Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra dalam kultur in vitro
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra dalam kultur in vitro
Hairy root culture of Cinchona ledgeriana and C. succirubra by in vitro culture
Nurita TORUAN-MATHIUS 1) , REFLINI 2) , NURHAIMI-HARIS 1) , JOKO-SANTOSO 3) & A. PRIANGANI-ROSWIEM 4)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia
2) PT London Sumatera, Bahlias, Medan, Indonesia
3) Pusat Penelitian Teh dan Kina, Gambung, Bandung, Indonesia
Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor, Bogor, Indonesia
Summary
species. The fastest hairy roots growth were found in MS medium, while growth in others
Problems encountered in hairy root culture medium was poor. Hairy roots of C. ledgeriana of
C. ledgeriana and C. succirubra are low has vigor and growth better than hairy roots of percentage of transformation of explants by
C. succirubra. MS with the addition of 50 mg/L Agrobacterium rhizogenes and slow growth of
L-tryptophane and three times the concen- hairy root. The objective of this research was to
trations of vitamin is the best medium for hairy evaluate the potential of several
root growth and vigor. Hairy roots of strains for initiation hairy roots of
A. rhizogenes
C. succirubra and C. ledgeriana used in this and
C. succirubra
C. ledgeriana, and to obtain the best medium studies were confirmed that hairy roots for hairy root culture of Cinchona spesies. Axenic
contained TL and TR-DNA region of Ri plasmid shoot and leaves explants of eight-month-old of
with molecular weight 780 and 1600 bp. The C. ledgeriana and C. succirubra seedlings were
results showed that strain of A. rhizogenes, plant inoculated with
species, source of explant and composition of 15834, ATCC-8196, R-20001, 07-20001, A4, R-
A. rhizogenes strain ATCC-
medium affect the initiation, growth, development MAFFA, TISTR509, TISTR510 and LBA9457.
and vigor of hairy roots. Inoculated explants were cultured in solid MS
medium with the addition of 100 mg/L [ Key woords: Cinchona ledgeriana, Cinchona amphicylin. Subculture of the hairy root was
hairy root- culture, succirubra, performed by transferred of root pieces into fresh
Agrobacterium rhizogenes ] liquid basal medium MS, B5, White and Heller.
Hairy roots from the best of basal medium were
subcultured on the same medium with the addition of 50 and 100 mg/L L-tryptophane,
Ringkasan
three or five times concentration of MS vitamins.
The integration of T-DNA of
kultur akar rambut hairy root was confirmed with specific primer for
A. rhizogenes in
Masalah dalam
C. ledgeriana dan C. succirubra adalah TL and TR-DNA of plasmid by Polymerase Chain
rendahnya tingkat keberhasilan transformasi Reaction analysis. The results showed that only
eksplan dengan Agrobacterium rhizogenes dan A. rhizogenes strain LBA 9457 were effective for
pertumbuhannya yang lambat. Penelitian ini transformation of explants from both Cinchona
bertujuan untuk mengevaluasi potensi dari
Toruan-Mathius et al.
beberapa galur A. Rhizogenes untuk inisiasi, kina, sedangkan pada bagian lain seperti mendapatkan komposisi medium terbaik untuk
kayu, buah dan daun hanya ditemukan pertumbuhan akar rambut C. ledgeriana dan
dalam kadar yang relatif sedikit ( Musalam C. succirubra, serta konfirmasi terintegrasinya
et al ., 1980; Staba & Chung, 1981). Kurang TR dan TL-DNA Ri plasmid ke dalam jaringan
eksplan. Eksplan batang dan daun berasal dari lebih 35 macam alkaloid kuinolin telah kecambah
ditemukan pada tanaman kina, namun hanya C. succirubra berumur delapan bulan diinokulasi
aksenik
C. ledgeriana
dan
empat macam kuinolin utama yaitu kuinin, dengan A. rhizogenes galur 15834, 8196,
kuinidin, sinkonin dan sinkonidin (Urdang, R-20001, 07-20001, A4, R.MAFFA,TISTR 509,
TISTR 510 dan LBA 9457. Eksplan yang sudah Setiap jenis Cinchona mempunyai diinokulasi dikulturkan dalam medium MS padat.
kandungan alkaloid kuinolin yang berbeda. Subkultur dilakukan dengan cara mentransfer
C. ledgeriana diketahui memiliki kadar potongan ujung akar rambut ke dalam medium
kuinin yang tinggi (4 - 13 %), sedangkan cair MS, B5, White dan Heller. Akar rambut dari
C. succirubra memiliki kadar kuinin yang medium
kultur yang
terbaik
kemudian
disubkultur ke dalam medium yang sama dengan sangat rendah (0,8-1,4 %). Akan tetapi kadar penambahan 50 dan 100 mg/L L-triptofan dengan
sinkonidin C. succirubra lebih tinggi yaitu konsentrasi vitamin sebanyak tiga kali dan lima
3,2 - 5,1 % dari pada C. ledgeriana yang kali dari konsentrasi normal MS. Integrasi T-
hanya mengandung 0 - 3,4 % (Astika, DNA dalam akar rambut dikonfirmasi meng-
1975). Kuinin digunakan sebagai obat anti- gunakan Polymerase Chain Reaction dengan
malaria, sedangkan kuinidin selain diguna- primer spesifik untuk TL dan TR-DNA plasmid.
kan sebagai obat anti malaria juga dapat Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa hanya
digunakan sebagai obat untuk menormalkan A.rhizogenes galur
LB9457 yang efektif menginfeksi eksplan baik batang maupun daun
denyut jantung yang tidak teratur (cardiac dari kedua spesies kina. Induksi, pertumbuhan
arythmic ) (Verstrijden, 1975). Pada industri dan vigor akar rambut yang terbaik diperoleh dari
minuman ringan, kuinin biasanya digunakan medium MS dengan penambahan 50 mg/L L-
sebagai pemberi cita rasa (flavoring agent) triptofan dan tiga kali konsentrasi vitamin. Hasil
karena rasanya pahit (Anderson et al., 1986). konfirmasi akar rambut baik dari batang maupun
Prospek pasar kina dunia pada beberapa daun menggunakan PCR, menunjukkan bahwa
tahun terakhir ini menunjukkan kecenderu- TL dan TR-DNA dari Ri plasmid A. rhizogenes
ngan meningkat dengan pesat. Permintaan mampu menghasilkan pita-pita DNA dengan
alkaloid kuinolin di pasar dunia diperkirakan BM780 dan 1600 pb. Hasil yang diperoleh akan terus meningkat karena penggunaanya menunjukkan bahwa galur A. rhizogenes, spesies
tanaman, sumber eksplan dan komposisi medium yang semakin meluas di berbagai bidang berpengaruh terhadap inisiasi, pertumbuhan,
industri antara lain industri farmasi, industri perkembangan dan vigor akar rambut.
minuman, industri kosmetik dan industri biopestisida. Setiap tahun terjadi pening-
Pendahuluan
katan permintaan alkaloid kuinolin sebesar
20 persen. Pada tahun 2001 kebutuhan Tanaman kina telah lama dikenal
alkaloid kuinolin mencapai 175 ton dan di- sebagai penghasil metabolit sekunder, yaitu
perkirakan pada tahun 2005 mendatang akan alkaloid
meningkat menjadi 275 - 300 ton dengan ditemukan di dalam kulit batang tanaman
kuinolin. Kuinolin
banyak
nilai sekitar US $ 9.900.000 (SIL, 2000).
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
Kendala yang dihadapi adalah diperlukan formasi Agrobacterium untuk menghasilkan waktu paling sedikit tujuh tahun untuk dapat
akar rambut.
memanen kulit batang dan produksi alkaloid Agrobacterium merupakan bakteri tanah tertinggi baru dapat diperoleh setelah
gram negatif yang termasuk pada kelompok tanaman berumur 20 tahun. Usaha-usaha
Rhizobiaceae, mempunyai kemampuan yang telah dilakukan untuk memproduksi
untuk mentransfer sebagian bahan genetik- alkaloid kuinolin antara lain dengan
nya (DNA) pada sel tanaman melalui memanfaatkan teknik kultur jaringan. Salah
pelukaan DNA yang ditransfer disebut satu keuntungan teknik kultur jaringan
dengan T-DNA merupakan potongan dibandingkan dengan cara konvensional
beberapa ratus kilo basa dari plasmid yang adalah kemampuan dalam menghasilkan
dikenal dengan Ri plasmid (root inducing senyawa kimia dalam waktu yang relatif
plasmid ) (Nilson & Olsson 1997). T-DNA singkat dan kemampuan untuk memproduksi
akan terintegrasi pada kromosom tanaman senyawa yang sukar diperoleh secara alami.
dan akan mengekspresikan gen-gen untuk Hal ini didasari oleh sifat totipotensi sel
mensintesis senyawa opin, di samping itu T- tanaman (Fowler, 1983).
DNA juga mengandung onkogen yaitu gen- Staba & Chung (1981) telah berhasil
gen yang berperan untuk menyandi hormon memproduksi kuinolin pada kultur daun
pertumbuhan auksin dan sitokinin. Apabila
C. ledgeriana . Sedangkan Mulder-Krieger onkogen terekspresi maka akan terjadi per- et al . (1982) juga berhasil mendapatkan
tumbuhan cepat dari sel. Ekspresi onkogen kuinin dari kalus C. pubeseens. Kuinin dan
pada plasmid Ri mencirikan pembentukan kuinidin juga berhasil diperoleh dari kultur
akar adventif secara besar-besaran pada akar C. ledgeriana (Anderson et al., 1982).
tempat yang diinfeksi dan dikenal dengan Scragg (1986) berhasil memperoleh kuinidin
‘hairy root’ (akar rambut) (Nilson & dari kalus C. ledgeriana. Sedangkan Hay
Olsson 1997).
(1986) mendapatkan kuinin dan kuinidin Pemanfaatan kultur akar rambut untuk pada kultur akar C. ledgerian. Produksi
menghasilkan senyawa metabolit sekunder alkaloid kina melalui kultur jaringan masih
telah banyak dilakukan, antara lain lobelin menunjukkan produksi yang rendah. Hal ini
dari Lobelia inflanta L. (Yonemitsu et al., diduga karena pertumbuhan sel yang lambat
1990), katarantin dan ajmalin dari Catha- dan diperlukannya sejumlah
ranthus roseus (Vazquez-Flota et al., 1994), pertumbuhan dengan konsentrasi yang tepat.
hormon
saponin dari Solanum aculeatissum (Ikenaga Rhodes et al. (1986) menerangkan bahwa
et al ., 1995), glukotropaeolin dari. banyak persenyawaan tidak ekonomis
Tropaeolum majus (Wielanek & Urbanek, diproduksi melalui kultur suspensi dan
1999), hiosiamin dan skopolamin dari tingkat heterogenitasnya juga tinggi. Kultur
Atropa belladonna (Kamada et al., 1986 & cenderung tidak stabil dari masa ke masa.
Aoki et al., 1997) dan Datura innoxia Adanya kendala-kendala yang dihadapi
(Boitel-Conti et al., 2000). Keuntungan tersebut telah membuka suatu pengem-
menggunakan kultur akar rambut di antara- bangan teknik baru untuk menghasilkan
nya relatif seragam, memiliki kestabilan senyawa metabolit sekunder yang lebih
genetik yang tinggi, dan dapat menggunakan tinggi, yakni dengan memanfaatkan trans-
medium tanpa penambahan zat pengatur
Toruan-Mathius et al.
tumbuh, di samping itu mudah dimanipulasi
C. succirubra dan C. ledgeriana, (ii) untuk meningkatkan produktivitasnya.
optimasi medium untuk pertumbuhan akar Kultur akar rambut pada tanaman kina
rambut dari percobaan (i), dan (iii) konfir- untuk memproduksi kuinolin juga telah
masi transfer T-DNA pada akar rambut dari dilakukan oleh Hamill et al. (1989) pada
percobaan (ii).
C. ledgeriana dengan A. rhizogenes galur LBA 9402 dan R1000, dan Geerling et al.
A. rhizogenes untuk induksi (1999) pada C. officinalis dengan galur LBA
Seleksi galur
akar rambut
9402. Namun produksi kuinolinnya masih rendah dan diperoleh dalam periode waktu
Eksplan C. ledgeriana dan C. succirubra lebih dari satu tahun. Hal ini disebabkan laju
yang digunakan untuk menginduksi ter- pertumbuhan akar rambut yang sangat
bentuknya akar rambut berasal dari lambat. Namun sistem produksi ini jauh
kecambah berumur delapan minggu yang lebih menguntungkan dibandingkan dengan
dikulturkan secara in vitro dalam medium tanamannya yang baru dapat dipanen setelah
Murashige & Skoog (1962) padat tanpa zat berumur lebih dari tujuh tahun.
pengatur tumbuh. Kultur diinkubasi dalam Adanya kendala dalam kultur akar
ruang kultur pada suhu 25ºC, dengan rambut tanaman kina disebabkan belum
intensitas cahaya 16.000 luks selama ditemukan komposisi medium yang tepat
12 jam/hari.
untuk pertumbuhan akar rambut. Menurut Untuk efisiensi transformasi, eksplan Giri & Narasu (2000) medium tumbuh
berupa daun dan batang dari kecambah in memberikan pengaruh yang nyata terhadap
vitro, dilukai dengan cara ditusuk-tusuk induksi akar rambut dan produksi metabolit
dengan pisau steril dan dikokultivasi selama sekunder. Untuk memperoleh pertumbuhan
60 menit di dalam suspensi bakteri. Sebelum akar rambut yang optimal, kondisi kultur
digunakan bakteri dikulturkan selama 48 harus diatur pada tingkat optimum.
jam dalam medium YMB dan dikocok pada Penelitian ini bertujuan untuk (i)
mesin pengocok dengan kecepatan 100 rpm. menyeleksi beberapa galur A. rhizogenes
Populasi bakteri dalam medium diukur yang dapat menginokulasi C. succirubra dan
dengan spektrofotometer, yaitu sebanyak
10 sel/mL (OD 600 = 0,2). A. rhizogenes yang optimum untuk pertumbuhan akar
C. ledgeriana , (ii) mendapatkan medium
yang diuji adalah galur ATCC-15834, rambut C. succirubra dan C. ledgeriana, dan
ATCC- 8196, R20001, 07-20001, LBA9457, (iii) mendapatkan akar rambut tanaman kina
A4,R-MAFFA, TISTR509 dan TISTR510, yang telah terintegrasi T-DNA.
berasal dari koleksi laboratorium Mikro- biologi, LIPI, Cibinong.
Untuk menghilangkan bakteri yang
Bahan dan Metode
tersisa pada permukaan eksplan, eksplan dikulturkan pada medium dasar MS padat
Penelitian terdiri dari tiga tahapan dengan penambahan ampisilin 100 mg/L. percobaan, yaitu (i) menyeleksi galur
Eksplan dipindahkan beberapa kali pada
A. rhizogenes yang dapat menginduksi medium yang sama sampai bebas bakteri. pembentukan
Selanjutnya eksplan aksenik dipindah-
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
kan pada medium dasar MS padat tanpa diamati, akar rambut di keluarkan dari dalam ampisilin. Kultur diinkubasi dalam ruang
kultur kemudian dimasukkan ke dalam gelap pada suhu 25ºC. Peubah yang diamati
cawan Petri berisi kertas saring yang adalah waktu inisiasi munculnya akar
berfungsi untuk mengeringkan akar rambut. rambut, persentase terbentuknya akar rambut
Akar rambut yang sudah agak kering pada masing-masing eksplan dan respons
dipindahkan ke dalam cawan Petri tanpa yang ditimbulkan oleh masing-masing galur
kertas saring yang di bawahnya diletakkan bakteri, jenis tanaman kina dan asal eksplan
kertas milimeter blok berukuran, untuk yang digunakan.
mengukur panjang akar rambut. Jumlah percabangan akar rambut dihitung ber-
Optimasi medium untuk pertumbuhan akar dasarkan percabangan utama. rambut
Konfirmasi transformasi TR dan T-DNA Untuk pertumbuhan akar rambut di-
plasmid dengan PCR gunakan
medium dasar MS
padat
(Murashige & Skoog, 1962), B5 (Gamborg Konfirmasi terjadinya integrasi T-DNA, et al ., 1968), White (White et al., 1985) dan
yaitu daerah TL dan TR-DNA dari Heller (Heller, 1953). Akar rambut dari
A. rhizogenes terhadap sel tanaman kina masing-masing medium kemudian dipotong
dilakukan dengan teknik Polymerase Chain ujungnya sepanjang ± 2 cm dan dikultur
Reaction (PCR). Untuk kontrol positif pada medium dasar yang sama dalam bentuk
digunakan DNA plasmid A. rhizogenes cair. Percobaan diulang sebanyak lima kali,
LB9457 dan untuk kontrol negatif diguna- dan tiap ulangan terdiri dari dua potong akar
kan DNA daun dan akar tanaman kina in rambut. Untuk mendapatkan pertumbuhan
vitro . Sedangkan DNA uji adalah DNA dari akar rambutyang lebih baik, akar rambut
C. succirubra dan yang berasal dari medium dasar terbaik
akar
rambut
C. ledgeriana .
dipotong ujung akarnya sepanjang ± 2 cm Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan dan dikultur pada medium MS dengan
menggunakan modifikasi metode Sambrook
penambahan L-triptofan 50 mg/L (MS 50 L) et al. (1989). Galur A. rhizogenes LB9457 dan 100 mg/L (MS 100L) serta vitamin
dikultur pada medium YMB cair dan dengan konsentrasi tiga (MS3V) dan lima
diletakkan pada mesin pengocok dengan (MS5V) kali vitamin MS normal. Percobaan
kecepatan 100 rpm selama 48 jam. Kultur diulang sebanyak lima kali dan tiap ulangan
dituang ke dalam tabung Eppendorf 2 mL terdiri dari dua potong akar rambut.
dan disentrifugasi dengan kecepatan Kultur diletakkan pada mesin pengocok
10.000 rpm selama dua menit sehingga dengan kecepatan 100 rpm, dan diinkubasi
membentuk pelet. Pelet yang terbentuk selama tujuh minggu pada suhu 25 o C±2 o C dilarutkan dengan bufer TELT (50 mM Tris-
dan kelembaban nisbi udara 80 - 90%. Cl pH 7,5; 82 mM EDTA, 2,5 M LiCl, 0,4% Peubah yang diukur berupa panjang, jumlah
Triton X-100). Ke dalam campuran percabangan dan bobot basah akar rambut
ditambahkan 50 µL lisozim 10 mg/mL dan pada kultur akar rambut berumur tujuh
diinkubasi pada suhu 37ºC selama satu jam. minggu. Untuk pengukuran peubah yang
Setelah itu campuran dimasukkan ke
Toruan-Mathius et al.
dalam air mendidih selama 1-2 menit diikuti 72ºC selama 2,5 menit sampai 35 siklus dengan perendaman di dalam air es beberapa
reaksi.
saat. Selanjutnya ke dalam campuran Hasil PCR difraksinasi melalui gel ditambahkan 50 µ L SDS 10% dan dibolak-
elektroforesis dengan konsentrasi 0,8% balik sampai lisis dan terlihat berlendir.
agarose dan penambahan loading dye brom- Campuran disentrifugasi dengan kecepatan
phenolblue sebagai pemberat. Elektro- 10.000 rpm selama dua menit pada suhu
foresis dilakukan dengan kondisi arus ruang. Supernatan yang terbentuk di-
36 mA, 100 volt selama 60 menit. Sebagai pindahkan ke dalam tabung baru dan ke
marker digunakan DNA 1 kb lader. Hasil dalamnya ditambahkan 2-3 volume etanol
elektroforesis dilihat dengan menggunakan absolut dingin. Untuk memurnikan DNA, ke
UV luminar dan didokumentasi dengan dalam campuran ditambahkan 0,1 volume
menggunakan kamera dan film Polaroid Na asetat 3M dan disimpan pada suhu
–20 o C 665.
selama 30 menit. Selanjutnya campuran Primer TL berupa rol B1 sekuen (5’ disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
ATGGATCCCAAATTGCTATTCC CCCA selama dua menit sehingga membentuk pelet
CGA 3’) dan rolB2 sekuen (5' TTAGGCTT DNA. Pelet DNA dicuci dengan alkohol
CTTTCATTCGGGTTTAC TGCAGC 3’). 70% lalu dikeringkan dengan vakum dan
Sedangkan untuk TR1 sekuen (5’ GGA AA dilarutkan dengan akuabides steril. DNA
TTGTGGCTCGTTGTGGAC3’) dan TR2 yang diperoleh dapat digunakan untuk
sekuen (5’ AATCGTTCAGAGAGC GTCC pengujian dengan PCR.
GAAGTT 3’) (Ermayanti et al., 2000). Sedangkan peubah yang diamati adalah Isolasi DNA daun, batang dan akar rambut
pita DNA dari akar rambut yang mempunyai tanaman kina
bobot molekul yang sama dengan TR dan L-NA plasmid A. rhizogenes pada gel
Isolasi dilakukan dengan menggunakan elektroforesis hasil PCR. modifikasi metode CTAB (Orozco-Castillo
et al ., 1994). Hasil isolasi DNA plasmid
A. rhizogenes dan DNA daun, dan akar
Hasil dan Pembahasan
rambut tanaman kina dianalisis dengan PCR
berdasarkan modifikasi metode Aoki et al.
A. rhizogenes untuk induksi (1997). Pereaksi PCR berupa bufer TrisHCl
Seleksi galur
akar rambut
1 mM + dNTP 0,2 mM mix yang telah berisi MgCl 2 200 µM + primer TL dan TR
Hasil inokulasi eksplan menunjukkan
10 pmol + enzim Taq DNA Polymerase bahwa hanya galur LBA9457 yang mampu
1 unit. Volume reaksi untuk PCR adalah menginduksi pembentukan akar rambut
25 µL dengan penambahan 50 ng DNA dan
baik
pada
C. succirubra maupun
C. ledgeriana . Setelah kultur berumur tujuh gunakan Thermolyne Amplitron I dengan
H 2 O. Reaksi PCR dilakukan dengan meng-
minggu persentase eksplan yang mati dari kondisi denaturasi pada suhu 94ºC selama
hasil inokulasi dengan galur LBA9457 satu menit, annealing pada suhu 55ºC
adalah sebesar 30% (ulangan sebanyak 15 selama satu menit dan polimerasi pada suhu
kali), sedangkan pada eksplan yang di-
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
inokulasi dengan galur ATCC-15834, rambut yang terbentuk dengan meng- ATCC-8196, R20001, 07-20001, LBA9457,
gunakan A. rhizogenes galur ATCC-8196. A4, R-MAFFA, TISTR509 dan TISTR510
Sedangkan galur ATCC-5835, A4RS dan sebesar 100%. Hasil ini menunjukkan
LBA9402 dapat dengan sukses menghasil- adanya perbedaan kemampuan
galur
kan akar rambut dengan frekuensi trans-
A. rhizogenes untuk menginokulasi sel formasi yang berbeda (Menze & Mollers, tanaman kina.
Owen & Smigocki (1988) menjelaskan Hamill et al. (1989) menginokulasikan bahwa kemampuan inokulasi Agrobacterium
dua galur A. rhizogenes pada C. ledgeriana, terhadap tanaman berbeda-beda dalam
yaitu LBA9402 dan R1000 pada tanaman efektivitas transfer T-DNAnya. Hal ini ber-
kina. Dari hasil tersebut dilaporkan bahwa hubungan dengan virulensi isolat Agro-
hanya galur LBA9402 yang dapat meng- bacterium yang dipakai dan kerentanan
induksi pembentukan akar rambut dan dalam kultivar tanaman. Winans (1992) juga
waktu lebih dari enam bulan. Geerling et al. mengungkapkan bahwa keberhasilan proses
(1999) juga melaporkan bahwa LBA 9402 inokulasi dan transfer T-DNA tergantung
yang diinokulasikan pada C. officinalis dari kompatibilitas antara kultivar dan isolat
sangat sulit untuk dapat menginduksi pem- Agrobacterium yang dipakai. Kompatibilitas
bentukan akar rambut. Hal tersebut kemung- ini
kinan karena tanaman kina merupakan Agrobacterium untuk menerima isyarat dari
ditunjukkan dengan
kemampuan
tanaman tahunan dan berkayu yang secara tanaman peka yang luka dan diikuti dengan
alami pertumbuhannya juga lambat. terinduksinya faktor virulensi yang diperlu- kan dalam proses inokulasi.
Respons Cinchona sp. setelah diinokulasikan Berdasarkan kompatibilitas gen ter-
A. rhizogenes sebut, tidak terbentuknya akar rambut kemungkinan karena tidak kompatibelnya
dengan
Respons awal Cinchona setelah diino- gen T-DNA A. rhizogenes terhadap kromo-
kulasikan dengan A. rhizogenes LBA 9457 som tanaman kina sehingga T-DNA tidak
selama tiga minggu memperlihatkan adanya terintegrasi pada sel genom tanaman kina.
pembentukan kalus dan pembentukan akar Pada tanaman tinggi terdapat suatu
pada tempat inokulasi. Akan tetapi hampir rangkaian DNA yang cukup besar yang
semua pembentukan akar rambut diawali de- tidak aktif menyandi protein. Apabila posisi
ngan pembentukan kalus. Selanjutnya pada T-DNA yang disisipkan tidak bersifat acak
permukaan kalus yang terbentuk tersebut dalam genom tanaman dan hanya ter-
terjadi pembentukan akar rambut. Pada eks- integrasi dalam DNA yang tidak aktif maka
plan daun, baik pada C. succirubra maupun tidak dapat diekspresikan oleh tanaman.
C. ledgeriana seluruh eksplan memper- Perbedaan kemampuan Agrobacterium
lihatkan respons awal berkalus pada tempat untuk menginduksi akar rambut juga
inokulasi. Sedangkan pada eksplan batang ditemukan, dari empat galur A. rhizogenes
memperlihatkan adanya respons awal yang diinokulasikan pada Brassica napus,
berkalus dan juga respons terbentuknya akar yaitu galur ATCC-8196, ATCC-5835, A4RS
secara langsung pada tempat inokulasi. dan LBA 9402, ternyata tidak ada akar
Persentase akar muncul secara langsung
Toruan-Mathius et al.
Kalus Kalus/callus akar/root akar
0 Kalus/callus akar/root
Respons/Response Respons/Response
Kalus Respons/Response akar
C. succirubra
C.ledgeriana
Respons/Response
C. ledgeriana
C. ledgeriana
C. succirubra
C.ledgeriana
C. ledgeriana
C. ledgeriana
Gambar 1. Respons C. succirubra dan C. Ledgeriana untuk membentuk kalus dan akar rambut (A) empat minggu dan (B) delapan minggu setelah inokulasi dengan A. Rhizogenes galur LBA 9457.
Figure 1. Response of C. succirubra and C.ledgeriana for callus and hairy roots formation (A) four- week and (B) eight-week after inoculation with
A. rhizogenes strain LBA 9457.
pada tempat inokulasi sekitar 5% untuk auksin dan sitokinin di dalam sel tanaman.
C. succirubra dan 2% untuk C. ledgeriana Ekspresi dari gen-gen ini membuat terjadi- (Gambar 1A & 1B).
nya perimbangan baru dari zat pengatur Pada respons awal eksplan membentuk
tumbuh internal yang akhirnya menyebab- kalus, tidak semua kalus dapat ber-
kan terjadinya induksi pembentukan akar diferensiasi menjadi akar rambut. Ada
rambut. Menurut Gelvin (1990) pembentu- beberapa eksplan yang hanya meng-
kan kalus yang terjadi pada permukaan ekspresikan kalus tanpa disertai dengan
eksplan sebelum munculnya akar rambut diferensiasi menjadi akar rambut. Dari
terjadi karena konsentrasi auksin dan seluruh eksplan yang diinokulasi hanya
sitokinin yang seimbang. sekitar 60% yang membentuk akar rambut.
Kalus-kalus yang tidak berdiferensiasi Keberhasilan dalam membentuk akar dari
menjadi akar rambut diduga karena tidak bagian eksplan yang diinokulasi merupakan
terintegrasinya TL-DNA pada sel-sel ter- suatu indikasi terjadinya proses transfer T-
sebut. Nillson & Olsson (1997) menjelas- DNA yang berasal dari plasmid Ri
kan bahwa TL-DNA membawa gen-gen rol,
A. rhizogenes pada genom sel tanaman kina. yaitu rolA, rolB, rolC dan rolD. Sedangkan Proses pembentukan akar rambut terjadi
Vilaine et al. (1987) dan Rhodes et al. karena di dalam T-DNA terdapat berbagai
(1994) menemukan bahwa rolA yang gen penyandi protein yang berperan dalam
pertama kali bertanggung jawab terhadap proses biosintesis zat pengatur tumbuh yaitu
pertumbuhan akar rambut pada tembakau,
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
sedangkan rolB merupakan faktor utama yang tidak tumbuh tersebut lama kelamaan pembentukan akar rambut.
menjadi cokelat dan akhirnya mati. Hasil pengujian dengan melakukan
Setelah tiga bulan sebagian besar akar inokulasi pada daun dan batang dari
yang terbentuk hanya menunjukkan panjang
C. succirubra dan C. ledgeriana menunjuk- akar 6-8 mm. Persentase akar rambut dengan kan bahwa pada C. succirubra, persentase
panjang akar lebih dari 10 mm hanya sekitar pembentukan akar rambut pada eksplan
15%. Adanya perbedaan respons eksplan batang lebih tinggi dibandingkan dengan
tersebut kemungkinan karena eksplan ber- eksplan daun, yaitu sekitar 63%. Sedangkan
asal dari benih atau sumber eksplan yang pada C. ledgeriana persentase pembentukan
memiliki potensi genetik yang berbeda. akar rambut lebih tinggi pada eksplan daun,
Setelah diinokulasi selama tujuh minggu, yaitu sekitar 68% (Gambar 1A & 1B). Hasil
persentase C. ledgeriana dan C. succirubra tersebut menunjukkan bahwa adanya per-
yang terinduksi membentuk akar rambut bedaan kompetensi eksplan terhadap
berturut-turut sekitar 74% dan 63%. Hasil inokulasi Agrobacterium.
tersebut menunjukkan bahwa C. ledgeriana Menurut Potrykus (1991) ada beberapa
lebih rentan inokulasi LBA 9457 dibanding- faktor
yang menentukan kompetensi kan dengan C. Succirubra (Gambar 1). eksplan, antara lain spesies atau genotip asal
Stomp et al. (1990) juga menemukan adanya eksplan, jenis organ yang digunakan sebagai
perbedaan respons yang terjadi pada tiap- eksplan, tingkat perkembangan organ,
tiap jenis tanaman pinus setelah diinokulasi bahkan historis dari masing-masing eksplan
dengan Agrobacterium Menurut Hinchee yang digunakan. Bergmann et al. (1997)
et al . (1990) tiap spesies tanaman atau mengemukakan bahwa pada Pinus radiata,
bahkan tiap kultivar tanaman dalam spesies pucuk in vitro lebih rentan inokulasi
yang sama mempunyai tingkat kerentanan Agrobacterium dibandingkan dengan pucuk
terhadap Agrobacterium yang berbeda-beda. hasil penyemaian di rumah kaca.
Morfologi dan perpanjangan akar rambut kedua jenis tanaman kina juga mem- Inisiasi dan pertumbuhan akar rambut
perlihatkan adanya perbedaan. Perpanjangan tanaman kina
akar rambut C. ledgeriana lebih cepat dari pada akar rambut C. succirubra. Sedangkan
Pada sebagian besar eksplan (sebanyak dari morfologi akar rambut yang terbentuk, 60-63% yang terinduksi), kalus telah muncul
akar rambut C. succirubra memperlihatkan minggu ke dua setelah inokulasi. Sedangkan
percabangan akar yang lebih banyak dan akar rambut umumnya muncul minggu ke
akar lebih besar (Gambar 2). tiga setelah inokulasi. Pertumbuhan akar
rambut dari eksplan-eksplan tersebut sangat Optimasi medium untuk pertumbuhan akar beragam. Hal ini terlihat dari akar yang
rambut
terbentuk menghasilkan panjang akar yang berbeda-beda. Beberapa akar yang terbentuk
Akar rambut yang digunakan pada pada eksplan dapat terus tumbuh, akan tetapi
percobaan kedua merupakan akar rambut sebagian besar akar tidak mengalami per-
C. ledgeriana yang diperoleh pada tambahan panjang akar yang berarti. Akar
percobaan pertama. Akar yang dipilih adalah
Toruan-Mathius et al.
Gambar 2. Akar rambut C. succirubra, pada eksplan (a) batang, dan (b) daun. Akar rambut C. Ledgeriana pada eksplan (c) batang, dan (d) daun berumur empat bulan setelah
inokulasi dengan A. Rhizogenes LBA9457.
Figure 2. Hairy root of C. succirubra, from (a) shoot, and (b) leaf. Hairy roots of C. ledgeriana, from explants (c) shoot, and (d) leaves, four-month after inoculation with
A. rhizogenes strain LBA9457.
Gambar 3. Kultur akar rambut C. ledgeriana (a), dan C. succirubra (b) pada medium MS cair dengan penambahan 50 mg/L L-triptofan dan vitamin tiga kali konsentrasi MS, umur tiga bulan.
Figure 3. Hairy root culture of
C. ledgeriana (a), and C. succirubra in liquid MS with the addition of 50 mg/L L- tryptophane and vitamins with concentration three times of MS, three-month-old.
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
akar yang tumbuh lebih cepat dan lebih akar rambut. Hal ini dilihat dari ukuran vigor. Setelah dikultur pada medium padat
panjang akar rambut, namun percabangan dan medium cair terlihat bahwa pertum-
akar tetap terbentuk (Gambar 3). buhan akar rambut lebih cepat pada medium
Terjadinya penghambatan pertum- cair dibandingkan dengan pertumbuhan pada
buhan akar rambut diduga karena komposisi medium padat. Demikian juga percabangan
auksin yang berlebihan. Hal tersebut akar lateral yang terbentuk lebih banyak.
terjadikarena L-triptofan akan diubah oleh Pertumbuhan akar rambut sangat lambat, hal
enzim triptofan 2-monooksidase dan amino tersebut dilihat dari panjang maksimum akar
hidrolase menjadi IAA (auksin). Auksin hanya sekitar 4 cm dengan percabangan
dapat menyebabkan pembelahan sel di lateral yang terbentuk setelah dikulturkan
dalam sel jaringan akar, tetapi juga dapat selama dua bulan (Gambar 2).
menyebabkan jaringan akar mengeluarkan Pertumbuhan akar rambut yang lebih
etilen yang merupakan penyebab langsung cepat pada medium cair kemungkinan
penghambatan. Menurut Gunawan & disebabkan oleh permukaan eksplan yang
Ermawati (1992) konsentrasi auksin yang kontak langsung dengan medium lebih luas
rendah dapat meningkatkan pertumbuhan, dan karena adanya pengocokan medium,
sebaliknya konsentrasi auksin yang tinggi menyebabkan penyerapan hara lebih efektif
dapat menghambat pertumbuhan. Wattimena serta senyawa-senyawa toksik atau senyawa
et al. (1992) menerangkan bahwa pada tahap penghambat yang mungkin terakumulasi di
awal pengaruh auksin adalah pembentukan sekitar jaringan akan mudah dipisahkan
sekumpulan akar-akar lateral, tetapi pada sehingga tidak merusak jaringan.
tahap selanjutnya tidak terjadi penambahan Variasi medium kultur yang digunakan
pembentukan akar. Hal ini menjelaskan memberikan pengaruh terhadap pertum-
bahwa adanya faktor selain auksin yang buhan akar rambut tanaman kina. Dilihat
diperlukan dan telah habis digunakan. dari ukuran panjang akar dan percabangan
Faktor tersebut mungkin terbentuk di dalam akar lateral yang terbentuk, pertumbuhan
ujung akar.
akar rambut lebih baik pada medium dasar Medium MS3V dan MS5V merupakan MS. Hal tersebut kemungkinan karena dari
medium dengan peningkatan konsentrasi empat medium dasar yang digunakan yaitu
vitamin medium dasar MS. Pada MS3V dan MS5V tersebut akar rambut memperlihatkan
Optimasi medium percabangan lateral yang lebih banyak dan terbentuk bulu-bulu akar pada ujung akar.
Akar rambut yang dikultur pada Akan tetapi percabangan akar tersebut medium dasar MS disubkulturkan pada
memiliki ukuran yang lebih pendek medium MS modifikasi. Akar rambut yang
dibandingkan dengan akar yang dikultur digunakan adalah klon akar yang tumbuh
pada medium MS tanpa modifikasi. lebih cepat dan lebih vigor. Ada empat
Hasil yang diperoleh menunjukkan medium MS modifikasi yang digunakan
bahwa pada medium MS50L rerata panjang yaitu MS50L, MS100L, MS3V dan MS5V.
akar dan jumlah cabang akar rambut ber- Penambahan
turut-turut adalah 1,7 cm dan 9,0 cabang. menunjukkan penghambatan pertumbuhan
prekursor
L-triptofan
Sedangkan pada medium MS100L rerata
Toruan-Mathius et al. ....
A 0.50 a b 4.00 2.00
Medium Medium
0.20 (g) 0.15
C 0.00
MS 0 MS 50 L
MS 3V MS MS 5V
10 0L
Medium
Gambar 4. Panjang (A), jumlah (B) dan bobot basah akar rambut (C) C. ledgeriana yang dikultur selama delapan minggu pada medium MS (MSo), MS + 50 mg/L L-triptofan (MS50L), MS + 100 mg/L L-triptofan (MS100L), MS + vitamin tiga kali MS (MS3V), dan MS + lima kali vitamin MS
(MS5V).
Figure 4. Length (A), numbers (B), and fresh weight of hairy root (C) C. ledgeriana cultured during
Eight weeks in MS (MSo), MS +50 mg/L L- tryiptophane (MS50L), MS +100 mg/L L-trytophane (MS100L), MS + vitamins, three times MS (MS3V), and five times (MS5V).
panjang akar adalah 0,3 cm dengan 11,0 kan sebagai kontrol, rerata panjang akar cabang. Rerata panjang akar dan jumlah
rambut adalah 3,8 cm dengan rerata jumlah cabang akar rambut yang dikultur pada
cabang adalah 6,0 cabang (Gambar 4 A&B). medium MS3V dan MS5V berturut-turut
Berdasarkan panjang akar dan jumlah 2,1 cm dengan 19,0 cabang dan 0,5 cm
cabang akar yang terbentuk, akar rambut dengan 11,0 cabang. Sedangkan pada
tanaman kina lebih baik dikulturkan pada medium MS tanpa modifikasi yang dijadi-
medium MS3V. Vitamin dalam medium MS
Toruan-Mathius et al.
Gambar 5. Fraksinasi DNA setelah PCR. (M) marka 1 kb ladder DNA. (1) Akar rambut C. succirubra dengan primer TR, (2) primer rol B, (3) daun C. succirubra dengan primer rol B, (4) akar rambut C. ledgeriana
rol B. dengan primer TR, (5) A.rhizogenes galur LBA 9457, (7) primer TR, (8) primer
Figure 5. DNA fractination after PCR. (M) 1 kb DNA ladder. (1) Hairy root of C. succirubra with TR primer, (2) primer rol B, (3) C. succirubra leaves with rol B primer, (4) hairy root C. ledgeriana with TR primer, (5) A. rhizogenes strain LBA 9457, (7) TR primer, (8) rol B
primer.
umumnya merupakan kelompok vitamin B. B5 memperlihatkan percabangan lateral dan Menurut George & Sherrington (1984).
rambut-rambut akar yang lebih banyak dari Vitamin B berfungsi mempercepat pem-
pada akar rambut yang dikultur pada belahan sel pada meristem akar dan juga
medium NN. Dibandingkan dengan bobot berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang
basah akar, akar rambut yang dikulturkan
menghasilkan energi dan reaksi-reaksi
pada medium MS3V menunjukkan bobot
enzimatis. Beberapa vitamin dapat mening- akar yang lebih besar dari pada akar yang katkan pembentukan akar lateral. Ikenaga
dikulturkan pada medium MS5V, MS50L, et al. (1995) memperoleh pertumbuhan akar
S100L dan MS tanpa modifikasi (Gambar rambut Solanum aculeatis-simum lebih baik
4 C). Konfirmasi transformasi TR dan TL- pada medium B5 dengan 3% sukrosa
DNA plasmid dengan PCR
dibandingkan dengan medium Linsmaier & Fraksinasi hasil amplifikasi DNA mem- Skoog (LS). Sedangkan Yonemitsu et al.
perlihatkan bahwa semua sampel meng- (1990) menyatakan bahwa pertumbuhan
hasilkan pola pita yang sama dengan kontrol akar rambut Lobelia inflata L. Memper-
positif (plasmid), kecuali kontrol negatif lihatkan morfologi yang berbeda antara akar
(non transformasi) tidak menghasilkan pita rambut yang dikultur dalam medium 1/2
DNA. Dari pola pita yang terbentuk, kedua MS, MS dan B5 dengan medium NN. Kultur
bagian T-DNA dapat terintegrasi pada akar rambut pada medium 1/2 MS, MS dan
semua akar rambut. Bagian TL-DNA (rol B)
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
muncul dengan bobot molekul 780 bp, pada akar rambut yang diperoleh. Pita TR
dan TL-DNA muncul pada gel elektroforesis bobot molekul 1600 bp (Gambar 5). Ri
sedangkan bagian TR-DNA muncul dengan
dengan bobot molekul DNA masing-masing plasmid yang terdapat pada A. rhizogenes
1600 pb dan 780 pb.
umumnya berukuran sekitar 140-235 kb dan ragmen DNA yang ditransfer ke dalam sel
Ucapan Terima Kasih
tanaman sekitar 14-42 kb yang merupakan daerah TR dan TL-DNA (Dow Kung et al.,
Penulis mengucapkan terima kasih 1993). Ermayanti et al. (2000) dan Subroto
kepada (i) Dewan Riset Nasional (DRN) dan et al. (2000) mendapatkan galur bakteri
lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) ATCC-15834 yang diinokulasikan ke
yang telah membiayai penelitian ini melalui tanaman Azadirachta dan Solanum
proyek Riset kompetitif Riset Unggulan ningrum
menunjukkan hasil analisis PCR Terpadu (RUT) XI dengan surat perjanjian pada 780 bp untuk TL-DNA dan 1672 bp
No. 14.262/SK/RUT/2004; (ii). Labora-
untuk TR-DNA. Sedangkan Lodhi &
torium mikrobiologi, LIPI, Cibinong atas
Charlwood (1996) juga mendapatkan hasil izin menggunakan koleksi A. Rhizogenes. analisis PCR dari A. rhizogenes galur LBA 9402 pada 0,78 kb untuk TL-DNA.
Daftar Pustaka
Kesimpulan
Anderson, L.A., A.T. Keene & J.D. Philipson (1982). Alkaloid production by leaf organ,
Dari sembilan galur A. rhizogenes yang root organ and cell suspension culture of diinokulasikan, hanya galur LBA 9457 yang
86, 22- dapat menginduksi pembentukan akar
Cinchona ledgeriana. Plant Med.,
rambut pada C. succirubra dan C. ledge- riana . Hasil inokulasi tersebut terlihat
Anderson, L.A., J.D. Philipson & M.F.S.Robert
C. ledgeriana lebih rentan dibandingkan (1986). Aspect of alkaloid production by plant cells cultures. In P. Morris et al. (eds.)
dengan C. succirubra. Secara keseluruhan Secondary Metabolism in Plant Cells dari hasil yang diperoleh menunjukkan
Culture . Cambrige, Cambrige University bahwa pertumbuhan akar rambut tanaman
Press.
kina relatif lambat.
Berdasarkan panjang akar, jumlah Aoki, T, H. Matsumoto, Y. Asako, Y. Matsunaga
percabangan akar lateral dan bobot basah & K. Shimomura (1997). Variation of akar, pertumbuhan akar rambut lebih baik
alkaloid productivity among several clones of hairy roots and regenerated plants of
pada medium dasar MS dan medium
Atropa
belladonna transformed with
Agrobacterium rhizogenes 15834. Plant Cell dikultur pada medium dasar MS berbeda
modifikasi MS3V. Akar rambut yang
16, 282-286. secara fenotip dibandingkan dengan akar rambut yang dikultur pada medium MS3V.
Rep.,
Astika, W. (1975) . Klon QRC, asal usul dan Hasil uji konfirmasi transfer DNA, kedua
daya produksinya. Warta BPTK, 1 (2,3), 175 bagian TL dan TR-DNA dapat terintegrasi
Toruan-Mathius et al .
Bergman, B.A. J. Dukes & A.M. Stomp (1997). N. Ansori (Eds). Bioteknologi Pertanian 2. Infection
Bogor, PAU Institut Pertanian Bogor. Agrobacterium rhizogenes and long-term growth of detached hairy root in vitro. New
of Pinus
radiata with
Hamill, J.D., R.J. Robins & M.J.C. Rhodes Zealand J. Forestry Sci ., 27(1)11-22.
(1989). Alkaloid production by transformed root cultures of Cinchona ledgeriana. Planta
Boitel-Conti, M., J.V. Laberche, A.Lanove,
55, 354-358. C.Ducrocg & B.S. Sangwan-Norreel (2000). Influence of feeding precursors on tropane
Med.,
Hay, C.A., L.A. Anderson, M.F.Robert & alkaloid production during an abiotic stress
J.D. Phillipson (1986). In vitro cultures of in Datura innoxia transformed roots. Plant
Cinchona spesies. precursor feeding of Cell Tiss. & Org. Cult., 60 , 131-137.
C. ledgeriana root organ suspension cultures with L-tryptophan. Berlin, Springer-Verlag. Dow-Kung, S. & C.J. Arntzen (1993). Plant Biotechnology . Boston, Butterworths.
Heller, R. (1953). Recherches sur la nutrition minerale de tissues vegetanx cultivees in Fowler, M.W. (1983). Commercial application
vitro . Ann. Sci. Nat. Biol. Veg., 1, 1 – 11. and economics aspects of plant mass cell culture. In Mantel SH & Smith (eds.) Plant
Hinchee, M. A. W., C.A.Newell, D.V.Connor- Biotechnology Cambrige,
Armstrong, W.R.Deaton, University Press.
Cambrige
Ward, T.A.
S.S. Sato & R.J. Rozman (1990). Transformation and regeneration of non
Gamborg, O.L., R.A.Miller & K. Oyama (1968). Solanaceous crop plants, In J.P. Gustafson Nutrient requirement of suspension cultures
Manipulation in Plant of soybean root cell. Exp. Cell Res. 50, 151
(ed).
Gene
Improvement. New York, Plenum Press. p. – 158.
203- 212.
Geerlings, A., D. Hallard, A.M. Caballero, Ikenaga, T., T. Oyama & T. Muranaka (1995). I.L. Cardoso, R. van der Heijden &
Growth and steroidal saponin production in Verpoorte (1999). Alkaloid production by a
cultures of Solanum Cinchona officinalis ‘Ledgeriana’ hairy root aculeatissimum . Plant Cell Rep., 14, 413-
hairy
root
culture containing constitutive expression
constructs of tryptophan decarboxylase and strictosidine
Kamada, H., N. Okamura, M.Satake, H.Harada & Catharanthus roseus . Plant Cell Rep., 19,
K. Shimomura (1986). Alkaloid production 191-196.
by hairy root culture in Atropla belladonna. Plant Cell Rep., 5 , 239-242.
George, E.F. & P.D. Sherrington (1984). Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook
Linsmaier, E.M. & F. Skoog (1965). Organic and Directory of Commercial Laboratories .
growth factor requirements of tobacco tissue England, Exegetics Ltd.
cultures. Physiol. Plant., 18, 100-127. Giri, A. & M.L.Narasu (2000). Transgenic hairy
Lodhi, A.H. & B.V. Charlwood (1996). root: recent trends and applications. Biotech.
Agrobacterium rhizogenes -mediated trans- Adv ., 18, 1-22.
formation of Rubia peregrine L. in vitro accumulation of Anthraquinones. Plant Cell
Gunawan L.W. & A. Ernawati (1992). Produk Tiss. & Org. Cult ., 46,103-108. metabolit sekunder. Dalam Harran, S. &
Kultur akar rambut Cinchona ledgeriana dan C. succirubra ....
Menze, A. & C. Moller (1999). Transformation cultures. Plant Cell Tiss. & Org. Cult., 38, of different Brassica napus cultivars with
143-151.
three different starins of Agrobacterium rhizogenes . In Proc. the 10 th Int. Rapeseed
Sambrook, J.E. & T. Frits & Maniatis (1989). Congress , Canberra, Australia.
Molecular Cloning . A Laboratory Manual. New York.
Murashige, T. & F. Skoog (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with
Scragg, A.H., P.Morris & J. Ailan (1986). The tobacco tissue culture. Physiol. Plant., 15,
effect of plant growth regulators and 473 – 497.
alkaloid formation in Cinchona ledgeriana callus culture. J. Plant Physiol., 124, 371-
Musalam, Y., Titik Sukasmono & Supria (1980).
Alkaloid kinina di dalam tanaman kina SIL. (2000). Peluang Pasar dan Perkembangan Cinchona ledgeriana . Warta BPTK , 6, 88-
Industri Kina Indonesia . Sinkona Indonesia 93.
Lestari.
Nillson, O. & O. Olsson (1997). Getting to the Staba, E.J. & A.C. Chung (1981). Quinine and root : the role of The Agrobacterium
Quinidine production by Cinchona leaf, root rhizogenes rol genes in the formation of
and unorganized cultures. Phytochem., 20 hairy roots. Physiol. Plant., 100, 463-473.
(11), 2495-2481.
Orozco-Castillo, C., K.J. Chalmers, R. Waugh & Stomp, A.M., C. Loopstra, W.S.Chilton, W. Powell (1994). Detection of genetic
R.R. Sederoff & L.W. Moore (1990). diversity and selective gene introgression in
Extended host range of Agrobacterium coffee using RAPD markers. Theor. Appl.
tumefasciens in the genus Pinus. Plant Genet.,
92, 1226- 1232. Owens, L.D. & A.C. Smigocki (1988).
87, 934-938.
Physiol.,
Subroto, M.A., D. Sudradjat, A. Djanakum & E. Transformation of soybean cell using mixed
Widayat (2000). Peningkatan efisiensi strains of Agrobacterium tumefasciens and
regenerasi akar rambut Solanum nigrum L. phenolic compounds. Plant Physiol., 88,
melalui induksi dengan hormon eksogen. 570- 573.
Dalam Pros. Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi II . p. 279-287.
Potrykus, I. (1990). Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and
Urdang, G. (1945). The legend of Cinchona. The result. Ann. Rev. Plant. Phisiol. Plant. Mol.
Sientific Monthly , 61, 17-20. Biol.,
42, 205- 225. Vazquez-Flota, F., O.Moreno-Volenzuela, M.L.
Rhodes, M.J.C., M. Hilton, A.J. Parr, J.D. Hamill Miranda-Ham & J. Loyola-Vorgas V.M. & R.J. Robins (1986). Nicotine production
(1994). Catharanthine and ajmaciline by hairy roots cultures of Nicotiana rustica:
synthesis in Catharanthus roseous hairy root fermentation
culture. Plant Cell Tiss. & Org. Cult., 38, Biotechnol. Lett ., 8,415-420.
Rhodes, M. J.C., A.J. Parr, A. Giulietti & Verstrijden, U. (1975). Beberapa aspek kimia E.L.H. Aird (1994). Influence of exogenous
kinina dan kinidina. Warta BPTK 1, 109- hormones on the growth and secondary
metabolite formation in transformed root
Toruan-Mathius et al .
Vilaine, F., C. Charbonnier & F. Casse-Delbart regions of the root inducing plasmid
(1987). Further insight concerning the TL-
Agrobacterium rhizogenes . J. Bacteriol., 164
region of the Ri-plasmid of Agrobacterium
(1), 33-44.
rhizogenes strain A4 transfer of a 1.9 kb fragment is sufficient to induce transformed
Wielanek, M.
H. Urbanek (1999).
roots on tobacco leaf fragments. Mol.
Glucotropaeolin and myrosinase production
Gen.Genet ., 210, 111-115.
in hairy root cultures of Tropaeolum majus. Plant Cell Tiss. & Org. Cult.,
57, 39-45. Wattimena, G.A., L.W. Gunawan, N.A. Mattjik,
N.M.A. Wiendi & A. Ermawati (1992).
Winans, S. (1992). Two way chemical signaling
Bioteknologi Tanaman Laboratorium Kultur
Agrobacterium plant interactions. Microbiol.
Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.
Yonemitsu, H., K. Shimosmura, M.Satake, S. Mochida, M.Tanaka, T. Endo & A. Kaji
White, F.F., B.H. Taylor, G.A. Huffman, M.P. (1990). Lobeline production by hairy root
Gordon & E.W. Nester (1985). Molecular
culture of Lobelia inflata L. Plant Cell Rep.,
genetic analysis of the transferred DNA
9 , 307-310.