasi dari sekuen EST lebih rendah daripada sekuen DNA genomik Wen et al., 2010; Zhang et al., 2005. Analisis dendogram menunjukkan hasil yang saling mendukung dengan hasil analisis lain dengan marka SSR Sudheer et al., 2011 dan dengan RAPD dan AFLP Sudheer et al., 2009; Basha dan Sujatha, 2009 yaitu J. multifida dan J. podagrica mengelompok menjadi satu dengan nilai bootstrap yang baik. Secara morfologis J. podagrica dan J. multifida mempunyai bentuk dan warna bunga yang sangat mirip lampiran 5. Sesuai dengan dendrogram yang terbentuk, pasangan spesies J. curcas J. integerrima mempunyai hubungan yang relatif dekat sejalan dengan penelitian sejenis yang dilakukan Sudheer et al. 2009 80 dengan marka RAPD dan ALFP serta didukung dengan fakta bahwa persilangan antara kedua spesies tersebut telah berhasil dilakukan Dhillon et al., 2009; Parthiban et al., 2009; Asbani dan Heliyanto 2008; Basha dan Sujatha, 2009. Sesuai dengan dendrogram, J. integerrima yang berbunga merah mempunyai hubungan paling dekat dengan J. integerrima berbunga merah muda. Hasil ini sejalan dengan hasil pengamatan karyotipe yang dilakukan oleh Soontornchainaksaeng dan Jenjittikul 2003 yang mendapatkan bahwa keduanya mempunyai konfigurasi miotik yang sama. Studi tersebut juga mengungkapkan bahwa jumlah kromosom dari spesies-spesies yang digunakan dalam penelitian ini sama yaitu 22. Secara umum jarak genetik antara J. curcasJ. integerrima tidak jauh berbeda dengan jarak genetik antara J. curcas dengan spesies lain selain J integerrima . Berdasarkan hal ini maka keberhasilan persilangan interspesifik antara J. curcas dengan spesies lain masih dapat diharapkan. Prabakaran dan Sujatha 1999 dengan menggunakan marka morfologi dan marka biokimia membuktikan bahwa J. curcas dan J. gossypifolia mempunyai hibrida alami yang dinamai J. tanjorensis. Laporan tersebut mengindikasikan kedekatan hubungan antara J. curcas dengan J. gossypifolia meskipun tidak sejalan dengan penelitian ini di mana pesentase polimorfisme yang didapatkan cukup besar 62.24. Berkaitan dengan hal ini Sudheer et al. 2009 juga menemukan nilai persentase polimorfisme yang besar antara J. curcas dan J. gossypifolia menggunakan marka RAPD dan ALFP yaitu masing-masing sebesar 62.8 dan 68.19 sehingga tidak mendukung penemuan Prabakaran dan Sujatha 1999 tentang J. tanjorensis. Secara umum marka SSR yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai tingkat kemampuan cukup tinggi untuk dapat ditransfer kepada spesies lain dalam genus Jatropha. Nilai kesamaan genetik yang diperoleh pada penelitian ini relatif rendah dibandingkan dengan penelitian sejenis dengan marka SSR maupun marka RAPD dan ALFP. Berdasarkan hal tersebut dan berdasar dendrogram yang dihasilkan maka marka yang digunakan dapat diandalkan untuk melukiskan derajat hubungan antara spesies dalam Jatropha. Marka yang dihasilkan selanjutnya dapat dikembangkan sebagai alat untuk membedakan spesies dan karakterisasi hibrida hasil persilangan interspesies. 81 Kesimpulan Dari dua puluh delapan marka SSR dari J. curcas yang digunakan dalam penelitian ini 11 di antaranya dapat diamplifikasi pada 4 spesies Jatropha di luar J. curcas dengan nilai rerata persentase sebesar 65. Nilai kesamaan genetik antara 5 spesies yang diuji relatif rendah 0,34. Hubungan genetik paling dekat ditemukan antara J. podagrica dengan J. multifida sementara hubungan paling jauh adalah antara J. curcas dengan J. gossypifolia. Spesies yang mempunyai hubungan paling dekat dengan J. curcas adalah J. integerrima. Daftar Pustaka Asbani N, Heliyanto B. 2008. Kompatibilitas persilangan interspesifik Jatropha curcas X J. integerrima. Infotek Jarak Pagar 32:7 Barbara et al. 2007. Cross-species transfer of nuclear microsatellite markers: potential and limitations. Molecular Ecology 16: 3759-3767 Basha SD, Sujatha M. 2007. Inter- and intra-population variability of Jatropha curcas L. characterized by RAPD and ISSR markers and development of population specific SCAR markers. Euphytica 156:375-386 Basha SD, Sujatha M. 2009. Genetic analysis of Jatropha species and interspecific hybrids of Jatropha curcas using nuclear and organelle specific markers. Euphytica 168:197-214 Castillo A et al. 2008. Transferability and polymorphism of barley EST-SSR markers used for phylogenetic analysis in Hordeum chilense. BMC Plant Biology 8:97 Chagne D et al. 2004. Cross-species transferability and mapping of genomic and cDNA SSRs in pines. Theor. Appl. Genet. 109:1204-1214 Csurhes SM. 1999. Bellyache bush Jatropha gossypiifolia in Queensland. Pest Status Review Series - Land Protection Branch. Department of Natural Resources and Mines, Qld. Dayanandan S, Kamaljit SB, Kesseli R. 1997. Conservation of microsatellites among tropical trees Leguminosae. American Journal of Botany 8412: 1658–1663 Dehgan B. 1982. Novel Jatrophas for Florida landscapes. Proc. Fla. State Hort. Soc. 95:277-280 82 Dhillon RS et al. 2009. Development and molecular characterization of interspecific hybrids of Jatropha curcas x J. integerrima. Indian Journal of Biotechnology 8:384-390 Ganesh Ram S, Parthiban KT, Senthil Kumar R, Thiruvengadam V, Paramathma M. 2008. Genetic diversity among Jatropha species as revealed by RAPD markers. Genet. Resour. Crop Evol. 55: 803-809 Gupta PK, Varshney RK, Sharma PC, Ramesh B. 1999. Molecular markers and their applications in wheat breeding. Plant Breeding 118:369-390 Hasnam. 2006b. Status perbaikan dan penyediaan bahan tanam jarak pagar Jatropha curcas L.. Lokakarya Jarak Pagar di Bogor 29 Nopember 2006. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. Heller J. 1996. Physic nut Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use of under utilized and neglected crops. International Plant Genetic Resources Institute. Rome Ikbal, Boora KS, Dhillon RS. 2010. Evaluation of genetic diversity in Jatropha curcas L. using RAPD markers. Indian Journal of Biotechnology 9:50-57 Ishii T, Xu Y, McCouch SR. 2001. Nuclear-and chloroplast-microsatellite variation in A-genome species of rice. Genome 44:658-666 Jubera et al. 2009. Genetic diversity analysis of elite Jatropha curcas L. genotypes using randomly amplified polymorphic DNA markers. Karnataka J. Agric. Sci 222:293-295 Nei M, Li WH. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci USA 76:5269-5273 Oduola T et al. 2005. Ranade SA, Srivastava AP, Rana TS, Srivastava J, Tuli R. 2008. Easy assessment of diversity in Jatropha curcas L. plants using two single-primer amplification reaction SPAR methods. Mechanism of action of Jatropha gossypifolia stem latex as a haemostatic agent. Eur J Gen Med 24:140-143 Olapeju OA, Gloer JB. 2008. Japodic acid, A Novel Aliphatic Acid from Jatropha podagrica Hook. Rec. Nat. Prod. 24:100-106 Parthiban KT et al. 2009. Hybrid progenies in Jatropha – a new development. Current Science 966:815-823 Poncet V et al. 2004. SSR cross-amplification and variation within coffee trees Coffea spp.. Genome 47:1071-1081 Prabakaran AJ, Sujatha M. 1999. Jatropha tanjorensis Ellis Saroja, a natural interspecific hybrid occurring in Tamil Nadu, India. Gene Res Crop Evol. 46:213-218 Biomass and Bioenergy 326 :533-540 83 Roa AC et al. 2000. Cross-species amplification of cassava Manihot esculenta Euphorbiaceae microsatellites: allelic polymorphism and degree of relationship. American Journal of Botany 8711: 1647–1655 Rohlf FJ. 1998. NTSYSPCpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0 User Guide. Applied Biostatistics Inc., 3 Heritage Lane, Setauket, New York Rosado TB et al. 2010. Molecular marker reveal limited genetic diversity in a large germplasm collection of the biofuel crop Jatropha curcas L. in Brazil. Crop Sci. 50:2372-2382 Rossetto M et al. 1999. Cross species amplification of microsatellite loci: a valuable tool for genetic studies in plants. Paper presented to the Plant and Animal Genome VII Conference, San Diego, California, USA, 17-21 January Semagn K, Bjørnstad Å, Ndjiondjop MN. 2006. An overview of molecular marker methods for plants. African Journal of Biotechnology 525:2540- 2568 Soontornchainaksaeng P, Jenjittikul T. 2003. Karyology of Jatropha Euphorbiaceae in Thailand. Thai For. Bull. Bot. 31:105-112 Sudheer PDVN et al. 2011. Cross species amplification ability of novel microsatellites isolated from Jatropha curcas and genetic relationship with sister taxa. Mol Biol Rep 38:1383-1388 Sudheer PDVN, Meenakshi, Sarkar R, Boricha G, Reddy MP. 2009. A simplified method for extraction of high quality genomic DNA from Jatropha curcas for genetic diversity and molecular marker studies. Indian Journal of Biotechnology 8:187-192 Sudheer PDVN, Pandya N, Reddy MP, Radhakrishnan. 2009. Comparative study of interspecific genetic divergence and phylogenetic analysis of genus Jatropha by RAPD and AFLP. Mol Biol Rep 36:901-907 Sun QB, Li LF, Li Y, Wu GJ, Ge XJ. 2008. SSR and AFLP markers reveal low genetic diversity in the biofuel plant Jatropha curcas in China. Crop Sci. 48:1865-1871 Sunita K, Kochar VK, Singh SP, Katiyar RS, Pushpangadan P. 2005. Differential rooting and sprouting behavior of two Jatropha species and associated physiological and biochemical changes. Curr. Sci. 89: 936-939 Tatikonda L, Suhas WP, Seetha K. 2009. AFLP-based molecular characterization of an elite germplasm collection of Jatropha curcas L. a biofuel plant. Plant Science 176:505-513 Thiel T, Michalek W, Varshney R, Graner A. 2003. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley Hordeum vulgare L.. Theor. Appl. Genet. 106: 411-422 84 Varshney RK, Graner A, Sorrells ME. 2005. Genic microsatellite markers: features and applications. Trends Biotechnol. 23:48-55 Wen M et al. 2010. Development of EST-SSR and genomic-SSR markers to assess genetic diversity in Jatropha curcas L. BMC Research Notes 342:1-8. http:www.biomedcentral.com1756-0500342 [5 April 2010] Whankaew S et al. 2011. Cross-genera transferability of simple sequence repeat SSR markers among cassava Manihot esculenta Crantz, rubber tree Hevea rasiliensis Muell. Arg. and physic nut Jatropha curcas L.. African Journal of Biotechnology 10 10: 1768-1776 Yadav HK et al. 2011. EST-derived SSR markers development, characterization, polymorphism and transferability across the speciesgenera. Tree Genetics Genomes 7:207-219 Yap IV, Nelson RJ. 1996. WINBOOT a program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence limits of UPGMA- based dendrograms. In: IRRI Disc. Pap. Ser. 14. International Rice Research Institute, Manila, Philippines Yasodha R, Ghosi M, Sumathi R, Gurumurthi K. 2005. Cross-species amplification of eucalyptus SSR markers in Casuarinaceae. Acta Bot. Croat . 641:115-120 Zhang LY, Bernard M, Leroy P. 2005. High transferability of bread wheat EST- derived SSRs to other cereals. Theor Appl Genet 111:677-687. Zhang Z, Guo X, Liu B, Tang L, Chen F. 2011. Genetic diversity and genetic relationship of Jatroha curcas between China and Southeast Asian revealed by amplified fragment length polymorphisms. African Journal of Biotechnology 1015:2825-2832 Zubieta CG, Ghiselli L, Benedettelli S, Palchetti E. 2009. Development of novel SSR markers from a genomic microsatellite library in Jatropha curcas L. Proceedings of the 53rd Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress. Torino, Italy – 1619 September 85

BAB VI PENGEMBANGAN MARKA DAN KARAKTERISASI