Kondisi optimum untuk produksi enzim mananase ekstraseluler dari bacillus subtilis yang diisolasi dari air laut bali
KONDISI OPTIMUM UNTUK PRODUKSI ENZIM
MANANASE EKSTRASELULER DARI Bacillus
subtilis YANG DIISOLASI DARI AIR LAUT BALI
RONY MASRI RAMADANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kondisi Optimum
untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi
dari Air Laut Bali adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Rony Masri Ramadana
G84100032
ABSTRAK
RONY MASRI RAMADANA. Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim
Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali.
Dibimbing oleh SURYANI dan NANIK RAHMANI.
Enzim mananase banyak digunakan pada industri makanan, pakan, farmasi,
kertas, maupun gas, namun enzim mananase dari bakteri laut masih sedikit diteliti.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi optimum produksi
enzim mananase dari isolat bakteri Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali.
Kondisi yang diamati berupa konsentrasi substrat locust bean gum (LBG)
optimum, pH optimum, dan suhu inkubasi optimum. Kondisi optimum untuk
produksi enzim tersebut ditentukan berdasarkan nilai aktivitas enzim yang
dihasilkan. Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan metode
Dinitrosalicylic Acid (DNS). Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh nilai aktivitas
enzim tertinggi sebesar 20.978 U/mL pada jam ke-48. Bacillus subtilis dapat
menghasilkan enzim mananase ekstraseluler pada kondisi optimum dengan
konsentrasi substrat LBG 1%, pH media 6, dan suhu inkubasi 400C.
Kata kunci: mananase, manan, optimasi, Bacillus subtilis, bakteri laut
ABSTRACT
RONY MASRI RAMADANA. Optimum Condition for Production Extracellular
Mannanase from Bacillus subtilis isolated from Bali’s Sea Water. Supervised by
SURYANI and NANIK RAHMANI.
Mannanase widely used in food, feed, pharmaceutical, paper, and gas
industries, but mannanase from marine bacteria has been researched just in a few
number. The objective of this research was to obtain the optimum condition for
production extracellular mannanase enzyme from Bacillus subtilis isolated from
Bali Sea. Conditions which have seen are optimum concentration locust bean gum
(LBG) substrate, optimum pH, and optimum incubation temperature. The
optimum condition for production of enzyme was determined by the value of
enzyme activity. Enzime activity assays performed using the Dinitrosalicylic Acid
(DNS) method. Result showed that the highest enzyme activity was 20.978 U/mL
at 48 hours. Bacillus subtilis produced extracellular mannanase in optimum
condition with LBG substrate concentration 1%, pH 6, and incubation temperature
400C.
Keywords: mannanase, mannan, optimation, Bacillus subtilis, marine bacteria
KONDISI OPTIMUM UNTUK PRODUKSI ENZIM
MANANASE EKSTRASELULER DARI Bacillus
subtilis YANG DIISOLASI DARI AIR LAUT BALI
RONY MASRI RAMADANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler
dari Bacillus Subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali
Nama
: Rony Masri Ramadana
NIM
: G84100032
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Nanik Rahmani, M.Si
Pembimbing I
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan karya ilmiah yang
berjudul Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari
Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali. Penelitian ini merupakan
proyek penelitian dari LIPI Cibinong atas nama Nanik Rahmani, M.Si pada
laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses, Bioteknologi.
Penulis menyadari bahwa kelancaran selama penyusunan karya ilmiah ini
tidak lepas dari kontribusi beberapa pihak. Ucapan terima kasih terutama
ditujukan kepada Dr. Suryani, S.P, M.Sc dan Nanik Rahmani, M.Si selaku dosen
pembimbing yang telah membimbing serta memberi saran dan kritik yang
membangun. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Nanik Rahmani,
M.Si yang telah membantu untuk mendanai penelitian ini. Ucapan terima kasih
juga penulis sampaikan kepada Pak Yopi, Mbak Lia, Mbak Kia, Mas Diki, dan
Pak Awan, di Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Bioproses, Pusat Penelitian
Biotekologi LIPI Cibinong, Bogor. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Ama, Apa, Uda, Kak Ija, Nindy, Bakhri, Nita, Nazul, Mbak Nisa dan
teman-teman atas dukungan yang selalu diberikan.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk
memperbaiki isi karya ilmiah ini. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang
ilmu pengetahuan khususnya biokimia serta memberikan kemaslahatan bagi
masyarakat.
Bogor, Mei 2014
Rony Masri Ramadana
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
METODE ................................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ..................................................................................................... 2
Prosedur Analisis Data ......................................................................................... 2
HASIL ..................................................................................................................... 5
Hasil Peremajaan Isolat Bacillus subtilis ............................................................. 5
Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase ............. 5
Kondisi pH Media Optimum untuk Produksi Enzim Mananase ......................... 6
Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase ................................ 8
PEMBAHASAN...................................................................................................... 9
Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase ............. 9
Kondisi pH Optimum Media untuk Produksi Enzim Mananase ....................... 10
Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase .............................. 10
SIMPULAN DAN SARAN................................................................................... 11
Simpulan ............................................................................................................ 11
Saran .................................................................................................................. 11
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 11
LAMPIRAN .......................................................................................................... 14
RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... 28
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media padat setelah 2 hari
2 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG
0,5%, 1%, 1,5%, 2%, dan 2,5%
3 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, dan 2,5%
4 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG
1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
5 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat LBG 1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
6 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 1%,
pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan 500C
7 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat 1%, pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan
500C
8 Kurva standar manosa untuk optimasi konsentrasi substrat LBG
9 Kurva standar manosa untuk optimasi pH media dan suhu inkubasi
5
5
6
7
7
8
9
17
17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan Alir Penelitian
2 Hasil pembacaan spektrofotometer = 660 nm isolat bakteri laut
Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG
3 Hasil pembacaan spektrofotometer = 540 nm menggunakan larutan
D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda
4 Hasil pembacaan spektrofotometer = 540 nm menggunakan larutan
D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda
5 Hasil pembacaan spektrofotometer
= 540 nm enzim mananase
isolat Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG
6 Hasil pembacaan spektrofotometer = 660 nm isolat bakteri laut
Bacillus subtilis variasi pH media
7 Hasil pembacaan spektrofotometer
= 540 nm enzim mananase
isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi pH media
8 Hasil pembacaan spektrofotometer = 660 nm isolat bakteri laut
Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi
9 Hasil pembacaan spektrofotometer
= 540 nm enzim mananase
isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi
10 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase isolat bakteri laut
Bacillus subtilis menggunakan konsentrasi substrat LBG 1% pada
jam ke-0 ulangan 1
11 Hasil analisis statistik uji lanjut menggunakan duncan test
15
16
17
17
18
20
21
23
24
26
27
PENDAHULUAN
Enzim mananase merupakan enzim yang dapat mengatalisis reaksi
hidrolisis dari ikatan β-1,4-manosidik dari rantai manan, glukomanan, dan
galaktomanan. Enzim mananase dapat digunakan dalam aplikasi teknologi enzim
pada industri yang beragam seperti makanan, pakan, farmasi, kertas, maupun
industri gas sebagai stimulasi maupun perlakuan awal terhadap biomassa
lignoselulosa sebagai bahan untuk biofuel (Songsiriritthigul et al. 2010). Enzim
mananase juga dapat digunakan untuk memecah kandungan manan yang terdapat
pada limbah pertanian seperti limbah bungkil kelapa, kelapa sawit, umbi porang,
dan lainnya, sehingga dapat dihasilkan manosa dan oligosakarida yang
dimanfaatkan sebagai agen prebiotik, dan komponen pangan fungsional yang
tinggi nilai ekonomisnya (Yopi et al. 2006).
Enzim mananase bisa berasal dari mikrob, tanaman, maupun hewan.
Enzim mananase yang dihasilkan dari mikrob memiliki beberapa keunggulan,
diantaranya yaitu bersifat lebih ekonomis, mudah dan efisien dalam
memproduksinya. Karakterisasi dan fermentasi enzim mananase dari mikrob
mempunyai waktu proses yang lebih cepat dibandingkan dengan enzim dari
tanaman dan hewan (Yopi et al. 2006).
Mikrob yang menghasilkan enzim mananase dikenal dengan sebutan
mikrob manolitik. Mikrob manolitik dapat menghidrolisis polisakarida kompleks
menjadi molekul sederhana seperti mano-oligosakarida dan manosa. Enzim
mananase yang berasal dari mikrob mempunyai kemampuan untuk mengikat βmanan dan aktivitas katalitik yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat
polisakarida. Umumnya enzim mananase yang sering diteliti berasal dari mikrob
darat, sedangkan enzim mananase yang berasal dari laut masih sedikit diteliti
(Tanaka et al. 2009).
Eksplorasi mikrob laut untuk memperkaya sumber dan lokasi
dihasilkannya enzim mananase belum banyak dilakukan karena selama ini
eksplorasi lebih banyak dilakukan dari mikrob darat. Karakteristik mikrob laut
adalah dapat tumbuh pada konsentrasi garam yang tinggi (halofil). Penelitian yang
dilakukan sebelumnya telah menghasilkan enzim mananase termofilik laut dari
bakteri Rhodothermus marinus, mikrob ini diisolasi dari perairan laut yang
mempunyai suhu tinggi sehingga mempunyai aktivitas enzim mananase yang
cukup unik dalam mendegradasi sumber manan seperti galaktomanan pada
substrat locust bean gum (LBG). Mikrob manolitik laut ini telah diketahui
menghasilkan enzim mananase glikosidasi famili 26 yang bersifat termofilik yaitu
tahan hingga suhu 85ºC dan optimum pada pH 5,4 (Politz et al. 2000). Beberapa
penelitian lainnya mengenai enzim mananase juga telah dipublikasikan. Bakteri
Bacillus sp. optimum pada pH 7,0 dan suhu 70°C (Sumardi 2005), dan Bacillus
subtilis B36 optimum pada pH 6,4 dan suhu 50°C (Li et al. 2006).
Optimasi untuk produksi enzim mananase yang dihasilkan dari bakteri
Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali masih belum dilakukan. Adapun
tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi optimum produksi
enzim mananase berupa konsentrasi substrat LBG optimum, pH media optimum,
dan suhu inkubasi optimum dari isolat Bacillus subtilis tersebut. Optimasi ini
perlu dilakukan agar dapat diketahui kondisi optimal untuk memproduksi enzim
2
mananase, sehingga nantinya dapat dihasilkan enzim mananase dengan kualitas
dan kuantitas optimum dalam mendegradasi substratnya. Hipotesis dari penelitian
ini yaitu produksi enzim mananase dari Bacillus subtilis dipengaruhi oleh
berbagai faktor antara lain konsentrasi substrat LBG, pH media, dan suhu
inkubasi. Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya kondisi optimum
produksi enzim mananase sehingga dapat digunakan dalam berbagai bidang, salah
satunya dalam bidang pemanfaatan limbah biomassa dari industri pertanian
sebagai bahan untuk biofuel.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Bacillus subtilis asal Laut Bali
yang diisolasi pada tahun 2013 oleh Dr Yopi, peneliti dari LIPI Bioteknologi
Cibinong, media kultur yang terdiri dari locust bean gum (LBG) Sigma, akuades,
pepton Sigma, yeast extract (YE) Sigma, artificial sea water (ASW) Sigma,
buffer fosfat Sigma, alkohol 70%, standar manosa Sigma, dan pereaksi asam
dinitrosalisilat (DNS) yang terdiri atas DNS Sigma, NaOH, dan K-Na-Tartrat
Sigma. Adapun alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca analitik
Boeco Germany, spektrofotometer Hitachi U-3900H, laminar horizontal Sanyo,
pipet mikro, tabung mikro, penangas air Julabo TW20, magnetic stirrer MSH300N, vortex Bionex, incubator shaker Jica BR-43FL, dan autoklaf Tomy SX500.
Prosedur Analisis Data
Peremajaan Bacillus subtilis dalam Media Padat (Yopi et al. 2006)
Isolat Bacillus subtilis dari Laut Bali ditumbuhkan pada media padat yang
mengandung sumber manan. Komposisi media yang digunakan ialah artificial sea
water (ASW) Sigma 3.8%, yeast extract (YE) Sigma 0.1%, Pepton Sigma 0.5%,
agar 1.5%, dan substrat manan locust bean gum (LBG) Sigma 0.5% dalam 100
mL aquades. Komposisi media tersebut diaduk menggunakan magnetic stirrer
sampai homogen dan disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15 menit, kemudian
media tersebut dituang ke dalam cawan Petri di dalam laminar hingga memadat.
Isolat Bacillus subtilis diinokulasikan ke dalam media padat dan diinkubasi
selama 1 sampai 2 hari.
Optimasi Konsentrasi Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase
Variasi konsentrasi substrat LBG yang diamati dalam optimasi untuk
produksi enzim mananase ini antara lain 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5% yang
dilarutkan dalam akuades. Setiap perlakuan dilakukan dengan 2 ulangan dan
diinkubasi selama 6 hari. Optimasi untuk produksi enzim mananase dilakukan
dengan mengamati parameter pertumbuhan sel (kurva pertumbuhan) dan aktivitas
enzim mananase (kurva produksi enzim mananase).
3
Pembuatan Kurva Pertumbuhan (Analisis Pertumbuhan Sel) (Yopi et al.
2006)
Pembuatan kurva pertumbuhan terdiri atas dua tahap, yaitu pra-kultivasi
dan kultivasi. Komposisi media cair terdiri atas artificial sea water (ASW) 3.8%,
yeast extract (YE) 0.1%, dan pepton 0.5% dalam 500 mL aquades. Media tersebut
kemudian dibagi ke dalam dua tabung, yaitu untuk pra-kultivasi dan kultivasi
yang kemudian ditambahkan substrat LBG dengan variasi konsentrasi 0.5%, 1%,
1.5%, 2% dan 2.5%. Media pra-kultivasi sebanyak 10 mL dalam labu Erlenmeyer
100 mL, sedangkan media kultivasi sebanyak 30 mL dalam labu Erlenmeyer 300
mL. Setelah disterilisasi dan didinginkan, biakan dimasukkan ke dalam media
secara aseptik, kemudian isolat Bacillus subtilis pada tahap pra-kultivasi
diinkubasi pada incubator shaker semalam dengan kecepatan 150 rpm pada suhu
300C.
Setelah tahap pra-kultivasi maka dilanjutkan dengan tahap kultivasi isolat
Bacillus subtilis selama 6 hari pada incubator shaker 150 rpm pada suhu ruang.
Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 7 kali yaitu pada jam ke 0, 24, 48, 72,
96, 120, dan 144. Setiap hasil pengambilan sampel tersebut dipindahkan ke dalam
1.5 ml tabung mikro dan disimpan dalam lemari pendingin. Setelah itu dilakukan
analisis pertumbuhan sel dengan pembacaan pada spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm.
Pembuatan Kurva Produksi Enzim Mananase (Analisis Aktivitas Enzim
Mananase) (Yopi et al. 2006)
Setelah diperoleh kurva pertumbuhan, selanjutnya dilakukan uji aktivitas
enzim mananase untuk mendapatkan kurva produksi enzim mananase. Enzim
diperoleh dengan cara disentrifugasi kultur dengan kecepatan 12.000 rpm selama
15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh disimpan pada suhu 4ºC.
Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai sediaan enzim untuk analisis
aktivitas enzim mananase.
Pengukuran aktivitas enzim mananase menggunakan metode DNS (asam
dinitrosalisilat). Larutan DNS sebanyak 50 ml dibuat dengan melarutkan DNS
(asam dinitrosalisilat) sebanyak 0.5 gram, NaOH, 0.8 gram, dan K-Na-Tartat 15
gram ke dalam 50 ml akuades. Larutan substrat manan (LBG) dibuat sebanyak
0.5% di dalam buffer fosfat 0.05 M pH 6.
Perlakuan untuk sampel adalah dengan cara menambahkan larutan enzim
sebanyak 250 L ke dalam 250 L larutan substrat LBG 0.5%, kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah reaksi enzim substrat selesai,
kemudian ditambahkan 750 L DNS dan divortex agar homogen, kemudian
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15 menit, dilanjutkan
dengan merendam di dalam es selama 10 menit.
Perlakuan untuk kontrol adalah sebanyak 250 L larutan buffer 0.05 M pH
6 ditambahkan ke dalam 250 L larutan substrat LBG 0.5%, selanjutnya
ditambahkan 750 L DNS, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu
ruang. Setelah itu divortex agar homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas
air pada suhu 100ºC selama 15 menit dan dilanjutkan dengan merendam di dalam
es selama 10 menit. Perlakuan untuk blanko adalah sebanyak 750 L DNS
ditambahkan ke dalam 500 L buffer fosfat 0.05 M pH 6 dan divortex agar
homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15
4
menit. Blanko, sampel, dan kontrol dibaca dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm. Berdasarkan kurva produksi yang diperoleh, dapat diketahui
konsentrasi substrat yang paling optimum yaitu yang menghasilkan aktivitas
enzim mananase tertinggi.
Satu unit aktivitas enzim mananase adalah banyaknya enzim yang dapat
memproduksi 1 mol manosa dalam satu menit, maka digunakan larutan D-(+)Manosa sebagai standar sehingga diperoleh kurva standar manosa, dari kurva
tersebut dapat diperoleh persamaan sehingga selanjutnya dapat dilakukan
perhitungan nilai aktivitas enzim. Pembuatan standar dilakukan dengan
menambahkan 750 L larutan DNS ke dalam 500 L standar manosa, kemudian
dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit, dan didinginkan dalam es selama
15 menit.
Optimasi pH Media dan Suhu Inkubasi untuk Produksi Enzim Mananase
Variasi pH yang digunakan untuk optimasi pH media adalah 5, 6, 7, 8, dan
9. Optimasi ini dilakukan pada konsentrasi substrat optimum yang telah diperoleh
sebelumnya. Pengaturan pH media dilakukan dengan cara menambahkan larutan
NaOH atau HCl ke dalam media. Penentuan kondisi optimum pH media
dilakukan dengan mengamati parameter pertumbuhan sel (kurva pertumbuhan)
dan aktivitas enzim mananase (kurva produksi enzim mananase) seperti pada
tahapan sebelumnya. Setelah diperoleh pH media optimum, selanjutnya dilakukan
optimasi suhu inkubasi dengan variasi suhu 20, 30, 40, dan 500C. Optimasi suhu
inkubasi untuk produksi enzim dilakukan pada konsentrasi substrat dan pH media
optimum yang telah diperoleh pada tahap sebelumnya. Penentuan kondisi
optimum suhu inkubasi juga dilakukan dengan mengamati parameter
pertumbuhan sel dan aktivitas enzimnya.
Analisis Statistik
Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan software SAS 9.1.3. Analisis
statistik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam Rancangan Acak
Lengkap (RAL). Model rancangannya:
Yijk = +αi+βj+(αβ)ij+εijk
Yijk
= nilai pengamatan pada faktor ke A (optimasi konsentrasi substrat/pH
media/suhu inkubasi) taraf ke-i faktor B (lamanya inkubasi) taraf ke-j dan
ulangan ke-k.
µ
= Rataan umum
αi
= pengaruh utama faktor A (optimasi konsentrasi substrat/pH media/suhu
inkubasi)
βj
= pengaruh utama faktor B (lamanya inkubasi)
(αβ)ij = pengaruh interaksi faktor A dan faktor B
εijk
= pengaruh acak yang menyebar normal
Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance)
pada tingkat kepercayaan 95 % dan taraf α 5%, dan dilakukan uji Duncan sebagai
uji lanjut.
5
HASIL
Hasil Peremajaan Isolat Bacillus subtilis
Isolat Bacillus subtilis diremajakan dalam media padat substrat locust
bean gum (LBG). Bakteri yang berhasil tumbuh ditandai dengan terlihatnya
koloni bakteri pada media tersebut. Koloni Bacillus subtilis terlihat berwarna
kuning kecoklatan, sedikit berlendir dan tumbuh pada permukaan media padat.
Hasil peremajaan isolat Bacillus subtilis dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media padat setelah 2 hari
Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase
Nilai OD (660 nm)
Kurva pertumbuhan dari Bacillus subtilis pada variasi konsentrasi substrat
LBG 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5% disajikan pada Gambar 2. Berdasarkan
kurva pertumbuhan yang diperoleh, terlihat bahwa nilai kerapatan optik (OD)
isolat Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 0.5% dan 1% mengalami
peningkatan seriring dengan bertambahnya waktu kultivasi dan kemudian
mengalami penurunan pada jam ke 96 sampai jam 144. Nilai kerapatan optik
tertinggi dari Bacillus subtilis pada konsentrasi tersebut adalah pada jam ke-72.
Nilai kerapatan optik isolat Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1.5%,
2%, dan 2.5% juga mengalami peningkatan seiring bertambahnya waktu, akan
tetapi mengalami penurunan pada jam 72 sampai jam 144. Nilai kerapatan optik
tertinggi dari Bacillus subtilis pada konsentrasi tersebut adalah pada jam ke-48.
Secara umum terlihat bahwa nilai kerapatan optik tertinggi dari isolat Bacillus
subtilis diperoleh pada konsentrasi 2.5% karena memiliki nilai absorban yang
lebih tinggi dibandingkan dengan nilai absorban pada konsentrasi substrat lainnya.
3.00
2.50
2.00
1.50
0,5%
1.00
1%
0.50
1.50
%
0.00
0
24 48 72 96 120 144
Waktu Kultivasi (Jam)
Gambar 2 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG
0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5%
6
Berdasarkan kurva tersebut dapat diketahui fase pertumbuhan bakteri.
Isolat Bacillus subtilis yang ditumbuhkan pada media LBG 1%, fase adaptasinya
terjadi sekitar jam ke-0 hingga jam ke-24. Fase adaptasi dari kultivasi ini tidak
terlalu jelas terlihat dalam kurva, hal ini disebabkan karena isolat tersebut telah
beradaptasi dengan media cair pada proses pra-kultivasi. Jam ke-24 sampai
dengan jam ke-72 merupakan fase log. Sekitar jam ke-72 sampai jam ke-96
menunjukkan fase stasioner. Sedangkan jam ke-96 sampai jam ke-144
menunjukkan fase kematian.
Pengukuran aktivitas enzim mananase menggunakan kurva standar dengan
persamaan garis y=0.0023x - 0.0872 (Lampiran 3). Aktivitas enzim mananase dari
Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat LBG ditunjukkan pada Gambar 3.
Nilai aktivitas enzim pada konsentrasi 0.5% lebih kecil dan berbeda nyata
(P0.05)
dibandingkan dengan aktivitas enzim pada konsentrasi substrat 1.5%, 2% dan
2.5%. Berdasarkan hal tersebut, konsentrasi substrat LBG yang paling optimum
untuk produksi enzim mananase adalah pada konsentrasi substrat LBG 1%.
Aktivitas enzim (U/mL)
15.00
12.00
0,5%
9.00
1%
6.00
1.50%
2%
3.00
2.50%
0.00
0
24 48 72 96 120 144
Waktu inkubasi (jam)
Gambar 3 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5%
Kondisi pH Media Optimum untuk Produksi Enzim Mananase
Optimasi pH media dilakukan pada konsentrasi substrat optimum yang
telah diperoleh pada tahapan penelitian sebelumnya, yaitu konsentrasi substrat
LBG 1%. Variasi pH media yang digunakan pada penelitian ini adalah 5, 6, 7, 8,
dan 9. Dasar dari penentuan rentang variasi pH tersebut adalah karena pada
umumnya mikroorganisme jenis bakteri dapat tumbuh pada rentang tersebut.
Berdasarkan nilai absorban pada panjang gelombang 660 nm (Lampiran 7),
diperoleh hasil yang disajikan melalui kurva pertumbuhan pada Gambar 4.
7
Nilai OD (660 nm)
2.50
2.00
5
1.50
6
1.00
7
0.50
8
9
0.00
0
24 48 72 96 120 144
Waktu kultivasi (jam)
Gambar 4 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1%
dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
Aktivitas Enzim (U/mL)
Terlihat bahwa nilai kerapatan optik Bacillus subtilis pada pH 9 lebih
rendah dibandingkan dengan pH lainnya, sedangkan nilai kerapatan optik pada pH
media 5, 6, 7, dan 8 tidak berbeda nyata (P
MANANASE EKSTRASELULER DARI Bacillus
subtilis YANG DIISOLASI DARI AIR LAUT BALI
RONY MASRI RAMADANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Kondisi Optimum
untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi
dari Air Laut Bali adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Rony Masri Ramadana
G84100032
ABSTRAK
RONY MASRI RAMADANA. Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim
Mananase Ekstraseluler dari Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali.
Dibimbing oleh SURYANI dan NANIK RAHMANI.
Enzim mananase banyak digunakan pada industri makanan, pakan, farmasi,
kertas, maupun gas, namun enzim mananase dari bakteri laut masih sedikit diteliti.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi optimum produksi
enzim mananase dari isolat bakteri Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali.
Kondisi yang diamati berupa konsentrasi substrat locust bean gum (LBG)
optimum, pH optimum, dan suhu inkubasi optimum. Kondisi optimum untuk
produksi enzim tersebut ditentukan berdasarkan nilai aktivitas enzim yang
dihasilkan. Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan metode
Dinitrosalicylic Acid (DNS). Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh nilai aktivitas
enzim tertinggi sebesar 20.978 U/mL pada jam ke-48. Bacillus subtilis dapat
menghasilkan enzim mananase ekstraseluler pada kondisi optimum dengan
konsentrasi substrat LBG 1%, pH media 6, dan suhu inkubasi 400C.
Kata kunci: mananase, manan, optimasi, Bacillus subtilis, bakteri laut
ABSTRACT
RONY MASRI RAMADANA. Optimum Condition for Production Extracellular
Mannanase from Bacillus subtilis isolated from Bali’s Sea Water. Supervised by
SURYANI and NANIK RAHMANI.
Mannanase widely used in food, feed, pharmaceutical, paper, and gas
industries, but mannanase from marine bacteria has been researched just in a few
number. The objective of this research was to obtain the optimum condition for
production extracellular mannanase enzyme from Bacillus subtilis isolated from
Bali Sea. Conditions which have seen are optimum concentration locust bean gum
(LBG) substrate, optimum pH, and optimum incubation temperature. The
optimum condition for production of enzyme was determined by the value of
enzyme activity. Enzime activity assays performed using the Dinitrosalicylic Acid
(DNS) method. Result showed that the highest enzyme activity was 20.978 U/mL
at 48 hours. Bacillus subtilis produced extracellular mannanase in optimum
condition with LBG substrate concentration 1%, pH 6, and incubation temperature
400C.
Keywords: mannanase, mannan, optimation, Bacillus subtilis, marine bacteria
KONDISI OPTIMUM UNTUK PRODUKSI ENZIM
MANANASE EKSTRASELULER DARI Bacillus
subtilis YANG DIISOLASI DARI AIR LAUT BALI
RONY MASRI RAMADANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler
dari Bacillus Subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali
Nama
: Rony Masri Ramadana
NIM
: G84100032
Disetujui oleh
Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Nanik Rahmani, M.Si
Pembimbing I
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan karya ilmiah yang
berjudul Kondisi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase Ekstraseluler dari
Bacillus subtilis yang diisolasi dari Air Laut Bali. Penelitian ini merupakan
proyek penelitian dari LIPI Cibinong atas nama Nanik Rahmani, M.Si pada
laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses, Bioteknologi.
Penulis menyadari bahwa kelancaran selama penyusunan karya ilmiah ini
tidak lepas dari kontribusi beberapa pihak. Ucapan terima kasih terutama
ditujukan kepada Dr. Suryani, S.P, M.Sc dan Nanik Rahmani, M.Si selaku dosen
pembimbing yang telah membimbing serta memberi saran dan kritik yang
membangun. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Ibu Nanik Rahmani,
M.Si yang telah membantu untuk mendanai penelitian ini. Ucapan terima kasih
juga penulis sampaikan kepada Pak Yopi, Mbak Lia, Mbak Kia, Mas Diki, dan
Pak Awan, di Laboratorium Biorekayasa Lingkungan, Bioproses, Pusat Penelitian
Biotekologi LIPI Cibinong, Bogor. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Ama, Apa, Uda, Kak Ija, Nindy, Bakhri, Nita, Nazul, Mbak Nisa dan
teman-teman atas dukungan yang selalu diberikan.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk
memperbaiki isi karya ilmiah ini. Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang
ilmu pengetahuan khususnya biokimia serta memberikan kemaslahatan bagi
masyarakat.
Bogor, Mei 2014
Rony Masri Ramadana
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
METODE ................................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ..................................................................................................... 2
Prosedur Analisis Data ......................................................................................... 2
HASIL ..................................................................................................................... 5
Hasil Peremajaan Isolat Bacillus subtilis ............................................................. 5
Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase ............. 5
Kondisi pH Media Optimum untuk Produksi Enzim Mananase ......................... 6
Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase ................................ 8
PEMBAHASAN...................................................................................................... 9
Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase ............. 9
Kondisi pH Optimum Media untuk Produksi Enzim Mananase ....................... 10
Suhu Inkubasi Optimum untuk Produksi Enzim Mananase .............................. 10
SIMPULAN DAN SARAN................................................................................... 11
Simpulan ............................................................................................................ 11
Saran .................................................................................................................. 11
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 11
LAMPIRAN .......................................................................................................... 14
RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... 28
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media padat setelah 2 hari
2 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG
0,5%, 1%, 1,5%, 2%, dan 2,5%
3 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, dan 2,5%
4 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG
1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
5 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat LBG 1% dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
6 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat 1%,
pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan 500C
7 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat 1%, pH media 6, dengan variasi suhu 200C, 300C, 400C, dan
500C
8 Kurva standar manosa untuk optimasi konsentrasi substrat LBG
9 Kurva standar manosa untuk optimasi pH media dan suhu inkubasi
5
5
6
7
7
8
9
17
17
DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan Alir Penelitian
2 Hasil pembacaan spektrofotometer = 660 nm isolat bakteri laut
Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG
3 Hasil pembacaan spektrofotometer = 540 nm menggunakan larutan
D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda
4 Hasil pembacaan spektrofotometer = 540 nm menggunakan larutan
D-(+)-Manosa dengan konsentrasi yang berbeda
5 Hasil pembacaan spektrofotometer
= 540 nm enzim mananase
isolat Bacillus subtilis variasi konsentrasi substrat LBG
6 Hasil pembacaan spektrofotometer = 660 nm isolat bakteri laut
Bacillus subtilis variasi pH media
7 Hasil pembacaan spektrofotometer
= 540 nm enzim mananase
isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi pH media
8 Hasil pembacaan spektrofotometer = 660 nm isolat bakteri laut
Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi
9 Hasil pembacaan spektrofotometer
= 540 nm enzim mananase
isolat bakteri laut Bacillus subtilis variasi suhu inkubasi
10 Contoh perhitungan aktivitas enzim mananase isolat bakteri laut
Bacillus subtilis menggunakan konsentrasi substrat LBG 1% pada
jam ke-0 ulangan 1
11 Hasil analisis statistik uji lanjut menggunakan duncan test
15
16
17
17
18
20
21
23
24
26
27
PENDAHULUAN
Enzim mananase merupakan enzim yang dapat mengatalisis reaksi
hidrolisis dari ikatan β-1,4-manosidik dari rantai manan, glukomanan, dan
galaktomanan. Enzim mananase dapat digunakan dalam aplikasi teknologi enzim
pada industri yang beragam seperti makanan, pakan, farmasi, kertas, maupun
industri gas sebagai stimulasi maupun perlakuan awal terhadap biomassa
lignoselulosa sebagai bahan untuk biofuel (Songsiriritthigul et al. 2010). Enzim
mananase juga dapat digunakan untuk memecah kandungan manan yang terdapat
pada limbah pertanian seperti limbah bungkil kelapa, kelapa sawit, umbi porang,
dan lainnya, sehingga dapat dihasilkan manosa dan oligosakarida yang
dimanfaatkan sebagai agen prebiotik, dan komponen pangan fungsional yang
tinggi nilai ekonomisnya (Yopi et al. 2006).
Enzim mananase bisa berasal dari mikrob, tanaman, maupun hewan.
Enzim mananase yang dihasilkan dari mikrob memiliki beberapa keunggulan,
diantaranya yaitu bersifat lebih ekonomis, mudah dan efisien dalam
memproduksinya. Karakterisasi dan fermentasi enzim mananase dari mikrob
mempunyai waktu proses yang lebih cepat dibandingkan dengan enzim dari
tanaman dan hewan (Yopi et al. 2006).
Mikrob yang menghasilkan enzim mananase dikenal dengan sebutan
mikrob manolitik. Mikrob manolitik dapat menghidrolisis polisakarida kompleks
menjadi molekul sederhana seperti mano-oligosakarida dan manosa. Enzim
mananase yang berasal dari mikrob mempunyai kemampuan untuk mengikat βmanan dan aktivitas katalitik yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat
polisakarida. Umumnya enzim mananase yang sering diteliti berasal dari mikrob
darat, sedangkan enzim mananase yang berasal dari laut masih sedikit diteliti
(Tanaka et al. 2009).
Eksplorasi mikrob laut untuk memperkaya sumber dan lokasi
dihasilkannya enzim mananase belum banyak dilakukan karena selama ini
eksplorasi lebih banyak dilakukan dari mikrob darat. Karakteristik mikrob laut
adalah dapat tumbuh pada konsentrasi garam yang tinggi (halofil). Penelitian yang
dilakukan sebelumnya telah menghasilkan enzim mananase termofilik laut dari
bakteri Rhodothermus marinus, mikrob ini diisolasi dari perairan laut yang
mempunyai suhu tinggi sehingga mempunyai aktivitas enzim mananase yang
cukup unik dalam mendegradasi sumber manan seperti galaktomanan pada
substrat locust bean gum (LBG). Mikrob manolitik laut ini telah diketahui
menghasilkan enzim mananase glikosidasi famili 26 yang bersifat termofilik yaitu
tahan hingga suhu 85ºC dan optimum pada pH 5,4 (Politz et al. 2000). Beberapa
penelitian lainnya mengenai enzim mananase juga telah dipublikasikan. Bakteri
Bacillus sp. optimum pada pH 7,0 dan suhu 70°C (Sumardi 2005), dan Bacillus
subtilis B36 optimum pada pH 6,4 dan suhu 50°C (Li et al. 2006).
Optimasi untuk produksi enzim mananase yang dihasilkan dari bakteri
Bacillus subtilis yang diisolasi dari Laut Bali masih belum dilakukan. Adapun
tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh kondisi optimum produksi
enzim mananase berupa konsentrasi substrat LBG optimum, pH media optimum,
dan suhu inkubasi optimum dari isolat Bacillus subtilis tersebut. Optimasi ini
perlu dilakukan agar dapat diketahui kondisi optimal untuk memproduksi enzim
2
mananase, sehingga nantinya dapat dihasilkan enzim mananase dengan kualitas
dan kuantitas optimum dalam mendegradasi substratnya. Hipotesis dari penelitian
ini yaitu produksi enzim mananase dari Bacillus subtilis dipengaruhi oleh
berbagai faktor antara lain konsentrasi substrat LBG, pH media, dan suhu
inkubasi. Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya kondisi optimum
produksi enzim mananase sehingga dapat digunakan dalam berbagai bidang, salah
satunya dalam bidang pemanfaatan limbah biomassa dari industri pertanian
sebagai bahan untuk biofuel.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Bacillus subtilis asal Laut Bali
yang diisolasi pada tahun 2013 oleh Dr Yopi, peneliti dari LIPI Bioteknologi
Cibinong, media kultur yang terdiri dari locust bean gum (LBG) Sigma, akuades,
pepton Sigma, yeast extract (YE) Sigma, artificial sea water (ASW) Sigma,
buffer fosfat Sigma, alkohol 70%, standar manosa Sigma, dan pereaksi asam
dinitrosalisilat (DNS) yang terdiri atas DNS Sigma, NaOH, dan K-Na-Tartrat
Sigma. Adapun alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca analitik
Boeco Germany, spektrofotometer Hitachi U-3900H, laminar horizontal Sanyo,
pipet mikro, tabung mikro, penangas air Julabo TW20, magnetic stirrer MSH300N, vortex Bionex, incubator shaker Jica BR-43FL, dan autoklaf Tomy SX500.
Prosedur Analisis Data
Peremajaan Bacillus subtilis dalam Media Padat (Yopi et al. 2006)
Isolat Bacillus subtilis dari Laut Bali ditumbuhkan pada media padat yang
mengandung sumber manan. Komposisi media yang digunakan ialah artificial sea
water (ASW) Sigma 3.8%, yeast extract (YE) Sigma 0.1%, Pepton Sigma 0.5%,
agar 1.5%, dan substrat manan locust bean gum (LBG) Sigma 0.5% dalam 100
mL aquades. Komposisi media tersebut diaduk menggunakan magnetic stirrer
sampai homogen dan disterilisasi pada suhu 121ºC selama 15 menit, kemudian
media tersebut dituang ke dalam cawan Petri di dalam laminar hingga memadat.
Isolat Bacillus subtilis diinokulasikan ke dalam media padat dan diinkubasi
selama 1 sampai 2 hari.
Optimasi Konsentrasi Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase
Variasi konsentrasi substrat LBG yang diamati dalam optimasi untuk
produksi enzim mananase ini antara lain 0.5%, 1%, 1.5%, 2% dan 2.5% yang
dilarutkan dalam akuades. Setiap perlakuan dilakukan dengan 2 ulangan dan
diinkubasi selama 6 hari. Optimasi untuk produksi enzim mananase dilakukan
dengan mengamati parameter pertumbuhan sel (kurva pertumbuhan) dan aktivitas
enzim mananase (kurva produksi enzim mananase).
3
Pembuatan Kurva Pertumbuhan (Analisis Pertumbuhan Sel) (Yopi et al.
2006)
Pembuatan kurva pertumbuhan terdiri atas dua tahap, yaitu pra-kultivasi
dan kultivasi. Komposisi media cair terdiri atas artificial sea water (ASW) 3.8%,
yeast extract (YE) 0.1%, dan pepton 0.5% dalam 500 mL aquades. Media tersebut
kemudian dibagi ke dalam dua tabung, yaitu untuk pra-kultivasi dan kultivasi
yang kemudian ditambahkan substrat LBG dengan variasi konsentrasi 0.5%, 1%,
1.5%, 2% dan 2.5%. Media pra-kultivasi sebanyak 10 mL dalam labu Erlenmeyer
100 mL, sedangkan media kultivasi sebanyak 30 mL dalam labu Erlenmeyer 300
mL. Setelah disterilisasi dan didinginkan, biakan dimasukkan ke dalam media
secara aseptik, kemudian isolat Bacillus subtilis pada tahap pra-kultivasi
diinkubasi pada incubator shaker semalam dengan kecepatan 150 rpm pada suhu
300C.
Setelah tahap pra-kultivasi maka dilanjutkan dengan tahap kultivasi isolat
Bacillus subtilis selama 6 hari pada incubator shaker 150 rpm pada suhu ruang.
Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 7 kali yaitu pada jam ke 0, 24, 48, 72,
96, 120, dan 144. Setiap hasil pengambilan sampel tersebut dipindahkan ke dalam
1.5 ml tabung mikro dan disimpan dalam lemari pendingin. Setelah itu dilakukan
analisis pertumbuhan sel dengan pembacaan pada spektrofotometer pada panjang
gelombang 660 nm.
Pembuatan Kurva Produksi Enzim Mananase (Analisis Aktivitas Enzim
Mananase) (Yopi et al. 2006)
Setelah diperoleh kurva pertumbuhan, selanjutnya dilakukan uji aktivitas
enzim mananase untuk mendapatkan kurva produksi enzim mananase. Enzim
diperoleh dengan cara disentrifugasi kultur dengan kecepatan 12.000 rpm selama
15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh disimpan pada suhu 4ºC.
Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai sediaan enzim untuk analisis
aktivitas enzim mananase.
Pengukuran aktivitas enzim mananase menggunakan metode DNS (asam
dinitrosalisilat). Larutan DNS sebanyak 50 ml dibuat dengan melarutkan DNS
(asam dinitrosalisilat) sebanyak 0.5 gram, NaOH, 0.8 gram, dan K-Na-Tartat 15
gram ke dalam 50 ml akuades. Larutan substrat manan (LBG) dibuat sebanyak
0.5% di dalam buffer fosfat 0.05 M pH 6.
Perlakuan untuk sampel adalah dengan cara menambahkan larutan enzim
sebanyak 250 L ke dalam 250 L larutan substrat LBG 0.5%, kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Setelah reaksi enzim substrat selesai,
kemudian ditambahkan 750 L DNS dan divortex agar homogen, kemudian
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15 menit, dilanjutkan
dengan merendam di dalam es selama 10 menit.
Perlakuan untuk kontrol adalah sebanyak 250 L larutan buffer 0.05 M pH
6 ditambahkan ke dalam 250 L larutan substrat LBG 0.5%, selanjutnya
ditambahkan 750 L DNS, kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu
ruang. Setelah itu divortex agar homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas
air pada suhu 100ºC selama 15 menit dan dilanjutkan dengan merendam di dalam
es selama 10 menit. Perlakuan untuk blanko adalah sebanyak 750 L DNS
ditambahkan ke dalam 500 L buffer fosfat 0.05 M pH 6 dan divortex agar
homogen, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100ºC selama 15
4
menit. Blanko, sampel, dan kontrol dibaca dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm. Berdasarkan kurva produksi yang diperoleh, dapat diketahui
konsentrasi substrat yang paling optimum yaitu yang menghasilkan aktivitas
enzim mananase tertinggi.
Satu unit aktivitas enzim mananase adalah banyaknya enzim yang dapat
memproduksi 1 mol manosa dalam satu menit, maka digunakan larutan D-(+)Manosa sebagai standar sehingga diperoleh kurva standar manosa, dari kurva
tersebut dapat diperoleh persamaan sehingga selanjutnya dapat dilakukan
perhitungan nilai aktivitas enzim. Pembuatan standar dilakukan dengan
menambahkan 750 L larutan DNS ke dalam 500 L standar manosa, kemudian
dipanaskan pada suhu 100°C selama 15 menit, dan didinginkan dalam es selama
15 menit.
Optimasi pH Media dan Suhu Inkubasi untuk Produksi Enzim Mananase
Variasi pH yang digunakan untuk optimasi pH media adalah 5, 6, 7, 8, dan
9. Optimasi ini dilakukan pada konsentrasi substrat optimum yang telah diperoleh
sebelumnya. Pengaturan pH media dilakukan dengan cara menambahkan larutan
NaOH atau HCl ke dalam media. Penentuan kondisi optimum pH media
dilakukan dengan mengamati parameter pertumbuhan sel (kurva pertumbuhan)
dan aktivitas enzim mananase (kurva produksi enzim mananase) seperti pada
tahapan sebelumnya. Setelah diperoleh pH media optimum, selanjutnya dilakukan
optimasi suhu inkubasi dengan variasi suhu 20, 30, 40, dan 500C. Optimasi suhu
inkubasi untuk produksi enzim dilakukan pada konsentrasi substrat dan pH media
optimum yang telah diperoleh pada tahap sebelumnya. Penentuan kondisi
optimum suhu inkubasi juga dilakukan dengan mengamati parameter
pertumbuhan sel dan aktivitas enzimnya.
Analisis Statistik
Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan software SAS 9.1.3. Analisis
statistik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam Rancangan Acak
Lengkap (RAL). Model rancangannya:
Yijk = +αi+βj+(αβ)ij+εijk
Yijk
= nilai pengamatan pada faktor ke A (optimasi konsentrasi substrat/pH
media/suhu inkubasi) taraf ke-i faktor B (lamanya inkubasi) taraf ke-j dan
ulangan ke-k.
µ
= Rataan umum
αi
= pengaruh utama faktor A (optimasi konsentrasi substrat/pH media/suhu
inkubasi)
βj
= pengaruh utama faktor B (lamanya inkubasi)
(αβ)ij = pengaruh interaksi faktor A dan faktor B
εijk
= pengaruh acak yang menyebar normal
Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance)
pada tingkat kepercayaan 95 % dan taraf α 5%, dan dilakukan uji Duncan sebagai
uji lanjut.
5
HASIL
Hasil Peremajaan Isolat Bacillus subtilis
Isolat Bacillus subtilis diremajakan dalam media padat substrat locust
bean gum (LBG). Bakteri yang berhasil tumbuh ditandai dengan terlihatnya
koloni bakteri pada media tersebut. Koloni Bacillus subtilis terlihat berwarna
kuning kecoklatan, sedikit berlendir dan tumbuh pada permukaan media padat.
Hasil peremajaan isolat Bacillus subtilis dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Hasil peremajaan Bacillus subtilis pada media padat setelah 2 hari
Konsentrasi Optimum Substrat LBG untuk Produksi Enzim Mananase
Nilai OD (660 nm)
Kurva pertumbuhan dari Bacillus subtilis pada variasi konsentrasi substrat
LBG 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5% disajikan pada Gambar 2. Berdasarkan
kurva pertumbuhan yang diperoleh, terlihat bahwa nilai kerapatan optik (OD)
isolat Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 0.5% dan 1% mengalami
peningkatan seriring dengan bertambahnya waktu kultivasi dan kemudian
mengalami penurunan pada jam ke 96 sampai jam 144. Nilai kerapatan optik
tertinggi dari Bacillus subtilis pada konsentrasi tersebut adalah pada jam ke-72.
Nilai kerapatan optik isolat Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1.5%,
2%, dan 2.5% juga mengalami peningkatan seiring bertambahnya waktu, akan
tetapi mengalami penurunan pada jam 72 sampai jam 144. Nilai kerapatan optik
tertinggi dari Bacillus subtilis pada konsentrasi tersebut adalah pada jam ke-48.
Secara umum terlihat bahwa nilai kerapatan optik tertinggi dari isolat Bacillus
subtilis diperoleh pada konsentrasi 2.5% karena memiliki nilai absorban yang
lebih tinggi dibandingkan dengan nilai absorban pada konsentrasi substrat lainnya.
3.00
2.50
2.00
1.50
0,5%
1.00
1%
0.50
1.50
%
0.00
0
24 48 72 96 120 144
Waktu Kultivasi (Jam)
Gambar 2 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG
0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5%
6
Berdasarkan kurva tersebut dapat diketahui fase pertumbuhan bakteri.
Isolat Bacillus subtilis yang ditumbuhkan pada media LBG 1%, fase adaptasinya
terjadi sekitar jam ke-0 hingga jam ke-24. Fase adaptasi dari kultivasi ini tidak
terlalu jelas terlihat dalam kurva, hal ini disebabkan karena isolat tersebut telah
beradaptasi dengan media cair pada proses pra-kultivasi. Jam ke-24 sampai
dengan jam ke-72 merupakan fase log. Sekitar jam ke-72 sampai jam ke-96
menunjukkan fase stasioner. Sedangkan jam ke-96 sampai jam ke-144
menunjukkan fase kematian.
Pengukuran aktivitas enzim mananase menggunakan kurva standar dengan
persamaan garis y=0.0023x - 0.0872 (Lampiran 3). Aktivitas enzim mananase dari
Bacillus subtilis pada berbagai konsentrasi substrat LBG ditunjukkan pada Gambar 3.
Nilai aktivitas enzim pada konsentrasi 0.5% lebih kecil dan berbeda nyata
(P0.05)
dibandingkan dengan aktivitas enzim pada konsentrasi substrat 1.5%, 2% dan
2.5%. Berdasarkan hal tersebut, konsentrasi substrat LBG yang paling optimum
untuk produksi enzim mananase adalah pada konsentrasi substrat LBG 1%.
Aktivitas enzim (U/mL)
15.00
12.00
0,5%
9.00
1%
6.00
1.50%
2%
3.00
2.50%
0.00
0
24 48 72 96 120 144
Waktu inkubasi (jam)
Gambar 3 Aktivitas enzim mananase dari Bacillus subtilis pada konsentrasi
substrat 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, dan 2.5%
Kondisi pH Media Optimum untuk Produksi Enzim Mananase
Optimasi pH media dilakukan pada konsentrasi substrat optimum yang
telah diperoleh pada tahapan penelitian sebelumnya, yaitu konsentrasi substrat
LBG 1%. Variasi pH media yang digunakan pada penelitian ini adalah 5, 6, 7, 8,
dan 9. Dasar dari penentuan rentang variasi pH tersebut adalah karena pada
umumnya mikroorganisme jenis bakteri dapat tumbuh pada rentang tersebut.
Berdasarkan nilai absorban pada panjang gelombang 660 nm (Lampiran 7),
diperoleh hasil yang disajikan melalui kurva pertumbuhan pada Gambar 4.
7
Nilai OD (660 nm)
2.50
2.00
5
1.50
6
1.00
7
0.50
8
9
0.00
0
24 48 72 96 120 144
Waktu kultivasi (jam)
Gambar 4 Kurva pertumbuhan Bacillus subtilis pada konsentrasi substrat LBG 1%
dengan variasi pH media 5, 6, 7, 8, dan 9
Aktivitas Enzim (U/mL)
Terlihat bahwa nilai kerapatan optik Bacillus subtilis pada pH 9 lebih
rendah dibandingkan dengan pH lainnya, sedangkan nilai kerapatan optik pada pH
media 5, 6, 7, dan 8 tidak berbeda nyata (P