Produksi B-glukan dari Saccharomyces cerevisiae dengan variasi sumber nitrogen

PRODUKSI

ββ

-GLUKAN DARI

Saccharomyces cerevisiae

DENGAN VARIASI SUMBER NITROGEN

WITA NURFAJARWATI

PROGRAM STUDI BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2006

ABSTRAK

WITA NURFAJARWATI. Produksi

ββ

-Glukan dari

Saccaromyces

cerevisiae

dengan Variasi Sumber Nitrogen. Dibimbing oleh I MADE

ARTIKA, SUKMA NUSWANTARA, dan AHMAD THONTOWI.

ββ

-glukan merupakan polisakarida yang banyak terkandung dalam

dinding sel khamir

S. cerevisiae

. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

sumber nitrogen alternatif untuk produksi

ββ

-glukan.

S. cerevisiae

diinokulasikan kedalam media fermentasi yang mengandung

sumber nitrogen yang berbeda. Sumber nitrogen yang digunakan yaitu

pepton 2%, asam glutamat 0,5%, urea 0,2%, dan diamonium hidrogen fosfat

(DAHP) 0,02%. Fermentasi dilakukan pada fermentor

air-lift

skala 2 liter

selama 84 jam dengan kondisi suhu 30

°°

C, pH 7, dan aerasi 1,5 vvm. Selama

fermentasi dilakukan analisis pertumbuhan, ekstraksi

ββ

-glukan, analisis

kadar glukosa dan kadar protein hidrolisat kultur.

Produsi

β

-glukan seiring dengan laju pertumbuhan yang diikuti dengan

penurunan kadar glukosa dan kadar protein hidrolisat kultur. Kadar

β

-glukan

paling tinggi diperoleh pada kultur dengan sumber nitrogen pepton dan terendah

pada kultur dengan sumber nitrogen asam glutamat. Hasil ekstraksi

β

-glukan pada

akhir fermentasi yaitu sebesar 933,33 mg/L dan 633,33 mg/L berturut-turut untuk

kultur dengan sumber nitrogen pepton dan asam glutamat. Kultur dengan sumber

nitrogen urea dan DAHP memberikan hasil akhir yang sama yaitu sebesar 733,33

mg/L.

Kadar

β

-glukan pada media dengan sumber nitrogen urea lebih tinggi

dibanding media dengan sumber nitrogen asam glutamat dan DAHP. Dengan

demikian, urea dapat dijadikan sumber nitrogen alternatif untuk produksi

β

-glukan. Selain mudah diperoleh, urea juga lebih murah dari asam glutamat dan

DAHP.

ABSTRACT

WITA NURFAJARWATI. Production of

β

-Glucan from

Saccharomyces

cerevisiae

with Nitrogen Sources Varia tion. Under the direction of I MADE

ARTIKA, SUKMA NUSWANTARA, and AHMAD THONTOWI.

β

-Glucan is one of the most abundant polysaccharides in yeast

Saccharomyces cerevisiae

cell wall.The aim of this research is to explore an

alternative nitrogen sources for

β

-Glucan production.

S. cerevisiae

were grown in fermentation medium with different nitrogen

sources. Peptone 2%, glutamic acid 0,5%, urea 0,2%, and diammonium hydrogen

phosphate (DAHP) 0,02% were used for nitrogen source in the medium. A 2 litre

air-lift fermenter was used in the fermentation process for 84 hours (T = 30

0

C, pH

7, and 1,5 vvm for the aeration). During the fermentation, optical density,

extraction of

β

-glucan, glucose and protein in hydrolisate cultured were

determined.

β

-glucan production level is similar with the growth rate of yeast and

followed by decreasing glucose and protein content in hydrolisate cultured. The

highest and lowest

β

-glucan content were obtained from peptone (933,33 mg/L)

and glutamic acid (633,33 mg/L) as a nitrogen source in cells cultured after

fermentation completed respectively. Yeast cells cultured with urea and DAHP as

a nitrogen source give the same content of

β

-glucan about 733,33 mg/L

β

-glucan concentration produced in medium with urea was a higher than that

produced using glutamic acid and DAHP as a nitrogen source. The result

indicated that urea can be used as an alternative nitrogen source for the production

of

β

-glucan. Urea is easily available and cheaper than glutamic acid and DAHP.

PRODUKSI

ββ

-GLUKAN DARI

Saccharomyces cerevisiae

DENGAN VARIASI SUMBER NITROGEN

WITA NURFAJARWATI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Program Studi Biokimia

PROGRAM STUDI BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2006

Judul Skripsi

: Produksi

β

-Glukan dari

Saccharomyces cerevisiae

dengan

Variasi Sumber Nitrogen.

Nama

: Wita Nurfajarwati

NIM

: G 44101032

Disetujui

Komisi Pembimbing

Diketahui

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S.

NIP 131 473 999

Tanggal Lulus :

Dr. I Made Artika, M.App.Sc.

Ketua

Ahmad Thontowi, S.Si.

Anggota

Dr. Sukma Nuswantara, M.Phil.

Anggota

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 13 Oktober 1984 dari pasangan Tarmawan Atmadiputra dan Dwi Mulyati sebagai anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis lulus dari SMUN 1 Indihiang Tasikmalaya pada tahun 2001. Pada tahun yang sama penulis diterima pada program studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Fisik tahun ajaran 2004/2005 dan asisten praktikum Kimia TPB tahun ajaran 2005/2006. Penulis juga pernah mengikuti Praktik Kerja Lapang (PKL) di Laboratorium Biopolimer, Puslit Bioteknologi LIPI selama periode Juni sampai September 2004, dan menulis laporan ilmiah berjudul Penentuan Konsentrasi Letal Trimethoprim untuk Media Seleksi Agrobacterium Penghasil Beta Glukan.

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan

rahmat dan karunia serta keluasan ilmu-Nya penulis dapat menyelesaikan

penulisan laporan penelitian yang dilaksanakan di Laboratorium Biopolimer dan

Laboratorium Fermentasi Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, dari bulan Februari

sampai September 2005. Penelitian ini berjudul Produksi â-Glukan dari

Saccharomyces cerevisiae

dengan Variasi Sumber Nitrogen.

Penulis mengucapkan terima kasih dengan segenap hati yang tulus kepada Dr. I Made Artika, M.App.Sc., Dr. Sukma Nuswantara, M.Phil., Ahmad Thontowi, S.Si dan Dra. Kusmiati, MSi yang telah memberikan bantuan, bimbingan, dan saran selama penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini.

Tak lupa penulis ucapkan terima kasih yang sangat dalam kepada Ayah, Ibu, Ago, Ayu, dan Mas Rafi serta seluruh keluarga besar atas do’a, cinta, dan dukunganny a. Terima kasih juga untuk Atick, Yenti, Goza, Dini, dan Iip atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian, serta kepada teman-teman Biokimia 38 atas semangat dan kebersamaannya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat untuk kepentingan di bidang ilmu penget ahuan.

Bogor, Februari 2006

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ...

ix

DAFTAR LAMPIRAN...

ix

PENDAHULUAN ...

1

TINJAUAN PUSTAKA

â-Glukan...

1

S. cerevisiae

...

2

Fermentasi...

2

Sumber Nitrogen...

2

Fermentor ...

3

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat...

3

Metode ...

3

HASIL DAN PEMBAHASAN

Morfologi Sel...

4

Proses Fermentasi...

5

Pertumbuhan

S.cerevisiae

...

6

Produksi â-glukan...

6

Analisis Kimia ...

7

SIMPULAN DAN SARAN...

8

DAFTAR PUSTAKA ...

8

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1

Struktur primer makromolekul â-glukan ...

2

2

Hasil pengamatan morfologi sel

S.cerevisiae

RN4 dengan perbesaran

1000x...

4

3

Proses fermentasi pada fermentor

air -lift

skala 2 L...

5

4

Hasil pengukuran parameter fermentasi S. cerevisiae RN4 pada

media dengan sumber N berbeda ... 5

5

Pola pertumbuhan

S. cerevisiae

RN4 pada media dengan sumber

N berbeda ...

6

6

Kadar â-glukan hasil ekstraksi kultur

S. cerevisiae

RN4 pada

media dengan sumber N berbeda ...

7

7

Kadar glukosa kultur selama fermentasi

S. cerevisiae

RN4 pada

media dengan sumber N berbeda ... 7

8

Kadar protein kultur selama fermentasi S. cerevisiae RN4 pada

media dengan sumber N berbeda ... 8

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Diagram alir penelitian ...

11

2 Kurva pertumbuhan

S. cerevisiae

...

11

3 Kurva standar protein ...

12

4

Kurva standar glukosa ...

13

5 Hasil analisis media dengan sumber N pepton 2% ...

14

6 Hasil analisis media dengan sumber N asam glutamat 0,5% ...

15

7 Hasil analisis media dengan sumber N urea 0,2% ...

16

8 Hasil analisis media dengan sumber N DAHP 0,02% ...

17

PENDAHULUAN

â-Glukan adalah polisakarida yang terdiri atas monomer glukosa yang dihubungkan oleh ikatan β-1,3 dan β-1,6 glukosida. Senyawa ini terbukti secara ilmiah sebagai biological defense modifier (BDM) dan termasuk kategori GRAS (Generally Recognized As Safe) menurut FDA, serta tidak memiliki toksisitas atau efek samping (Ber 1997). β-glukan memiliki berbagai aktifitas biologis sebagai antitumor , antioksidan, antikolesterol, antipenuaandini, dan peningkat sistem imun (Kulickle et al. 1996; Lee et al. 2001). Selain itu, senyawa ini dapat juga dimanfaatkan sebagai zat aditif dalam industri makanan. Berbagai manfaat inilah yang mendorong adanya pene litian dan pengembangan aplikasi β-glukan serta peningkatan produksinya.

â-Glukan dapat diproduksi oleh beberapa galur bakteri yang juga dapat diekstraksi dari sumber lain seperti khamir, tanaman gandum, dan jamur tertentu setelah proses fermentasi.

Saccharomyces cerevisiae termasuk khamir uniseluler yang tersebar luas di alam dan merupakan galur potensial penghasil â-glukan karena sebagian besar dinding selnya tersusun atas â- glukan (Lee et al. 2001). Mikroba ini bersifat nonpatogenik dan nontoksik sehingga sejak dahulu banyak digunakan dalam berbagai proses fermentasi seperti pada pembuatan roti, asam laktat, dan alkohol (Lee 1992).

Proses fermentasi memerlukan adanya kondisi yang aseptis serta media yang dapat menunjang pertumbuhan mikroba untuk menghasilkan produk. Fermentor merupakan bejana fermentasi aseptis yang dirancang untuk memberikan kondisi terbaik bagi pertumbuhan mikroba sehingga diperoleh produk yang diinginkan (Rachman 1989). Jenis fermentor juga dapat mempengaruhi produk fermentasi. Fermentor air -lift

merupakan jenis fermentor yang banyak digunakan karena bersifat sederhana, memiliki transfer panas yang baik, dan memiliki efisisensi absorpsi gas yang tinggi (Bains 1998; Lee 1992). Berdasarkan penelitian Lee (2003), penggunaan fermentor buble-column

(tanpa pengocokan mekanis seperti halnya fermentor air -lift) memberikan hasil produksi curdlan dengan laju produksi lebih rendah, tetapi produknya memiliki kualitas biopolimer dan karakteristik yang lebih baik dibanding menggunakan fermentor tangki diaduk.

Hal lain yang mempengaruhi proses fermentasi yaitu media. Komponen media

harus memenuhi kebutuhan elemen dasar untuk pembentukan produk fermentasi dan penyedia energi untuk pertumbuhan sel (Smith 1990). Sumber nitrogen disamping sumber karbon merupakan komponen terpenting dalam media fermentasi (substrat) yang dibutuhkan untuk sintesis protein. Selain itu sumber nitrogen yang digunakan akan mempengaruhi proses fermentasi yang secara tidak langsung akan berpengaruh terhadap produk fermentasi (Rachman 1989).

Formulasi media merupakan tahap yang penting dalam industri fermentasi. Sehingga, biaya pembuatan media merupakan faktor kritis bagi aspek ekonomi suatu proses fermentasi. Dalam industri fermentasi diperlukan substrat yang murah, mudah tersedia, dan efisien penggunaannya. Pepton merupakan sumber nitrogen yang sering digunakan dalam proses fermentasi termasuk pada produksi β-glukan. Namun, harganya yang relatif mahal untuk produksi skala idustri, maka diperlukan alternatif sumber nitrogen yang lebih murah dan lebih mudah tersedia.

Produksi β-glukan pada penelitian ini menggunakan sumber nitrogen yang berbeda. Sumber nitrogen yang digunakan yaitu pepton, asam glutamat, urea dan diamonium hidrogen fosfat (DAHP). Hal ini bertujuan untuk mencari sumber nitrogen alternatif untuk memproduksi β-glukan.

Hasil penelitian yang diperoleh diharapkan dapat menambah pengetahuan tentang sumber nitrogen selain pepton yang dapat digunakan untuk memproduksi β-glukan.

TINJAUAN PUSTAKA

ββ-Glukan

â-Glukan merupakan homopolimer glukosa yang diikat melalui ikatan â-(1,3) dan â-(1,6)-glukosida (Ha et al. 2002) dan banyak ditemukan dalam dinding sel beberapa bakteri, tumbuhan, dan khamir (Hunter et al.

2002). Senyawa ini juga merupakan simpanan polisakarida pada alga coklat, euglenoid, krisofita, dan beberapa jamur (Stasinopoules

et al. 1999).

â-Glukan terdiri atas polimer linear dengan konfigurasi â-D, memiliki derajat polimerisasi rata-rata 1500, panjang rata-rata 1500 residu yang dihubungkan melalui percabangan dengan â-(1,6)-glukan dan kitin (Zlatkoviæ et al 2003; Shahinian et al. 1998), serta memiliki massa molekul sebesar 240.000

Da (Lipke & ovalle 1998). â-glukan memiliki tiga bentuk konformasi yaitu untai ganda tiga, untai tunggal, dan gulungan acak (Ha et al. 2002). Struktur primer â-glukan dapat dilihat pada Gambar 1.

Menurut Cheeseman dan Brown (1995), dalam keadan alami â-glukan berbentuk butiran kristal yang kurang baik seperti pati, bersifat tidak larut dalam air, tetapi mudah dilarutkan dalam larutan alkali, dan dapat membentuk gel jika dipanaskan pada suhu diatas 54°C. Gel yang terbentuk bersifat tidak memiliki rasa, warna, dan bau serta tidak memiliki nilai kalori (Jezequel 1998).

â-glukan dapat digunakan sebagai zat aditif pada makanan (Cheeseman & Brown 1995). Di Jepang, bahan ini digunakan untuk memperbaiki tekstur berbagai makanan seperti mie, sosis, selai, jeli, dan dadih kedelai (Sutherland 1990). â-glukan diketahui memiliki aktivitas antimikroba dan antitumor dengan meningkatkan fungsi imun inang, dan mengaktifkan makrofag dan neutrofil melalui pengikatan dengan reseptor â-glukan (Lee et al. 2001). â-glukan juga dilaporkan memiliki berbagai aktifitas penstimulasi sistem imun yang dipengaruhi oleh strukturnya seperti bobot molekul, derajat percabangan, dan konformasinya (Miura et al. 2003).

Gambar 1 Struktur primer makromolekul â-glukan (Cheeseman & Brown 1995)

S. cerevisiae

Menurut Reed dan Nagodawithana (1991),

S. cerevisiae memiliki klasifikasi sebagai berikut: kingdom; Fungi, divisi; Eumicotina, kelas; Hemiascomycetes, ordo; Endomycetales, famili; Saccharomycetaceae, genus; Saccharomyces.

S. cerevisiae umumnya memiliki bentuk elipsoidal dengan diameter yang besar antara 5-10 µm dan diameter yang kecil ant ara 1-3 µ m sampai 1-7 µ m. Memiliki warna putih kekuningan yang dapat dilihat diatas permukaan tumbuh koloni. Organisme ini biasa tumbuh dalam lingkungan hangat, lembab, mengandung gula, dan aerobik. Suhu optimum pertumbuhannya adalah 30°C, suhu

maksimumnya 35-37°C dan suhu minimummya 9-11°C (Walker 1998).

S. cerevisiae memiliki dinding sel yang mengandung â-D-glukan, kitin, dan manoprotein. Dinding selnyadiketahui terdiri dari tiga lapis: lapisan dalam adalah alkali in-soluble â-glukan (30-35%), lapisan tengah adalah alkali -soluble â-glukan (20-22%), dan lapisan luar adalah glikoprotein (30%) yaitu karbohidrat yang disusun dari manan yang terfosforilasi (Lee et al. 2001).

Fermentasi

Menurut Rachman (1989), fermentasi merupakan aktivitas mikroba untuk memperoleh energi melalui pemecahan substrat atau katabolisme guna keperluan metabolisme dan pertumbuhannya. Fermentasi dapat dilakukan melalui metode kultur permukaan dengan kultur berupa media padat, semi padat, atau cair dan kultur terendam yang dilakukan dalam media cair menggunakan bioreaktor.

Fermentasi dalam media cair dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu fermentasi sistem tertutup (batch culture), fermentasi kontinyu, dan fermentasi fed batch. Fermentasi media cair lebih memungkinkan untuk mengendalikan faktor-faktor fisik dan kimia yang mempengaruhi proses fermentasi seperti suhu, pH, dan kebutuhan oksigen (Stanbury & Whitaker 1984).

Sumber Nitrogen

Mikroorganisme dapat memanfaatkan sumber nitrogen organik dan anorganik. Nitrogen anorganik dapat disuplai sebagai gas amonia, garam amonium, atau nitrat. Amonia merupakan gas berbau yang diproduksi sebagai komoditas terbesar dalam industri kimia. Kebanyakan organisme dapat menggunaan amonia, dan kadang dikonversi menjadi garam amonium atau menjadi urea.

Nitrogen organik dapat diperoleh dari asam amino, protein, atau urea. Urea biasa digunakan sebagai sumber nitrogen dan sebagai pupuk, merupakan senyawa yang tidak stabil dan mudah terdekomposisi menjadi NH3, CO2, dan H2O (Rogers 2000). Sumber nitrogen organik lain yang dapat digunakan yaitu ekstrak khamir, pepton, dan

corn steep liquor. (Bains 1998; Rachman 1989; Stanbury & Whitaker 1984; Pelczar dan Chan 1986).

Pepton (hidrolisat protein) dapat dimanfaatkan sebagai sumber nitrogen oleh berbagai mikroorganisme, tapi relatif lebih mahal. Sumber pepton diantaranya daging,

kasein, gelatin, biji kacang, dan biji bunga matahari. Komposisi pepton bervariasi tergantung pada sumbernya. Contohnya, pepton yang berasal dari gelatin kaya akan prolin dan hidroksipr olin, tetapi hampir tidak memiliki asam amino yang mengandung sulfur (Crueger & Crueger 1984).

Fermentor

Fermentor (bioreaktor) adalah sistem tertutup untuk reaksi biologis dari suatu proses bioteknologi. Fungsi utamanya yaitu menyediakan lingkungan yang dapat dikontrol untuk pertumbuhan mikroorganisme, atau campuran mikroorganisme untuk mendapatkan produk yang diinginkan. Fermentor harus memenuhi persyaratan tertentu diantaranya dapat dioperasikan selama beberapa hari dalam kondisi aseptis, memiliki sistem aerasi dan agitasi yang cukup, dan sistem pengocokan yang tidak dapat menyebabkan kerusakan organisme (Smith 1990; Stanbury & Whitaker 1984).

Fermentor diklasifikasikan berdasarkan tipe vesselnya menjadi reaktor tangki (tank), reaktor menara (column), dan reaktor melingkar (loop). Fermentor yang biasa digunakan yaitu fermentor tangki diaduk, fermentor air -lift, dan fermentor bubble column (Lee 1992).

Fermentor air-lift merupakan jenis fermentor melingkar yang terkenal dan banyak digunakan. Terdiri dari dua bagian yaitu riser dan downcomer. Fermentor air-lift bekerja berdasarkan perbedaan berat jenis antara bagian cairan kultur yang kaya udara dalam riser dan cairan kultur yang kurang udara di dalam downcomer. Media fermentasi cair bersirkulasi digerakkan melalui riser oleh udara (gas lain, kadang oksigen murni) dipompa menuju bagian dasar melalui sparger. Jadi, tidak ada pengocokan mekanis pada fermentor jenis ini. Biasanya terdapat pemisah gas pada bagian atas riser. Ada dua macam konstruksi dasar fermentor yang biasa digunakan yaitu air-lift dengan sirkulasi internal dan air -lift dengan sirkulasi eksternal (Bains 1998; Rachman 1989; Schügerl & Sittig 1987).

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan ialah S. cerevisiae

RN4 yang merupakan koleksi dari Laboratorium Biopolimer Puslit Bioteknologi LIPI, glukosa, pepton, diamonium hidrogen

fosfat (DAHP), asam glutamat, urea, ekstrak khamir, agar bakteriologi, akuades, NaOH, CH3COOH, etanol, anti foam, fenol, H2SO4,

Bovine Serum Albumin (BSA), folin C, Na2CO3, CuSO4.5H2O, dan potasium sodium tartrat.

Alat -alat yang dipergunakan yaitu peralatan gelas, autoklaf, laminar, shaker, mikroskop, neraca analitik, botol film, mikro pipet, vorteks, inkubator, oven, sentrifus, tabung sentrifus, spektrofotometer UV-VIS, Spektronik 21D, dan fermentor air -lift

BIOSTAT D B-BRAUN skala 2 L.

Metode Pembuatan Media

Media yeast peptone glucose (YPG) cair dibuat dengan komposisi glukosa 2 g, pepton 2 g, dan ekstrak khamir 1 g. Semua bahan dilarutkan dalam 100 mL akuades dan dipanaskan untuk mempercepat kelarutan, lalu disterilkan dengan autoklaf. Media YPG padat dibuat dengan komposisi yang sama dengan media cair dan ditambahkan 2 g agar bakteriologi.

Pemurnian Isolat

Biakan S. cerevisiae sebanyak satu ose digoreskan diatas permukaan agar pada cawan petri yang telah berisi 25 mL media YPG padat, kemudian diinkubasi semalam pada suhu 30°C. Koloni tunggal yang terpisah diambil sedikit dengan ose untuk uji morfologi dan sisanya dipindahkan ke dalam media agar miring lalu disimpan pada suhu 4°C sebagai stok kultur.

Pembuatan Prekultur

S. cerevisiae diinokulasikan sebanyak satu ose ke dalam 10 mL media YPG cair, lalu diinkubasi selama 24 jam dengan penggojokan pada suhu ruang. Inokulum kemudian dipindahkan sebanyak 2 mL ke dalam 100 mL media fermentasi, dan diinkubasi dengan pengojokan selama 48 jam pada suhu ruang.

Proses Fermentasi

Proses fermentasi dilakukan sebanyak empat kali dengan menggunakan sumber N yang berbeda yaitu pepton 2%, asam glutamat 0,5%, DAHP 0,02%, dan urea 0,2%. Media fermentasi cair sebanyak 1900 mL dibuat dengan komposisi glukosa 2%, ekstrak khamir 1%, dan sumber N. Semua bahan dilarutkan dalam air, dipanaskan sambil diaduk hingga homogen. Media dimasukkan kedalam vessel

(bejana fermentor ) lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah preparasi fermentor, 100 mL prekultur 48 jam diinokulasikan. Fermentasi berlangsung selama 84 jam pada fermentor

air-lift skala 2 L dengan kondisi suhu 30°C,

pH 7, dan aerasi 1,5 vvm. Selama fermentasi berlangsung, dilakukan pengambilan sampel untuk analisis optical density (OD), kadar glukosa, kadar protein, dan ekstraksi β -glukan. Pengambilan sampel dilakukan setiap 2 jam sampai masa inkubasi 24 jam, dilanjutkan setiap 4 jam sampai masa inkubasi 48 jam, kemudian setiap 12 jam sampai masa inkubasi 84 jam.

Pengukuran OD

Sampel kultur sebanyak 1 mL ditambahkan 5 mL akuades. Suspensi divorteks, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. Absorbansi diukur menggunakan Sp ektronik 21D.

Analisis Kimia

Analisis kimia yang dilakukan yaitu pengukuran kadar glukosa dan protein. Sampel kultur disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk uji kadar glukosa dan kadar protein.

Analisis kadar glukosa menurut metode fenol-sulfat (Chaplin 1986). Deret larutan baku glukosa dibuat dengan konsentrasi: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 dan 90 ìg/L. Sampel sebanyak 5 µL ditambahkan 995 µL akuades lalu ditambahkan 500 µL fenol 5%. Larutan ditambahkan 2,5 mL H2SO4 pekat, didiamkan selama 10 menit lalu divorteks. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 490 nm.

Analisis kadar protein menurut metode Lowry (Copeland 1951). Dibuat deret larutan baku standar BSA dengan konsent rasi 0, 20,

40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 dan 500 ìg/L. Sampel sebanyak 10 µL ditambahkan 490 µL akuades, ditambahkan 500 µL NaOH 1M. Larutan dipanaskan selama 20 menit, didinginkan lalu ditambahkan 2,5 mL larutan D (campuran antara 50 mL Na2CO3 5%, 1 mL CuSO4.5H2O 1%, dan 1 mL potasium sodium tartrat 2%). Larutan didiamkan selama 10 menit, lalu ditambahkan 500 µL larutan folin C (1:1). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 755 nm setelah 30 menit.

Ekstraksi ββ-glukan

Sampel kultur sebanyak 30 mL disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 20 menit pada suhu 15°C. Supernatan dibuang, pelet biomassa sel ditambahkan 5 mL NaOH 2% lalu dipanaskan selama 5 jam pada suhu 90°C. Suspensi biomassa sel disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh ditambahkan CH3COOH 2 M tetes demi tetes hingga pH larutan sekitar 6,8-7, setelah itu dipresipitasikan dengan 3 volume etanol. Endapan yang terbentuk dipisahkan melalui sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Pelet yang terpisah dikeringkan, lalu ditimbang sebagai bobot β -glukan kasar.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Morfologi Sel

Gambar 2 memperlihatkan morfologi sel

S. cerevisiae RN4 yang merupakan koleksi dari laboratorium biopolimer. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x.

Sel terl ihat seragam dengan bentuk elipsoidal berwarna merah. Hal ini menunjukkan bahwa koloni yang diambil merupakan koloni murni. Warna merah berasal dari pewarna safranin yang diserap dinding sel yang permeabilitasnya meningkat setelah perlakuan dengan etanol (Pelczar & Chan 1986).

Gambar 2 Hasil pengamatan morfologi sel S. cerevisiae RN4 dengan perbesaran 1000x.

Proses Fermentasi

S. cerevisiae RN4 dikulturkan pada media yang mengandung glukosa dan sumber nitrogen (sumber N) yang berbeda. Sumber N yang digunakan yaitu pepton 2%, asam glutamat 0,5%, urea 0,2% dan diamonium hidrogen fosfat (DAHP) 0,02%. Hal ini

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Absorbans 0 1 2 3 4 5 6 7

Kadar glukosa (µ

g/L) 230 235 240 245 250 255 260 265 270

Kadar protein dan ß-glukan (µ

g/L) 300 400 500 600 700 800 900 1000

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Absorbans

0 1 2 3

Kadar glukosa (µ

g/L) 230 240 250 260 270 280 290 300

Kadar protein dan ß-glukan (µ

g/L) 200 300 400 500 600 700 800 900

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Absorbans

0 1 2 3

Kadar glukosa (µ

g/L) 200 220 240 260 280 300

Kadar protein dan ß-glukan (µ

g/L) 200 300 400 500 600 700

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Absorbans

0 1 2 3

Kadar glukosa (µ

g/L) 220 230 240 250 260

Kadar protein dan ß-glukan (µ

g/L) 200 300 400 500 600 700 Sumber N pepton 2 %

Sumber N asam glutamat 0,5 %

Sumber N urea 0,2 %

Sumber N DAHP 0,02 %

dilakukan untuk mencari sumber N alternatif yang dapat digunakan untuk produksi â-glukan. Proses fermentasi dilakukan dengan metode kultur terendam pada fermentor air -lift skala dua liter. Metode ini terbukti lebih efisien dibanding metode lain seperti metode kultur permukaan dengan media cair (Rachman 1989).

Gambar 3 memperlihatkan suatu proses fermentasi dalam fermentor. Fermentasi sistem tertutup ini berlangsung selama 84 jam pada suhu 30°C dengan aerasi 1,5 vvm. Menurut Walker (1998), pertumbuhan khamir maksimum terjadi pada hari ketiga. Selain itu, berdasarkan penelitian pendahuluan, pertumbuhan S. cerevisiae RN4 telah memasuki fase stasioner pada waktu fermentasi memasuki jam ke-14 (Lampiran 2). Hal ini yang mendasari proses fermentasi dihentikan setelah 84 jam, karena semakin lama waktu fermentasi laju pertumbuhan spesifik mikroba semakin menurun. Penurunan ini dapat disebabkan adanya penurunan konsentrasi nutrien-nutrien penting dalam media yang secara tidak langsung dapat mempengaruhi hasil fermentasi (Rachman 1992).

Parameter yang diukur selama fermentasi yaitu pertumbuhan (OD), kadar â-glukan, kadar glukosa, dan protein hidrolisat kultur. Perubahan -perubahan parameter yang terjadi pada tiap proses fermentasi ditunjukkan pada Gambar 4.

Keempat gambar memperlihatkan pola perubahan parameter fermentasi yang hampir sama. Pada gambar terlihat pola produksi â-glukan seiring dengan pola pertumbuhan S. cerevisiae. Hal ini diikuti dengan penurunan kadar glukosa dan kadar protein dalam kultur.

Gambar 3 Proses fermentasi pada fermentor

air-lift skala 2L.

Gambar 4 Hasil pengukuran parameter fermentasi S. cerevisiae RN4 pada media dengan sumber N berbeda. ( ) OD, ( ) kadar â-glukan, ( ) kadar glukosa, ( ) kadar protein.

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Absorbansi 0 1 2 3 4 5 6 Pertumbuhan S. cerevisiae

S. cerevisiae RN4 ditumbuhkan dalam media yang mengandung sumber karbon glukosa dengan sumber nitrogen yang berbeda-beda. Meskipun demikian, S. cerevisiae memiliki pola pertumbuhan yang sama seperti yang ditunjukkan Gambar 5. Pertumbuhan S. cerevisiae diukur berdasarkan kekeruhan media menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

Media dengan sumber N pepton memberikan pertumbuhan yang tinggi, lebih tinggi dari pertumbuhan pada media dengan sumber N yang lain. Media dengan sumber N asam glutamat, urea, dan DAHP memperlihatkan pola pertumbuhan yang tidak berbeda jauh. S. cerevisiae dapat memanfaatkan sumber nitrogen tunggal dan sumber nitrogen kompleks untuk pertumbuhannya (Berry 1989). Namun, pertumbuhan S. cerevisiae pada media dengan sumber N kompleks seperti pepton jauh lebih tinggi dibandingkan pada media dengan sumber N tunggal seperti asam glutamat, urea, dan DAHP. Hal ini dapat disebabkan karena nitrogen biasanya menjadi faktor pembatas dan hanya diperlukan dalam jumlah yang sedikit untuk pertumbuhan dan aktivitas khamir (Malherbe et al. 2004). Selain itu, adanya amonium sebagai hasil dekomposisi sumber N dapat merepresi penyerapa n asam amino yang juga dibutuhkan untuk pertumbuhan (Berry 1989).

Penggunaan media kultur inokulum yang sama dengan media fermentasi dapat mempersingkat fase adaptasi (Rachman 1989), sehingga pada tahap awal fermentasi, pertumbuhan S. cerevisiae langsung memasuki fase eksponensial. Selama fase eksponensial, S. cerevisiae tumbuh pada laju pertumbuhan spesifik maksimum (Stanbury & Whitaker 1984). Setelah 22 jam waktu fermentasi, pertumbuhan mulai memasuki fase stasioner. Pada fase stasioner, populasi sel mencapai maksimum dan tidak bertambah lagi (Lee 1992), populasi masih aktif secara metabolik memproduksi metabolit sekunder (Stanbury & Whitaker 1984). Pada fermentasi diatas jam ke-48, kurva pertumbuhan cenderung meningkat. Keadaan ini dapat dijelaskan karena pada akhir fermentasi, kultur sudah banyak berkurang dan sel-sel yang mati cenderung mengendap sehingga aerasi sedikit terganggu. Hal ini dapat menyebabkan tidak homogennya kultur pada saat pengambilan sampel yang sangat mempengaruhi pengukuran turbidit asnya.

Pengukuran pertumbuhan berdasarkan kekeruhan atau turbiditas media relatif cepat dan mudah dilakukan, serta dapat memperkirakan jumlah dan massa sel tetapi tidak dapat membedakan sel yang hidup dan sel yang mati (Lim 1998). Dengan demikian, fase kematian yang ditandai dengan penurunan kurva pertumbuhan tidak terlihat.

Gambar 5 Pola pertumbuhan S. cerevisiae

RN4 pada media dengan sumber N berbeda. ( ) N peptone, ( ), N asam glutamat ( ), N urea, dan ( ) sumber N DAHP

Produksi â-glukan

β-1,3 dan β-1,6 glukan bersama -sama dengan kitin dan manoprotein merupakan komponen struktural dinding sel S. cerevisiae

yang terikat secara kovalen (Ha et al. 2002). β-1,3 -glukan disintesis melalui reaksi enzimatis yang kompleks (Raclavsky 1998). β-glukan sintetase yang berada di membran plasma (Lipke & Ovalle 1998) mengkatalisis sintesis β-glukan dari UDP-glukosa menurut reaksi berikut (Shematek et al.1980; Cabib et al. 2001):

UDP- glukosa + (β-(1,3)-glukosa)n→ UDP + (β-(1,3)-glukosa)n+ 1

β-glukan dapat diekstraksi dari dinding sel S. cerevisiae melalui ekstraksi basa. Namun, untuk mendapatkan β-glukan murni perlu dilakukan purifikasi lebih lanjut. Ekstraksi basa didasarkan pada sifat β-glukan yang mudah larut dalam basa (alkali). β-glukan diekstraksi menggunakan NaOH dengan bantuan panas, kemudian dipresipitasikan dalam etanol sehingga diperoleh β-glukan kasar (Lee et al. 2001). Bobot β-glukan kasar yang diperoleh selama fermentasi S. cerevisiae pada media dengan sumber nitrogen berbeda dapat dilihat pada Lampiran 9. Gambar 6 menunjukkan kadar β-glukan dalam kultur yang diekstraksi. Kultur yang diekstraksi sebanyak 30 mL yang di ambil pada beberapa titik waktu fermentasi.

Pengambilan sampel kultur dilakukan setiap selang waku 4 jam mulai jam ke-4 dan setiap 12 jam setelah waktu fermentasi 48 jam.

Kadar β-glukan pada kultur cenderung meningkat pada awal fermentasi dan relatif tetap pada akhir waktu fermentasi. Kadar β-glukan yang fluktuatif sepanjang proses fermentasi dapat disebabkan adanya kesalahan positif dan kesalahan negatif yang mungkin terjadi selama proses ekstraksi. Adanya debris sel yang ikut terbawa pada saat pemisahan hasil ekstraksi NaOH dapat menambah bobot β-glukan yang diperoleh. Sedangkan kesalahan negatif yang dapat men gurangi bobot β-glukan dapat terjadi karena adanya β -glukan yang ikut terbuang pada saat pemisahan presipitat.

Kadar β-glukan paling tinggi diperoleh pada kultur dengan sumber N pepton dan terendah pada kultur dengan sumber N asam glutamat. Hasil ekstraksi β-glukan pada akhir fermentasi yaitu sebesar 933,33 mg/L dan 633,33 mg/L berturut -turut untuk kultur dengan sumber N pepton dan asam glutamat. Kultur dengan sumber N urea dan DAHP memberikan hasil akhir yang sama yaitu sebesar 733,33 mg/L.

Berdasar hasil tersebut diatas, pepton merupakan sumber N yang bagus untuk produksi β-glukan. Namun, sebagai alternatif sumber N untuk produksi β-glukan, urea merupakan pilihan yang lebih baik dibandingkan DAHP. Urea lebih murah dan ketersediaannya yang melimpah sehingga mudah didapat. Selain itu, berdasarkan hasil ekstraksi sampel media dengan sumber N urea sepanjang waktu pengambilan sampel menghasilkan kadar β-glukan yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan sampel media dengan sumber N asam glutamat dan DAHP.

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Kadar ß-glukan (µ

g/L) 200 400 600 800 1000

Gambar 6 Kadar β-glukan hasil ekstraksi kultur S. cerevisiae RN4 pada media dengan sumber N berbeda. ( ) N peptone, ( ) N asam glutamat, ( ) N urea, dan ( ) N DAHP

Analisis Kimia

Kebutuhan dasar nutrisi bagi mikroorganisme adalah energi atau sumber karbon, sumber nitrogen, dan unsur anorganik (Smith 1990). Analisis kadar glukosa dan kadar protein dilakukan untuk mengetahui penyerapan nutrien selama proses fermentasi. Pengukuran kadar glukosa menggunakan metode fenol sulfat dan kadar protein dengan metode Lowry.

Gambar 7 memperlihatkan adanya penyerapan glukosa yang menyebabkan penurunan kadar glukosa dalam kultur selama fermentasi. Glukosa sebagai sumber karbon utama diserap melalui proses transfor aktif yang kemudian dimetabolisme untuk menghasilkan energi dan mensintesis bahan pembentuk sel, serta sintesis metabolit (Priest & Campbell 1996).

Sumber N dalam media fermentasi digunakan untuk sintesis protein di dalam sel. Adanya penyerapan sel terhadap sumber N ini menyebabkan kandungan protein di dalam media semakin berkurang dengan lamanya waktu fermentasi (Gambar 8).

Komposisi pepton yang kompleks menyebabkan kadar protein dalam media dengan sumber N pepton memiliki kadar protein yang lebih tinggi dibandingkan dengan kadar protein pada media lain.

Penurunan kadar glukosa dan kadar protein yang fluktuatif dapat disebabkan adanya metabolisme sel yang tidak stabil selama proses fermentasi. Metabolit primer yang dihasilkan selama fermentasi juga dapat mempengaruhi kadar nutrien dalam kultur.

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Kadar glukosa (µ

g/L) 220 240 260 280 300

Gambar 7 Kadar glukosa kultur selama fermentasi S. cerevisiae RN4 pada media dengan sumber N berbeda. ( ) N pepton, ( ) N asam glutamat, ( ) N urea, dan ( ) N DAHP

Waktu fermentasi (jam) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Kadar protein (µ

g/L) 200 300 400 500 600 700

Gambar 8 Kadar protein kultur selama fermentasi S. cerevisiae RN4 pada media dengan sumber N berbeda. ( ) N pepton, ( ) N asam glutamat, ( ) N urea, dan ( ) N DAHP

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

S. cerevisiae RN4 memiliki kurva pertumbuhan tertinggi pada media fermentasi yang mengandung sumber nitrogen pepton. â-Glukan dapat diproduksi dengan menggunakan sumber nitrogen yang lebih murah seperti urea. Kadar â-Glukan pada akhir fermentasi pada sumber N pepton sebesar 933.33 ìg/L, pada sumber N asam glutamat sebesar 633.33 ìg/L, dan pada sumber N urea dan DAHP masing-masing sebesar 733.33 ìg/L. Urea dapat dijadikan sumber N alteratif pengganti pepton.

Saran

Perlu dilakukan purifikasi dan karakterisasi â-glukan yang diperoleh untuk mendapatkan â-glukan murni sehingga dapat dilakukan pembandingan berdasarkan kualitas.

DAFTAR PUSTAKA

Bains W. 1998. Biotechnology from A to Z. Ed ke-2. New York: Oxford University Press.

Ber L. 1997. Yeast derived beta-1,3-D-Glucan: an adjuvant concept. http://www.tldp.com/issue/184/Yeast%20 Derived%20Beta.htm [27 Agustus 2004] Berry DR. 1989. Growth of Yeast. Di dalam:

Neway JO, editor. Fermentation Process

Development of Industrial Organisms. New York: Marcell D ekker.

Cabib E et al. 2001. The yeast cell wall and septum as paradigms of cell growth and morphogenesis. J Biol Chem 276: 19679-19682.

Chaplin MF. 1986. Monosaccharides . Di dalam: Chaplin MF, Kennedy JF, editor.

Carbohydrate Analysis a Practical Approach. Ed ke-2. Oxford: Oxford University Press.

Chees eman IM, Brown RMJr. 1995.

Microscopy of Curdlan Structure. http://www.botany.utexas.edu/facstaff/fac pages/mbrown/ongres/icheese.htm. [27 Agustus 2004]

Copeland RA. 1951. Methodes for Protein Analysis. New York: Chapman & Hall. Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology:

A Textbook of Industrial Microbiology. Brock TD, editor. Madison: Science Tech.

Ha CH et al. 2002. Analysis of alkali-soluble glucan produced by Saccha romyces cerevisiae wild-type and mutants. Appl Microbiol Biotechnol 58: 370-377. Hunter KWJr, Gault RA, Berner MD. 2002.

Preparation of microparticulate â-Glucan from Saccharomyces cerevisiae for use in immune potentiation. Letters in Applied Microbiology 35: 267.

Jezequel V. 1998. Curdlan: A new functional beta-Glukan. Cereal Foods World 43: 361-364.

Kulickle WM, Lettau AL, Thielking H. 1996. Correlation between immunological activity, molar mass, and molar structure of different (1,3)-â-D-Glucans.

Carbohydrate Research 297: 135 -143. Lee JM. 1992. Biochemical Engineering. New

Jersey: Prentice Hall.

Lee JN et al. 2001. Purification of soluble â-Glucan with immuno-enhancing activity from the cell wall of yeast. Bioschi. Biotechnol. Biochem 65: 837-841. Lee M, Moon CJ, Lee JH. 2003. Effect of

fermentation condition on the curdlan productio n. www.cape.canterbury.ac.nz/ webdb/ Apcche Proceedings/ APPCHE/ data/ 131rev.pdf [27 Agustus 2004].

Lim D. 1998. Microbiology. Ed ke-2. Boston: McGraw-Hill.

Lipke PN, Ovalle R. 1998. Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges. Journal of Bacteriology

80: 3735-3740.

Malherbe et al. 2004. Modelling the effects of assimilable nitrogen and temperature on fermentation kinetics in enological condition. Biotechnol and Bioeng 86: 261-272.

Miura NN et al. 2003. Structure and biological activities of â-Glucans from yeast and mycelial forms of Candida albicans. Microbiol. Immunol 47: 173-182.

Pelczar MJJr, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Volume ke-1,2. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

Priest FG, Campbell I. 1996. Brewing Microbiology. Ed ke-2. London: Chapman & Hall.

Rachman A. 1989. Pengantar Teknologi Fermentasi. Bogor: PAU IPB.

Rachman A. 1992. Teknologi Fermentasi industrial II. Bogor: PAU IPB.

Raclavsky V. 1998. Signalling towards cell wall synthesis in budding yeast. Acta Univ Palacki Olomuc Fac Med 141: 7-14 Reed G, Nagodawithana TW. 1991. Yeast

Technology. Ed ke-2. New York: Van Nostrand Reinhold.

Rogers J. 2000. Urea: a risky alternative. http://www.noble.org/Ag/soils/urea/Index .htm. [17 April 2005].

Schügerl K, Sittig W. 1987. Bioreactors. Di dalam Präve P, Faust U, Sittig W, Sukatsch DA, editor: Fundamentals of Biotechnology. New York: VCH Publisher.

Shahinian S et al. 1998. Involvement of protein N-Glycosyl chain glycosylation and processing in the biosinthesis of cell wall â-1,6 -Glucan of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 149: 843-856. Shematek EM et al. 1980. Biosynthesis of the

yeast cell wall: I preparation and

properties of β-(1→3) glukan synthetase.

J Biol Chem 25: 888-894.

Smith JE. 1990. Prinsip Bioteknologi. Sumo FU, Sumantri B, Subono A, penerjemah; Jakarta: Gramedia. Terjemahan dari:

BiotechnologyPrinciples.

Stanbury PF, Whitaker A. 1984. Principles of Fermentation Technology. Oxfor d: Pergamon Press.

Stasinopoulus SJ et al. 1999. Detection of two loci involved in (1 3)-â-glukan (curdlan) biosynthesis by Agrobacterium sp ATCC31749, and comparative sequence analysis of the putative curdlan synthase gene. Glicobiology 9: 31-41. Sutherland IW. 1990. Biotechnology of

Microbial Exopolysaccharides. Cambridge: Cambridge University Press. Walker GM. 1998. Yeast Physiology and

Biotechnology. Chichester: John Wiley & Sons.

Zlatkoviæ D, Jakovljeviæ D, Zekoviæ D, Vrviæ MM. 2003. A glucan from active dry Baker’s Yeast (Saccharomyces cerevisiae): a chemical and enzymatic investigation of the structure. J. Serb. Chem. Soc. 68: 805 -809.

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Lampiran 2 Kurva pertumbuhan

S. cerevisiae

(OD

550

)

Pemurnian

Pembuatan stok

Produksi â-glukan

skala fermentor

Pengukuran

Ekstraksi

β

-glukan

Analisis glukosa

Metode

fenol-Analisis protein

Metode Lowry

Waktu fermentasi (jam)

0

4

8

12 16 20 24 28 32 36 40

Absorbans

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Konsentrasi (ppm)

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

Absorbans

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Lampiran 3 Kurva standar protein

Konsentrasi BSA

(ppm)

Absorbans

0

0,000

20

0,028

40

0,066

60

0,087

80

0,111

100

0,141

120

0,168

140

0,199

160

0,228

180

0,258

200

0,289

250

0,332

300

0,409

350

0,470

400

0,491

450

0,536

500

0,591

y = 0.0363x – 0.0677

r

2

= 0.9781

Lampiran 4 Kurva standar glukosa

Konsentrasi

gukosa (ppm)

Absorbans

0

0,000

10

0,175

20

0,574

30

0,911

40

1,069

50

1,425

60

1,679

70

1,825

80

2,428

90

2,428

Konsentrasi (ppm)

0 20 40 60 80 100

Absorbans

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

y= 0.282x – 0.299

r

2

= 0.9879

Lampiran 5 Hasil analisis media dengan sumber N pepton 2%

OD

Analisis Glukosa

Analisis Protein

Jam

Terukur

Terkorek

si

Absorba

ns

Konsentrasi

(ppm)

Absorbans

Konsentra

si (ppm)

Kadar

Glukan

(mg/L)

0

0,302

1,510

0,076

266,596

0,420

671,763

2

0,324

1,620

0,068

260,922

0,409

656,612

4

0,455

2,275

0,062

256,667

0,404

649,725

366,670

6

0,589

2,945

0,060

255,248

0,391

631,818

8

0,619

3,095

0,056

252,411

0,391

631,818

300,000

10

0,685

3,425

0,053

250,284

0,387

626,309

12

0,787

3,935

0,050

248,156

0,379

615,289

466,670

14

0,671

3,355

0,048

246,738

0,382

619,426

16

0,713

3,565

0,049

247,447

0,376

611,157

466,670

18

0,757

3,785

0,045

244,610

0,373

607,025

20

0,771

3,855

0,047

246,028

0,370

602,893

600,000

22

0,833

4,165

0,040

241,064

0,356

583,609

24

0,813

4,065

0,037

238,936

0,356

583,609

500,000

28

0,773

3,865

0,037

238,936

0,348

572,590

700,000

32

0,823

4,115

0,037

238,936

0,340

561,570

866,670

36

0,999

4,995

0,036

238,227

0,287

488,568

933,333

40

0,837

4,185

0,034

236,809

0,297

502,342

866,670

44

0,817

4,085

0,034

236,809

0,297

502,342

800,000

48

0,877

4,385

0,032

235,390

0,284

484,435

866,670

60

0,975

4,875

0,031

234,681

0,263

455,510

866,670

72

1,043

5,215

0,030

233,972

0,264

456,887

900,000

Lampiran 6 Hasil analisis media dengan sumber N asam glutamat 0,5%

OD

Analisis Glukosa

Analisis Protein

Jam

Terukur

Terkorek

si

Absorba

ns

Konsentrasi

(ppm)

Absorbans

Konsentra

si (ppm)

Kadar

Glukan

(mg/L)

0

0,074

0,280

0,118

296,383

0,161

315,014

2

0,207

0,945

0,065

258,794

0,157

309,504

4

0,243

1,125

0,086

273,688

0,142

288,843

466,667

6

0,240

1,110

0,084

272,270

0,137

281,956

8

0,247

1,145

0,079

268,723

0,127

268,182

466,667

10

0,245

1,135

0,083

271,560

0,128

269,559

12

0,306

1,440

0,080

269,433

0,117

254,408

433,333

14

0,358

1,700

0,073

264,468

0,107

240,634

16

0,367

1,745

0,079

268,723

0,100

230,992

666,667

18

0,346

1,640

0,070

262,340

0,085

210,331

20

0,363

1,725

0,068

260,922

0,085

210,331

433,333

22

0,419

2,005

0,065

258,794

0,089

215,840

24

0,338

1,600

0,060

255,248

0,085

210,331

466,667

28

0,332

1,570

0,050

248,156

0,080

203,444

466,667

32

0,340

1,610

0,048

246,738

0,070

189,669

566,667

36

0,355

1,685

0,054

250,993

0,066

184,160

466,667

40

0,470

2,260

0,043

243,192

0,061

177,273

466,667

44

0,351

1,665

0,041

241,773

0,061

177,273

866,667

48

0,387

1,845

0,046

245,319

0,070

189,669

533,333

60

0,421

2,015

0,037

238,936

0,066

184,160

566,667

72

0,394

1,880

0,040

241,064

0,068

186,915

666,667

Lampiran 7 Hasil analisis media dengan sumber N urea 0,2%

OD

Analisis Glukosa

Analisis Protein

Jam

Terukur

Terkorek

si

Absorba

ns

Konsentrasi

(ppm)

Absorbans

Konsentra

si (ppm)

Kadar

Glukan

(mg/L)

0

0,024

0,005

0,104

286,454

0,183

345,317

2

0,104

0,405

0,090

276,525

0,185

348,072

4

0,267

1,220

0,104

286,454

0,176

335,675

466,667

6

0,369

1,730

0,105

287,163

0,168

324,656

8

0,333

1,550

0,095

280,071

0,126

266,804

466,667

10

0,308

1,425

0,071

263,050

0,112

247,521

12

0,355

1,660

0,064

258,085

0,117

254,408

533,333

14

0,375

1,760

0,070

262,340

0,116

253,030

16

0,376

1,765

0,073

264,468

0,118

255,785

533,333

18

0,406

1,915

0,061

255,957

0,106

239,256

20

0,418

1,975

0,059

254,539

0,103

235,124

633,333

22

0,410

1,935

0,070

262,340

0,094

222,727

24

0,472

2,245

0,060

255,248

0,101

232,369

566,667

28

0,425

2,010

0,055

251,702

0,101

232,369

566,667

32

0,431

2,040

0,054

250,993

0,094

222,727

666,667

36

0,407

1,920

0,047

246,028

0,097

226,860

633,333

40

0,483

2,300

0,050

248,156

0,093

221,350

666,667

44

0,534

2,555

0,035

237,518

0,093

221,350

666,667

48

0,487

2,320

0,044

243,901

0,091

218,595

700,000

60

0,584

2,805

0,020

226,879

0,085

210,331

633,333

72

0,578

2,774

0,014

222,624

0,067

185,537

666,667

Lampiran 8 Hasil analisis media dengan sumber N DAHP 0,02%

OD

Analisis Glukosa

Analisis Protein

Jam

Terukur

Terkorek

si

Absorba

ns

Konsentrasi

(ppm)

Absorbans

Konsentra

si (ppm)

Kadar

Glukan

(mg/L)

0

0,049

0,210

0,058

253,830

0,174

332,920

2

0,093

0,430

0,052

249,575

0,150

299,862

4

0,165

0,790

0,046

245,319

0,172

330,165

466,667

6

0,228

1,105

0,048

246,738

0,160

313,636

8

0,256

1,245

0,049

247,447

0,158

310,882

400,000

10

0,280

1,365

0,049

247,447

0,157

309,504

12

0,290

1,415

0,048

246,738

0,151

301,240

500,000

14

0,309

1,510

0,043

243,192

0,144

291,598

16

0,326

1,595

0,044

243,901

0,149

298,485

600,000

18

0,328

1,605

0,042

242,482

0,149

298,485

20

0,351

1,720

0,042

242,482

0,131

273,692

466,667

22

0,324

1,585

0,038

239,645

0,151

301,240

24

0,373

1,830

0,038

239,645

0,147

295,730

533,333

28

0,340

1,665

0,038

239,645

0,149

298,485

533,333

32

0,382

1,875

0,036

238,227

0,132

275,0690

633,333

36

0,331

1,620

0,037

238,936

0,122

261,295

700,000

40

0,378

1,855

0,033

236,099

0,121

259,918

600,000

44

0,346

1,695

0,036

238,227

0,098

228,237

600,000

48

0,429

2,110

0,035

237,518

0,098

228,237

600,000

60

0,407

2,000

0,032

235,390

0,095

224,105

666,667

72

0,609

3,010

0,031

234,681

0,086

211,708

633,333

Lampiran 9 Bobot â-glukan hasil ekstraksi

Bobot â-glukan hasil ekstraksi pada media dengan sumber N

(g)

Jam ke-

Pepton 2% Asam glutamat 0,5% Urea 0,2% DAHP 0,02%

4

0,011

0,014

0,014

0,014

8

0,009

0,014

0,014

0,012

12

0,014

0,013

0,016

0,015

16

0,014

0,020

0,016

0,018

20

0,018

0,013

0,019

0,014

24

0,015

0,014

0,017

0,016

28

0,021

0,014

0,017

0,016

32

0,026

0,017

0,020

0,019

36

0,028

0,014

0,019

0,021

40

0,026

0,014

0,020

0,018

44

0,024

0,026

0,020

0,018

48

0,026

0,016

0,021

0,018

60

0,026

0,017

0,019

0,020

72

0,027

0,020

0,020

0,019

Lampiran 4 Kurva standar glukosa

Konsentrasi

gukosa (ppm) Absorbans

0 0,000

10 0,175

20 0,574

30 0,911

40 1,069

50 1,425

60 1,679

70 1,825

80 2,428

90 2,428

Konsentrasi (ppm)

0 20 40 60 80 100

Absorbans

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

y= 0.282x – 0.299 r2= 0.9879

Lampiran 5 Hasil analisis media dengan sumber N pepton 2%

OD Analisis Glukosa Analisis Protein Jam

Terukur Terkorek si

Absorba ns

Konsentrasi

(ppm) Absorbans

Konsentra si (ppm)

Kadar Glukan (mg/L)

0 0,302 1,510 0,076 266,596 0,420 671,763

2 0,324 1,620 0,068 260,922 0,409 656,612

4 0,455 2,275 0,062 256,667 0,404 649,725 366,670

6 0,589 2,945 0,060 255,248 0,391 631,818

8 0,619 3,095 0,056 252,411 0,391 631,818 300,000 10 0,685 3,425 0,053 250,284 0,387 626,309

12 0,787 3,935 0,050 248,156 0,379 615,289 466,670 14 0,671 3,355 0,048 246,738 0,382 619,426

16 0,713 3,565 0,049 247,447 0,376 611,157 466,670 18 0,757 3,785 0,045 244,610 0,373 607,025

20 0,771 3,855 0,047 246,028 0,370 602,893 600,000 22 0,833 4,165 0,040 241,064 0,356 583,609

24 0,813 4,065 0,037 238,936 0,356 583,609 500,000 28 0,773 3,865 0,037 238,936 0,348 572,590 700,000 32 0,823 4,115 0,037 238,936 0,340 561,570 866,670 36 0,999 4,995 0,036 238,227 0,287 488,568 933,333 40 0,837 4,185 0,034 236,809 0,297 502,342 866,670 44 0,817 4,085 0,034 236,809 0,297 502,342 800,000 48 0,877 4,385 0,032 235,390 0,284 484,435 866,670 60 0,975 4,875 0,031 234,681 0,263 455,510 866,670 72 1,043 5,215 0,030 233,972 0,264 456,887 900,000 84 1,208 6,040 0,028 232,553 0,268 462,397 933,333

Lampiran 6 Hasil analisis media dengan sumber N asam glutamat 0,5%

OD Analisis Glukosa Analisis Protein Jam

Terukur Terkorek si

Absorba ns

Konsentrasi

(ppm) Absorbans

Konsentra si (ppm)

Kadar Glukan (mg/L)

0 0,074 0,280 0,118 296,383 0,161 315,014

2 0,207 0,945 0,065 258,794 0,157 309,504

4 0,243 1,125 0,086 273,688 0,142 288,843 466,667

6 0,240 1,110 0,084 272,270 0,137 281,956

8 0,247 1,145 0,079 268,723 0,127 268,182 466,667 10 0,245 1,135 0,083 271,560 0,128 269,559

12 0,306 1,440 0,080 269,433 0,117 254,408 433,333 14 0,358 1,700 0,073 264,468 0,107 240,634

16 0,367 1,745 0,079 268,723 0,100 230,992 666,667 18 0,346 1,640 0,070 262,340 0,085 210,331

20 0,363 1,725 0,068 260,922 0,085 210,331 433,333 22 0,419 2,005 0,065 258,794 0,089 215,840

24 0,338 1,600 0,060 255,248 0,085 210,331 466,667 28 0,332 1,570 0,050 248,156 0,080 203,444 466,667 32 0,340 1,610 0,048 246,738 0,070 189,669 566,667 36 0,355 1,685 0,054 250,993 0,066 184,160 466,667 40 0,470 2,260 0,043 243,192 0,061 177,273 466,667 44 0,351 1,665 0,041 241,773 0,061 177,273 866,667 48 0,387 1,845 0,046 245,319 0,070 189,669 533,333 60 0,421 2,015 0,037 238,936 0,066 184,160 566,667 72 0,394 1,880 0,040 241,064 0,068 186,915 666,667 84 0,414 1,980 0,032 235,390 0,047 157,989 633,333

Lampiran 7 Hasil analisis media dengan sumber N urea 0,2%

OD Analisis Glukosa Analisis Protein Jam

Terukur Terkorek si

Absorba ns

Konsentrasi

(ppm) Absorbans

Konsentra si (ppm)

Kadar Glukan (mg/L)

0 0,024 0,005 0,104 286,454 0,183 345,317

2 0,104 0,405 0,090 276,525 0,185 348,072

4 0,267 1,220 0,104 286,454 0,176 335,675 466,667

6 0,369 1,730 0,105 287,163 0,168 324,656

8 0,333 1,550 0,095 280,071 0,126 266,804 466,667 10 0,308 1,425 0,071 263,050 0,112 247,521

12 0,355 1,660 0,064 258,085 0,117 254,408 533,333 14 0,375 1,760 0,070 262,340 0,116 253,030

16 0,376 1,765 0,073 264,468 0,118 255,785 533,333 18 0,406 1,915 0,061 255,957 0,106 239,256

20 0,418 1,975 0,059 254,539 0,103 235,124 633,333 22 0,410 1,935 0,070 262,340 0,094 222,727

24 0,472 2,245 0,060 255,248 0,101 232,369 566,667 28 0,425 2,010 0,055 251,702 0,101 232,369 566,667 32 0,431 2,040 0,054 250,993 0,094 222,727 666,667 36 0,407 1,920 0,047 246,028 0,097 226,860 633,333 40 0,483 2,300 0,050 248,156 0,093 221,350 666,667 44 0,534 2,555 0,035 237,518 0,093 221,350 666,667 48 0,487 2,320 0,044 243,901 0,091 218,595 700,000 60 0,584 2,805 0,020 226,879 0,085 210,331 633,333 72 0,578 2,774 0,014 222,624 0,067 185,537 666,667 84 0,533 2,550 0,019 226,170 0,064 181,405 733,333

Lampiran 8 Hasil analisis media dengan sumber N DAHP 0,02%

OD Analisis Glukosa Analisis Protein Jam

Terukur Terkorek si

Absorba ns

Konsentrasi

(ppm) Absorbans

Konsentra si (ppm)

Kadar Glukan (mg/L)

0 0,049 0,210 0,058 253,830 0,174 332,920

2 0,093 0,430 0,052 249,575 0,150 299,862

4 0,165 0,790 0,046 245,319 0,172 330,165 466,667

6 0,228 1,105 0,048 246,738 0,160 313,636

8 0,256 1,245 0,049 247,447 0,158 310,882 400,000 10 0,280 1,365 0,049 247,447 0,157 309,504

12 0,290 1,415 0,048 246,738 0,151 301,240 500,000 14 0,309 1,510 0,043 243,192 0,144 291,598

16 0,326 1,595 0,044 243,901 0,149 298,485 600,000 18 0,328 1,605 0,042 242,482 0,149 298,485

20 0,351 1,720 0,042 242,482 0,131 273,692 466,667 22 0,324 1,585 0,038 239,645 0,151 301,240

24 0,373 1,830 0,038 239,645 0,147 295,730 533,333 28 0,340 1,665 0,038 239,645 0,149 298,485 533,333 32 0,382 1,875 0,036 238,227 0,132 275,0690 633,333 36 0,331 1,620 0,037 238,936 0,122 261,295 700,000 40 0,378 1,855 0,033 236,099 0,121 259,918 600,000 44 0,346 1,695 0,036 238,227 0,098 228,237 600,000 48 0,429 2,110 0,035 237,518 0,098 228,237 600,000 60 0,407 2,000 0,032 235,390 0,095 224,105 666,667 72 0,609 3,010 0,031 234,681 0,086 211,708 633,333 84 0,617 3,050 0,025 230,426 0,085 210,331 733,333

Lampiran 9 Bobot â-glukan hasil ekstraksi

Bobot â-glukan hasil ekstraksi pada media dengan sumber N (g)

Jam ke-

Pepton 2% Asam glutamat 0,5% Urea 0,2% DAHP 0,02%

4 0,011 0,014 0,014 0,014

8 0,009 0,014 0,014 0,012

12 0,014 0,013 0,016 0,015

16 0,014 0,020 0,016 0,018

20 0,018 0,013 0,019 0,014

24 0,015 0,014 0,017 0,016

28 0,021 0,014 0,017 0,016

32 0,026 0,017 0,020 0,019

36 0,028 0,014 0,019 0,021

40 0,026 0,014 0,020 0,018

44 0,024 0,026 0,020 0,018

48 0,026 0,016 0,021 0,018

60 0,026 0,017 0,019 0,020

72 0,027 0,020 0,020 0,019