PRODUKSI DAN PENENTUAN KONDISI OPTIMUM ENZIM XILANASE Bacillus amyloliquefaciens FUKUMOTO PADA SUBSTRAT XILAN JERAMI.

Vol. 2, No. 1, September 2008

J. Ris. Kim.

PRODUKSI DAN PENENTUAN KONDISI OPTIMUM ENZIM XILANASE Bacillus
amyloliquefaciens FUKUMOTO PADA SUBSTRAT XILAN JERAMI
Widiyanti Sekatresna1,2, Abdi Dharma2, Periadnadi3
1
SMA N 2 Lubuk Basung
2
Program Studi Kimia Pasca Sarjana Universitas Andalas
3
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Andalas Padang
ABSTRACT
The production and determination of optimal condition of xylanase produced by Bacillus
amyloliquefaciens on rice straw xylan were investigated in this study. The parameters to be
observed were optimal conditions of pH, temperature, substrate concentration and incubation time.
Xilanase activity was determined by measuring the amount of reducing sugar formed in the
enzymatic reaction based on Somogyi Nelson method. Optimal conditions needed for the
production of xylanase were at pH 7, temperature 27°C and six days of incubation time. While
optimal conditions of xylanase action were reached at pH 8.2, temperature 45°C, substrate

concentration 3.5%(w/w) and 15 minutes of incubation time with enzyme activity and enzyme
specific activity of 1.285 U/mL and 0.738 U/mg respectively. As a comparison, xylanase was also
produced on pure xylan (birchwood), enzyme activity and enzyme specific activity obtained were
2.701 U/mL and 1.658 U/mg respectively. Cellulase content in enzyme produced on rice straw
xilan showed the enzyme activity of 0.094 U/mL.
Keywords : xylanase, Bacillus amyloliquefaciens, rice straw xilan
PENDAHULUAN
Salah satu sasaran dalam pengembangan
bioteknologi adalah merintis pemanfaatan
mikroorganisme dalam biokonversi limbah.
Pemanfaatan limbah berlignoselulose dengan
menggunakan jasa mikroorganisme dapat
menghasilkan enzim ekstraseluler yang mampu
mendegradasi bahan berlignoselulose menjadi
komponen penyusunnya. Limbah pertanian
yang dihasilkan selama kegiatan pertanian
sebagian
besar
merupakan
limbah

berlignoselulose dengan tiga komponen utama
meliputi hemisulose, selulose dan lignin[1] .
Salah satu tipe hemiselulose adalah xilan yang
dapat menjadi substrat penghasil enzim
xilanase[2]. Kandungan hemiselulose sebesar
26% sampai 35% pada jerami [3] menyebabkan
limbah tersebut berpeluang menjadi salah satu
sumber xilan.
Enzim xilanase telah dimanfaatkan dalam
berbagai industri baik industri pangan maupun
non pangan, seperti pada pembuatan gula
xilosa, produksi jus, ekstrak kopi, makanan

ternak, tekstil serta pulp dan kertas [4,5]. Pada
industri pulp dan kertas, xilanase digunakan
pada proses bleaching (pemutihan), yang
bertujuan untuk menghilangkan gugus
kromofor dan lignin.
Lignin merupakan
komponen di dalam pulp yang mengandung

gugus kromofor, yaitu gugus penyebab warna
dan sering terikat pada hemiselulose. Senyawa
ini mengurangi tingkat keputihan dan
mempengaruhi warna produk akhir kertas.
Proses bleaching biasanya menggunakan
senyawa-senyawa yang mengandung klorin.
Namun senyawa ini menimbulkan dampak
negatif, karena dapat menghasilkan dioksin
pada limbah industri pulp dan kertas.
Keunggulan enzim xilanase, selain mengurangi
penggunaan
bahan-bahan
kimia,
juga
meningkatkan kualitas maupun kuantitas pulp,
karena memungkinkan terjadinya proses yang
lebih selektif[6,7] .
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
kemampuan
Bacillus

amyloliquefaciens
menghasilkan enzim xilanase pada substrat
xilan jerami, sekaligus menentukan kondisi

ISSN : 1978-628X
74

Vol. 2, No. 1, September 2008

optimum yang
enzimatiknya.

dibutuhkan

J. Ris. Kim.

untuk

proses

METODOLOGI
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi,
gelas ukur, erlenmeyer, cawan petri, gelas
piala, dan alat-alat gelas lainnya, magnetic
stirer, hotplate, jarum ose, autoklaf, lampu
spiritus, timbangan analitik, inkubator (Max Q
4000), spektrofotometer (Genesys 20),
pHmeter (pHep Family) dan vorteks.
Bahan-bahan yang digunakan adalah biakan
murni Bacillus amyloliquefaciens (dari
laboratorium Teknologi Industri Pakan
Fakultas Peternakan Universitas Andalas
Padang), jerami, xilan murni (birchwood)
medium Nutrien Agar (NA), larutan BSA
(Bovine Serum Albumin), glukosa, buffer
fosfat, alkohol, akuades, NaOH, reagen
Nelson, fosfomolibdat dan reagen Lowry.
Prosedur
Persiapan Substrat

Sebagai
bahan dasar substrat fermentasi
digunakan jerami. Jerami yang telah
dikumpulkan dikeringkan dan dipotong-potong
sampai ukuran 10 mm.
Pengeringan
dilanjutkan sampai temperatur 121°C selama 1
jam dalam oven. Ditambahkan larutan etanol
96% dan diblender ± 2 menit. Kemudian
dibiarkan selama 12 jam. Selanjutnya akan
didapat endapan yang merupakan xilan kasar.
Pembuatan Suspensi Bakteri
Untuk starter digunakan bakteri yang berumur
6 hari pada media miring NA. Ditambahkan
masing-masing 5 mL akuades ke dalam media
miring tersebut. Koloni bakteri dilepaskan
dengan bantuan jarum ose, sehingga terbentuk
suspensi bakteri.
Penentuan Kondisi Optimum Produksi Enzim
Kondisi optimum produksi enzim ditentukan

dengan mempersiapkan 6 buah erlenmeyer
untuk 6 buah sampel sesuai kombinasi pH (A 1,

75

A2 dan A3 masing-masing untuk pH 7, 8 dan 9)
dan temperatur (B1 dan B2 untuk temperatur
kamar dan 40°C). Ke dalam sebuah gelas piala
dimasukkan 12 g xilan kasar (substrat xilan
jerami), 6 g urea sebagai sumber nitrogen serta
suspensi bakteri yang sudah dihomogenkan.
Selanjutnya ditambah akuades sampai volume
600 mL. Kemudian dibagikan ke dalam 6 buah
Erlenmeyer dengan kombinasi A1B1, A2B1,
A3B1, A1B2, A2B2 dan A3B2. pH diatur dengan
menambahkan larutan NaOH.
Masing-masing sampel dicuplik pada hari ke 3,
4, 5, 6, 7, dan 8 pada jam yang sama. Masingmasing cuplikan ditentukan aktivitas enzimatik
xilanasenya, dengan menentukan mol gula
reduksi yang terbentuk melalui metode

Somogyi Nelson. Dari data yang didapat,
dibuat kurva untuk mengetahui kondisi
optimum bagi Bacillus amyloliquefaciens
dalam menghasilkan enzim xilanase.
Produksi Enzim Xilanase
Sampel enzim dengan kondisi produksi
optimum diperbanyak dengan cara melarutkan
2 g substrat xilan jerami, 1 g urea sebagai
sumber nitrogen dalam akuades 100 mL.
Selanjutnya ditambahkan 1 mL suspensi
bakteri. pH, temperatur dan waktu inkubasi
diatur sesuai kondisi optimum produksi enzim
dari
optimasi
sebelumnya.
Sebagai
pembanding enzim juga diproduksi pada
substrat xilan murni (birchwood) dengan
prosedur yang sama dengan preparasi produksi
enzim pada substrat xilan jerami.

Penentuan pH Optimum
Pada sederetan tabung reaksi diisikan 1 mL
substrat (xilan murni) 2% dan 1 mL buffer
fosfat dengan variasi pH 7,2 – 8,6. Ke
dalamnya ditambahkan 1 mL enzim dan
inkubasi dilakukan pada suhu 35°C selama 30
menit.
Enzim
diinaktifkan
dengan
mencelupkan pada air mendidih selama 20
menit. Tahap berikutnya 1 mL reagen Nelson
ditambahkan pada masing-masing tabung dan
dipanaskan selama 20 menit, kemudian
didinginkan dengan segera pada gelas piala
yang berisi air dingin hingga suhu 26°C.
Ditambahkan 1 mL fosfomolibdat, dan
dikocok hingga sempurna. Volume dicukupkan
sampai 10 mL dengan akuades. Didiamkan

ISSN : 1978-628X

J. Ris. Kim.

Vol. 2, No. 1, September 2008

selama 30 menit untuk menyempurnakan
reaksi. Absorban masing-masing larutan diukur
pada panjang gelombang serapan maksimum
glukosa yaitu 540 nm. Melalui persamaan
regresi larutan standar glukosa, aktivitas enzim
dapat dihitung, dan pH optimum aktifitas
enzim ditentukan berdasarkan hasil yang
didapat setelah mengalurkan aktivitas enzim
xilanase terhadap nilai pH.

Pengujian Kandungan Selulase

Penentuan Temperatur, Waktu Inkubasi dan
Konsentrasi Substrat Optimum

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penentuan temperatur optimum, waktu
inkubasi optimum dan konsentrasi substrat
optimum dilakukan dengan prosedur yang
sama pada penentuan pH optimum dengan
menggunakan kondisi optimum yang telah
ditetapkan sebelumnya. Variasi suhu pada
penentuan temperatur optimum adalah 25; 30;
35; 40; 45; 50 dan 55°C, dan variasi waktu
inkubasi pada penentuan waktu inkubasi
optimum adalah 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45
dan 50 menit sedangkan variasi konsentrasi
substrat pada penentuan konsentrasi substrat
optimum adalah 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0;
3,5 dan 4,0%.
Penentuan Kestabilan terhadap Pengaruh
Pemanasan

Produser pengujian kandungan selulase sama
dengan produser penentuan kondisi optimum
konsentrasi substrat. Dalam hal ini untuk uji
selulase digunakan substrat Carboxy Methyl
Cellulose (CMC) dengan variasi konsentrasi
1,5; 2; 2,5 dan 3%.

Penentuan
Xilanase

Kondisi

Optimum

Produksi

Hasil penentuan kondisi optimum yang
dibutuhkan oleh Bacillus amyloliquefaciens
untuk menghasilkan xilanase tergambar pada
Gambar 1. Dari gambar telihat bahwa sampel
enzim dengan kombinasi A1B1 menunjukkan
aktivitas tertinggi. Dengan demikian kondisi
optimum yang dibutuhkan oleh Bacillus
amyloliquefaciens untuk memproduksi enzim
xilanase semaksimal mungkin adalah dengan
mengkondisikan sampel pada pH 7, temperatur
kamar (27°C) dan waktu inkubasi selama 6
hari. Oleh karena itu pada tahap ini telah
dilakukan produksi enzim dengan kondisi
optimum tersebut.
Penentuan Kondisi Optimum

Penentuan stabilitas enzim terhadap pengaruh
pemanasan
dilakukan
dengan
cara
memanaskan enzim pada variasi suhu 50, 60,
70, 80, 90 dan 100°C selama 10 menit.
Kemudian aktivitas enzimatik xilanase
ditentukan sesuai metode pada penentuan pH
optimum.

ISSN : 1978-628X

Kondisi pH sangat menentukan aktivitas
enzim. Hasil penentuan pH optimum terdapat
pada Gambar 2. Untuk enzim dengan media
produksi xilan jerami nilai maksimum dicapai
pada pH 8,2 dengan aktivitas sebesar 0,573
U/mL.

76

Tabel 1. Kondisi Awal Produksi Enzim Xilanase

Parameter (perlakuan)
Populasi awal bakteri

Kondisi
615 x109 cfu/mL

Substrat Xilan Jerami ( sumber karbon )

2 % (b/v)

Urea ( sumber nitrogen )

1 % (b/v)

pH
Temperatur
Kondisi Fermentasi
Cfu = colony forming unit

8,4
27°C
Kultur diam

Gambar 1. Kurva optimasi produksi xilanase

Gambar 2. Kurva penentuan pH optimum xilanase

Aktivitas enzim rendah pada pH di bawah nilai
pH optimum disebabkan karena kondisi
keasaman tidak sesuai bagi berlangsungnya
reaksi enzimatik, sehingga belum semua
substrat dikatalisis oleh enzim. Sedangkan
kondisi pH di atas pH optimum dapat merubah
struktur tiga dimensi protein enzim, yang dapat
merusak pusat aktif enzim. Hal ini sesuai
dengan yang dituliskan Tortora dkk[8] .

signifikan itu menunjukkan bahwa jenis enzim
yang dihasilkan sama pada kedua media
produksi tersebut. Nilai aktivitas enzim dari
media produksi xilan murni lebih besar
dibandingkan aktivitas enzim dari media
produksi xilan jerami. Hal ini disebabkan
karena substrat xilan murni menginduksi
produksi enzim lebih baik dibandingkan xilan
jerami yang masih merupakan xilan kasar.

Enzim yang dihasilkan media produksi xilan
murni, memberikan akivitas tertinggi enzim
sebesar 1,228 U/mL, yang dicapai oleh enzim
dengan pH 8,0. pH optimum enzim dari kedua
media produksi yang tidak berbeda secara

Penentuan Temperatur Optimum
Pada penentuan temperatur optimum kondisi
pH yang dipakai adalah pH optimum dari

penentuan sebelumnya. Hasil penentuan
temperatur optimum terdapat pada Gambar 3.
Enzim yang dihasilkan pada substrat xilan
jerami mencapai aktivitas tertinggi sebesar
0,682 U/mL pada temperatur 45°C. Rendahnya
aktivitas enzim di bawah temperatur optimum
disebabkan karena belum semua molekul
enzim mendapat energi yang cukup untuk
melangsungkan reaksi. Akibatnya, belum
semua substrat yang tersedia dikatalisis oleh
enzim. Sedangkan pada temperatur di atas
temperatur optimal, berkurangnya nilai
aktivitas disebabkan karena sebagian molekul
enzim sudah mengalami denaturasi, sehingga
sebagian struktur tiga dimensi protein telah
berubah serta menyebabkan perubahan
susunan asam amino di pusat aktif enzim.
Kondisi ini dapat menyebabkan berkurangnya
kemampuan katalitik enzim, sesuai dengan
yang dituliskan Hein dkk [9] . Sementara enzim
dari substrat xilan murni memiliki nilai
aktivitas sebesar 1,243U/mL yang dicapai pada
temperatur 40°C.
Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Gambar 4 memperlihatkan hasil penentuan
waktu inkubasi optimum. Pada penentuan
waktu inkubasi optimum pH larutan yang
dipakai adalah pH optimum yang telah
ditentukan sebelumnya yaitu pH 8,2 untuk
enzim dari substrat xilan jerami dan pH 8,0
untuk enzim dari substrat xilan murni. Dan
temperatur yang digunakan selama inkubasi
adalah 45°C untuk enzim dari media produksi

xilan jerami dan 40°C untuk enzim dari media
produksi xilan murni. Pada Gambar 4 terlihat
bahwa untuk kedua media produksi baik xilan
jerami maupun xilan murni aktivitas tertinggi
enzim dicapai pada waktu inkubasi 15 menit
dengan nilai aktivitas berturut-turut 1,077
U/mL dan 2,482 U/mL.
Penentuan Konsentrasi Substrat Optimum
Gambar 5 memperlihatkan hasil penentuan
konsentrasi substrat optimum. Pada Gambar 5
terlihat bahwa enzim dengan media produksi
xilan jerami, konsentrasi substrat optimumnya
adalah 3,5% dengan nilai aktivitas 1,285
U/mL. Sedangkan enzim dengan media
produksi xilan murni, optimum dicapai pada
konsentrasi 2,5% dengan nilai aktivitas 2,701
U/mL.
Perbedaan konsentrasi substrat optimum yang
cukup signifikan antara kedua substrat tersebut
disebabkan oleh adanya perbedaan komposisi
dari kedua substrat tersebut. Xilan dari substrat
xilan jerami merupakan xilan kasar yang masih
mengandung komponen lain selain xilan.
Sehingga untuk mencapai reaksi enzimatik
yang maksimal dibutuhkan konsentrasi yang
lebih tinggi, yaitu 3,5%. Sedangkan substrat
xilan murni merupakan xilan yang sudah
dimurnikan dari komponen-komponen lain.
Dengan demikian pada konsentrasi yang lebih
rendah yaitu 2,5% sudah memadai untuk
berlangsungnya reaksi enzimatik yang
maksimal.

Gambar 3. Kurva penentuan temperatur optimum xilanase

Gambar 4. Kurva penentuan waktu inkubasi optimum xilanase

Gambar 5. Kurva penentuan konsentrasi substrat optimum xilanase

Uji
Kestabilan
Terhadap
Pengaruh
Pemanasan dan Uji Kandungan Selulase
Hasil pengujian menunjukkan bahwa sampai
suhu 80°C aktivitas enzim masih konstan,
aktivitas baru berkurang pada pemanasan
90°C dan 100°C. Hal ini menunjukkan bahwa
enzim xilanase yang dihasilkan dapat
digolongkan ke dalam enzim termostabil.
Sedangkan hasil pengujian kandungan selulase
menunjukkan bahwa dalam preparat enzim
pada substrat xilan jerami juga terdapat enzim
selulase yang dapat bereaksi positif dengan

CMC. Aktivitas enzim selulase yang diperoleh
adalah 0,094 U/mL.
KESIMPULAN
Dari penelitian yang dilakukan, diperoleh
kesimpulan bahwa enzim xilanase dapat
dihasilkan
oleh
bakteri
Bacillus
amyloliquefaciens baik pada substrat xilan
jerami maupun pada substrat xilan murni.
Perbedaan enzim dari kedua media produksi
tersebut adalah terletak pada tingkat kemurnian
enzim. Aktivitas enzim xilanase media

produksi xilan jerami adalah 1,285 U/mL
dengan aktivitas spesifik 0,739 U/mg.
Sedangkan aktivitas enzim xilanase media
produksi xilan murni adalah 2,701 U/mL
dengan aktivitas spesifik 1,552 U/mg. Kondisi
optimum enzim xilanase dari media produksi
xilan jerami, pH 8,2; temperatur 45°C; waktu
inkubasi 15 menit dan konsentrasi substrat
3,5%. Sedangkan kondisi optimum enzim
xilanase dari media produksi xilan murni, pH
8,0; temperatur 40°C; waktu inkubasi 15 menit
dan konsentrasi substrat 2,5%. Enzim masih
stabil sampai pemanasan 800°C dan di dalam
enzim dari substrat xilan jerami masih
terkandung selulase dengan aktivitas 0,094
U/mL.

4.

5.

6.

DAFTAR PUSTAKA
7.
1. N. Richana, Produksi dan Prospek
Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri
di Indonesia, Buletin Agrobio, 5(1): 29 –
36, (2002),
2. I. Seyis, and N. Aksoz, Xylanase
Production from Trichoderma harzianum
1073 D3 with Alternative Carbon and
Nitrogen Sources, Food Technology and
Biotechnology, 43(1): 37 – 40, (2005).
3. S. Weber, S. Stubner, and R. Conrad,
Bacterial Population Colonizing and
Degrading Rice Straw in Anoxic Paddy

8.

9.

Soil,
Applied
and
Environmental
Microbiology, 67(3): 1318 – 1327, (2000).
Trismillah, W. Deden dan Sumaryanto,
Produksi Xilanase, Pengaruh Komposisi
Media pada Produksi Xilan, Bacillus
stearothermophillus
DSM
22
Menggunakan Substrat Kulit Buah Pisang,
Pustaka IPTEK J. Sains dan Teknologi
BPPT, VII.IIA.01, (2005).
D. S. Reis, F. A. M. Costa and M. R.
Peralta, Xylanase Production by A wild
Strain of Aspergillus Nidulans, Acta
Scientiarum Biological Science, Brazil,
(2003).
R. W. Kenealy, and W. T. Jeffries, Enzym
Processes for Pulp and Paper : A Review
of Recent Developments, Institute for
Microbial and Biochemical Technology,
U.S. Madison, 210 : 215, (2003)
P. Wahyudi, Enzim Xilanase, Teknologi
Bersih untuk Bleaching Pulp, Harian Sinar
Harapan, No.4053, (2002).
J. G. Tortora, R. B. Funke and L. C. Case,
Microbiology An Introduction, Eighth
Edition. Pearson Education, Benjamin
Cummings, San Franscisco, 2004, 112 –
118.
M. Hein, R. L. Best, S. Patisson, and S.
Arena, Introduction to Organik and
Biochemistry. Brooks/Cole Publishing
Company, California, 2000, 324 – 3357.