KARAKTERISASI DAN UJI DAYA ANTIBAKTERI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT DARI USUS ITIK (Anas domestica) TERHADAP Escherichia coli DAN Salmonella pullorum

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Itik merupakan salah satu unggas penting yang diternakkan di Indonesia. Ternak ini memiliki nilai ekonomis yang cukup tinggi dengan produk yang dihasilkannya. Produk yang dihasilkan oleh itik yang bernilai ekonomis antara lain: telur, daging, dan bulu. Saat ini di Indonesia produksi ternak itik semakin berkembang dan mengalami berbagai perubahan pada teknik pemeliharaannya (Abun, 2008).

Itik adalah ternak yang sering berinteraksi dengan air dan tempat yang basah. Selain itu dalam hal makanan, itik bersifat omnivorus (pemakan segala), mulai dari jenis biji-bijian, rumput-rumputan, umbi-umbian, hingga makanan yang berasal dari hewan atau binatang-binatang kecil (Suharno dan Amri, 2000). Hal ini sangat

memungkinkan bahwa itik merupakan ternak yang rentan terhadap penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme, seperti bakteri, jamur, dan virus.

Peternakan itik masa kini banyak yang menggunakan antibakteri sintetik sebagai suplemen tambahan pada pakan ternak untuk menjaga kesehatan ternak. Akan tetapi, penggunaan senyawa antibakteri pada ternak itik ini dapat menyebabkan defisiensi komposisi mikroflora dalam saluran pencernaan itik. Hal ini dapat mengakibatkan kekebalan alami hewan ternak berkurang. Penggunaan antibakteri sintetik yang terlalu sering juga dapat menimbulkan resistensi terhadap bakteri patogen. Hewan ternak yang sehat memiliki kekebalan alami untuk melawan infeksi bakteri patogen, dengan adanya interaksi mikroflora di dalam saluran pencernaan hewan, terutama usus.

Pada penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Sutrisna (2010), diperoleh 20 isolat bakteri usus itik dan diketahui bahwa dari dua puluh isolat, terdapat 13 isolat yang memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri Salmonella pullorum. Sebanyak 13 isolat tersebut secara umum memiliki karakter bersifat gram positif, katalase negatif, dan motil.

Hasil penelitian Ariani (2006), diketahui bahwa tidak semua isolat flora normal saluran pencernaan ayam kampung mampu menghasilkan antibakteri, hanya beberapa isolat bakteri saja yang mampu menghasilkan antibakteri, yaitu isolat bakteri

Lactobacillus sp yang dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli dengan diameter hambat 0,18 cm. Hal ini menunjukkan bahwa flora normal usus unggas berpotensi sebagai penghasil antibakteri alami dan dapat mengatasi permasalahan penggunaan antibakteri sintetik pada peternakan.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakter isolat bakteri asam laktat dari usus itik dan mendapatkan bakteri asam laktat dari jenis Lactobacillus yang mampu menghasilkan antibakteri yang menghambat pertumbuhan Escherechia coli dan Salmonella pullorum.

C. Manfaat Penelitian

Melalui penelitian ini diharapkan isolat bakteri yang diperoleh dapat menjadi kandidat probiotik untuk mengatasi permasalahan penggunaan antibakteri sintetik.

D. Kerangka Pemikiran

Pada unggas, saluran pencernaan merupakan habitat mikroflora yang segera terbentuk setelah hewan tersebut di tetaskan. Mikroflora indigenous dewasa akan menjadi karier atau pembawa koloni bakteri patogen, seperti Salmonella dan Escherechia coli (Abun, 2008). Mikroflora normal usus unggas memiliki sifat antara lain dapat tumbuh dalam kondisi anaerobik, terdapat pada saluran pencernaan dewasa normal, mampu melekatkan diri pada permukaan epitel usus (Nakazawa, 1992).

Mikroflora yang tinggal pada organ tertentu dalam tubuh ternak memegang peranan dalam mempertahankan kesehatan dan fungsi normal tubuh. Mikroflora penetap dalam saluran pencernaan mensintesis vitamin K dan membantu mengabsorbsi zat-zat makanan. Pada selaput mukosa dan kulit, mikroflora penetap dapat mencegah

kolonisasi oleh bakteri patogen dan kemungkinan timbulnya penyakit melalui interferensi bakteri. Mekanisme interferensi bakteri ini dapat berupa persaingan memperoleh reseptor atau tempat melekat pada sel-sel inang, persaingan memperoleh makanan, saling menghambat dengan zat-zat antibiotik atau bakteriosin, atau

mekanisme lainnya (Jawetz dkk., 1996).

Salah satu bakteri yang terdapat dalam usus itik adalah bakteri asam laktat. Bakteri Asam Laktat (BAL) memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri lain dengan memproduksi protein yang disebut bakteriosin. Selain bakteriosin, senyawa antimikroba (penghambat bakteri lain) yang dapat diproduksi oleh BAL adalah hidrogen peroksida, asam lemah, dan reuterin. Bakteri asam laktat menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) untuk melindungi selnya terhadap keracunan oksigen. Asam laktat dan asam lemah lain yang dihasilkan BAL dapat memberikan efek bakterisidal untuk bakteri lain karena pH lingkungan dapat turun menjadi 3-4,5. Pada

pH tersebut, BAL tetap dapat hidup, sedangkan bakteri lain termasuk bakteri pembusuk makanan yang merugikan akan mati. Reuterin adalah senyawa

antimikrobial efektif untuk melawan berbagai jenis bakteri, yang diproduksi oleh Lactobacillus reuteri (Salminen. dkk, 2004).

Mikroba tersebut secara alami telah ada dalam saluran pencernaan itik terutama usus, dan merupakan bagian dari pertahanan tubuh karena mampu menjaga tubuh dari bakteri yang berbahaya bagi kesehatan, dengan menghasilkan zat antibakteri.

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Sutrisna (2010), diketahui bahwa terdapat 13 isolat bakteri usus itik yang mampu menghambat bakteri Salmonella pullorum dan secara umum memiliki karakter bersifat gram positif, katalase negatif, dan bersifat motil. Hal ini mengindikasikan bahwa kemungkinan besar isolat bakteri yang diperoleh adalah jenis bakteri Lactobacillus, karena karakter tersebut merupakan karakter yang dimiliki oleh Lactobacillus. Secara umum Lactobacillus merupakan bakteri gram positif, berbentuk kokus atau batang, bersifat motil, katalase negatif, dan nonspora. Menggunakan laktosa sebagai sumber karbon utama dalam memproduksi energi, dapat tumbuh dengan baik dengan atau tanpa oksigen, dan bakteri ini mampu hidup pada lingkungan yang sangat asam sekalipun, seperti pada pH4-5 atau di bawahnya. Selain itu mampu melakukan fermentasi terhadap glukosa.

Lactobacillus merupakan jenis bakteri yang mampu menghasilkan zat antibakteri yang berupa asam laktat, protein (bakteriosin), atau keduanya yaitu asam laktat dan protein (bakteriosin) sekaligus.

Selain itu Lactobacillus merupakan bakteri yang dapat bertahan melewati pH

di usus seperti Escherichia coli dan Salmonella pullorum dapat berkurang karena kalah bersaing dengan Lactobacillus . Bakteri ini pun tidak berbahaya untuk saluran pencernaan dan kesehatan ternak, karena bersifat apatogen, tidak beracun dan bersifat alami (Lopez, 2000).

E. Hipotesis

Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah isolat bakteri asam laktat dari usus itik (Anas domestica) yang diperoleh adalah Lactobacillus yang memiliki kemampuan menghasilkan zat antibakteri yang dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli dan Salmonella pullorum.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Usus Itik

Semua saluran pencernaan hewan dapat disebut sebagai tabung dari mulut sampai anus, yang memiliki fungsi untuk mencerna, mengabsorbsi, dan mengeluarkan sisa makanan yang tidak tercerna. Alat pencernaan itik termasuk ke dalam kelompok ternak non ruminansia atau monogastrik (berlambung tunggal sederhana) (Abun, 2008).

Ketika menetas usus itik memiliki sifat yang steril, akan tetapi mikroba segera masuk bersama makanan. Keasaman lambung mampu mempertahankan jumlah

mikroorganisme yang minimal (103-105 per gram isi lambung). Dengan pH lambung yang asam ini ternyata bersifat melindungi terhadap infeksi beberapa bakteri patogen usus, misalnya kolera (Rasyaf, 1999).

Proses pencernaan terjadi di dalam saluran pencernaan dan absorbsi zat nutrisi pada usus halus. Sekret yang dihasilkan oleh usus halus berupa enzim-enzim yang

disekresikan untuk memecah gula dan zat makanan lainnya menjadi bentuk sederhana untuk selanjutnya dialirkan ke dalam aliran darah (Blakely dan David,1991).

Usus buntu pada unggas hampir sama dengan usus buntu pada manusia, belum diketahui secara pasti fungsinya (Sudaryani, 1995). Usus besar pada itik adalah kelanjutan saluran pencernaan dari persimpangan usus buntu ke kloaka (Blakely dan David, 1991).

Klasifikasi menurut Holt, dkk. (2000) : Kingdom : Bacteria

Divisi : Firmicutes Class : Bacilli

Ordo : Lactobacillales Family : Lactobacillaceae Genus : Lactobacillus

Gambar 1. Lactobacillus (Gupta, 2010)

Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk kokus atau batang, katalase negatif, anaerob fakultatif atau anaerob, toleran terhadap asam, hidup pada temperatur antara 350_C– ₅₀0_{C, dan bersifat sedikit motil (Prescott. dkk,} 2000). Bakteri ini hidup dalam tubuh manusia dan juga hewan ternak sebagai flora normal tubuh (Prescott. dkk, 2000).

Nama bakteri asam laktat berasal dari kemampuan bakteri tersebut dalam

memfermentasi gula menjadi asam laktat. Asam laktat yang dihasilkan kelompok bakteri ini mampumemberikan efek bakterisidal yang berkaitan dengan penurunan pH lingkungan menjadi 3 sampai 4,5. _{Sehingga pertumbuhan bakteri lain termasuk} bakteri pembusuk akan terhambat. Umumnya mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 6-8 (Buckle. dkk, 1987). Dengan terbentuknya zat antibakteri yang berupa asam maka pertumbuhan bakteri patogen seperti Salmonella dan Escherichia coli dapat dihambat (Suriawiria, 1995).

Kelompok bakteri yang termasuk bakteri asam laktat adalah Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus dan Weissella (Jay, 1992). Lactobacillus merupakan genus terbesar dalam kelompok bakteri asam laktat, terdapat 80 spesies berbeda. Bakteri ini berbentuk batang panjang serta bersifat anaerob fakultatif dan katalase negatif (Prescott. dkk, 2000).

Beberapa persyaratan agar bakteri asam laktat dapat diklasifikasikan sebagai probiotik adalah stabil terhadap asam (terutama asam lambung) dan garam empedu, mampu bertahan hidup selama berada pada usus kecil, dapat memproduksi senyawa antimikroba, mampu menempel dan mengolonisasi pada sel usus manusia, tumbuh baik dan berkembang dalam saluran pencernaan, apatogen, serta mampu membentuk lingkungan mikroflora yang normal dan seimbang. Beberapa jenis bakteri asam laktat yang sering digunakan sebagai probiotik adalah Lactobacillus dan Bifidobacteria (Crueger, 1984).

C. Antibakteri

Menurut Fardiaz (1987), antibakteri merupakan hasil dari metabolisme sekunder. Salah satu ciri dari metabolit sekunder yaitu senyawa tersebut diproduksi pada akhir fase logaritmik.

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi penghambatan bakteri oleh antibakteri menurut Lay (1994) yaitu

a. Jumlah populasi bakteri. Semakin banyak jumlah bakteri, maka semakin sulit senyawa antibakteri menghambat pertumbuhan bakteri.

b. Kepekaan bakteri terhadap antibakteri. Semakin tinggi kepekaan antibakteri, maka akan semakin tinggi pula kemampuan antibakteri dalam menghambat pertumbuhan patogen. Begitu pula sebaliknya, bila kepekaan bakteri terhadap senyawa

antibakteri rendah, maka kemampuan antibakteri menghambat pertumbuhan juga rendah.

c. Lamanya senyawa antibakteri diaplikasikan terhadap bakteri. Semakin lama senyawa antibakteri tersebut diberikan terhadap bakteri, maka semakin besar kemampuan antibakteri tersebut dalam menghambat pertumbuhan bakteri.

d. Konsentrasi senyawa antibakteri. Semakin tinggi konsentrasi senyawa antibakteri, maka semakin tinggi pula kemampuan antibakteri tersebut dalam menghambat pertumbuhan antibakteri.

e. Lingkungan. Aktivitas dari senyawa antibakteri sangat bergantung terhadap kondisi lingkungan. Senyawa antibakteri bergantung pada pH dan suhu yang ada di sekitarnya, aktivitas antibakteri tinggi pada suhu dan pH optimum, namun rendah atau tidak dapat bekerja pada kondisi suhu dan pH yang maksimum maupun minimum.

D. Escherichia coli

Klasifikasi menurut Holt, dkk. (2000) : Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Gambar 2. Escherichia coli (Yalun, 2008)

Escherihchia coli adalah bakteri Gram negatif, anaerob fakultatif, resisten terhadap penisilin dan streptomisin. Merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 µm dan diamater 0.5 µm. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7 µm 3_{. Bakteri} E. coli umumnya hidup pada suhu lingkungan 20-40 0C, optimum pada 37 0. Uji fisiologis menunjukkan bereaksi positif terhadap indol dan merah metil, serta tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya (Holt. dkk, 2000).

Penyebaran E.coli dapat terjadi dengan cara kontak langsung (bersentuhan, berjabatan tangan dan sebagainya ) kemudian diteruskan melalui mulut, akan tetapi E.coli pun dapat ditemukan tersebar di alam sekitar kita. Penyebaran secara pasif dapat terjadi melalui makanan atau minuman (Panigraphy, 1990).

Pada umumnya penyakit yang ditimbulkan E. coli adalah diare. Selain diare, E. coli juga dapat menyebabkan beberapa penyakit yang bisa juga disebabkan beberapa bakteri lain, antaralain : Infeksi saluran kemih, sepsis, dan meningitis ( Jawetz dkk., 1996 ).

Faktor virulensi E. coli dipengaruhi oleh kemampuan bertahannya terhadap fagositosis, kemampuan perlekatannya terhadap epitel sel pernafasan dan

ketahanannya terhadap daya bunuh serum. E coli yang bersifat patogen, mempunyai struktur dinding sel yang disebut “pili”, yang tidak ditemukan pada serotipe yang

tidak patogen (Tabbu, 2000), dan “pili” inilah yang berperan dalam kolonisasi (Lay dan Hastowo, 1992).

Salah satu penyakit pada unggas yang disebabkan oleh E. coli yang patogen adalah kolibasilosis. Infeksi E. coli atau koliseptikemia ini dapat

terjadi pada ayam pedaging dan petelur dari semua kelompok umur. Serta unggas lain seperti kalkun dan itik (Charlton. dkk, 2000).

Penyakit kolibasilosis ini cukup berbahaya bagi peternakan unggas, karena dapat menimbulkan gangguan pertumbuhan, penurunan produksi, serta penurunan kualitas telur. Selain itu, adanya infeksi E. coli dapat menjadi faktor pendukung timbulnya penyakit komplek pada saluran pernafasan, pencernaan atau reproduksi yang sulit ditanggulangi (Tabbu, 2000).

E. Salmonella pullorum

Klasifikasi menurut Holt, dkk. (2000): Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Salmonella

Gambar 3. Salmonella pullorum (Todar, 2008)

Salmonella pullorum adalah bakteri berbentuk batang Gram negatif, bersifat anaerob fakultatif tidak membentuk spora. Uji fisiologis Salmonella pullorum, menunjukkan H2S, merah metal, reduksi nitrat, sitrat, dulcitol, lisin dekarboksilasi dan ornitin dekarboksilasi bersifat positif. Reaksi biokimia lain seperti oksidasi, indol, urease, glukonat, laktosa dan fenilalanin deaminasi bersifat negatif (Holt. dkk, 2000).

Adapun penyakit yang ditimbulkan oleh Salmonella adalah Salmonellosis. Gejala klinis Salmonellosis pada manusia ada 3 sindrom yaitu :

1. Gastroenteritis merupakan infeksi usus dan tidak ditemukan toksin sebelumnya (Karsinah dkk., 1994). Terjadi karena menelan makanan yang tercemar

Salmonella sp. misalnya daging dan telur (Julius, 1990).

2. Demam tifoid yang disebabkan oleh Salmonella typhi (Julius, 1990). 3. Bakterimia ( septikimia ) dapat ditemukan pada demam tifoid dan infeksi

Salmonella non-typhi. Gejala yang menonjol adalah panas dan bakterimia (Karsinah dkk., 1994)

F. Karakterisasi

Karakterisasi mikroba adalah proses untuk mengetahui karakter suatu mikroba ( James, 1983 ). Karakterisasi ini meliputi karakter secara morfologi dan fisiologi dari bakteri. Karakter morfologi dapat diketahui dengan teknik tertentu pada gelas obyek sehingga karakter tersebut dapat diamati dengan mikroskop (Hadioetomo, 1993). Melalui pengecatan bakteri juga dapat diketahui bentuk dan reaksi bakteri tersebut terhadap zat warna, lalu dapat ditentukan apakah bakteri tersebut bersifat gram negatif atau gram positif, serta menghasilkan spora atau tidak menghasilkan spora (Madigan. dkk, 2006). Karakter fisiologi dapat diketahui dengan uji fisiologi. Uji ini meliputi

uji ketahanan terhadap pH, tekanan osmotik, suhu, sinar UV, resistensi terhadap antibiotik, kemampuan menghasilkan antibiotik, kemampuan fermentasi, kemampuan enzimatik, dan lain-lain (James, 1983).

Ciri lain yang dapat membantu dalam karakterisasi mikroba adalah pola pertumbuhan, kemampuan memfermentasi karbohidrat dan pengguanaan asam amino (Lay, 1994).

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan dari Bulan April sampai dengan Juli 2011,

di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Cawan petri, tabung reaksi, mikropipet, rak tabung reaksi, autoclave, jarum ose, mikrotip, microtube, tisu, laminair air flow, lemari es, gelas ukur, kompor listrik, beaker glass, Erlenmeyer, kapas, pembakar spritus, kertas kopi, aluminium foil, inkubator bakteri,anaerobic jar, Vortex mixer dan alat-alat pendukung lainnya.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Nutrient Agar (NA), MRS broth (de man rogosa sharpe) ,CMC Selulosa, glukosa broth, laktosa broth,

congored, Skim milk, 1 M NaCl, akuades, 13 isolat bakteri dari usus itik (koleksi Sutrisna, 2010) yang diremajakan, isolat bakteri uji berupa Escherichia coli dan Salmonella pullorum umur 24 jam, alkohol 70%, spiritus, lilin, cat Gram A,B,C, dan D. EMBA (Eosin Methylen Blue Agar), Mac Conkay, Larutan H2O2 3%.

Metode yang dipakai untuk penelitian ini adalah dengan melakukan karakterisasi terlebih dahulu terhadap ketiga belas isolat yang diperoleh dari usus itik yang merupakan koleksi Sutrisna ( 2010 ) yang telah diremajakan. Lalu membiakkan masing-masing isolat bakteri usus itik ke dalam media MRS broth untuk

memproduksi zat antibakteri, kemudian ekstrak antibakteri tersebut diujikan terhadap bakteri uji E. coli dan Salmonella pullorum. Pengujian daya hambat bakteri

menggunakan metode sumur oleh Carson dan Relay 1995 (Meidiana dkk., 2006), parameter yang diamati yaitu diameter zona bening yang terbentuk disekitar sumuran. Data besar zona hambat yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dengan histogram.

D. Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada penelitian ini terdiri dari : Peremajaan, karakterisasi, pembuatan starter, produksi zat antibakteri dan uji daya hambat isolat bakteri terhadap E. coli dan Salmonella pullorum.

1. Peremajaan

Untuk peremajaan, pada tabung reaksi yang berisi media MRS padat miring, di-streak satu ose setiap isolat bakteri usus itik, kemudian di inkubasi di dalam anaerobic jar selama 48 jam.

2. Karakterisasi

Karakterisasi isolat bakteri usus itik dilakukan untuk memastikan bahwa bakteri yang diperoleh adalah bakteri asam laktat dengan Genus Lactobacillus. Hal ini

dilakukan dengan cara melakukan uji katalase, pengecatan Gram, uji motilitas, uji fermentasi gula, dan pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri,serta uji

protease dan selulase.

a. Uji katalase, dilakukan dengan cara mengambil masing-masing satu ose isolat bakteri usus itik, lalu diletakkan di atas gelas preparat yang sebelumnya telah diberi dua ose akuades, kemudian diratakan, ditetesi H2O23%. Jika terbentuk gelembung gas maka hal itu menandakan bahwa bakteri bersifat katalase positif. Apabila tidak terbentuk gelembung gas, maka bakteri itu bersifat katalase

negatif. Bakteri asam laktat terutama Lactobacillus bersifat katalase negatif. b. Pengecatan Gram, dilakukan dengan cara mengambil satu ose dari

masing-masing isolat bakteri usus itik, lalu diletakkan pada gelas preparat, diratakan, lalu difiksasi sebentar diatas api bunsen ( ± 5 detik). Setelah itu isolat bakteri ditetesi larutan Gram A 3 tetes dan didiamkan selama 1 menit, lalu di bilas dengan akuades, kemudian diteteskan kembali dengan larutan Gram B 3 tetes dan didiamkan selama I menit, lalu di bilas. Setelah itu diteteskan larutan Gram C 3 tetes, diamkan selama 30 detik, lalu di bilas dengan akuades. Lalu

diteteskan dengan larutan Gram D 3 tetes, diamkan selama 2 menit, setelah itu dibilas dengan akuades dan di kering anginkan. Dikatakan Gram positif jika hasil pengecatan berwarna ungu, dan Gram negatif jika berwarna merah. Lactobacillus bersifat Gram positif atau berwarna ungu.

c. Uji motilitas, dilakukan dengan mengambil satu ose masing-masing isolat bakteri usus itik dengan ose runcing, lalu di tusukkan secara lurus atau vertikal pada media MRS padat yang telah disiapkan pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi 2 hari dalam Anaerobic Jar. Dikatakan motil jika pertumbuhan

koloni bakteri menyebar, sedangkan non-motil jika pertumbuhan koloni bakteri tidak menyebar. Lactobacillus bersifat motil.

d. Uji fermentasi gula, dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri diinokulasikan pada media uji (glukosa dan laktosa). Kemudian diinkubasi selama 48 jam di dalam Anaerobic jar. Setelah waktu inkubasi selesai, diamati perubahan warna pada media dan terbentuknya gelembung udara pada tabung durham. Perubahan warna media menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi sedangkan terbentuknya gelembung udara pada tabung durham menunjukkan bahwa bakteri menghasilkan gas pada proses metabolismenya. e. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri, dilakukan dengan

men-streakisolat bakteri usus itik pada media NA kemudian diinkubasi pada suhu 300

C, 400_{C, dan 50}0_{C. Setelah diinkubasi, dilakukan pengamatan dengan melihat} pertumbuhan koloni.

f. Uji enzim protease, dilakukan dengan cara menginokulasikan secara titik menggunakan ose pada media NA yang diperkaya protein (skimmilk).

Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada Anaerobic jar. Setelah diinkubasi 48 jam diamati adanya zona jernih di sekitar koloni. Jika terlihat zona jernih di sekitar koloni bakteri, berarti bakteri mampu menghasilkan enzim protease. g. Uji enzim selulase, dilakukan dengan cara menginokulasikan secara titik

menggunakan ose pada media yang diperkaya dengan CMC (selulosa). Kemudian diinkubasi 48 jam pada Anaerobic jar. Setelah 48 jam, ditetesi larutan congored 1%, lalu di diamkan selama 20 menit pada suhu ruang, kemudian dicuci dengan 1 M NaCl. Jika terlihat zona jernih di sekitar koloni bakteri, berarti bakteri mampu menghasilkan enzim selulase.

3. Pembuatan Starter

Bakteri yang tumbuh dari hasil peremajaan diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam 12 ml MRS Broth steril, lalu diinkubasi selama 48 jam dalam anaerobic jar.

4. Produksi Zat Antibakteri

Untuk produksi zat antibakteri, sebanyak 1,2 ml starter dimasukkan ke dalam 10,8 ml MRS Broth yang ditempatkan pada tabung reaksi, lalu diinkubasi selama 48 jam dalam anaerobic jar. Setelah 48 jam masing-masing kultur bakteri diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam microtube untuk di uji daya antibakterinya. Setelah itu kultur yang telah dimasukkan ke dalam microtube di sentrifuge selama10 menit. Supernatan yang diperoleh adalah ekstrak antibakteri yang akan di uji.

1. Uji Daya Antibakteri terhadap Escherichia.coli dan Salmonella Pullorum

Satu mililiter suspensi dari bakteri E. coli dan Salmonella pullorum yang berumur 24 jam dituangkan (pour plate) ke dalam cawan petri steril, setelah itu dimasukkan media NA, lalu digoyang membentuk angka delapan agar tercampur rata, setelah itu di tunggu hingga media padat. Media yang telah padat, dibuat sumuran dengan diameter lubang 1 cm, setiap petri berisi tiga sumuran. Pada masing-masing sumuran tersebut, kemudian dimasukkan zat antibakteri sebanyak 0,1 ml. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator bakteri pada suhu 370 _{C selama 48 jam.}

di sekitar sumur. Semakin besar diameter zona hambat yang terbentuk, maka semakin tinggi daya hambat bakteri tersebut.

6. Cara Mengukur Diameter Zona Hambat Antibakteri

Pengukuran diameter zona hambat dilakukan dengan menggunakan penggaris ukuran centimeter. Kemudian zona hambat yang terbentuk pada setiap sumuran diukur besar diameternya dengan tiga kali pengulangan dari sisi yang berbeda antar ketiganya, kemudian dari ketiga hasil pengukuran tersebut di jumlahkan lalu di rata-rata. Setelah itu hasil rata-rata pengukuran pada setiap sumuran tadi

dijumlahkan dan di rata-rata kembali. Hasil akhir rata-rata pengukuran inilah yang menjadi besar zona hambat isolat yang diuji.

E. Diagram Alir Uji Daya Hambat Antibakteri

Hasil peremajaan isolat

pada media miring 12 mL (MRS + Agar) MRS broth

Starter diinkubasi 2 hari Di dalam anaerobic jar 1,2 mL

10,8 mL

MRS broth Inkubasi

Di anaerobic jar

Hari ke-2 Hari ke-3 Hari ke-4

1 mL 1 mL 1 mL Sentrifuge Sentrifuge Sentrifuge

100 µL 100 µL 100 µL

Gambar 4. Diagram alir uji daya hambat antibakteri Bahan Uji

1

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari usus itik adalah Lactobacillus. 2. Tidak semua isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari usus itik mampu

menghasilkan zat antibakteri yang dapat menghambat E. coli dan Salmonella pullorum. Isolat yang tidak mampu menghambat adalah isolat dengan kode B7, B9, B12, dan B13 terhadap E. coli, sedangkan B5, B6, B11, B12 dan B13 terhadap Salmonella pullorum.

3. Isolat dengan kode B1 dan B2 adalah isolat yang dapat dijadikan sebagai kandidat probiotik, karena B1 memiliki kemampuan menghambat terbesar terhadap E. coli yaitu 2,4 cm dan B2 yang terbesar terhadap Salmonella pullorum.yaitu 1,2 cm.

B. Saran

Adanya penelitian lebih lanjut terhadap isolat bakteri asam laktat dari usus itik yang diperoleh, agar dapat diketahui Lactobacillus jenis apakah yang diperoleh sehingga dapat dijadikan sebagai bakteri probiotik

dilakukan dengan cara melakukan uji katalase, pengecatan Gram, uji motilitas, uji fermentasi gula, dan pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri,serta uji

protease dan selulase.

a. Uji katalase, dilakukan dengan cara mengambil masing-masing satu ose isolat bakteri usus itik, lalu diletakkan di atas gelas preparat yang sebelumnya telah diberi dua ose akuades, kemudian diratakan, ditetesi H2O23%. Jika terbentuk gelembung gas maka hal itu menandakan bahwa bakteri bersifat katalase positif. Apabila tidak terbentuk gelembung gas, maka bakteri itu bersifat katalase

negatif. Bakteri asam laktat terutama Lactobacillus bersifat katalase negatif. b. Pengecatan Gram, dilakukan dengan cara mengambil satu ose dari

masing-masing isolat bakteri usus itik, lalu diletakkan pada gelas preparat, diratakan, lalu difiksasi sebentar diatas api bunsen ( ± 5 detik). Setelah itu isolat bakteri ditetesi larutan Gram A 3 tetes dan didiamkan selama 1 menit, lalu di bilas dengan akuades, kemudian diteteskan kembali dengan larutan Gram B 3 tetes dan didiamkan selama I menit, lalu di bilas. Setelah itu diteteskan larutan Gram C 3 tetes, diamkan selama 30 detik, lalu di bilas dengan akuades. Lalu

diteteskan dengan larutan Gram D 3 tetes, diamkan selama 2 menit, setelah itu dibilas dengan akuades dan di kering anginkan. Dikatakan Gram positif jika hasil pengecatan berwarna ungu, dan Gram negatif jika berwarna merah. Lactobacillus bersifat Gram positif atau berwarna ungu.

c. Uji motilitas, dilakukan dengan mengambil satu ose masing-masing isolat bakteri usus itik dengan ose runcing, lalu di tusukkan secara lurus atau vertikal pada media MRS padat yang telah disiapkan pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi 2 hari dalam Anaerobic Jar. Dikatakan motil jika pertumbuhan

koloni bakteri menyebar, sedangkan non-motil jika pertumbuhan koloni bakteri tidak menyebar. Lactobacillus bersifat motil.

d. Uji fermentasi gula, dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri diinokulasikan pada media uji (glukosa dan laktosa). Kemudian diinkubasi selama 48 jam di dalam Anaerobic jar. Setelah waktu inkubasi selesai, diamati perubahan warna pada media dan terbentuknya gelembung udara pada tabung durham. Perubahan warna media menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi sedangkan terbentuknya gelembung udara pada tabung durham menunjukkan bahwa bakteri menghasilkan gas pada proses metabolismenya. e. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri, dilakukan dengan

men-streakisolat bakteri usus itik pada media NA kemudian diinkubasi pada suhu 300 C, 400_{C, dan 50}0_{C. Setelah diinkubasi, dilakukan pengamatan dengan melihat} pertumbuhan koloni.

f. Uji enzim protease, dilakukan dengan cara menginokulasikan secara titik menggunakan ose pada media NA yang diperkaya protein (skimmilk).

Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada Anaerobic jar. Setelah diinkubasi 48 jam diamati adanya zona jernih di sekitar koloni. Jika terlihat zona jernih di sekitar koloni bakteri, berarti bakteri mampu menghasilkan enzim protease. g. Uji enzim selulase, dilakukan dengan cara menginokulasikan secara titik

menggunakan ose pada media yang diperkaya dengan CMC (selulosa). Kemudian diinkubasi 48 jam pada Anaerobic jar. Setelah 48 jam, ditetesi larutan congored 1%, lalu di diamkan selama 20 menit pada suhu ruang, kemudian dicuci dengan 1 M NaCl. Jika terlihat zona jernih di sekitar koloni bakteri, berarti bakteri mampu menghasilkan enzim selulase.

3. Pembuatan Starter

Bakteri yang tumbuh dari hasil peremajaan diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam 12 ml MRS Broth steril, lalu diinkubasi selama 48 jam dalam anaerobic jar.

4. Produksi Zat Antibakteri

Untuk produksi zat antibakteri, sebanyak 1,2 ml starter dimasukkan ke dalam 10,8 ml MRS Broth yang ditempatkan pada tabung reaksi, lalu diinkubasi selama 48 jam dalam anaerobic jar. Setelah 48 jam masing-masing kultur bakteri diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam microtube untuk di uji daya antibakterinya. Setelah itu kultur yang telah dimasukkan ke dalam microtube di sentrifuge selama10 menit. Supernatan yang diperoleh adalah ekstrak antibakteri yang akan di uji.

1. Uji Daya Antibakteri terhadap Escherichia.coli dan Salmonella Pullorum

Satu mililiter suspensi dari bakteri E. coli dan Salmonella pullorum yang berumur 24 jam dituangkan (pour plate) ke dalam cawan petri steril, setelah itu dimasukkan media NA, lalu digoyang membentuk angka delapan agar tercampur rata, setelah itu di tunggu hingga media padat. Media yang telah padat, dibuat sumuran dengan diameter lubang 1 cm, setiap petri berisi tiga sumuran. Pada masing-masing sumuran tersebut, kemudian dimasukkan zat antibakteri sebanyak 0,1 ml. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator bakteri pada suhu 370 _{C selama 48 jam.}

di sekitar sumur. Semakin besar diameter zona hambat yang terbentuk, maka semakin tinggi daya hambat bakteri tersebut.

6. Cara Mengukur Diameter Zona Hambat Antibakteri

Pengukuran diameter zona hambat dilakukan dengan menggunakan penggaris ukuran centimeter. Kemudian zona hambat yang terbentuk pada setiap sumuran diukur besar diameternya dengan tiga kali pengulangan dari sisi yang berbeda antar ketiganya, kemudian dari ketiga hasil pengukuran tersebut di jumlahkan lalu di rata-rata. Setelah itu hasil rata-rata pengukuran pada setiap sumuran tadi

dijumlahkan dan di rata-rata kembali. Hasil akhir rata-rata pengukuran inilah yang menjadi besar zona hambat isolat yang diuji.

E. Diagram Alir Uji Daya Hambat Antibakteri

Hasil peremajaan isolat

pada media miring 12 mL (MRS + Agar) MRS broth

Starter diinkubasi 2 hari Di dalam anaerobic jar 1,2 mL

10,8 mL

MRS broth Inkubasi

Di anaerobic jar

Hari ke-2 Hari ke-3 Hari ke-4

1 mL 1 mL 1 mL Sentrifuge Sentrifuge Sentrifuge

100 µL 100 µL 100 µL

Gambar 4. Diagram alir uji daya hambat antibakteri Bahan Uji

1

V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari usus itik adalah Lactobacillus. 2. Tidak semua isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari usus itik mampu

menghasilkan zat antibakteri yang dapat menghambat E. coli dan Salmonella pullorum. Isolat yang tidak mampu menghambat adalah isolat dengan kode B7, B9, B12, dan B13 terhadap E. coli, sedangkan B5, B6, B11, B12 dan B13 terhadap Salmonella pullorum.

3. Isolat dengan kode B1 dan B2 adalah isolat yang dapat dijadikan sebagai kandidat probiotik, karena B1 memiliki kemampuan menghambat terbesar terhadap E. coli yaitu 2,4 cm dan B2 yang terbesar terhadap Salmonella pullorum.yaitu 1,2 cm.

B. Saran

Adanya penelitian lebih lanjut terhadap isolat bakteri asam laktat dari usus itik yang diperoleh, agar dapat diketahui Lactobacillus jenis apakah yang diperoleh sehingga dapat dijadikan sebagai bakteri probiotik