UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT ACTINOMYCETES SELAMA PROSES SOLID STATE FERMENTATION KITIN DENGAN METODE SOMOGYI-NELSON

ABSTRAK

UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT ACTINOMYCETES SELAMA PROSES SOLID STATE FERMENTATION KITIN

DENGAN METODE SOMOGYI-NELSON Oleh

WELLY ANGGRAINI

Telah dilakukan uji aktivitas enzim kitinase dari isolat actinomycetes selama proses Solid State Fermentation kitin dengan metode Somogyi-Nelson. Enzim kitinase dapat diproduksi oleh mikroorganisme kitinolitik, yaitu actinomycetes. Actinomycetes ini diambil dari Lumpur Hutan Bakau asal Pantai Ringgung Perairan Teluk Lampumg, dan telah diisolasi pada penelitian sebelumnya. Isolat actinomycetes yang digunakan adalah ANL-12, ANL-9, ANLd-2b-3, dan ANL-4, dengan memiliki aktivitas kitinolitik berturut-turut 1,9 cm, 2,0 cm, 2,3 cm, dan 5,0 cm. Isolat ANL-4 yang memiliki aktivitas kitinolitik terbesar ini dipilih untuk proses selanjutnya, yaitu proses Solid State Fermentation (SSF) dengan metode Somogyi-Nelson. Untuk proses SSF ini dilakukan dalam satu tempat. Aktivitas enzim kitinase diukur menggunakan microplate reader dengan metode Somogyi-Nelson. Aktivitas enzim dihitung dengan mengukur jumlah glukosa yang dilepaskan dalam µg/ml enzim kasar/jam (U/mL) oleh reaksi substrat dengan kondisi tertentu. Dari data penelitian menunjukkan bahwa enzim hasil pemurnian mempunyai waktu reaksi optimumnya sama-sama 20 menit dengan pH optimum pH 7,0 (kitin dicuci dengan NaOH), dan pH 6,0 (kitin tanpa dicuci NaOH); suhu optimumnya 30oC (kitin dicuci dengan NaOH), dan 20oC (kitin tanpa dicuci NaOH). Aktivitas unit terbesar dimiliki oleh kitin dicuci dengan NaOH yaitu 4,3157 x 10-5 U/mL dibandingkan dengan kitin tanpa dicuci NaOH adalah 4,1399 x 10-5 U/mL.

DAFTAR PUSTAKA

Alexander ,M. 1977 . Introduction to Soil Microbiology. 2nd edition. John Wiley and Sons. New York.

Amorso, R., M. Clowell, dan R. Hill. 1998. Mercury-resistant actinomycetes from the Chesapeake Bay. FEMS Microbiol Lett. 162: 177-184.

Anonim. 2009.Limbah Udang Sebagai Material Penyerap Logam Berat.

http://Mangrove.Unila.Ac.Id/Index/Php. Dibuka pada 28 Mei 2009, pukul 11.00 WIB

Angenent, L., K. Karim, M. Al-Dahhan, B. Wrenn, dan R. Domiguez-Espinosa. 2004. Production of bioenergy and biochemicals from industrial and agricultural wastewater. Trends in Biotechnology. 22, 477–485.

Bhakuni, D.S. and D.S. Rawat. 2005. Bioactive Marine Natural Products. Anamaya Publishers, New Delhi, India

Cohen-Kupiec R, Chet I. 1998. The molecular biology of chitin digestion. Curr Opinion Biotechnol 9: 270-277.

Das, H., S. Singh. 2004. Useful byproducts from cellulosic wastes of agriculture and food industry-a critical appraisal. Crit Rev Food Sci Nutr.44:77–89. Du Toit, P., S. Oliver, dan P. Van Biljon. 1984. Sugar cane bagasse as a possible

source of fermentable carbohydrates : Characteristics of bagasse with regard to monosaccharide, hemicellulose and amino acid composition.

Bio-technology and bioengineering 26, 1071-1078.

Foth, D. 1991. Dasar-dasar Ilmu Tanah. Gajah Mada University Press. Yogyakarta.

Fukamizo T. 2000. Chitinolityc enzymes: catalysis, substrate binding, and their application. Curr Prot Peptide Sci 1: 105-124

Gijzen M, Kuflu K, Qutob D, Chernys JT. 2001. A class I chitinase from soybean seed coat. J Exp Bot 52: 2283-2289

Ghose, T. 1987. Measurement of cellulase activities. Pure & App!. Chem. Vol. 59 No. 2: 257—268.

40

Gray, P., N. Hendy, dan W. Dunn. 1978. Digestion by cellulolytic enzymes of alkali pretreated bagasse. J. Aust. Inst. Agric. Sci., hal: 210-212.

Holker, U., M. Hofer, dan J. Lenz. 2004. Biotechnological advantages of

laboratory-scale solid state fermentation with fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 64:175–186

Lee, J. S., Joo, D. S., Cho, S. Y., Ha, J. H. and Lee, E. H. 2000. Purification and characterization of extracellular chitinase produced by marine bacterium, Bacillus sp. LJ-25. J. Microbiol. Biotechnol. 10, 307-311.

Lehninger, 1982. Dasar-dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta. Hal: 84-89 Linden, J., Stoner, R., et al., 2007. ”Organic Disease Control Elicitors”. Agro

Food Industry. New York

Lin, Y., dan S. Tanaka. 2006. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology 69. 6: 627-642.

Lowry, O., N. Rosebrough, A. Farr, dan R. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol.Chem. 193: 265–275

M.Al-Tai, Amira., et al., 1989. Cellulase Production from Actinomycetes isolated from Iraqi Soils : I Characterization of A Celluloytic Streptomyces SP. Strain AT7. Journal of Islamic Academy of Sciences 2:2, 185-188.

Magarvey, N.A., J.M. Keller, V. Bernan, M. Dworkin, and D.H. Sherman. 2004. Isolation and Characterization of Novel Marine-Derived Actinomycete Taxa Rich in Bioactive Metabolites†. Applied and Environmental Microbiology, Dec. 2004, P. 7520–7529 Vol. 70, No. 12

Mathivanan N (1995). Studies on extracellular chitinase and secondary metabolites produced by Fusarium chlamydosporum, an antagonist to Puccinia arachidis, the rust pathogen of groundnut. Ph. D. thesis, University of Madras, Chennai, India.

Mathivanan N, Kabilan V, Murugesan K (1997). Production of chitinase by Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust, Puccinia arachidis. Indian J. Exp. Biol. 35: 890-893.

Mitchel, D., N. Krieger, dan M. Berovic. 2006. Solid-State Fermentation Bioreactors. Springer-Verlag Berlin. Heidelberg.

Moo-Young M, A. Moriera, dan R. Tengerdy. 1983. Principles of solid state fermentation, Dalam The Filamentous Fungi, Vol. 4, Fungal Technology, JE Smith, DR Berry, & B Kristiansen (eds), Edward Arnold Publishers, London.

41

Nelson, D., dan M. Cox. 2000. Lehninger: Principles of Biochemistry. University of Wisconsin. Madison.

Nelson, N. 1944. A Photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem, 153: 375-380.

Nikolova, Stefka Antonova, Vanya Stefanova, dan Lyubomira Yocheva. 2006-2007. Taxonomic Study of Streptomyces sp. Strain 34-1. Journal of Culture Collections, Volume 5 pp. 10-15.

Ohno T, Armand S, Hata T, Nikaidou N, Henrissat B, Mitsutomi M, Watanabe T. 1996.A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griceus HUT 6037. J Bacteriol 178: 5065-5070

Pandey, A., C. Ricardo, dan C. Larroche. 2008. Current Developments in Solid-state Fermentation. Asiatech Publishers, INC. New Delhi.

Pandey, A., C. Soccoll, D. Mitchell. 2000. New developments in solid-state fermentation: I – Bioprocesses and products. Process Biochemistry. 35: 1153–1169.

Paturau, J. 1982. Byproducts of the Cane Sugar Industry, Second edition. Elsevier. Amsterdam.

Pujaningsih, R. 2005. Teknologi Fermentasi dan Peningkatan Kualitas Pakan . Laboratorium Teknologi Makanan Ternak Fakultas Peternakan UNDIP. Semarang.

Rifaat, H.M., O.H. El-Said, S.M. Hassanein and M.S. M. Selim. 2007. Protease Activity of Some Mesophilic Streptomycetes Isolated from Egyptian Habitats. Journal of Culture Collections Vol. 5, 2006-2007, Pp. 16-24 Skjak-Braek GA, Athonsen T, Sandford PT. 1989. Chitin and Chitosan: Sources,

Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Applications. Elsevier Appl Sci, London. p:561

Sukara, E. 2006. Biotrends. Puslit Bioteknologi LIPI. Majalah Populer Bioteknologi. Vol. 1 No.2

Sulistianingsih. 2006. Teknik Pengomposan Limbah Padat Industri Gula dan Aplikasinya pada Lahan Pertanaman Tebu di PT GMP. Lampung Tengah. Laporan PU. Unila. Bandar Lampung.

Suryanto, D., E.M. dan Yurnaliza. 2005. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik :

Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase pada Berbagai Jenis Bakteri dan Pemanfaatannya. USU.

42

Rao, K. 2009. Fermentation Biotechnology. http://www.fbae.org. Sabtu, 11 April 2009. 14.00 WIB.

Rao, N. 1994. Mikrooganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. UI press. Jakarta.

Remya, M., dan Vijayakumar, R. 2008. Isolation and characterization of marine antagonistic actinomycetes from west coast of India. Medicine and Biology Vol.15, No 1: 13 – 19.

Samsuri, M., M. Gozan, R. Mardias, M. Baiquni, H. Hermansyah, A. Wijanarko, Schwarz, W. 2001. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic

bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 634–649.

Sheehan, J., dan M. Himmel. 1999. Enzymes, energy, and the environment: a strategic perspective on the U.S. Department of Energy's Research and Development Activities for Bioethanol. Biotechnol Prog.15: 817–27.

Sutedjo, M., dan G. Kartasapoetra. 1991. Mikrobiologi Tanah. Ineka Cipta. Jakarta.

Suwandi, U. 1989. Mikroorganisme Penghasil Antibiotik. Pusat Penelitian dan Pengembangan PT. Kalbe Farma. Jakarta.

Takagi, M., S. Abe, G. Suzuki, G. Emert, dan N. Yata. 1977. A method for production of alcohol direct from cellulose using cellulase and yeast. Proceedings of the Bioconversion Symposium IIT, Delhi 551-571.

Tsujibo, H. Okami, Y., Tanno, H. and Inamori, Y. (1993) Cloning, sequence, and expression of a chitinase gene from a marine bacterium, Alteromonas sp. strain O-7. J. Bacteriol. 175, 176-181.

Volk, W.A dan M.F.Wheeler.1993. Mikrobiologi Dasar, Penerjemah Markham Edisi Kelima. Erlangga. Jakarta

Winarno, F. 1995. Enzim Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Xu, L., Q. Li, dan C. Jiang. 1996. Diversity of soil actinomycetes in Yunnan, China. Applied Environmental Microbiology 62 (1): 244-248.

Zhang, Y., M. Himmel, J. Mielenz. 2006. Outlook for cellulase improvement : Screening and selection strategies Biotechnology Advances. Elsevier. Amsterdam

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK... i

LEMBAR PENGESAHAN... ii

DAFTAR ISI... iii

DAFTAR TABEL ... iv

DAFTAR GAMBAR ... v

I. PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang Penelitian ... 1

B. Tujuan Penelitian ... 3

C. Manfaat Penelitian ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

A. Udang ... 4

B. Actinomycetes ... 5

C. Enzim ... 9

D. Kitin ... 11

E. Kitinase ... 12

F. Fermentasi ... 14

G. Solid State Fermentation ... .. 15

1. Proses Solid State Fermentation ... 16

ii

3. Aplikasi Solid State Fermentation... 18

H. Metode Somogyi-Nelson... 19

III. METODOLOGI PENELITIAN ... 20

A. Waktu dan Tempat Penelitian ... 20

B. Alat dan Bahan ... 20

C. Prosedur penelitian ... 21

1. Pembuatan Media ... 21

1.1 Media ISP-2 ... 21

1.2 Larutan Mineral garam ... 21

2. Pembuatan Larutan Pereaksi ... 21

2.1 Larutan Pereaksi Lowry ... 21

2.2 Larutan Pereaksi Somogyi-Nelson ... 22

2.3 Larutan Buffer Pospat 6,5 ... 22

3. Pertumbuhan Actinomycetes ... 23

4. Persiapan Inokulum ... 23

5. Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation) ... 23

6. Pembuatan Substrat Collodial kitin... 24

7. Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim ... 24

8. Assay Enzim ... 24

8.1 Penentuan pH optimum ... 25

8.2 Penentuan Suhu Optimum ... 25

8.3 Penentuan Waktu Inkubasi Optimum ... 25

9. Metode Somogyi-Nelson ... 26

iii

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 27

A. Identifikasi Actinomycetes ... 27

B. Solid State Fermentation, (Fermentasi Keadaan Padat ).... 30

C. Uji Aktivitas Enzim Kitinase... 31

1. Pengaruh pH Selama Reaksi Enzim Substrat... 32

2. Pengaruh Suhu Selama Reaksi Enzim Substrat... 34

3. Pengaruh Waktu Selama Reaksi Enzim Substrat... 35

V. SIMPULAN DAN SARAN... 37

A. Kesimpulan ... 37

B. Saran ... 38

DAFTAR PUSTAKA... .... 39

iv

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Sumber Nutrien Utama Dalam Pertumbuhan Mikroba... .... 15

2. Indeks Kitinolitik Actinomycetes... ... 27

3. Aktivitas unit enzim kitinase, kadar protein, dan aktivitas spesifik... ... 32

4. Hasil Pengamatan Makroskopis Isolat Actinomycetes………... ... 48

5. Absorbansi Berdasarkan Nilai pH... 50

6. Absorbansi Berdasarkan Nilai Suhu (oC )... 51

7. Absorbansi Berdasarkan Nilai Waktu Inkubasi ( menit ) 52

8. Absorbansi berbagai konsentrasi glukosa... . 53

v

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Berbagai Strain Actinomycetes dalam Media Agar... . 8

2. Struktur Kitin, dan Kitosan... ... 12

3. Actinomycetes yang mempunyai kemampuan dalam mendegradasi kitin pada media mineral-salt agar plate dengan Kitin 1% dengan pewarnaan Congo Red 1 %Isolat Actinomycetes Secara Mikroskopik... .. 28

4. Isolat actinomycetes secara mikroskopik... 29

5. Kurva pH Optimum Untuk Enzim Kitinase……….... . 33

6. Kurva Suhu Optimum Untuk Enzim Kitinase... 34

7. Kurva Waktu Inkubasi Optimum Untuk Enzim Kitinase... 36

8. Skema Diagram Alir Penelitian... 44

9. Skema Dalam Menghitung Total Protein... 45

10.Skema Dalam Menghitung Gula Pereduksi... 46

11.Isolat Actinomycetes ...………... 47

12.Proses Solid State Fermentation, SSF ( Fermentasi Padat )... 49

13.Kitin seteah dicuci NaOH dan sebelum dicuci NaOH………... . 49

14.Kurva Standar Glukosa……… 53

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Penelitian

Saat ini budi daya udang dengan tambak telah berkembang dengan pesat, karena udang merupakan komoditi ekspor yang dapat dihandalkan dalam meningkatkan ekspor non migas dan merupakan salah satu jenis biota laut yang bernilai ekonomis tinggi. Udang di Indonesia pada umumnya diekspor dalam bentuk udang beku (30%-75%) yang telah dibuang bagian kepala, kulit, dan ekornya Limbah kulit udang mengandung konstituen utama yang terdiri dari protein, kalsium karbonat, kitin, pigmen, abu, dan lain - lain (Anonim, 2009).

Kitin, polimer berantai lurus tersusun atas residu N-asetilglukosamin melalui ikatan ß-(1,4) yang terdapat berlimpah di alam setelah selulosa. Penyebaran kitin yang relatif luas menjadikan enzim pendegradasi kitin, kitin deasetilase, berpotensi diaplikasikan untuk menghidrolisis kitin menjadi kitosan (Tsigos et al., 2000). Adanya konfigurasi ß- tersebut membuat molekul glukosa mudah untuk membentuk serabut kristal fibriler yang kuat (Winarno, 1995), sehingga untuk merusaknya diperlukan suatu enzim yang spesifik. Enzim spesifik yang digunakan untuk menghidrolisis kitin adalah enzim kitinase (Howard et al., 2003).

2

Enzim kitinase dapat diproduksi oleh mikroorganisme kitinolitik, salah satunya adalah actinomycetes, karena actinomycetes ini mampu untuk mensintesis metabolit senyawa yang memiliki aktivitas biologis dan spora dari actinomycetes sangat esensial untuk biokonversi (Xu et al., 1996). Actinomycetes merupakan mikroorganisme yang paling efisien dalam menggunakan substrat bagi kelangsungan hidupnya. Substrat kitin mudah dihidrolisis oleh actinomycetes menjadi karbohidrat yang lebih sederhana, selanjutnya karbohidrat ini akan digunakan dalam memproduksi etanol dengan bantuan fermentasi (Samsuri, 2007). Proses hidrolisis dan fermentasi ini dapat dilakukan dalam satu tempat, dimana proses ini disebut sebagai proses fermentasi keadaan padat atau disebut Solid State Fermentation (SSF).

Proses SSF ini, pertama kali dikenalkan oleh Takagi et al. (1977), yang berhasil mengkombinasikan enzim kitinase dan yeast S. cerevisiae untuk fermentasi gula menjadi etanol. Menurut Moo–Young et al (1983), fermentasi keadaan padat (solid state fermentation) merupakan proses fermentasi yang melibatkan zat padat dalam suatu fasa cair. Dalam penerapan bioteknologi alternatif, pemanfaatan SSF menggunakan actinomycetes pendegradasi kitin pada udang dapat digunakan sebagai bioenergi dan bioproduk yang bermanfaat dengan biaya produksi yang murah (Angenent et al., 2004, Das dan Singh 2004).

Berdasarkan hasil penelitian dari Takagi et al. (1977), maka dalam penelitian ini, SSF difokuskan pada uji aktivitas enzim kitinase dari isolat actinomycetes selama proses fermentasi keadaan padat (solid state fermentation) udang dengan metode Somogyi-Nelson. Metode Somogyi-Nelson adalah metode untuk menentukan jumlah

3

perubahan glukosa dengan reagen tembaga dan reagen arsenomolibdat (Nelson, 1944). Metode Somogyi-Nelson ini dipilih karena memiliki kemampuan mendeteksi kisaran relatif perubahan gula yang tinggi, sedikit interferensi dari enzim dan biaya yang relatif lebih murah. Untuk proses fermentasi ini dapat dilihat dari karakteristik (berdasarkan pH, suhu, dan waktu inkubasi) dan aktivitas enzim kitinase (berdasarkan jumlah glukosa yang direduksi) actinomycetes pada saat inkubasi. Aktivitas enzim kitinase dihitung dari jumlah glukosa yang dilepaskan dalam μg/mL enzim kasar/ jam (U/mL) enzim oleh reaksi substrat dengan kondisi tertentu (Mathivanan et al., 1995).

B. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah :

1. Untuk mempelajari kondisi optimum dan aktivitas enzim kitinase selama proses reaksi enzim substrat.

2. Mempelajari substrat kitinolitik yang digunakan dalam aktivitas enzim kitinase.

C. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang :

1. Proses fermentasi keadaan padat (solid state fermentation) sebagai salah satu dari bioteknologi alternatif yang dapat digunakan dalam hidrolisis enzim.

4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Udang

Limbah udang yang berupa kulit, kepala, dan ekor dengan mudah didapatkan mengandung senyawa kimia berupa kitin dan kitosan. Senyawa ini dapat diolah dan dimanfaatkan sebagai bahan penyerap logam–logam berat yang dihasilkan oleh limbah industri. Hal ini dimungkinkan karena senyawa kitin dan kitosan mempunyai sifat sebagai bahan pengemulsi koagulasi, reaktifitas kimia yang tinggi dan menyebabkan sifat polielektrolit kation sehingga dapat berperan sebagai penukar ion (ion exchanger) dan dapat berfungsi sebagai absorben terhadap logam berat dalam air limbah.

Kulit udang mengandung protein (25% - 40%), kalsium karbonat (45% - 50% ), dan kitin (15% - 20%), tetapi besarnya kandungan komponen tersebut tergantung pada jenis udangnya. Sedangkan kulit kepiting mengandung protein (15,60% - 23,90%), kalsium karbonat (53,70% – 78,40%), dan kitin (18,70% - 32,20%), hal ini juga tergantung pada jenis kepiting dan tempat hidupnya. Kandungan kitin dalam kulit udang lebih sedikit dari kulit kepiting (crab), tetapi kulit udang lebih mudah didapat dan tersedia dalam jumlah yang banyak sebagai limbah (Anonim, 2009).

5

B. Actinomycetes

Actinomycetes merupakan organisme tanah yang memiliki sifat–sifat yang umum dimiliki oleh bakteri dan jamur. Terlihat dari luar seperti jamur (eukariotik), namun organisme ini sesuai dengan semua kriteria untuk sel prokariotik, yaitu : dinding selnya mengandung asam muramat, tidak mempunyai mitokondrion, mengandung ribosom 70s, tidak mempunyai pembungkus nukleus, garis tengah selnya berkisar dari 0,5-2,0 µm, dan dapat dimatikan atau dihambat oleh banyak antibiotik bakteri (Wesley dan Wheeler, 1993 dan Rao, 1994).

Menurut Alexander, 1997, Actinomycetes memiliki dinding sel yang terdiri dari polimer-polimer gula, asam amino dan asam gula seperti dinding sel bakteri Gram positif. Sedangkan dinding sel fungi terdiri dari selulosa dan kitin. Hal tersebut sejalan dengan Lay dan Hastowo (1992), yang mengatakan bahwa actinomycetes merupakan kelompok mikroba bersifat Gram positif.

Walaupun actinomycetes dikatakan sebagai mikroorganisme peralihan antara bakteri dan fungi (Alexander, 1997), tetapi actinomycetes mempunyai ciri yang khas, yang cukup membatasinya menjadi satu kelompok yang jelas berbeda. Pada medium cair, pertumbuhan actinomycetes ditandai dengan keruhnya medium dan terbentuk lapisan tipis di permukaan medium.

Actinomycetes menyerupai fungi karena mempunyai hifa bercabang dengan membentuk miselium. Miselium tumbuh menjulang ke udara, dan memisah dalam fragmen–fragmen yang pendek sehingga terlihat seperti cabang pada

6

bakteri (Sutedjo et al., 1991). Actinomycetes mempunyai kesamaan dengan bakteri yaitu struktur sel dan ukuran irisan melintang (Foth, 1991).

Menurut Rao (1994), pada lempeng agar, actinomycetes dapat dibedakan dengan mudah dari bakteri, dimana koloni bakteri tumbuh dengan cepat dan berlendir, sedangkan actinomycetes muncul perlahan dan berbubuk serta melekat erat pada permukaan agar. Koloni actinomycetes biasanya keras, kasar, dan tumbuh tinggi di atas permukaan medium. Umumnya, actinomycetes tidak toleran terhadap asam dan jumlahnya menurun pada pH 5,0. Rentang pH dan temperatur yang cocok untuk pertumbuhan actinomycetes ini sekitar 6,5–8,0 dan 25–300C. Namun, ada beberapa actinomycetes termofilik yang dapat tumbuh pada temperatur sekitar 55– 650C seperti Thermoactinomycetes dan Streptomyces.

Medium yang baik untuk menumbuhkan actinomycetes adalah medium yang mengandung glukosa, gliserol atau tepung sebagai sumber karbon; nitrat atau kasein sebagai sumber nitrogen dan mineral–mineral tertentu seperti NaCl, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, FeSO4.7H2O. Inkubasi biasanya selama 2–7 hari (Jutono dalam Fithria, 2007). Populasi actinomycetes di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti kandungan organik, pH, kelembapan, temperatur, musim, dan lain- lain (Suwandi, 1989).

Menurut Sutedjo (1991), actinomycetes dapat membentuk dua tipe miselium, yaitu :

1. Miselium vegetatif

Miselium vegetatif merupakan miselium yang tumbuh di atas medium. Pada beberapa spesies miselium vegetatif berbentuk lurus dan panjang, sedang

7

pada spesies lain berbentuk pendek, bercabang, atau bengkok. Diameter miselium vegetatif antara 0,2-0,8 mikron. Miselium vegetatif juga dapat membentuk pigmen.

2. Miselium udara (aerial)

Miselium udara (aerial) merupakan miselium yang tumbuh pada permukaan medium dan terbentuk konidia. Banyak actinomycetes khususnya yang termasuk dalam Streptomyces dapat membentuk miselium udara. Miselium udara berbentuk pendek dan lurus, atau berulir–ulir (spiral) dan bercabang, dapat membentuk sporofora yang lurus, serta beberapa hifa udara bersifat steril. Miselium udara memiliki pigmen putih, kelabu, lembayung, merah, kuning, hijau, atau warna lainnya.

Berdasarkan morfologinya actinomycetes diklasifikasi sebagai berikut :

1. Nocardioforms, terdiri dari 11 genus dengan ciri–ciri filamen mengalami fragmentasi, diameter filamen 0,5-1,2 µm, rantai konidia terdapat pada miselium subtrat dan aerial, dan bersifat mesofilik. Contoh: Nocardia. 2. Multiloculars, meliputi 3 genus dengan ciri–ciri diameter 0,5-2,0 µm,

tidak ada miselium aerial, sporangiospora non motil, membentuk bintil akar pada tanaman yang bukan kacang-kacangan. Contoh : Frankia. 3. Actinoplanes, terdiri dari 5 genus dengan ciri-ciri diameter cabang septa

miselium 0,5 µm, tanpa miselium aerial, spora dibentuk pada miselium subtrat. Contoh : Micromonospora.

4. Sterptomycetes, terdiri dari 4 genus dengan ciri-ciri diameter filamen 0,5-2,0 µm, rantai terdiri dari tiga hingga beberapa spora, miselium aerial, dan dapat memproduksi antibiotik. Contoh : Strepomyces.

8

5. Maduromycetes, terdiri dari 7 genus dengan ciri-ciri memiliki hifa aerial, bentuk sporangiospora pada gelendong, hifa tidak bercabang dan hifa hidrosilat berisi madurose (metal galaktosa). Contoh : Streptosporangium. 6. Thermomonospora, terdiri dari 4 genus dengan ciri–ciri bercabang tanpa fragmentasi, filamen berbentuk koloni tipis, spora dibentuk pada sekelompok cabang sporangiospora. Contoh : Thermoactinomyces. 7. Thermoactinomycetes, hanya 1 genus dengan ciri–ciri memiliki miselium

subtrat, bercabang, bersepta, diameternya 0,4–0,8 µm, dan membentuk endospora. Contoh : Thermoactinomyces.

8. Lainnya, terdiri dari 4 genus dengan ciri–ciri cabang hifa vegetatif berdiameter 0,4 µm, hifa aerial membentuk lingkaran yang diakhiri dengan konidia, miselium tidak berisi nitrogen, fosfolipid dan asam mycolic tetapi berisi glikolipid. Contoh : Glycomyces.

Gambar 1. Berbagai strain actinomycetes yang ditumbuhkan pada media agar (Caveletti, 2009)

9

C. Enzim

Enzim merupakan produk protein sel hidup yang berperan sebagai biokatalisator dalam proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel (Poedjiadi, 1994). Enzim merupakan katalisator sejati yang meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik dengan nyata, tanpa enzim, suatu reaksi kimia akan berlangsung amat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi tersebut (Lehninger, 1982).

Enzim adalah protein yang diproduksi oleh sel-sel hidup. Protein yang diproduksi ini berbeda dengan protein lain seperti albumin, gelatin dan kasein karena protein enzim yang diproduksi oleh sel hidup dapat berfungsi sebagai katalis dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi kimia spesifik yang terjadi di dalam sel. Enzim yang diperoleh dari mikroorganisme lebih menguntungkan karena mikroorganisme dapat berkembang biak dengan cepat, tidak memerlukan lahan yang luas, biaya produksi relatif murah dan mudah dikontrol (Maggy dkk, 1989).

Fungsi terpenting dari enzim adalah kemampuannya menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Kemampuan enzim mendegradasi substrat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, pH, serta temperatur (Lehninger, 1982).

10

Protein adalah bagian utama enzim yang dihasilkan sel, maka semua yang dapat mempengaruhi protein dan sel akan berpengaruh terhadap reaksi enzimatik. Beberapa faktor penting yang mempengaruhi aktivitas enzim antara lain :

a). Substrat (reaktan)

Pada konsentrasi substrat rendah, kecepatan reaksi yang terjadi rendah. Kecepatan reaksi akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Akan tetapi setelah peningkatan substrat lebih lanjut akan tercapai suatu laju maksimum. Pada keadaan substrat yang berlebih akan terjadi kejenuhan pembentukan kompleks enzim substrat sehingga sebagian besar substrat tidak diubah menjadi produk. Penambahan substrat lebih lanjut tidak berakibat terhadap laju reaksi.

b). Suhu

Seperti reaksi kimia pada umumnya, maka reaksi enzimatik dipengaruhi oleh suhu. Jika suhu meningkat, maka laju reaksi juga akan meningkat. Karena enzim adalah protein, maka semakin tinggi suhu mengakibatkan proses enzim tidak aktif meningkat. Umumnya enzim mengalami kerusakan (denaturasi) pada suhu di atas 50oC.

c). Derajat keasaman ( pH )

Reaksi suatu enzim dipengaruhi oleh perubahan pH karena akan berakibat langsung terhadap sifat ion dari gugus–gugus amino dan karboksilat, sehingga akan mempengaruhi bagian aktif enzim dan konformasi dari enzim. pH yang terlalu rendah atau terlalu tinggi akan mengakibatkan denaturasi dari protein enzim.

11

d). Penghambat enzim (inhibitor)

Inhibitor dapat meminimalkan kerja enzim karena akan membentuk ikatan dengan sisi aktif enzim sehingga mengganggu proses pembentukan dan kestabilan ikatan kompleks enzim substrat. Ada beberapa cara penghambatan enzim, seperti penghambat secara bersaing (kompetitif), penghambat tidak bersaing (non–kompetitif ), penghambat umpan balik (feed back inhibitor), dan penghambat alosterik.

D. Kitin

Kitin adalah polimer kedua terbanyak di alam setelah selulosa. Kitin merupakan komponen penyusun tubuh serangga, udang, kepiting, cumi-cumi, dan artropoda lainnya, serta bagian dari dinding sel kebanyakan fungi dan alga. Setiap tahun dari perairan (laut) dihasilkan sekitar 10–11 ton kitin, namun kurang dari 0,1% yang dimanfaatkan kembali.

Kitin memiliki struktur yang mirip selulosa. Bila selulosa tersusun atas monomer glukosa, maka kitin tersusun dari monomer N–asetilglukosamin (Gambar 2). Keduanya memiliki kelarutan sangat rendah dalam air serta mengalami biodegradasi melalui mekanisme yang hampir serupa dengan melibatkan komplek enzim.

12

Gambar 2. Struktur Kitin, dan Kitosan ( Skjak-Braek and Sanford, 1989 )

E. Kitinase

Kitinase merupakan enzim yang mampu menghidrolisa polimer kitin menjadi kitin oligosakarida atau monomer N-asetilglukosamin. Enzim ini dihasilkan oleh bakteri, fungi, tanaman, dan hewan. Atas dasar cara kerjanya dalam mendegradasi substrat, kitinase dibedakan kedalam 2 kelompok utama: endokitinase dan eksokitinase. Endokitinase memotong polimer kitin secara acak menghasilkan dimer, trimer, tetramer dan atau oligomer gula. Eksokitinase memotong kitin hanya dari ujung non reduksi. Bila hasil potongan berupa monomer maka enzim tersebut dinamakan N-asetilheksosaminidase, namun bila potongan yang dihasilkan berupa dimer maka enzim tersebut disebut sitobiosidase (Cohen-Kupiec dan Chet, 1998).

Berdasarkan homologi sekuen asam aminonya, kitinase dibedakan atas famili 18 dan 19. Famili 18 meliputi kitinase dari bakteri, fungi, serangga, tanaman (kelas III dan V), hewan (Gijzen et al, 2001) dan satu kitinase dari Streptomyces griseus (Ohno et al, 1996). Kitinase tanaman kelas I tersusun atas sekuen yang conserved pada struktur utamanya, serta domain kaya sistein pada ujung N. Kitinase kelas II

13

secara struktural homolog dengan kelas I, tetapi tidak memiliki domain kaya sistein. Sementara, kitinase kelas III dan V tidak memiliki homologi dengan kitinase kelas I, II dan IV (Fukamizo, 2000).

Selain oleh kitinase, polimer kitin juga bisa didegradasi oleh enzim kitin deasetilase dan kitosanase (Gambar 2). Kitin deasetilase menghilangkan gugus asetil dari kitin menghasilkan kitosan. Kitosan akan dipotong–potong oleh kitosanase menghasilkan kitosan oligomer kitosan. Oligomer kitosan kemudian dipotong-potong lagi oleh β–D-glukosaminidase menghasilkan monomer glukosamin, kitin dan kitosan memiliki struktur yang serupa tetapi disusun oleh monomer gula yang berlainan. Kitin tersusun atas monomer N-asetilglukosamin, sementara kitosan disusun oleh monomer glukosamin.

Pengukuran aktivitas kitinase dalam memecah kitin dapat dilakukan dengan beberapa cara seperti yang disebutkan dalam Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987) yaitu :

a) Berdasarkan pengurangan substrat

1. Metode viskosimetri yaitu aktivitas kitinase terhadap kitosan, glikol kitin atau karboksimetil kitin yang ditunjukkan oleh terjadinya pengurangan viskositas substrat.

2. Metode turbidimetri (nephelometri) yaitu pengukuran variasi kekeruhan suspensi kolodial kitin selama kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat tapi tidak cocok untuk enzim dengan aktivitas rendah. Contoh pada pengukuran aktivitas enzim endokitinase. Unit aktivitas enzim endokitinase diukur sebagai persen

14

pengurangan kerapatan atau turbiditas relatif dari suspensi yang sama antara yang berisi enzim dengan akuades. Satu unit endokitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mereduksi turbiditas suspensi kitin 5 %.

b) Berdasarkan pembentukan produk akhir yaitu GlcNAc (metode Reissig, 1955). GlcNAc yang dibebaskan dari kitin ditentukan secara kolometrik dengan penambahan p-dimetilaminobenzaldehida. Satu unit aktivitas kitinase dinyatakan sebagai µmol GlcNAc yang dibebaskan selama 1 jam dalam kondisi yang ditetapkan.

c) Pengujian spektrofotometri yaitu menggunakan kromogen 3,4-dinitrophenil-tetra- N-asetilkitotetraose sebagai substrat.

d) Pengujian sensitifitas kitinase menggunakan radiometri yaitu substrat diberi label 14C atau 3H. Kadar produk diuji dengan radioaktifitasnya setelah penghilangan kitin yang belum dipecah dengan penyaringan atau dengan cara disentrifugasi.

F. Fermentasi

Fermentasi merupakan reaksi oksidasi reduksi yang menggunakan sumber energi dan sumber karbon, nitrogen dan pospor untuk membentuk senyawa yang mempunyai nilai ekonomi lebih tinggi serta terakumulasi dalam medium. Proses fermentasi disebabkan oleh organisme atau hasil metabolisme (Rao, 2009). Medium yang digunakan dalam suatu fermentasi harus mengandung substrat kaya akan nutrien. Substrat atau nutrien adalah senyawa yang terdapat di lingkungan pertumbuhan dan digunakan untuk proses katabolisme dan anabolisme. Nutrien

15

utama yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba adalah karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen dan pospor.

Tabel 1. Sumber nutrien utama yang digunakan dalam pertumbuhan mikroba ( Rao, 2009 )

Nutrien Sumber

Karbon Glukosa Laktosa Lemak Hidrokarbon

gula jagung, pati, selulosa tebu, molasse

milkwhey Fraksi minyak Nitrogen Protein Ammonia Nitrat Nitrogen kedelai

amoniak atau garam amonium garam nitrat

Udara

Pospor garam pospat

Menurut Pujaningsih (2005) faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan substrat fermentasi, adalah :

a) Kontinyuitas ketersediaan, yaitu tersedia substrat sepanjang tahun sehingga dapat disimpan dalam beberapa bulan, mutu dan komposisi relatif tetap.

b) Sifat fermentasi substrat harus dapat difermentasikan, contoh pada Tichoderma viridae yang hanya tumbuh baik pada substrat selulosa (jerami padi), tetapi tidak dapat tumbuh pada bungkil kelapa.

c) Harga substrat ekonomis dan dapat digunakan sesuai kebutuhan.

G. Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation)

Untuk fermentasi pertumbuhan mikroba dan pembentukan produk bergantung dari permukaan pada substrat padat. Substrat tradisional yang digunakan berupa hasil produk agrikultur seperti beras, tepung, maisena, tebu, dan lain-lain. Substrat

16

tersebut dapat bermanfaat bagi organisme miselium untuk tumbuh pada konsentrasi nutrisi yang tinggi, dan menghasilkan berbagai macam enzim ekstraseluler seperti sejumlah filamen jamur dan beberapa bakteri, actinomycetes dan satu strain dari Bacillus (Pandey, 2008).

Fermentasi keadaan padat atau Solid State Fermentation (SSF) pertama kali dikenalkan oleh Takagi et al. (1977), yang telah berhasil mengkombinasikan enzim kitinase dan yeast S. Cerevisiae untuk fermentasi gula menjadi etanol. Fermentasi keadaan padat (SSF) sebagai proses fermentasi yang melibatkan zat padat dalam suatu fasa cair (Moo-Young et al., 1983). Untuk proses SSF ini dapat dilakukan dalam satu tempat, proses ini hampir sama dengan proses hidrolisis dengan enzim dan proses fermentasi. Proses SSF ini membutuhkan bahan mentah alami sebagai sumber karbon dan bahan iner sebagai matrik padatan. Substrat padat (matrik) harus cukup akan kelembapan dan memiliki area permukaan substrat yang lebar.

Pembagian SSF berdasarkan dari sifat fisik dibagi menjadi dua kelompok, antara lain :

1. Fermentasi keadaan padat dengan kelembapan rendah atau dengan agitasi berkala.

2. Fermentasi keadaan padat tersuspensi dalam kolom dengan sirkulasi larutan. Jamur yang digunakan biasanya aerob obligat.

1. Proses Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation)

Menurut Mitchel et al. (2006) tahapan–tahapan proses SSF secara umum, antara lain :

17

a) Persiapan substrat, dimana substrat harus dipotong, digiling, dipecahkan, atau dibuat menjadi butiran kecil. Dengan penambahan air dan nutrisi disebut dengan pra-perawatan substrat untuk menambah ketersediaan gizi. b) Persiapan inokulum, tipe dan persiapan inokulum tergantung pada

mikroorganisme yang digunakan. Banyak proses SSF melibatkan hifa khamir, maka digunakan spora hasil inokulasi. Tujuan dari langkah ini untuk mengembangkan sebuah inokulum dengan tingkat kelangsungan hidup mikoorganisme yang tinggi.

c) Persiapan wadah, dimana wadah harus dibersihkan setelah fermentasi sebelumnya dan perlu disterilkan sebelum penambahan substrat.

d) Inokulasi dan pengerjaan, pengerjaan tahapan ini dengan menyebarkan substrat pada media yang telah disterilkan secara hati–hati untuk menghindari kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. e) Proses SSF, pada proses ini banyak hal yang harus diperhatikan antara lain

pH medium, suhu, dan waktu inkubasi, kelembapan.

f) Kultivasi, pada tahapan ini memerlukan bantuan mekanis untuk memisahkan substrat padat dari medium. Penggunaan kertas saring dan sentrifugasi dapat dipakai untuk memisahkan substrat.

2. Keuntungan Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation) Keuntungan dari SSF, antara lain biaya lebih murah, media produksi dapat menggunakan residu agroindustri, menggunakan sedikit air, limbah yang dihasilkan sedikit, proses sederhana, menggunakan wadah dalam jumlah kecil tetapi menghasilkan konsentrasi produk tinggi, dan proses aerasi lebih mudah.

18

3. Aplikasi Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation)

Menurut Holker et al. (2004) dan Pandey (2000) dapat menguraikan aplikasi dari SSF secara tradisional, antara lain :

a) Tempe, dimana tempe melibatkan kultivasi dari khamir Rhizopus oligosporus pada kedelai yang direbus, kemudian digoreng dan dimakan sebagai pengganti daging. Makanan fermentasi ini sangat terkenal di Indonesia.

b) Tahapan koji dalam pembuatan kecap yang melibatkan kultivasi dari khamir Aspergillus oryzae dalam kedelai rebus. Proses SSF miselium khamir menutupi kedelai dan menginjeksikan ke dalam campuran enzim. Kedelai hasil fermentasi kemudian dipindahkan ke dalam air asin selama beberapa bulan sehingga akan menghasilkan saus yang berwarna coklat tua.

c) “ang-kak” atau anggur merah melibatkan kultivasi dari khamir Monascus purpureus pada beras yang direbus. Produksi khamir menghasilkan pigmen berwarna merah gelap, pada tahap akhir fermentasi beras hasil fermentasi dikeringkan dan dihaluskan menjadi bubuk yang akan digunakan sebagai pewarna saat memasak.

Selain aplikasi di atas, kebanyakan dari aplikasi tersebut menghasilkan produk-produk seperti enzim, pigmen, senyawa aromatik, senyawa kimia, antibiotik, dan agen pengontrol biologis serta banyak aplikasi penggunaan mikroorganisme dalam SSF sebagai bagian dari proses perantara, yaitu pewarnaan zat warna, biobleaching, biopulping, dan bioremediation.

19

H. Metode Somogyi - Nelson

Metode Somogyi-Nelson adalah metode fotometri yang dapat mereduksi gula dengan reagen tembaga dan reagen arsenomolibdat. Assay reduksi gula bergantung pada reduksi oksidan anorganik seperti ion tembaga (Cu2+) dengan penerima elektron yang berasal gugus aldehid ujung rantai kitosan. Kisaran deteksi berkisar kurang dari 1 μg per sampel hingga 2500 μg per sampel. DNS dan metode Nelson-Somogyi adalah dua assay yang umum digunakan untuk mengukur reduksi gula aktivitas kitinase. Kedua metode ini digunakan karena tinggi kisaran deteksi dan sedikit gangguan dari kitinase (Ghose, 1987; Zhang et al., 2006).

Dalam penelitian ini akan digunakan metode Somogyi–Nelson dengan modifikasi menggunakan microplate reader. Keuntungan utama modifikasi assay ini adalah sampel dan reagen yang lebih sedikit dan menghilangkan proses pemanasan.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Actinomycetes

Pada penelitian ini isolat actinomycetes yang digunakan adalah ANL–4, isolat ini telah berhasil diisolasi dari sedimen mangrove pantai dengan ciri– ciri strain ini memiliki miselium aerial berwarna putih keabuan dan miselium substratnya berwarna krem keabuan. Isolat ANL–4 ini memiliki indeks kitinolitik terbesar dibandingkan dengan ketiga isolat lainnya (Tabel 2), ini ditentukan berdasarkan rasio diameter zona bening yang dihasilkan terhadap diameter koloni. Berikut ini indeks kitinolitik isolat yang mempunyai aktivitas kitinolitik :

Tabel 2 Indeks kitinolitik actinomycetes yang diisolasi dari Lumpur Hutan Bakau asal Pantai Ringgung Perairan Teluk Lampung

Kode Isolat Diameter Zona Bening

(cm)

Diameter Koloni (cm)

Indeks Kitinolitik

ANL – 12 2,3 1,2 1,9

ANL – 9 1,0 0,5 2,0

ANLd – 2b – 3 0,7 0,3 2,3

28

ANL-4 ANL-9

ANL-12 ANLd-2b-3

Gambar 3. Actinomycetes yang mempunyai kemampuan dalam

mendegradasi kitin pada media mineral-salt agar plate dengan Kitin 1% dengan pewarnaan Congo Red 1 %

Strain actinomycetes ini ditumbuhkan dalam media ISP–2. Isolat ANL-4 yang diperoleh memiliki kemiripan dengan Gambar mikroskopis dari streptomyces sp yang telah berhasil diisolasi dari tanah oleh Nikolova, et al. pada 2006-2007, sehingga dapat dikatakan bahwa isolat ANL-4 termasuk kedalam genus streptomyces.

29

ANL-12 ANL-9

ANL-4 ANLd-2b-3

Nikolova, et al. pada 2006-2007

30

B. Solid State Fermentation, SSF (Fermentasi Keadaan Padat)

Pada tahap ini, isolat actinomycetes yang akan diisolasi enzimnya, ditumbuhkan pada media mineralsalt sebanyak 100 mL kemudian media tersebut ditambahkan dengan 5 mL media mineralsalt yang didalamnya terdapat isolat actinomycetes (ANL–4), selanjutnya dikultivasi pada orbital shaker dengan kecepatan 175 rpm selama 5 hari. Hasil kultivasi yang didapat berwarna kuning kekeruhan, warna tersebut menunjukkan adanya pertumbuhan actinomycetes. Setiap isolat actinomycetes mempunyai warna yang berbeda–beda, jika dikultivasi dalam media mineralsalt. Setelah dikultivasi selama 5 hari, isolat actinomycetes (ANL–4) yang ada pada media mineralsalt dipisahkan antara biomasa dengan filtratnya. Kemudian filtrat yang diperoleh di sentrifius, dan hasil dari sentrifius tersebut merupakan ekstrak kasar enzim kitinase.

Dalam proses fermentasi keadaan padat (SSF) ini menggunakan dua substrat yaitu kitin dicuci dengan NaOH dan kitin tanpa dicuci NaOH. NaOH ini berperan sebagai pencuci untuk menghilangkan zat pengotor yang ada didalam kitin, dan dapat memutus gugus asetamida, sehingga pada penelitian ini tujuan menggunakan dua substrat tersebut adalah untuk membandingkan hasil antara kitin dicuci dengan NaOH dan kitin tanpa dicuci NaOH.

31

C. Uji Aktivitas Enzim

Enzim kitinase merupakan suatu enzim ekstraseluler, oleh karena itu pengambilan eksrak kasar enzim dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC (M.Al-Tai et al., 1989). Filtrat hasil sentrifius diuji berdasarkan variasi pH, suhu, dan waktu inkubasi dengan menggunakan metode Somolgi–Nelson, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm dengan menggunakan microplate reader. Microplate reader memiliki keuntungan utama adalah sampel dan reagen yang lebih sedikit, dan menghilangkan proses pemanasan serta dapat dilakukan secara banyak.

Total protein ditentukan dengan menggunakan metode Lowry (1951) dengan pengulangan sebanyak 3 kali untuk setiap sampel dan standar. Pengulangan ini dilakukan untuk memperkecil kesalahan pada pembacaan absorbansi dalam microplate. Total protein ekstrak kasar enzim kitinase dapat dilihat pada Tabel 3, dengan memplotkan serapan standar Bovine Serum Albumin konsentrasi 100 sampai 2000 µ L/mL.

Aktivitas enzim kitinase ditentukan berdasarkan jumlah dari glukosa yang

dilepaskan dalam μg/mL enzim kasar/jam (U/mL) enzim oleh reaksi substrat

32

Aktivitas unit terbesar dimiliki oleh collodial kitin (kitin dicuci dengan NaOH) dibandingkan dengan collodial kitin (kitin tanpa dicuci NaOH) (Tabel 3). Substrat collodial kitin (kitin tanpa dicuci NaOH) sedikit menunjukkan adanya aktivitas kitinolitik pada media mineralsalt. Hal ini dimungkinkan aktivitasnya telah hilang setelah masa inkubasi 7 hari. Kemampuan suatu mikroorganisme dalam mensekresikan enzim adalah berbeda-beda. Tergantung pada jenis mikroba itu sendiri maupun media yang digunakan.

Tabel 3. Aktivitas unit enzim kitinase, kadar protein, dan aktivitas spesifik dari isolat Actinomycetes (ANL-4)

No. substrat Aktivitas

Unit (U/mL)

Kadar protein (mg/mL)

Aktivitas spesifik (U/mg)

1. Collodial kitin (Kitin tanpa dicuci NaOH)

4,1399 x 10-5 4,58708 9,04

x 10

-6

2. Colloidal kitin (Kitin dicuci dengan

NaOH)

4,3157 x 10-5 6,05631

_{7,12 x 10}

-6

1. Pengaruh pH Selama Reaksi Enzim Substrat

Ekstrak kasar enzim yang dihasilkan selanjutnya digunakan sebagai sampel utama untuk mengetahui pengaruh pH terhadap substrat selama reaksi. Penentuan pH optimum dilakukan dengan cara mereaksikan substrat dengan enzim dengan variasi pH yaitu 6,0; 6,5; 7,0; dan 7,5 dimana substrat yang digunakan adalah kitin yang telah dicuci dengan menggunakan NaOH dan

33

tanpa dicuci dengan NaOH. Berikut ini hasil dari penentuan pH optimum enzim kitinase dengan substrat yang telah dicuci dengan NaOH dan tanpa dicuci dengan NaOH yang diperlihatkan pada Gambar 5.

0 2 4 6 8 10 12

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

p H ak ti vi ta s u n it

c ollodial k itin (k itin dic uc i dengan NaO H) c ollodial k itin (k itin tanpa dic uc i NaO H)

Gambar 5. Kurva pH optimum untuk enzim kitinase

Pada Gambar 5 dapat dilihat bahwa enzim kitinase dengan substrat yaitu kitin yang telah dicuci dengan NaOH menghasilkan aktivitas optimum pada pH 7,0 dengan aktivitas unit sebesar 11,166 U/mL, sedangkan pada substrat kitin tanpa dicuci dengan NaOH menghasilkan aktivitas optimum pada pH 6 dengan aktivitas unit sebesar 10,929 U/mL.

Berdasarkan uraian di atas, terjadi peningkatan pH optimum dari enzim kitinase dengan substrat yang telah dicuci dengan NaOH dibandingkan enzim kitinase dengan substrat tanpa dicuci dengan NaOH. Hal ini diperkirakan karena NaOH dapat bersifat sebagai pencuci untuk menghilangkan zat pengotor dan dapat memutus gugus asetamida. Hal ini juga disebabkan adanya pengaruh terhadap struktur ion pada enzim sehingga perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektifitas bagian aktif enzim dalam membentuk ion komplek enzim substrat.

34

Aktivitas maksimum dicapai pada suatu pH tertentu, dan penyimpangan-penyimpangan dari pH tersebut menyebabkan berkurangnya aktivitas. Hal ini disebabkan adanya pertumbuhan mikroorganisme dipengaruhi oleh berbagai keadaan fisik dan kimiawi, karena enzimlah yang mengkatalisis reaksi-reaksi yang berhubungan dengan proses kehidupan. Maka keadaan-keadaan tersebut sebenarnya mempengaruhi enzim dan juga mempengaruhi pertumbuhan.

2. Pengaruh Suhu Selama Reaksi Enzim Substrat

Setelah mengetahui pH optimumnya, maka selanjutnya dilakukan penentuan suhu selama reaksi enzim dengan substrat, yaitu dengan cara mereaksikan substrat dengan enzim, dengan variasi suhu 20, 30, 40, dan 500C. Berikut ini hasil dari penentuan pH optimum enzim kitinase dengan substrat yang telah dicuci dengan NaOH dan tanpa dicuci dengan NaOH yang diperlihatkan pada Gambar 6.

0 2 4 6 8 10 12 14

0 10 20 30 40 50 60

S uhu ( C )

a k ti v it a s u n it ( U /m L )

c ollodial kitin ( kitin dic uc i dengan NaO H) c ollodial kitin (kitin tanpa dic uc i NaO H)

35

Berdasarkan gambar di atas, menunjukkan bahwa enzim dengan substrat yang telah dicuci dengan NaOH menghasilkan aktivitas optimum pada suhu 30oC dengan aktivitas unit sebesar 12,225 U/mL, sedangkan enzim dengan substrat tanpa dicuci NaOH aktivitas optimumnya pada suhu 20oC dengan aktivitas unit sebesar 12,096 U/mL. Di atas 40oC, aktivitas menurun dan hilang sepenuhnya pada 60oC. Bila enzim itu disimpan di berbagai temperatur selama 30 menit dalam suatu buffer phospat (pH 7.0), itu signifikan tidak aktif di atas 50oC dan 65oC sepenuhnya (Gambar 6).

Kurva di atas memiliki perbedaan bentuk kurva, ini dikarenakan pada suhu rendah aktivitas enzim bertambah dengan naiknya suhu sampai aktivitas optimumnya dicapai. Kenaikkan suhu lebih lanjut berakibat dengan berkurangnya aktivitas dan pada akhirnya perusakan enzim (mengalami denaturasi). Apabila terjadi denaturasi, bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya akan menurun.

3. Pengaruh Waktu Selama Reaksi Enzim Substrat

Untuk penentuan waktu selama reaksi enzim substrat dapat dilakukan setelah mengetahui pH optimum dan suhu optimum yaitu mereaksikan enzim dengan substrat, dengan variasi waktu 20, 30, 40, dan 50 menit. Hasil penentuan waktu selama reaksi enzim substrat dapat dilihat pada Gambar 7.

36 0 50 100 150 200 250 300

0 10 20 30 40 50 60

W a ktu Inkuba si

A k ti v it a s U n it ( U /m L )

c ollodial kitin (kitin dic uc i dengan NaO H) c ollodial kitin (kitin tanpa dic uc i NaO H)

Gambar 7. Kurva waktu inkubasi optimum untuk enzim kitinase

Dari Gambar 7 tersebut, dapat dilihat bahwa enzim dengan substrat yang telah dicuci dengan NaOH memiliki aktivitas optimumnya yaitu 20 menit dengan aktivitas unit sebesar 238,672 U/mL. Sedangkan enzim dengan substrat tanpa dicuci NaOH, aktivitas optimumnya yaitu 20 menit dengan aktivitas unit sebesar 228,857 U/mL. Aktivitas enzim mengalami penurunan dengan bertambahnya waktu inkubasi, hal ini tergantung pada mikroorganisme yang digunakan.

UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT ACTINOMYCETES SELAMA PROSES SOLID STATE FERMENTATION KITIN

DENGAN METODE SOMOGYI-NELSON ( SKRIPSI

)

Oleh

WELLY ANGGRAINI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2010

Judul Penelitian : UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT ACTINOMYCETES SELAMA PROSES SOLID STATE FERMENTATION KITIN DENGAN MOTODE SOMOGYI-NELSON

Nama Mahasiswa : Welly Anggraini Nomor Pokok Mahasiswa : 0517011066

Jurusan : Kimia

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

MENYETUJUI 1. Komisi pembimbing

Dra, Aspita Laila, M.S Dr. Andi Setiawan, M.Sc

NIP. 196009091988112001 NIP 195809221988111001

2. Ketua Jurusan

Dr. Andi Setiawan, M.Sc NIP. 195809221988111001

MENGESAHKAN

1. Tim Penguji

Ketua : Dra. Aspita Laila, M.S. ………

Sekretaris : Dr. Andi Setiawan, M.Sc. ………

Penguji

Bukan Pembimbing : Prof. Dr. John Hendri, M.S. ………...

2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Sutyarso, M.Biomed. NIP 195704241987031001

“ Tidak

ada yang dapat mengubah

nasib seseorang selain orang itu

sendiri. Yakin dengan kemampuan

sendiri dan selalu belajar dan

berusaha tuk jadi yang

terbaik”

Bismillahirrohmanirrohim

Kupersembahkan karya kecil dan sederhana ini teruntuk :

Ayah dan Emak tercinta,

Sebagai penyemangat, dan donatur cintaku

Keluarga besar dan saudaraku tersayang,

Sahabat-sahabatku

Dan

Bismillahirrohmanirrohim

Kupersembahkan karya kecil dan sederhana ini teruntuk :

Ayah dan Emak tercinta,

Sebagai penyemangat, dan donatur cintaku

Keluarga besar dan saudaraku tersayang,

Sahabat-sahabatku

Dan

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 02 Desember 1986 sebagai anak keempat dari empat bersaudara pasangan Rizal dan Yarlis.

Penulis menyelesaikan Pendidikan Taman Kanak - kanak pada tahun 1992 di TK AL-Munawwarah, tahun 1999 menyelesaikan Sekolah Dasar di SD Negeri I Kaliawi, tahun 2002 menyelesaikan Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama di SLTP Negeri 17 Bandar Lampung, menyelesaikan Sekolah Menegah Umum di SMU YP Unila Bandar Lampung, pada tahun 2005 dan pada tahun 2005 penulis diterima sebagai mahasiswa Universitas Lampung melalui jalur SPMB.

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten pembimbing praktikum pada mata kuliah Biokimia untuk Fakultas Pertanian Unila, mata kuliah Biokimia untuk Jurusan Biologi FMIPA Unila dan mata kuliah Mikrobiologi untuk Jurusan D3 Analisis Kimia FMIPA. Penulis juga menerima beasiswa BBM pada tahun 2008.

SANWACANA

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala kemudahan dan kekuatan yang luar biasa yang telah diberikanNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul :

UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT ACTINOMYCETES SELAMA PROSES SOLID STATE FERMENTATION KITIN DENGAN

METODE SOMOGYI-NELSON

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tulus kepada :

1. Bapak Prof. Dr. John Hendri M.Si, selaku pembahas atas serta memberikan arahan bagi penulis dalam proses penyelesaian skripsi ini.

2. Bapak Andi Setiawan Ph.D selaku Ketua Jurusan kimia sekaligus pembimbing II atas saran dan sumbangan ide yang sangat berharga bagi penulis untuk kesempurnaan skripsi ini.

3. Ibu Dra. Aspita Laila M.Si, selaku pembimbing I atas bimbingan, saran, dan dorongan semangatnya bagi penulis selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

4. Ibu Mita Rilyanti M.Si, selaku pembimbing akademik atas saran dan dorongan semangat bagi penulis selama ini.

5. Bapak dan Ibu staf pengajar dan segenap karyawan di lingkungan FMIPA Universitas Lampung.

6. Ayah dan emak yang mengajarkan arti hidup dengan segenap kasih sayang dan perhatiannya, dan yang selalu menyisipkan namaku di setiap doanya untuk keberhasilanku.

7. Kakakku sayang ‘ Hendra Gunawan S.H, Reni Dwi Aryani S.E, dan Ricky Kurnia A.Md atas persediaan cinta dan rindunya.

8. Special Thanks to Mas Idam, Mba Diah S. Si, Mba Dian S.Si, Kak Pras S.Si Kak Ridho, Kak Randi, Peni, Eko, Deliana, Reni, dan Slamet atas segala bantuannya kepada penulis selama penulis melakukan penelitian.

9. Sahabat seperjuangan : Deliana H.S dan Endah P.R, S.Si, atas kerja sama dan keceriaan yang telah diberikan selama ini.

10. Sahabat-sahabatku : Septi Andayani S.Si, Candra Rini W. S.Si, Setiani S.Si, Desi S.Si, Witanti S.Si, Dwi Arief, Somad, Herlina, Endah PR S.Si, Baskoro (bidang Anorganik); Fera Y, Riki A, Selpi A, Apriyanti S.Si, Ruliyanti S.Si, Mardayana S.Si, dan Endah R (bidang Biokimia); Linda, Didah, Riya, Helma, Tika, Iman, Nita, Sugeng, Ana S.Si, dan Dian S.Si (bidang Analitik); Liya, Vonny, Deni, Ipung S.Si, Soni, Yeni, Fitri, Sarah, dan Yesi (bidang Fisik); Indarto S.Si, Epra, Doni, Dedi, Taufan, Kadek, Peni, Eko, dan Deliana (bidang Organik), dan ninie. atas persaudaraannya selama ini.

11. all chemist ’04, ’06, dan ’07 atas kebersamaan dan persaudaraan yang terjalin selama ini.

12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang secara tulus memberikan bantuan moril dan materil kepada penulis.

Bandar Lampung, Juli 2010 Penulis

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa : 1. Isolat ANL-12, ANL-9, ANLd-2b-3, dan ANL-4 memiliki aktivitas

kitinolitik pada media mineralsalt agar dengan kitin 1% (w/v) dengan indeks kitinolitik berturut-turut 1,9 cm, 2,0 cm, 2,3 cm, dan 5,0 cm. 2. Isolat ANL-4 memiliki pH optimum yaitu pH 7,0 dengan aktivitas unit

sebesar 11,166 U/mL (kitin dicuci dengan NaOH) dan pH 6,0 dengan aktivitas unit sebesar 10,929 U/mL (kitin tanpa dicuci NaOH).

3. Isolat ANL-4 memiliki suhu optimum yaitu suhu 30oC dengan aktivitas unit sebesar 12,225 U/mL (kitin dicuci dengan NaOH) dan suhu 20oC dengan aktivitas unit sebesar 12,096 U/mL (kitin tanpa dicuci NaOH). 4. Isolat ANL-4 memiliki waktu inkubasi optimum yaitu 20 menit dengan

aktivitas unit sebesar 238,672 U/mL (kitin dicuci dengan NaOH) dan 228,857 U/mL (kitin tanpa dicuci NaOH).

38

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh pada penelitian ini, untuk penelitian selanjutnya disarankan :

1. Untuk mempelajari karakter spesifik dari isolat actinomycetes ANL-4 yang mempunyai aktivitas kitinolitik paling besar.

2. Menentukan konsentrasi optimum dan pengaruh ion logam agar aktivitas dari enzim yang dihasilkan juga besar.

3. Menggunakan variasi isolat actinomycetes untuk lebih meningkatkan produksi enzim kitinase.

4. Untuk mempelajari karakteristik enzim kitinase terhadap substrat dengan menggunakan teknik analisis HPLC dan FTIR

Bismillahirrohmanirrohim

Kupersembahkan karya kecil dan sederhana ini teruntuk :

Ayah dan Emak tercinta,

Sebagai penyemangat, dan donatur cintaku

Keluarga besar dan saudaraku tersayang,

Sahabat-sahabatku

Dan

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 02 Desember 1986 sebagai anak keempat dari empat bersaudara pasangan Rizal dan Yarlis.

Penulis menyelesaikan Pendidikan Taman Kanak - kanak pada tahun 1992 di TK AL-Munawwarah, tahun 1999 menyelesaikan Sekolah Dasar di SD Negeri I Kaliawi, tahun 2002 menyelesaikan Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama di SLTP Negeri 17 Bandar Lampung, menyelesaikan Sekolah Menegah Umum di SMU YP Unila Bandar Lampung, pada tahun 2005 dan pada tahun 2005 penulis diterima sebagai mahasiswa Universitas Lampung melalui jalur SPMB.

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten pembimbing praktikum pada mata kuliah Biokimia untuk Fakultas Pertanian Unila, mata kuliah Biokimia untuk Jurusan Biologi FMIPA Unila dan mata kuliah Mikrobiologi untuk Jurusan D3 Analisis Kimia FMIPA. Penulis juga menerima beasiswa BBM pada tahun 2008.

SANWACANA

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala kemudahan dan kekuatan yang luar biasa yang telah diberikanNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul :

UJI AKTIVITAS ENZIM KITINASE DARI ISOLAT ACTINOMYCETES SELAMA PROSES SOLID STATE FERMENTATION KITIN DENGAN

METODE SOMOGYI-NELSON

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tulus kepada :

1. Bapak Prof. Dr. John Hendri M.Si, selaku pembahas atas serta memberikan arahan bagi penulis dalam proses penyelesaian skripsi ini.

2. Bapak Andi Setiawan Ph.D selaku Ketua Jurusan kimia sekaligus pembimbing II atas saran dan sumbangan ide yang sangat berharga bagi penulis untuk kesempurnaan skripsi ini.

3. Ibu Dra. Aspita Laila M.Si, selaku pembimbing I atas bimbingan, saran, dan dorongan semangatnya bagi penulis selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

4. Ibu Mita Rilyanti M.Si, selaku pembimbing akademik atas saran dan dorongan semangat bagi penulis selama ini.

5. Bapak dan Ibu staf pengajar dan segenap karyawan di lingkungan FMIPA Universitas Lampung.

6. Ayah dan emak yang mengajarkan arti hidup dengan segenap kasih sayang dan perhatiannya, dan yang selalu menyisipkan namaku di setiap doanya untuk keberhasilanku.

7. Kakakku sayang ‘ Hendra Gunawan S.H, Reni Dwi Aryani S.E, dan Ricky Kurnia A.Md atas persediaan cinta dan rindunya.

8. Special Thanks to Mas Idam, Mba Diah S. Si, Mba Dian S.Si, Kak Pras S.Si Kak Ridho, Kak Randi, Peni, Eko, Deliana, Reni, dan Slamet atas segala bantuannya kepada penulis selama penulis melakukan penelitian.

9. Sahabat seperjuangan : Deliana H.S dan Endah P.R, S.Si, atas kerja sama dan keceriaan yang telah diberikan selama ini.

10. Sahabat-sahabatku : Septi Andayani S.Si, Candra Rini W. S.Si, Setiani S.Si, Desi S.Si, Witanti S.Si, Dwi Arief, Somad, Herlina, Endah PR S.Si, Baskoro (bidang Anorganik); Fera Y, Riki A, Selpi A, Apriyanti S.Si, Ruliyanti S.Si, Mardayana S.Si, dan Endah R (bidang Biokimia); Linda, Didah, Riya, Helma, Tika, Iman, Nita, Sugeng, Ana S.Si, dan Dian S.Si (bidang Analitik); Liya, Vonny, Deni, Ipung S.Si, Soni, Yeni, Fitri, Sarah, dan Yesi (bidang Fisik); Indarto S.Si, Epra, Doni, Dedi, Taufan, Kadek, Peni, Eko, dan Deliana (bidang Organik), dan ninie. atas persaudaraannya selama ini.

11. all chemist ’04, ’06, dan ’07 atas kebersamaan dan persaudaraan yang terjalin selama ini.

12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang secara tulus memberikan bantuan moril dan materil kepada penulis.

Bandar Lampung, Juli 2010 Penulis

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa : 1. Isolat ANL-12, ANL-9, ANLd-2b-3, dan ANL-4 memiliki aktivitas

kitinolitik pada media mineralsalt agar dengan kitin 1% (w/v) dengan indeks kitinolitik berturut-turut 1,9 cm, 2,0 cm, 2,3 cm, dan 5,0 cm. 2. Isolat ANL-4 memiliki pH optimum yaitu pH 7,0 dengan aktivitas unit

sebesar 11,166 U/mL (kitin dicuci dengan NaOH) dan pH 6,0 dengan aktivitas unit sebesar 10,929 U/mL (kitin tanpa dicuci NaOH).

3. Isolat ANL-4 memiliki suhu optimum yaitu suhu 30oC dengan aktivitas unit sebesar 12,225 U/mL (kitin dicuci dengan NaOH) dan suhu 20oC dengan aktivitas unit sebesar 12,096 U/mL (kitin tanpa dicuci NaOH). 4. Isolat ANL-4 memiliki waktu inkubasi optimum yaitu 20 menit dengan

aktivitas unit sebesar 238,672 U/mL (kitin dicuci dengan NaOH) dan 228,857 U/mL (kitin tanpa dicuci NaOH).

38

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh pada penelitian ini, untuk penelitian selanjutnya disarankan :

1. Untuk mempelajari karakter spesifik dari isolat actinomycetes ANL-4 yang mempunyai aktivitas kitinolitik paling besar.

2. Menentukan konsentrasi optimum dan pengaruh ion logam agar aktivitas dari enzim yang dihasilkan juga besar.

3. Menggunakan variasi isolat actinomycetes untuk lebih meningkatkan produksi enzim kitinase.

4. Untuk mempelajari karakteristik enzim kitinase terhadap substrat dengan menggunakan teknik analisis HPLC dan FTIR