1. Induksi dan Proliferasi Kalus
Induksi kalus dilakukan dengan menginisiasi potongan lamina daun muda tanpa aksis pada media WP padat dengan gelrite MB Cell 3,5 gl, sukrosa
Merck 30 gl, pikloram 15 µM, BA 2 µM, floroglusinol 1 µM. Daun muda dibersihkan dengan sabun cair dan disterilisasi dengan fungisida Dithane M-45 2
gl selama 10 menit dan larutan NaOCl 1,05 selama 15 menit sebelum diinisiasi ke media. Kalus yang terbentuk diproliferasi ke media baru dengan kandungan
yang sama pada akhir minggu keempat. Kalus digunakan untuk bahan suspensi sel pada akhir minggu keempat proliferasi. Inisiasi dan proliferasi kalus dilakukan
pada ruang gelap dengan suhu 26
2. Kultur Suspensi SelHomogenisasi
C.
Kultur suspensi sel dilakukan dengan mentransfer kalus remah sekitar 1 g dari media padat ke media WP cair tanpa gelrite dengan sukrosa 30 gl,
pikloram 15 µM, BA 0,5 µM dan floroglusinol 1 µM pada Baffle flask Erlenmeyer bersekat. Kalus hasil proliferasi diambil dengan hati-hati dan diurai
menggunakan jarum sampai membentuk agregat gumpalan yang agak halus. Agregat kalus dimasukkan ke dalam media pada Baffle flask agar menghasilkan
suspensi sel yang homogen. Baffle flask berisi agregat kalus dan media induksi suspensi selanjutnya diletakkan di meja pengocok dengan kecepatan 90 rpm di
ruang kultur selama seminggu. Ruang kultur diatur suhunya 26±1
Induksi dan proliferasi kalus serta kultur suspensi selhomogenisasi menikuti prosedur Sumaryono Riyadi 2005.
C dengan intensitas cahaya 20 µmolfotondetik selama 12 jamhari.
3. Perlakuan Senyawa Kimia dan Pengukuran Volume Sel
Hasil homogenisasi disaring dengan ukuran pori 1000 μm dan 50 μm.
Perlakuan dilakukan dengan memindahkan 1 spatula sel tersebut ke dalam media WP cair dengan sukrosa 30 gl, pikloram 15 µM, BA 2 µM, floroglusinol 1 µM
dan perlakuan berupa: 1 sukrosa 30gl Kontrol, 2 sukrosa 30 gl dan ABA 1 ppm A
1
, 3 sukrosa 30 gl dan ABA 3 ppm A
3
, 4 sukrosa 20 gl, manitol 5,3 gl dan triptofan 0,2 ppm T
0,2
, 5 sukrosa 20 gl, manitol 5,3 gl dan triptofan 2 ppm T
2
, 6 sukrosa 20 gl, manitol 5,3 gl dan paklobutrazol 5 ppm P
5
, 7 sukrosa 20 gl, manitol 5,3 gl dan paklobutrazol 7 ppm P
7
. Pengukuran volume
sel dengan metode CVS cell volume after sedimentation: volume sel setelah diendapkan Blom et al. 1992 dilakukan pada tahap ini pada hari ke-0, ke-4, ke-
7, ke-14, ke-21, ke-28, ke-35, ke-42 dan ke-49. Masing-masing perlakuan dibuat 10 kultur yang dianggap sebagai ulangan, 5 ulangan dipanen pada usia 6 minggu
dan 5 ulangan dipanen pada usia 7 minggu untuk dilakukan pengukuran kadar kinolin. Kultur dengan perlakuan dikocok secara horizontal dengan kecepatan 90
rpm di ruang kultur.
4. Pengukuran Kadar Kinolin
Kategori