Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera
PENCARIAN VARIAN GEN MIOSTATIN
PADA DOMBA KOMPOSIT SUMATERA
ANDALUSIA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRAK
ANDALUSIA. Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera. Dibimbing oleh
ACHMAD FARAJALLAH dan BESS TIESNAMURTI.
Domba komposit sumatera merupakan bentuk silangan domba lokal ekor tipis Sumatera
(DETS) dengan domba St. Croix (SC) dan Barbados Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al. 2000). Miostatin atau growth differentiations factor 8
(GDF 8) merupakan anggota dari superfamili transforming growth factor-β (TGF-β) berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot (McPherron et al.1997). Mutasi gen miostatin dapat
mengganggu ekspresi dan aktifitasnya sehingga otot kerangka akan mengalami hipertropi ataupun
hiperplasia (pertumbuhan otot yang melebihi normal), hal ini dikenal dengan fenomena double
muscling. Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi secara alami dalam jangka waktu yang
panjang, sehingga menghasilkan varian-varian baru dari makhluk hidup tersebut. Hasil pencarian
varian gen miostatin pada domba komposit sumatera menggunakan dengan metode PCR-RFLP
dengan enzim restriksi Hae III dan Mbo I tidak menunjukkan adanya keragaman. Metode PCRSSCP menunjukkan adanya varian gen miostatin ekson 3 pada domba komposit dalam penelitian
ini yaitu W, X, Y, dan Z dengan frekuensi berturut-turut 3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, dan 21.69 %.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tipe SSCP gen miostatin ekson 3 tidak
nyata mempengaruhi tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot badan pada
domba komposit sumatera.
Kata-kata kunci: Domba komposit sumatera, miostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
ABSTRACT
ANDALUSIA. Exploring Myostatin Gene in Sumatera Composite Sheep. Under supervising of
ACHMAD FARAJALLAH and BESS TIESNAMURTI.
Sumatera composite sheep is a synthetic breed of Sumatera thin tail (STT) sheep with St.
Croix (SC) and Barbados Blackbelly (BB) with genetic constituent of 50% STT : 25% SC:
25%BB (Subandriyo et al. 2000). Myostatin or growth differentiations factor 8 (GDF 8) is a
member from super family transforming growth factor-β (TGF-β) act as a feedback negative that
controlling muscle growth (McPherron et al.1997). Mutation in myostatin gene interact with the
expression and activity of muscle growth. It can cause hypertrophy or hyperplasia (abnormally
muscle growth), known as double muscling. Naturally, mutation can occur in a long and slow
process that produce new variants. The result from exploring the myostatin gene in Sumatera
composite sheep by PCR-RFLP using Hae III and Mbo I restriction enzyme showed no differences
among the samples. PCR-SSCP methods showed four variants in myostatin gene reside at exon 3
of Sumatera composite sheep which are W, X, Y,and Z (3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, and 21.69 %,
respectively). SSCP types of myostatin gene exon 3 were not significantly influencing birth type.
It can be concluded that SSCP technique of myostatin gene at exon 3 did not significantly affect
(P>0.05) litter size, birth weight as well as average daily gain of Sumatera Composite Sheep.
Keywords: Sumatera composite sheep, myostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
3
PENCARIAN VARIAN GEN MIOSTATIN
PADA DOMBA KOMPOSIT SUMATERA
ANDALUSIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
4
Judul Skripsi: Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera
Nama
: Andalusia
NRP
: G 34103059
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
NIP 131878947
Dr. Ir. BessTiesnamurti
NIP 080063117
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
5
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat,
karunia, dan ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul
Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan Ibu Dr.
Ir. Bess Tiesnamurti selaku pembimbing serta seluruh staf Departemen Biologi, khususnya Staf
Zoologi yang telah bersedia memberikan bimbingan, fasilitas, saran dan masukkan dalam
penyelesaian karya ilmiah ini.
Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Mama, Daddy, dan Adik-adik:
Cordova dan Sevilla atas curahan doa, cinta, kasih sayang, dukungan dan pengertiannya yang tulus
selama ini. Tak lupa penulis ucapkan terimakasih kepada keluarga besar Agus MB dan Moechidin
serta teman-teman di Biologi 39, 40, 41, 42, Zoologiers, Malabar 8, SMU 6 Jakarta, FOSMA,
Teens, dan FKA ESQ 165 Bogor Raya, Bunda Gina, Bunda Wiwi, Bunda Noortje, Mba Fina dan
sahabat-sahabatku yang tak dapat disebutkan satu persatu. Terima kasih untuk hari-hari indah,
nasihat, spirit, motivasi dan perhatian yang selalu terjalin indah hingga saat ini.
Penulis menyadari bahwa karya tulis ini mungkin masih jauh dari sempurna. Oleh karena
itu saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan. Semoga karya ilmiah ini dapat
memberikan tambahan informasi dan bermanfaat bagi masyarakat pertanian, khususnya
peternakan.
Bogor, September 2007
Andalusia
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 12 Januari 1986 dari ayah Helmi Agus, SE dan
ibu Muji Lestari. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMU Negeri 6 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi
Biologi Jurusan biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada
tahun ajaran 2005/2006 dan 2006/2007, mata kuliah Ilmu Lingkungan dan Perkembangan Hewan
tahun ajaran 2005/2006, serta mata kuliah Struktur Hewan 2006/2007. Penulis juga aktif sebagai
pengurus Dewan Perwakilan Mahasiswa FMIPA IPB 2004/2005 sebagai anggota Komisi Minat
dan Bakat, pengurs Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) 2005/2006 sebagai ketua bidang
infokom serta pernah meraih predikat sebagai penyaji tingkat nasional pada Pekan Ilmiah
Mahasiswa Nasional XIX di Universitas Muhammadiyah Malang pada tahun 2006.
7
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL....................................................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................................................. vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................................................
Tujuan ...................................................................................................................................
1
1
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu .................................................................................................................
Sampel DNA.........................................................................................................................
Amplifikasi DNA..................................................................................................................
Elektroforesis dan Visualisasi DNA .....................................................................................
PCR-RFLP ............................................................................................................................
PCR-SSCP ............................................................................................................................
Analisa Statistik ....................................................................................................................
1
1
1
2
2
2
2
HASIL
Amplifikasi DNA..................................................................................................................
PCR-RFLP ............................................................................................................................
PCR-SSCP ............................................................................................................................
Respon Bobot Lahir, Bobot Sapih, Pertambahan Bobot Badan dan Tipe Kelahiran
Terhadap Tipe SSCP Gen Miostatin Ekson 3 .......................................................................
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA..................................................................................................................
PCR-RFLP ............................................................................................................................
PCR-SSCP ............................................................................................................................
Respon Bobot Lahir, Bobot Sapih, Pertambahan Bobot Badan dan Tipe Kelahiran
Terhadap Tipe SSCP Gen Miostatin Ekson 3 .......................................................................
2
2
3
3
3
4
4
4
SIMPULAN ................................................................................................................................
5
SARAN........................................................................................................................................
5
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................
5
8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Tampilan Ternak Domba Komposit BALITNAK Bogor ........................................................... 3
2 Hasil Analisis Respon Tipe Kelahiran, Bobot Lahir, Bobot Sapih, Dan Pertambahan Bobot
Badan Terhadap Tipe SSCP............................................................................................. .......... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil Amplifikasi Gen Miostatin Ekson 3........................................................................ ..........
2 Hasil Pemotongan Gen Miostatin Ekson 3 dengan Enzim Restriksi Hae III (A) Dan
Mbo I (B).......................................................................................................................... ..........
3 Hasil Elektroforesis Produk PCR-SSCP Sampel Domba Komposit Sumatera, (B)
Interpretasi Migrasi Untai Tunggal Pita DNA Hasil Elektroforesis Produk
PCR-SSCP ....................................................................................................................... ..........
4 Sekuen Gen Miostatin Ekson 3 Gabungan dari Ovis Aries (Domba) Dan
Bos Taurus (Sapi) ............................................................................................................ ..........
2
2
3
3
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba merupakan salah satu hewan
ternak populer di Indonesia setelah ayam, sapi
dan kambing. Domba lokal di Indonesia dapat
dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain
domba ekor tipis, domba ekor gemuk, domba
garut (Utoyo et al. 1996) dan domba sumatera
(Priyanto et al. 1999). Beberapa hasil silangan
antar jenis domba-domba tersebut banyak
ditemukan dalam rangka meningkatkan
kualitas produksi domba, misalnya laju
pertumbuhan yang cepat, kualitas karkas,
tahan penyakit dan sifat prolifik (kemampuan
beranak lebih banyak). Salah satu domba hasil
persilangan yang sengaja dirakit untuk
meningkatkan laju pertumbuhan adalah
domba komposit sumatera. Domba komposit
sumatera merupakan hasil silangan domba
lokal ekor tipis Sumatera (DETS) dengan
domba St. Croix (SC) dan Barbados
Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al.
2000).
Miostatin atau growth differentiations
factor 8 (GDF 8) merupakan anggota dari
superfamili transforming growth factor-β
(TGF-β) yang mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot kerangka. Cara kerja
miostatin dalam mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot adalah dengan menghambat
aktifitas miogenin. Miogenin yang tidak
bekerja menyebabkan mioblas tidak dapat
berdiferensiasi menjadi miotube. Miotube ini
nantinya akan berkembang menjadi serabut
otot. Dengan kata lain, miostatin berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot.
Miostatin diekspresikan oleh gen miostatin
yang pada sapi terdapat pada kromosom No. 2
(McPherron et al.1997). Pada sebagian besar
vertebrata, ekspresi gen miostatin terjadi
pascanatal (McNally 2004). Jika gen miostatin
mengalami mutasi yang mengganggu ekspresi
dan/atau aktifitasnya, maka otot kerangka
akan mengalami hipertropi (serabut otot
bertambah besar) ataupun hiperplasia (jumlah
serabut otot bertambah banyak). Fenomena
double muscling pada sapi Belgian Blue dan
Piedmontese adalah salah satu contoh mutasi
pada ekson ketiga gen miostatin sehingga otot
mengalami pertumbuhan yang melebihi
normal (McPherron et al.1997, Oldham et al.
2001). Walaupun jenis mutasi pada kedua sapi
diatas berbeda, mutasi keduanya ternyata
sama-sama mengganggu proses ekspresi gen
akibat bergesernya kodon stop.
Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi
secara alami dalam setiap gen dan dapat
menyebabkan perubahan fisiologis atau
morfologis yang semakin baik, semakin
buruk, bahkan tidak menyebabkan perubahan
sama sekali. Makhluk hidup yang mengalami
mutasi ini disebut mutan. Mutan yang dapat
bertahan hidup ini tentunya memiliki
perbedaan dalam susunan nukleotida basa
suatu gen sehingga di dalam populasi akan
ada banyak keragaman (varian) dari makhluk
hidup tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mencari varian gen
miostatin pada domba komposit sumatera.
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Januari sampai Juni 2007 di Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel DNA
Sampel DNA domba yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan koleksi DNA
dalam EtOH yang diekstraksi dari darah
domba komposit sumatera yang laju
pertumbuhannya sudah dikarakterisasi dengan
baik (koleksi Dr. Bess Tiesnamurti
BALITNAK Bogor yang disimpan di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
FMIPA IPB). Sampel yang tersedia berjumlah
89 sampel yang terdiri dari jenis M (komposit
sumatera) hasil persilangan antara DETS, SC
dan BB.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler.
Sepasang primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi ruas ekson ketiga gen
miostatin sebesar 610 pb mengikuti Tellgren
et al. (2004), yaitu M03-30f 5’ATGTGACATAAGCAAAAT GATTAG-3’
dan M03-33r 5’-CTTGTGCTTAAGTGAC
GTAG-3’. Sampel DNA domba komposit
dipindahkan ke dalam tabung PCR sebanyak
10-100 ng kemudian dicampur dengan
pereaksi PCR yang terdiri atas dNTP mix 320
pM, enzim taq polimerase 1 unit beserta
bufernya (NewEngland Biolabs) dan masingmasing primer forward dan reverse 1 nM.
Amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu
2
predenaturasi 92 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 4 menit, penempelan
primer pada suhu 51 oC selama 1 menit,
pemanjangan ruas target pada suhu 72 oC
selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada
72 oC selama 7 menit .
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Produk PCR diuji menggunakan PAGE
6% (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilanjutkan
dengan
pewarnaan
perak
mengikuti
Tegelstrom
(1986)
yang
dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998).
PCR-RFLP
Produk
PCR
kemudian
dipotong
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI
mengikuti
petunjuk
produsen
(NewEngland Biolabs). Pola pita hasil
pemotongan
enzim
restriksi
diuji
menggunakan PAGE 6% yang dilanjutkan
dengan pewarnaan perak.
PCR-SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan metode
pengendapan alkohol. Sebanyak 20 μl produk
PCR ditambah dengan 5M NaCl 2 μl dan
alkohol absolut 200 μl kemudian diinkubasi
semalaman dalam suhu -20 oC. Molekul DNA
diendapkan dengan sentrifuse selama 5 menit
pada kecepatan 8000 rpm. Endapan DNA
kemudian disuspensikan dengan
larutan
formamida 25 μl (formamida solution 80%,
EDTA 10 mM bromtimol blue 1 mg/mL, dan
xylene cyanol 1mg/mL) dan direndam dalam
water bath bersuhu 94 oC selama ± 10 menit
agar untai ganda DNA terpisah menjadi untai
tunggal (single strand). Setelah 10 menit
sampel dipindahkan dengan cepat ke dalam
ice bath selama ± 5 menit untuk mencegah
kedua untai yang sudah terpisah menyatu
kembali. Konformasi untai tunggal kemudian
diuji dengan PAGE 12% (akrilamid:bis
akrilamid = 59:1). Elektroforesis dijalankan
dengan kekuatan listrik sebesar 150 volt
selama 240 menit pada suhu konstan 4 oC.
Visualisasi dilakukan dengan pewarnaan
perak seperti pada visualisasi produk PCR.
yij
μ
ai
ε ij
= Variabel terikat (tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan
pertambahan bobot badan.)
= Rataan umum
= Variabel bebas (tipe pita DNA)
= Galat eror
HASIL
Amplifikasi DNA
Produk
PCR
hasil
amplifikasi
menggunakan primer M03-30 dan M03-33
mempunyai ukuran 610 pb (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen miostatin ekson 3.
Keterangan: M= marker 100 pb (Biorad),
kolom 1 – 4: produk PCR
PCR-RFLP
Hasil
pemotongan
produk
PCR
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI memberikan pola yang sama (Gambar 2
dan 3).
Gambar 2
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Hae III.
Keterangan: M= marker 100 pb
Gambar 3
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Mbo I.
Keterangan: M= marker 100 pb
Analisa statistik
Uji statistik dilakukan untuk melihat
keterpautan tipe gen dengan beberapa karakter
ternak
dengan
model
linier
umum
menggunakan program Minitab 14.
Model matematis yang diajukan adalah:
yij = μ + ai + ε i j
Keterangan:
3
Tabel 1 Tampilan ternak domba komposit sumatera, BALITNAK, Bogor
Tipe Pita
Keterangan
W
X
Y
Jumlah sampel
3
31
31
Z
18
Frekuensi (%)
3.615
37.349
37.349
21.687
Rataan bobot lahir (kg)
1.933
2.329
2.387
2.450
Rataan bobot sapih (kg)
10.133
8.984
8.897
9.594
Rataan pertambahan bobot badan
(gr/ekor/hari)
136.667
110.914
108.495
119.074
PCR-SSCP
Visualisasi DNA hasil SSCP dari 88
sampel domba komposit menunjukkan adanya
keragaman tipe DNA (polimorfik). Tipe-tipe
DNA ini kemudian dikelompokkan menjadi
empat tipe berdasarkan bentuk pemisahan
rantai DNAnya yaitu W,X,Y, dan Z (Gambar
4).
Respon Bobot lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3.
Analisis dilakukan dengan uji statistik
model linier umum yaitu dengan tipe SSCP
sebagai peubah bebas serta tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan
bobot badan sebagai peubah terikat. Hasil
analisis disajikan dalam Tabel 2.
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA
Ukuran produk PCR sepanjang 610 pb
sesuai dengan sekuen DNA miostatin domba
dan sapi yang disimpan dalam GenBank
(www.ncbi.nlm.gov no. acc. AF266758 dan
AB076403).
Gambar 4
(A) Hasil elektroforesis produk PCR-SSCP
sample domba komposit sumatera, (B)
Interpretasi migrasi untai tunggal pita DNA
hasil elektroforesis produk PCR-SSCP.
Keterangan W, X, Y, dan Z = tipe SSCP.
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
pada gen
varian/keragaman pola tipe
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.615 % (W), 37.349 % (X), 37.349 %
(Y), dan 21.687% (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak). Menunjukkan bahwa
semua tipe W berjenis kelamin betina. Selain
itu, jika ditelusuri menurut induknya bapak
dan ibu berbangsa BC (Barbados x Croix)
memiliki anak yang semuanya bertipe Z.
Gambar 5 Sekuen gen miostatin ekson 3 gabungan dari
Ovis aries (domba) dan Bos taurus (sapi).
Sumber: www.ncbi.nlm.nih.gov
4
Tabel 2
Hasil analisis respon tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot
badan terhadap tipe SSCP
Peubah bebas
Tipe Kelahiran
Bobot Lahir
Bobot Sapih
Pertambahan bobot badan
Sumber
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
DB
3
79
82
3
79
82
3
79
82
3
79
82
PCR-RFLP
Pola yang sama pada hasil pemotongan
produk PCR menggunakan enzim restriksi
HaeIII dan MboI memberikan arti bahwa
sekuen DNA yang menjadi pengenal kedua
enzim tersebut sama pada semua sampel
domba yang dianalisis.
Eksplorasi berbagai situs enzim retsriksi
lain yang dilakukan dengan analisis homologi
dari berbagai sekuen gen miostatin yang
disimpan dalam Gen Bank tidak berpeluang
untuk bisa menemukan keragaman gen
miostatin
lebih
lanjut
(data
tidak
diperlihatkan). Selain itu, Cieslak et al. (2003)
melaporkan bahwa bagian ekson gen
miostatin pada selain sapi lebih terjaga dan
stabil. Untuk mencari varian gen miostatin
lebih lanjut dilakuan dengan metode deteksi
PCR-SSCP.
PCR-SSCP
Single-Strand
Conformation
Polymorphisms (SSCPs) adalah metode
elektroforesis
yang
populer
untuk
mengidentifikasi mutasi sekuen karena
mudah, murah dan memiliki sensitifitas tinggi
walau hanya satu nukleotida saja (Nataraj
1999) dapat mendeteksi polimorfisme dan
mutasi titik pada berbagai posisi dalam
fragmen DNA, meskipun mutasi yag terjadi
hanya pada satu basa. (Orita et al.1998).
Kesensitifitasan dari analsis SSCP merupakan
hal yang cukup sulit dalam teknik karena
sangat peka seperti kondisi elektroforesis,
sensitifitas dipengaruhi beberapa faktor
termasuk didalamnya tipe subtitusi basa,
panjang fragmen, sekuen basa, kandungan G
dan C dalam fragmen dan lokasi variasi
sekuen, tidak ada teori yang tepat
memprediksi apakah SSCP dapat mendeteksi
mutasi tertentu (Highsmith et al. 1999).
JK
0.556
41.950
42.506
0.744
21.750
22.494
9.25
574.49
583.74
3102
146413
149515
KT
0.185
0.531
F
0.35
P
0.790
0.248
0.275
0.90
0.445
3.08
7.27
0.42
0.736
1034
1853
0.56
0.644
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
varian/keragaman pola tipe
pada gen
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.62 % (W), 37.35 % (X), 37.35 %
(Y), dan 21.69 % (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak) menunjukkan bahwa
semua tipe Z dan W berjenis kelamin betina.
Selain itu, semua tipe Z jika ditelusuri
menurut induknya berasal dari bapak dan ibu
berbangsa BC (Barbados x St.Croix).
Respon Bobot Lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3
Hasil analisis menunjukkan bahwa tipetipe SSCP gen miostatin ekson 3 yang
ditemukan dalam penelitian ini tidak terpaut
dengan tipe kelahiran, bobot lahir, bobot
sapih, dan pertambahan bobot badan.
Sebagaimana telah disampaikan oleh Cockett
et al. (2001) bahwa fenomena hipertropi otot
pada domba Texel terpaut dengan mutasi gen
miostatin dibagian promotor. Hal yang sama
juga ditemukan pada fenomena hipertropi
pada babi (Cieslak et al. 2003). Kelebihan otot
pada babi ditemukan sebagai konsekuensi dari
hipertropi otot, khususnya pada babi jenis
Pietrain dan Belgian Landrace, namun
perbedaan ciri-ciri karkas dan genotip
mengindikasikan bahwa mutasi ini tidak
memiliki pengaruh pada fungsi protein
miostatin dalam miogenesis. Walaupun
begitu, usaha-usaha pencarian varian gen tetap
harus bisa mencakup keseluruhan gen target
5
mulai dari promotor, intron dan ekson
(Dunner 2003).
SIMPULAN
Varian gen miostatin ekson 3 dengan
menggunakan metode PCR-RFLP dengan
enzim restriksi Hae III dan Mbo I tidak
menunjukkan adanya keragaman. Metode
PCR-SSCP menunjukkan adanya varian gen
miostatin ekson 3 pada domba komposit
dalam penelitian ini yaitu W, X, Y, dan Z
dengan frekuensi berturut-turut 3.62 %, 37.35
%, 37.35 %, dan 21.69 %. Berdasarkan hasil
penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tipe
SSCP gen miostatin ekson 3 tidak nyata
mempengaruhi tipe kelahiran, bobot lahir,
bobot sapih, dan pertambahan bobot badan
pada domba komposit sumatera.
SARAN
Pencarian varian gen miostatin yang lebih
luas perlu dilakukan pada populasi dombadomba lokal Indonesia sebagai manifestasi
dari proses adaptasi domba-omba tersebut di
wilayah tropis Indnesia.
Penelitian lebih lanjut terhadap varian gen
miostatin ekson 3 yang ditemukan dalam
penelitian ini perlu diverifikasi dengan
sekuensing. Selain itu, tipe-tipe yang
diperoleh dari penelitian tersebut bisa
digunakan untuk mendeteksi keterpautannya
dengan tipe kelahiran, bobot lahir, bobot
sapih, dan pertambahan bobot badan.
DAFTAR PUSTAKA
Cieslak D, Blicharsi T, Kapelanski W,
Pierzchala M. 2003. Investigation of
polymorphisms in the porcine myostatin
(GDF8; MSTN) gene. Czech J anim Sci
48(2):69-75.
Cockett NE, Shay TL, Smit M. 2001. Analysis
of the sheep genome [invited review].
Physiol Genomics 7:69-78.
Dunner et al. 2003. Haplotype diversity of the
myostatin gene among beef cattle breeds.
Genet Sel Evol 35: 103-118.
Farajallah A, Suryobroto B, Puntorini T.
1998. Analisis Keragaman Genetik dan
Filogeni Molekular Bangsa Kura-Kura
Air Tawar (Reptilia: Testudines) di
Indonesia Sebagai Dasar Pelestarian dan
Pemanfaatannya. Laporan Pelaksanaan
RUT V/1. Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Pada Masyarakat Institut
Pertanian Bogor. Bogor: IPB.
Highsmith et al. 1999. Use of DNA toolbox
for the characterization of mutation
scanning methods. II: Evaluation of
single-strand conformation polymorphism
analysis. Electrophoresis 20:1195-1203.
McNally EM. 2004. Powerful genes –
myostatin regulation of human muscle
mass. N Engl J Med 350:2642-2644.
McPherron AC, Lee SJ. 1997. Double
muscling in cattle due to mutations in the
myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA
94:12457-12461.
Nataraj AJ, Glander IO, Kusukawa N.
Highsmith WE. 1999. Single-strand
conformation
polymorphism
and
heteroduplex analysis for gel-based
mutation
detection.
Electrophoresis
20:117-1185.
Oldham et al. 2001. Molecular expression of
myostatin and MyoD is greater in doublemuscled than normal-muscled cattle
fetuses. Am J Physiol Regulatory
Integrative Comp Physiol 280:1488-1493.
Orita M, Iwahana A, Kanazawa H, Hayashi K,
Sekiya
T.
1998.
Detection
of
polymorphisms of human DNA by gel
electrophoresis
as
single-strand
conformation polymorphisms. Proc Natl
Acad Sci USA 86:2766-2770.
Priyanto D, Siregar AR, Handiwirawan E,
Subandriyo. 1999. Karakter domba
introduksi dan pola konservasi domba
lokal sumatera di Sumatera Utara. Ilmu
Ternak dan Veteriner 5(1):12-22.
Subandriyo, Setiadi B, Handiwirawan E,
Suparyanto A. 2000. Performa domba
komposit hasil persilangan antara domba
lokal sumatera dengan domba rambut
pada kondisi dikandangkan. Ilmu Ternak
dan Veteriner 5(2):73-83.
Tegelstrom H. 1986. Mitokondrial DNA in
natural population: an improved routine
for screening of genetic variation based
on
sensitive
silver
staining.
Electrophoresis 7:226-229.
Tellgren A, Berglund A, Savolainen P, Janis
CM, Liberles DA. 2004. Myostatin rapid
sequence evolution in ruminants predates
domestication. Molecular Phylogenetics
and Evolution 33:782-790.
Utoyo DP, Djarsanto, Nasution SN. 1996.
Animal Genetic Resources and Domestic
Animal Diversity in Indonesia. Jakarta:
Ministry
of
Ariculture.
6
PENCARIAN VARIAN GEN MIOSTATIN
PADA DOMBA KOMPOSIT SUMATERA
ANDALUSIA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRAK
ANDALUSIA. Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera. Dibimbing oleh
ACHMAD FARAJALLAH dan BESS TIESNAMURTI.
Domba komposit sumatera merupakan bentuk silangan domba lokal ekor tipis Sumatera
(DETS) dengan domba St. Croix (SC) dan Barbados Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al. 2000). Miostatin atau growth differentiations factor 8
(GDF 8) merupakan anggota dari superfamili transforming growth factor-ȕ (TGF-ȕ) berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot (McPherron et al.1997). Mutasi gen miostatin dapat
mengganggu ekspresi dan aktifitasnya sehingga otot kerangka akan mengalami hipertropi ataupun
hiperplasia (pertumbuhan otot yang melebihi normal), hal ini dikenal dengan fenomena double
muscling. Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi secara alami dalam jangka waktu yang
panjang, sehingga menghasilkan varian-varian baru dari makhluk hidup tersebut. Hasil pencarian
varian gen miostatin pada domba komposit sumatera menggunakan dengan metode PCR-RFLP
dengan enzim restriksi Hae III dan Mbo I tidak menunjukkan adanya keragaman. Metode PCRSSCP menunjukkan adanya varian gen miostatin ekson 3 pada domba komposit dalam penelitian
ini yaitu W, X, Y, dan Z dengan frekuensi berturut-turut 3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, dan 21.69 %.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tipe SSCP gen miostatin ekson 3 tidak
nyata mempengaruhi tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot badan pada
domba komposit sumatera.
Kata-kata kunci: Domba komposit sumatera, miostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
ABSTRACT
ANDALUSIA. Exploring Myostatin Gene in Sumatera Composite Sheep. Under supervising of
ACHMAD FARAJALLAH and BESS TIESNAMURTI.
Sumatera composite sheep is a synthetic breed of Sumatera thin tail (STT) sheep with St.
Croix (SC) and Barbados Blackbelly (BB) with genetic constituent of 50% STT : 25% SC:
25%BB (Subandriyo et al. 2000). Myostatin or growth differentiations factor 8 (GDF 8) is a
member from super family transforming growth factor-ȕ (TGF-ȕ) act as a feedback negative that
controlling muscle growth (McPherron et al.1997). Mutation in myostatin gene interact with the
expression and activity of muscle growth. It can cause hypertrophy or hyperplasia (abnormally
muscle growth), known as double muscling. Naturally, mutation can occur in a long and slow
process that produce new variants. The result from exploring the myostatin gene in Sumatera
composite sheep by PCR-RFLP using Hae III and Mbo I restriction enzyme showed no differences
among the samples. PCR-SSCP methods showed four variants in myostatin gene reside at exon 3
of Sumatera composite sheep which are W, X, Y,and Z (3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, and 21.69 %,
respectively). SSCP types of myostatin gene exon 3 were not significantly influencing birth type.
It can be concluded that SSCP technique of myostatin gene at exon 3 did not significantly affect
(P>0.05) litter size, birth weight as well as average daily gain of Sumatera Composite Sheep.
Keywords: Sumatera composite sheep, myostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba merupakan salah satu hewan
ternak populer di Indonesia setelah ayam, sapi
dan kambing. Domba lokal di Indonesia dapat
dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain
domba ekor tipis, domba ekor gemuk, domba
garut (Utoyo et al. 1996) dan domba sumatera
(Priyanto et al. 1999). Beberapa hasil silangan
antar jenis domba-domba tersebut banyak
ditemukan dalam rangka meningkatkan
kualitas produksi domba, misalnya laju
pertumbuhan yang cepat, kualitas karkas,
tahan penyakit dan sifat prolifik (kemampuan
beranak lebih banyak). Salah satu domba hasil
persilangan yang sengaja dirakit untuk
meningkatkan laju pertumbuhan adalah
domba komposit sumatera. Domba komposit
sumatera merupakan hasil silangan domba
lokal ekor tipis Sumatera (DETS) dengan
domba St. Croix (SC) dan Barbados
Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al.
2000).
Miostatin atau growth differentiations
factor 8 (GDF 8) merupakan anggota dari
superfamili transforming growth factor-β
(TGF-β) yang mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot kerangka. Cara kerja
miostatin dalam mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot adalah dengan menghambat
aktifitas miogenin. Miogenin yang tidak
bekerja menyebabkan mioblas tidak dapat
berdiferensiasi menjadi miotube. Miotube ini
nantinya akan berkembang menjadi serabut
otot. Dengan kata lain, miostatin berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot.
Miostatin diekspresikan oleh gen miostatin
yang pada sapi terdapat pada kromosom No. 2
(McPherron et al.1997). Pada sebagian besar
vertebrata, ekspresi gen miostatin terjadi
pascanatal (McNally 2004). Jika gen miostatin
mengalami mutasi yang mengganggu ekspresi
dan/atau aktifitasnya, maka otot kerangka
akan mengalami hipertropi (serabut otot
bertambah besar) ataupun hiperplasia (jumlah
serabut otot bertambah banyak). Fenomena
double muscling pada sapi Belgian Blue dan
Piedmontese adalah salah satu contoh mutasi
pada ekson ketiga gen miostatin sehingga otot
mengalami pertumbuhan yang melebihi
normal (McPherron et al.1997, Oldham et al.
2001). Walaupun jenis mutasi pada kedua sapi
diatas berbeda, mutasi keduanya ternyata
sama-sama mengganggu proses ekspresi gen
akibat bergesernya kodon stop.
Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi
secara alami dalam setiap gen dan dapat
menyebabkan perubahan fisiologis atau
morfologis yang semakin baik, semakin
buruk, bahkan tidak menyebabkan perubahan
sama sekali. Makhluk hidup yang mengalami
mutasi ini disebut mutan. Mutan yang dapat
bertahan hidup ini tentunya memiliki
perbedaan dalam susunan nukleotida basa
suatu gen sehingga di dalam populasi akan
ada banyak keragaman (varian) dari makhluk
hidup tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mencari varian gen
miostatin pada domba komposit sumatera.
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Januari sampai Juni 2007 di Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel DNA
Sampel DNA domba yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan koleksi DNA
dalam EtOH yang diekstraksi dari darah
domba komposit sumatera yang laju
pertumbuhannya sudah dikarakterisasi dengan
baik (koleksi Dr. Bess Tiesnamurti
BALITNAK Bogor yang disimpan di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
FMIPA IPB). Sampel yang tersedia berjumlah
89 sampel yang terdiri dari jenis M (komposit
sumatera) hasil persilangan antara DETS, SC
dan BB.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler.
Sepasang primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi ruas ekson ketiga gen
miostatin sebesar 610 pb mengikuti Tellgren
et al. (2004), yaitu M03-30f 5’ATGTGACATAAGCAAAAT GATTAG-3’
dan M03-33r 5’-CTTGTGCTTAAGTGAC
GTAG-3’. Sampel DNA domba komposit
dipindahkan ke dalam tabung PCR sebanyak
10-100 ng kemudian dicampur dengan
pereaksi PCR yang terdiri atas dNTP mix 320
pM, enzim taq polimerase 1 unit beserta
bufernya (NewEngland Biolabs) dan masingmasing primer forward dan reverse 1 nM.
Amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba merupakan salah satu hewan
ternak populer di Indonesia setelah ayam, sapi
dan kambing. Domba lokal di Indonesia dapat
dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain
domba ekor tipis, domba ekor gemuk, domba
garut (Utoyo et al. 1996) dan domba sumatera
(Priyanto et al. 1999). Beberapa hasil silangan
antar jenis domba-domba tersebut banyak
ditemukan dalam rangka meningkatkan
kualitas produksi domba, misalnya laju
pertumbuhan yang cepat, kualitas karkas,
tahan penyakit dan sifat prolifik (kemampuan
beranak lebih banyak). Salah satu domba hasil
persilangan yang sengaja dirakit untuk
meningkatkan laju pertumbuhan adalah
domba komposit sumatera. Domba komposit
sumatera merupakan hasil silangan domba
lokal ekor tipis Sumatera (DETS) dengan
domba St. Croix (SC) dan Barbados
Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al.
2000).
Miostatin atau growth differentiations
factor 8 (GDF 8) merupakan anggota dari
superfamili transforming growth factor-β
(TGF-β) yang mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot kerangka. Cara kerja
miostatin dalam mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot adalah dengan menghambat
aktifitas miogenin. Miogenin yang tidak
bekerja menyebabkan mioblas tidak dapat
berdiferensiasi menjadi miotube. Miotube ini
nantinya akan berkembang menjadi serabut
otot. Dengan kata lain, miostatin berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot.
Miostatin diekspresikan oleh gen miostatin
yang pada sapi terdapat pada kromosom No. 2
(McPherron et al.1997). Pada sebagian besar
vertebrata, ekspresi gen miostatin terjadi
pascanatal (McNally 2004). Jika gen miostatin
mengalami mutasi yang mengganggu ekspresi
dan/atau aktifitasnya, maka otot kerangka
akan mengalami hipertropi (serabut otot
bertambah besar) ataupun hiperplasia (jumlah
serabut otot bertambah banyak). Fenomena
double muscling pada sapi Belgian Blue dan
Piedmontese adalah salah satu contoh mutasi
pada ekson ketiga gen miostatin sehingga otot
mengalami pertumbuhan yang melebihi
normal (McPherron et al.1997, Oldham et al.
2001). Walaupun jenis mutasi pada kedua sapi
diatas berbeda, mutasi keduanya ternyata
sama-sama mengganggu proses ekspresi gen
akibat bergesernya kodon stop.
Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi
secara alami dalam setiap gen dan dapat
menyebabkan perubahan fisiologis atau
morfologis yang semakin baik, semakin
buruk, bahkan tidak menyebabkan perubahan
sama sekali. Makhluk hidup yang mengalami
mutasi ini disebut mutan. Mutan yang dapat
bertahan hidup ini tentunya memiliki
perbedaan dalam susunan nukleotida basa
suatu gen sehingga di dalam populasi akan
ada banyak keragaman (varian) dari makhluk
hidup tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mencari varian gen
miostatin pada domba komposit sumatera.
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Januari sampai Juni 2007 di Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel DNA
Sampel DNA domba yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan koleksi DNA
dalam EtOH yang diekstraksi dari darah
domba komposit sumatera yang laju
pertumbuhannya sudah dikarakterisasi dengan
baik (koleksi Dr. Bess Tiesnamurti
BALITNAK Bogor yang disimpan di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
FMIPA IPB). Sampel yang tersedia berjumlah
89 sampel yang terdiri dari jenis M (komposit
sumatera) hasil persilangan antara DETS, SC
dan BB.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler.
Sepasang primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi ruas ekson ketiga gen
miostatin sebesar 610 pb mengikuti Tellgren
et al. (2004), yaitu M03-30f 5’ATGTGACATAAGCAAAAT GATTAG-3’
dan M03-33r 5’-CTTGTGCTTAAGTGAC
GTAG-3’. Sampel DNA domba komposit
dipindahkan ke dalam tabung PCR sebanyak
10-100 ng kemudian dicampur dengan
pereaksi PCR yang terdiri atas dNTP mix 320
pM, enzim taq polimerase 1 unit beserta
bufernya (NewEngland Biolabs) dan masingmasing primer forward dan reverse 1 nM.
Amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu
2
predenaturasi 92 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 4 menit, penempelan
primer pada suhu 51 oC selama 1 menit,
pemanjangan ruas target pada suhu 72 oC
selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada
72 oC selama 7 menit .
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Produk PCR diuji menggunakan PAGE
6% (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilanjutkan
dengan
pewarnaan
perak
mengikuti
Tegelstrom
(1986)
yang
dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998).
PCR-RFLP
Produk
PCR
kemudian
dipotong
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI
mengikuti
petunjuk
produsen
(NewEngland Biolabs). Pola pita hasil
pemotongan
enzim
restriksi
diuji
menggunakan PAGE 6% yang dilanjutkan
dengan pewarnaan perak.
PCR-SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan metode
pengendapan alkohol. Sebanyak 20 μl produk
PCR ditambah dengan 5M NaCl 2 μl dan
alkohol absolut 200 μl kemudian diinkubasi
semalaman dalam suhu -20 oC. Molekul DNA
diendapkan dengan sentrifuse selama 5 menit
pada kecepatan 8000 rpm. Endapan DNA
kemudian disuspensikan dengan
larutan
formamida 25 μl (formamida solution 80%,
EDTA 10 mM bromtimol blue 1 mg/mL, dan
xylene cyanol 1mg/mL) dan direndam dalam
water bath bersuhu 94 oC selama ± 10 menit
agar untai ganda DNA terpisah menjadi untai
tunggal (single strand). Setelah 10 menit
sampel dipindahkan dengan cepat ke dalam
ice bath selama ± 5 menit untuk mencegah
kedua untai yang sudah terpisah menyatu
kembali. Konformasi untai tunggal kemudian
diuji dengan PAGE 12% (akrilamid:bis
akrilamid = 59:1). Elektroforesis dijalankan
dengan kekuatan listrik sebesar 150 volt
selama 240 menit pada suhu konstan 4 oC.
Visualisasi dilakukan dengan pewarnaan
perak seperti pada visualisasi produk PCR.
yij
μ
ai
ε ij
= Variabel terikat (tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan
pertambahan bobot badan.)
= Rataan umum
= Variabel bebas (tipe pita DNA)
= Galat eror
HASIL
Amplifikasi DNA
Produk
PCR
hasil
amplifikasi
menggunakan primer M03-30 dan M03-33
mempunyai ukuran 610 pb (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen miostatin ekson 3.
Keterangan: M= marker 100 pb (Biorad),
kolom 1 – 4: produk PCR
PCR-RFLP
Hasil
pemotongan
produk
PCR
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI memberikan pola yang sama (Gambar 2
dan 3).
Gambar 2
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Hae III.
Keterangan: M= marker 100 pb
Gambar 3
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Mbo I.
Keterangan: M= marker 100 pb
Analisa statistik
Uji statistik dilakukan untuk melihat
keterpautan tipe gen dengan beberapa karakter
ternak
dengan
model
linier
umum
menggunakan program Minitab 14.
Model matematis yang diajukan adalah:
yij = μ + ai + ε i j
Keterangan:
2
predenaturasi 92 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 4 menit, penempelan
primer pada suhu 51 oC selama 1 menit,
pemanjangan ruas target pada suhu 72 oC
selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada
72 oC selama 7 menit .
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Produk PCR diuji menggunakan PAGE
6% (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilanjutkan
dengan
pewarnaan
perak
mengikuti
Tegelstrom
(1986)
yang
dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998).
PCR-RFLP
Produk
PCR
kemudian
dipotong
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI
mengikuti
petunjuk
produsen
(NewEngland Biolabs). Pola pita hasil
pemotongan
enzim
restriksi
diuji
menggunakan PAGE 6% yang dilanjutkan
dengan pewarnaan perak.
PCR-SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan metode
pengendapan alkohol. Sebanyak 20 μl produk
PCR ditambah dengan 5M NaCl 2 μl dan
alkohol absolut 200 μl kemudian diinkubasi
semalaman dalam suhu -20 oC. Molekul DNA
diendapkan dengan sentrifuse selama 5 menit
pada kecepatan 8000 rpm. Endapan DNA
kemudian disuspensikan dengan
larutan
formamida 25 μl (formamida solution 80%,
EDTA 10 mM bromtimol blue 1 mg/mL, dan
xylene cyanol 1mg/mL) dan direndam dalam
water bath bersuhu 94 oC selama ± 10 menit
agar untai ganda DNA terpisah menjadi untai
tunggal (single strand). Setelah 10 menit
sampel dipindahkan dengan cepat ke dalam
ice bath selama ± 5 menit untuk mencegah
kedua untai yang sudah terpisah menyatu
kembali. Konformasi untai tunggal kemudian
diuji dengan PAGE 12% (akrilamid:bis
akrilamid = 59:1). Elektroforesis dijalankan
dengan kekuatan listrik sebesar 150 volt
selama 240 menit pada suhu konstan 4 oC.
Visualisasi dilakukan dengan pewarnaan
perak seperti pada visualisasi produk PCR.
yij
μ
ai
ε ij
= Variabel terikat (tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan
pertambahan bobot badan.)
= Rataan umum
= Variabel bebas (tipe pita DNA)
= Galat eror
HASIL
Amplifikasi DNA
Produk
PCR
hasil
amplifikasi
menggunakan primer M03-30 dan M03-33
mempunyai ukuran 610 pb (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen miostatin ekson 3.
Keterangan: M= marker 100 pb (Biorad),
kolom 1 – 4: produk PCR
PCR-RFLP
Hasil
pemotongan
produk
PCR
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI memberikan pola yang sama (Gambar 2
dan 3).
Gambar 2
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Hae III.
Keterangan: M= marker 100 pb
Gambar 3
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Mbo I.
Keterangan: M= marker 100 pb
Analisa statistik
Uji statistik dilakukan untuk melihat
keterpautan tipe gen dengan beberapa karakter
ternak
dengan
model
linier
umum
menggunakan program Minitab 14.
Model matematis yang diajukan adalah:
yij = μ + ai + ε i j
Keterangan:
3
Tabel 1 Tampilan ternak domba komposit sumatera, BALITNAK, Bogor
Tipe Pita
Keterangan
W
X
Y
Jumlah sampel
3
31
31
Z
18
Frekuensi (%)
3.615
37.349
37.349
21.687
Rataan bobot lahir (kg)
1.933
2.329
2.387
2.450
Rataan bobot sapih (kg)
10.133
8.984
8.897
9.594
Rataan pertambahan bobot badan
(gr/ekor/hari)
136.667
110.914
108.495
119.074
PCR-SSCP
Visualisasi DNA hasil SSCP dari 88
sampel domba komposit menunjukkan adanya
keragaman tipe DNA (polimorfik). Tipe-tipe
DNA ini kemudian dikelompokkan menjadi
empat tipe berdasarkan bentuk pemisahan
rantai DNAnya yaitu W,X,Y, dan Z (Gambar
4).
Respon Bobot lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3.
Analisis dilakukan dengan uji statistik
model linier umum yaitu dengan tipe SSCP
sebagai peubah bebas serta tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan
bobot badan sebagai peubah terikat. Hasil
analisis disajikan dalam Tabel 2.
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA
Ukuran produk PCR sepanjang 610 pb
sesuai dengan sekuen DNA miostatin domba
dan sapi yang disimpan dalam GenBank
(www.ncbi.nlm.gov no. acc. AF266758 dan
AB076403).
Gambar 4
(A) Hasil elektroforesis produk PCR-SSCP
sample domba komposit sumatera, (B)
Interpretasi migrasi untai tunggal pita DNA
hasil elektroforesis produk PCR-SSCP.
Keterangan W, X, Y, dan Z = tipe SSCP.
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
pada gen
varian/keragaman pola tipe
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.615 % (W), 37.349 % (X), 37.349 %
(Y), dan 21.687% (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak). Menunjukkan bahwa
semua tipe W berjenis kelamin betina. Selain
itu, jika ditelusuri menurut induknya bapak
dan ibu berbangsa BC (Barbados x Croix)
memiliki anak yang semuanya bertipe Z.
Gambar 5 Sekuen gen miostatin ekson 3 gabungan dari
Ovis aries (domba) dan Bos taurus (sapi).
Sumber: www.ncbi.nlm.nih.gov
3
Tabel 1 Tampilan ternak domba komposit sumatera, BALITNAK, Bogor
Tipe Pita
Keterangan
W
X
Y
Jumlah sampel
3
31
31
Z
18
Frekuensi (%)
3.615
37.349
37.349
21.687
Rataan bobot lahir (kg)
1.933
2.329
2.387
2.450
Rataan bobot sapih (kg)
10.133
8.984
8.897
9.594
Rataan pertambahan bobot badan
(gr/ekor/hari)
136.667
110.914
108.495
119.074
PCR-SSCP
Visualisasi DNA hasil SSCP dari 88
sampel domba komposit menunjukkan adanya
keragaman tipe DNA (polimorfik). Tipe-tipe
DNA ini kemudian dikelompokkan menjadi
empat tipe berdasarkan bentuk pemisahan
rantai DNAnya yaitu W,X,Y, dan Z (Gambar
4).
Respon Bobot lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3.
Analisis dilakukan dengan uji statistik
model linier umum yaitu dengan tipe SSCP
sebagai peubah bebas serta tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan
bobot badan sebagai peubah terikat. Hasil
analisis disajikan dalam Tabel 2.
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA
Ukuran produk PCR sepanjang 610 pb
sesuai dengan sekuen DNA miostatin domba
dan sapi yang disimpan dalam GenBank
(www.ncbi.nlm.gov no. acc. AF266758 dan
AB076403).
Gambar 4
(A) Hasil elektroforesis produk PCR-SSCP
sample domba komposit sumatera, (B)
Interpretasi migrasi untai tunggal pita DNA
hasil elektroforesis produk PCR-SSCP.
Keterangan W, X, Y, dan Z = tipe SSCP.
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
pada gen
varian/keragaman pola tipe
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.615 % (W), 37.349 % (X), 37.349 %
(Y), dan 21.687% (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak). Menunjukkan bahwa
semua tipe W berjenis kelamin betina. Selain
itu, jika ditelusuri menurut induknya bapak
dan ibu berbangsa BC (Barbados x Croix)
memiliki anak yang semuanya bertipe Z.
Gambar 5 Sekuen gen miostatin ekson 3 gabungan dari
Ovis aries (domba) dan Bos taurus (sapi).
Sumber: www.ncbi.nlm.nih.gov
4
Tabel 2
Hasil analisis respon tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot
badan terhadap tipe SSCP
Peubah bebas
Tipe Kelahiran
Bobot Lahir
Bobot Sapih
Pertambahan bobot badan
Sumber
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
DB
3
79
82
3
79
82
3
79
82
3
79
82
PCR-RFLP
Pola yang sama pada hasil pemotongan
produk PCR menggunakan enzim restriksi
HaeIII dan MboI memberikan arti bahwa
sekuen DNA yang menjadi pengenal kedua
enzim tersebut sama pada semua sampel
domba yang dianalisis.
Eksplorasi berbagai situs enzim retsriksi
lain yang dilakukan dengan analisis homologi
dari berbagai sekuen gen miostatin yang
disimpan dalam Gen Bank tidak berpeluang
untuk bisa menemukan keragaman gen
miostatin
lebih
lanjut
(data
tidak
diperlihatkan). Selain itu, Cieslak et al. (2003)
melaporkan bahwa bagian ekson gen
miostatin pada selain sapi lebih terjaga dan
stabil. Untuk mencari varian gen miostatin
lebih lanjut dilakuan dengan metode deteksi
PCR-SSCP.
PCR-SSCP
Single-Strand
Conformation
Polymorphisms (SSCPs) adalah metode
elektroforesis
yang
populer
untuk
mengidentifikasi mutasi sekuen karena
mudah, murah dan memiliki sensitifitas tinggi
walau hanya satu nukleotida saja (Nataraj
1999) dapat mendeteksi polimorfisme dan
mutasi titik pada berbagai posisi dalam
fragmen DNA, meskipun mutasi yag terjadi
hanya pada satu basa. (Orita et al.1998).
Kesensitifitasan dari analsis SSCP merupakan
hal yang cukup sulit dalam teknik karena
sangat peka seperti kondisi elektroforesis,
sensitifitas dipengaruhi beberapa faktor
termasuk didalamnya tipe subtitusi basa,
panjang fragmen, sekuen basa, kandungan G
dan C dalam fragmen dan lokasi v
PADA DOMBA KOMPOSIT SUMATERA
ANDALUSIA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRAK
ANDALUSIA. Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera. Dibimbing oleh
ACHMAD FARAJALLAH dan BESS TIESNAMURTI.
Domba komposit sumatera merupakan bentuk silangan domba lokal ekor tipis Sumatera
(DETS) dengan domba St. Croix (SC) dan Barbados Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al. 2000). Miostatin atau growth differentiations factor 8
(GDF 8) merupakan anggota dari superfamili transforming growth factor-β (TGF-β) berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot (McPherron et al.1997). Mutasi gen miostatin dapat
mengganggu ekspresi dan aktifitasnya sehingga otot kerangka akan mengalami hipertropi ataupun
hiperplasia (pertumbuhan otot yang melebihi normal), hal ini dikenal dengan fenomena double
muscling. Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi secara alami dalam jangka waktu yang
panjang, sehingga menghasilkan varian-varian baru dari makhluk hidup tersebut. Hasil pencarian
varian gen miostatin pada domba komposit sumatera menggunakan dengan metode PCR-RFLP
dengan enzim restriksi Hae III dan Mbo I tidak menunjukkan adanya keragaman. Metode PCRSSCP menunjukkan adanya varian gen miostatin ekson 3 pada domba komposit dalam penelitian
ini yaitu W, X, Y, dan Z dengan frekuensi berturut-turut 3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, dan 21.69 %.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tipe SSCP gen miostatin ekson 3 tidak
nyata mempengaruhi tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot badan pada
domba komposit sumatera.
Kata-kata kunci: Domba komposit sumatera, miostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
ABSTRACT
ANDALUSIA. Exploring Myostatin Gene in Sumatera Composite Sheep. Under supervising of
ACHMAD FARAJALLAH and BESS TIESNAMURTI.
Sumatera composite sheep is a synthetic breed of Sumatera thin tail (STT) sheep with St.
Croix (SC) and Barbados Blackbelly (BB) with genetic constituent of 50% STT : 25% SC:
25%BB (Subandriyo et al. 2000). Myostatin or growth differentiations factor 8 (GDF 8) is a
member from super family transforming growth factor-β (TGF-β) act as a feedback negative that
controlling muscle growth (McPherron et al.1997). Mutation in myostatin gene interact with the
expression and activity of muscle growth. It can cause hypertrophy or hyperplasia (abnormally
muscle growth), known as double muscling. Naturally, mutation can occur in a long and slow
process that produce new variants. The result from exploring the myostatin gene in Sumatera
composite sheep by PCR-RFLP using Hae III and Mbo I restriction enzyme showed no differences
among the samples. PCR-SSCP methods showed four variants in myostatin gene reside at exon 3
of Sumatera composite sheep which are W, X, Y,and Z (3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, and 21.69 %,
respectively). SSCP types of myostatin gene exon 3 were not significantly influencing birth type.
It can be concluded that SSCP technique of myostatin gene at exon 3 did not significantly affect
(P>0.05) litter size, birth weight as well as average daily gain of Sumatera Composite Sheep.
Keywords: Sumatera composite sheep, myostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
3
PENCARIAN VARIAN GEN MIOSTATIN
PADA DOMBA KOMPOSIT SUMATERA
ANDALUSIA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
4
Judul Skripsi: Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera
Nama
: Andalusia
NRP
: G 34103059
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si
NIP 131878947
Dr. Ir. BessTiesnamurti
NIP 080063117
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS
NIP 131473999
Tanggal Lulus:
5
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat,
karunia, dan ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul
Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si dan Ibu Dr.
Ir. Bess Tiesnamurti selaku pembimbing serta seluruh staf Departemen Biologi, khususnya Staf
Zoologi yang telah bersedia memberikan bimbingan, fasilitas, saran dan masukkan dalam
penyelesaian karya ilmiah ini.
Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Mama, Daddy, dan Adik-adik:
Cordova dan Sevilla atas curahan doa, cinta, kasih sayang, dukungan dan pengertiannya yang tulus
selama ini. Tak lupa penulis ucapkan terimakasih kepada keluarga besar Agus MB dan Moechidin
serta teman-teman di Biologi 39, 40, 41, 42, Zoologiers, Malabar 8, SMU 6 Jakarta, FOSMA,
Teens, dan FKA ESQ 165 Bogor Raya, Bunda Gina, Bunda Wiwi, Bunda Noortje, Mba Fina dan
sahabat-sahabatku yang tak dapat disebutkan satu persatu. Terima kasih untuk hari-hari indah,
nasihat, spirit, motivasi dan perhatian yang selalu terjalin indah hingga saat ini.
Penulis menyadari bahwa karya tulis ini mungkin masih jauh dari sempurna. Oleh karena
itu saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan. Semoga karya ilmiah ini dapat
memberikan tambahan informasi dan bermanfaat bagi masyarakat pertanian, khususnya
peternakan.
Bogor, September 2007
Andalusia
6
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 12 Januari 1986 dari ayah Helmi Agus, SE dan
ibu Muji Lestari. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMU Negeri 6 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus
seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi
Biologi Jurusan biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada
tahun ajaran 2005/2006 dan 2006/2007, mata kuliah Ilmu Lingkungan dan Perkembangan Hewan
tahun ajaran 2005/2006, serta mata kuliah Struktur Hewan 2006/2007. Penulis juga aktif sebagai
pengurus Dewan Perwakilan Mahasiswa FMIPA IPB 2004/2005 sebagai anggota Komisi Minat
dan Bakat, pengurs Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) 2005/2006 sebagai ketua bidang
infokom serta pernah meraih predikat sebagai penyaji tingkat nasional pada Pekan Ilmiah
Mahasiswa Nasional XIX di Universitas Muhammadiyah Malang pada tahun 2006.
7
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL....................................................................................................................... vii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................................................. vii
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................................................
Tujuan ...................................................................................................................................
1
1
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu .................................................................................................................
Sampel DNA.........................................................................................................................
Amplifikasi DNA..................................................................................................................
Elektroforesis dan Visualisasi DNA .....................................................................................
PCR-RFLP ............................................................................................................................
PCR-SSCP ............................................................................................................................
Analisa Statistik ....................................................................................................................
1
1
1
2
2
2
2
HASIL
Amplifikasi DNA..................................................................................................................
PCR-RFLP ............................................................................................................................
PCR-SSCP ............................................................................................................................
Respon Bobot Lahir, Bobot Sapih, Pertambahan Bobot Badan dan Tipe Kelahiran
Terhadap Tipe SSCP Gen Miostatin Ekson 3 .......................................................................
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA..................................................................................................................
PCR-RFLP ............................................................................................................................
PCR-SSCP ............................................................................................................................
Respon Bobot Lahir, Bobot Sapih, Pertambahan Bobot Badan dan Tipe Kelahiran
Terhadap Tipe SSCP Gen Miostatin Ekson 3 .......................................................................
2
2
3
3
3
4
4
4
SIMPULAN ................................................................................................................................
5
SARAN........................................................................................................................................
5
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................
5
8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Tampilan Ternak Domba Komposit BALITNAK Bogor ........................................................... 3
2 Hasil Analisis Respon Tipe Kelahiran, Bobot Lahir, Bobot Sapih, Dan Pertambahan Bobot
Badan Terhadap Tipe SSCP............................................................................................. .......... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Hasil Amplifikasi Gen Miostatin Ekson 3........................................................................ ..........
2 Hasil Pemotongan Gen Miostatin Ekson 3 dengan Enzim Restriksi Hae III (A) Dan
Mbo I (B).......................................................................................................................... ..........
3 Hasil Elektroforesis Produk PCR-SSCP Sampel Domba Komposit Sumatera, (B)
Interpretasi Migrasi Untai Tunggal Pita DNA Hasil Elektroforesis Produk
PCR-SSCP ....................................................................................................................... ..........
4 Sekuen Gen Miostatin Ekson 3 Gabungan dari Ovis Aries (Domba) Dan
Bos Taurus (Sapi) ............................................................................................................ ..........
2
2
3
3
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba merupakan salah satu hewan
ternak populer di Indonesia setelah ayam, sapi
dan kambing. Domba lokal di Indonesia dapat
dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain
domba ekor tipis, domba ekor gemuk, domba
garut (Utoyo et al. 1996) dan domba sumatera
(Priyanto et al. 1999). Beberapa hasil silangan
antar jenis domba-domba tersebut banyak
ditemukan dalam rangka meningkatkan
kualitas produksi domba, misalnya laju
pertumbuhan yang cepat, kualitas karkas,
tahan penyakit dan sifat prolifik (kemampuan
beranak lebih banyak). Salah satu domba hasil
persilangan yang sengaja dirakit untuk
meningkatkan laju pertumbuhan adalah
domba komposit sumatera. Domba komposit
sumatera merupakan hasil silangan domba
lokal ekor tipis Sumatera (DETS) dengan
domba St. Croix (SC) dan Barbados
Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al.
2000).
Miostatin atau growth differentiations
factor 8 (GDF 8) merupakan anggota dari
superfamili transforming growth factor-β
(TGF-β) yang mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot kerangka. Cara kerja
miostatin dalam mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot adalah dengan menghambat
aktifitas miogenin. Miogenin yang tidak
bekerja menyebabkan mioblas tidak dapat
berdiferensiasi menjadi miotube. Miotube ini
nantinya akan berkembang menjadi serabut
otot. Dengan kata lain, miostatin berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot.
Miostatin diekspresikan oleh gen miostatin
yang pada sapi terdapat pada kromosom No. 2
(McPherron et al.1997). Pada sebagian besar
vertebrata, ekspresi gen miostatin terjadi
pascanatal (McNally 2004). Jika gen miostatin
mengalami mutasi yang mengganggu ekspresi
dan/atau aktifitasnya, maka otot kerangka
akan mengalami hipertropi (serabut otot
bertambah besar) ataupun hiperplasia (jumlah
serabut otot bertambah banyak). Fenomena
double muscling pada sapi Belgian Blue dan
Piedmontese adalah salah satu contoh mutasi
pada ekson ketiga gen miostatin sehingga otot
mengalami pertumbuhan yang melebihi
normal (McPherron et al.1997, Oldham et al.
2001). Walaupun jenis mutasi pada kedua sapi
diatas berbeda, mutasi keduanya ternyata
sama-sama mengganggu proses ekspresi gen
akibat bergesernya kodon stop.
Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi
secara alami dalam setiap gen dan dapat
menyebabkan perubahan fisiologis atau
morfologis yang semakin baik, semakin
buruk, bahkan tidak menyebabkan perubahan
sama sekali. Makhluk hidup yang mengalami
mutasi ini disebut mutan. Mutan yang dapat
bertahan hidup ini tentunya memiliki
perbedaan dalam susunan nukleotida basa
suatu gen sehingga di dalam populasi akan
ada banyak keragaman (varian) dari makhluk
hidup tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mencari varian gen
miostatin pada domba komposit sumatera.
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Januari sampai Juni 2007 di Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel DNA
Sampel DNA domba yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan koleksi DNA
dalam EtOH yang diekstraksi dari darah
domba komposit sumatera yang laju
pertumbuhannya sudah dikarakterisasi dengan
baik (koleksi Dr. Bess Tiesnamurti
BALITNAK Bogor yang disimpan di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
FMIPA IPB). Sampel yang tersedia berjumlah
89 sampel yang terdiri dari jenis M (komposit
sumatera) hasil persilangan antara DETS, SC
dan BB.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler.
Sepasang primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi ruas ekson ketiga gen
miostatin sebesar 610 pb mengikuti Tellgren
et al. (2004), yaitu M03-30f 5’ATGTGACATAAGCAAAAT GATTAG-3’
dan M03-33r 5’-CTTGTGCTTAAGTGAC
GTAG-3’. Sampel DNA domba komposit
dipindahkan ke dalam tabung PCR sebanyak
10-100 ng kemudian dicampur dengan
pereaksi PCR yang terdiri atas dNTP mix 320
pM, enzim taq polimerase 1 unit beserta
bufernya (NewEngland Biolabs) dan masingmasing primer forward dan reverse 1 nM.
Amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu
2
predenaturasi 92 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 4 menit, penempelan
primer pada suhu 51 oC selama 1 menit,
pemanjangan ruas target pada suhu 72 oC
selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada
72 oC selama 7 menit .
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Produk PCR diuji menggunakan PAGE
6% (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilanjutkan
dengan
pewarnaan
perak
mengikuti
Tegelstrom
(1986)
yang
dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998).
PCR-RFLP
Produk
PCR
kemudian
dipotong
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI
mengikuti
petunjuk
produsen
(NewEngland Biolabs). Pola pita hasil
pemotongan
enzim
restriksi
diuji
menggunakan PAGE 6% yang dilanjutkan
dengan pewarnaan perak.
PCR-SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan metode
pengendapan alkohol. Sebanyak 20 μl produk
PCR ditambah dengan 5M NaCl 2 μl dan
alkohol absolut 200 μl kemudian diinkubasi
semalaman dalam suhu -20 oC. Molekul DNA
diendapkan dengan sentrifuse selama 5 menit
pada kecepatan 8000 rpm. Endapan DNA
kemudian disuspensikan dengan
larutan
formamida 25 μl (formamida solution 80%,
EDTA 10 mM bromtimol blue 1 mg/mL, dan
xylene cyanol 1mg/mL) dan direndam dalam
water bath bersuhu 94 oC selama ± 10 menit
agar untai ganda DNA terpisah menjadi untai
tunggal (single strand). Setelah 10 menit
sampel dipindahkan dengan cepat ke dalam
ice bath selama ± 5 menit untuk mencegah
kedua untai yang sudah terpisah menyatu
kembali. Konformasi untai tunggal kemudian
diuji dengan PAGE 12% (akrilamid:bis
akrilamid = 59:1). Elektroforesis dijalankan
dengan kekuatan listrik sebesar 150 volt
selama 240 menit pada suhu konstan 4 oC.
Visualisasi dilakukan dengan pewarnaan
perak seperti pada visualisasi produk PCR.
yij
μ
ai
ε ij
= Variabel terikat (tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan
pertambahan bobot badan.)
= Rataan umum
= Variabel bebas (tipe pita DNA)
= Galat eror
HASIL
Amplifikasi DNA
Produk
PCR
hasil
amplifikasi
menggunakan primer M03-30 dan M03-33
mempunyai ukuran 610 pb (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen miostatin ekson 3.
Keterangan: M= marker 100 pb (Biorad),
kolom 1 – 4: produk PCR
PCR-RFLP
Hasil
pemotongan
produk
PCR
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI memberikan pola yang sama (Gambar 2
dan 3).
Gambar 2
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Hae III.
Keterangan: M= marker 100 pb
Gambar 3
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Mbo I.
Keterangan: M= marker 100 pb
Analisa statistik
Uji statistik dilakukan untuk melihat
keterpautan tipe gen dengan beberapa karakter
ternak
dengan
model
linier
umum
menggunakan program Minitab 14.
Model matematis yang diajukan adalah:
yij = μ + ai + ε i j
Keterangan:
3
Tabel 1 Tampilan ternak domba komposit sumatera, BALITNAK, Bogor
Tipe Pita
Keterangan
W
X
Y
Jumlah sampel
3
31
31
Z
18
Frekuensi (%)
3.615
37.349
37.349
21.687
Rataan bobot lahir (kg)
1.933
2.329
2.387
2.450
Rataan bobot sapih (kg)
10.133
8.984
8.897
9.594
Rataan pertambahan bobot badan
(gr/ekor/hari)
136.667
110.914
108.495
119.074
PCR-SSCP
Visualisasi DNA hasil SSCP dari 88
sampel domba komposit menunjukkan adanya
keragaman tipe DNA (polimorfik). Tipe-tipe
DNA ini kemudian dikelompokkan menjadi
empat tipe berdasarkan bentuk pemisahan
rantai DNAnya yaitu W,X,Y, dan Z (Gambar
4).
Respon Bobot lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3.
Analisis dilakukan dengan uji statistik
model linier umum yaitu dengan tipe SSCP
sebagai peubah bebas serta tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan
bobot badan sebagai peubah terikat. Hasil
analisis disajikan dalam Tabel 2.
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA
Ukuran produk PCR sepanjang 610 pb
sesuai dengan sekuen DNA miostatin domba
dan sapi yang disimpan dalam GenBank
(www.ncbi.nlm.gov no. acc. AF266758 dan
AB076403).
Gambar 4
(A) Hasil elektroforesis produk PCR-SSCP
sample domba komposit sumatera, (B)
Interpretasi migrasi untai tunggal pita DNA
hasil elektroforesis produk PCR-SSCP.
Keterangan W, X, Y, dan Z = tipe SSCP.
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
pada gen
varian/keragaman pola tipe
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.615 % (W), 37.349 % (X), 37.349 %
(Y), dan 21.687% (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak). Menunjukkan bahwa
semua tipe W berjenis kelamin betina. Selain
itu, jika ditelusuri menurut induknya bapak
dan ibu berbangsa BC (Barbados x Croix)
memiliki anak yang semuanya bertipe Z.
Gambar 5 Sekuen gen miostatin ekson 3 gabungan dari
Ovis aries (domba) dan Bos taurus (sapi).
Sumber: www.ncbi.nlm.nih.gov
4
Tabel 2
Hasil analisis respon tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot
badan terhadap tipe SSCP
Peubah bebas
Tipe Kelahiran
Bobot Lahir
Bobot Sapih
Pertambahan bobot badan
Sumber
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
DB
3
79
82
3
79
82
3
79
82
3
79
82
PCR-RFLP
Pola yang sama pada hasil pemotongan
produk PCR menggunakan enzim restriksi
HaeIII dan MboI memberikan arti bahwa
sekuen DNA yang menjadi pengenal kedua
enzim tersebut sama pada semua sampel
domba yang dianalisis.
Eksplorasi berbagai situs enzim retsriksi
lain yang dilakukan dengan analisis homologi
dari berbagai sekuen gen miostatin yang
disimpan dalam Gen Bank tidak berpeluang
untuk bisa menemukan keragaman gen
miostatin
lebih
lanjut
(data
tidak
diperlihatkan). Selain itu, Cieslak et al. (2003)
melaporkan bahwa bagian ekson gen
miostatin pada selain sapi lebih terjaga dan
stabil. Untuk mencari varian gen miostatin
lebih lanjut dilakuan dengan metode deteksi
PCR-SSCP.
PCR-SSCP
Single-Strand
Conformation
Polymorphisms (SSCPs) adalah metode
elektroforesis
yang
populer
untuk
mengidentifikasi mutasi sekuen karena
mudah, murah dan memiliki sensitifitas tinggi
walau hanya satu nukleotida saja (Nataraj
1999) dapat mendeteksi polimorfisme dan
mutasi titik pada berbagai posisi dalam
fragmen DNA, meskipun mutasi yag terjadi
hanya pada satu basa. (Orita et al.1998).
Kesensitifitasan dari analsis SSCP merupakan
hal yang cukup sulit dalam teknik karena
sangat peka seperti kondisi elektroforesis,
sensitifitas dipengaruhi beberapa faktor
termasuk didalamnya tipe subtitusi basa,
panjang fragmen, sekuen basa, kandungan G
dan C dalam fragmen dan lokasi variasi
sekuen, tidak ada teori yang tepat
memprediksi apakah SSCP dapat mendeteksi
mutasi tertentu (Highsmith et al. 1999).
JK
0.556
41.950
42.506
0.744
21.750
22.494
9.25
574.49
583.74
3102
146413
149515
KT
0.185
0.531
F
0.35
P
0.790
0.248
0.275
0.90
0.445
3.08
7.27
0.42
0.736
1034
1853
0.56
0.644
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
varian/keragaman pola tipe
pada gen
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.62 % (W), 37.35 % (X), 37.35 %
(Y), dan 21.69 % (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak) menunjukkan bahwa
semua tipe Z dan W berjenis kelamin betina.
Selain itu, semua tipe Z jika ditelusuri
menurut induknya berasal dari bapak dan ibu
berbangsa BC (Barbados x St.Croix).
Respon Bobot Lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3
Hasil analisis menunjukkan bahwa tipetipe SSCP gen miostatin ekson 3 yang
ditemukan dalam penelitian ini tidak terpaut
dengan tipe kelahiran, bobot lahir, bobot
sapih, dan pertambahan bobot badan.
Sebagaimana telah disampaikan oleh Cockett
et al. (2001) bahwa fenomena hipertropi otot
pada domba Texel terpaut dengan mutasi gen
miostatin dibagian promotor. Hal yang sama
juga ditemukan pada fenomena hipertropi
pada babi (Cieslak et al. 2003). Kelebihan otot
pada babi ditemukan sebagai konsekuensi dari
hipertropi otot, khususnya pada babi jenis
Pietrain dan Belgian Landrace, namun
perbedaan ciri-ciri karkas dan genotip
mengindikasikan bahwa mutasi ini tidak
memiliki pengaruh pada fungsi protein
miostatin dalam miogenesis. Walaupun
begitu, usaha-usaha pencarian varian gen tetap
harus bisa mencakup keseluruhan gen target
5
mulai dari promotor, intron dan ekson
(Dunner 2003).
SIMPULAN
Varian gen miostatin ekson 3 dengan
menggunakan metode PCR-RFLP dengan
enzim restriksi Hae III dan Mbo I tidak
menunjukkan adanya keragaman. Metode
PCR-SSCP menunjukkan adanya varian gen
miostatin ekson 3 pada domba komposit
dalam penelitian ini yaitu W, X, Y, dan Z
dengan frekuensi berturut-turut 3.62 %, 37.35
%, 37.35 %, dan 21.69 %. Berdasarkan hasil
penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tipe
SSCP gen miostatin ekson 3 tidak nyata
mempengaruhi tipe kelahiran, bobot lahir,
bobot sapih, dan pertambahan bobot badan
pada domba komposit sumatera.
SARAN
Pencarian varian gen miostatin yang lebih
luas perlu dilakukan pada populasi dombadomba lokal Indonesia sebagai manifestasi
dari proses adaptasi domba-omba tersebut di
wilayah tropis Indnesia.
Penelitian lebih lanjut terhadap varian gen
miostatin ekson 3 yang ditemukan dalam
penelitian ini perlu diverifikasi dengan
sekuensing. Selain itu, tipe-tipe yang
diperoleh dari penelitian tersebut bisa
digunakan untuk mendeteksi keterpautannya
dengan tipe kelahiran, bobot lahir, bobot
sapih, dan pertambahan bobot badan.
DAFTAR PUSTAKA
Cieslak D, Blicharsi T, Kapelanski W,
Pierzchala M. 2003. Investigation of
polymorphisms in the porcine myostatin
(GDF8; MSTN) gene. Czech J anim Sci
48(2):69-75.
Cockett NE, Shay TL, Smit M. 2001. Analysis
of the sheep genome [invited review].
Physiol Genomics 7:69-78.
Dunner et al. 2003. Haplotype diversity of the
myostatin gene among beef cattle breeds.
Genet Sel Evol 35: 103-118.
Farajallah A, Suryobroto B, Puntorini T.
1998. Analisis Keragaman Genetik dan
Filogeni Molekular Bangsa Kura-Kura
Air Tawar (Reptilia: Testudines) di
Indonesia Sebagai Dasar Pelestarian dan
Pemanfaatannya. Laporan Pelaksanaan
RUT V/1. Lembaga Penelitian dan
Pengabdian Pada Masyarakat Institut
Pertanian Bogor. Bogor: IPB.
Highsmith et al. 1999. Use of DNA toolbox
for the characterization of mutation
scanning methods. II: Evaluation of
single-strand conformation polymorphism
analysis. Electrophoresis 20:1195-1203.
McNally EM. 2004. Powerful genes –
myostatin regulation of human muscle
mass. N Engl J Med 350:2642-2644.
McPherron AC, Lee SJ. 1997. Double
muscling in cattle due to mutations in the
myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA
94:12457-12461.
Nataraj AJ, Glander IO, Kusukawa N.
Highsmith WE. 1999. Single-strand
conformation
polymorphism
and
heteroduplex analysis for gel-based
mutation
detection.
Electrophoresis
20:117-1185.
Oldham et al. 2001. Molecular expression of
myostatin and MyoD is greater in doublemuscled than normal-muscled cattle
fetuses. Am J Physiol Regulatory
Integrative Comp Physiol 280:1488-1493.
Orita M, Iwahana A, Kanazawa H, Hayashi K,
Sekiya
T.
1998.
Detection
of
polymorphisms of human DNA by gel
electrophoresis
as
single-strand
conformation polymorphisms. Proc Natl
Acad Sci USA 86:2766-2770.
Priyanto D, Siregar AR, Handiwirawan E,
Subandriyo. 1999. Karakter domba
introduksi dan pola konservasi domba
lokal sumatera di Sumatera Utara. Ilmu
Ternak dan Veteriner 5(1):12-22.
Subandriyo, Setiadi B, Handiwirawan E,
Suparyanto A. 2000. Performa domba
komposit hasil persilangan antara domba
lokal sumatera dengan domba rambut
pada kondisi dikandangkan. Ilmu Ternak
dan Veteriner 5(2):73-83.
Tegelstrom H. 1986. Mitokondrial DNA in
natural population: an improved routine
for screening of genetic variation based
on
sensitive
silver
staining.
Electrophoresis 7:226-229.
Tellgren A, Berglund A, Savolainen P, Janis
CM, Liberles DA. 2004. Myostatin rapid
sequence evolution in ruminants predates
domestication. Molecular Phylogenetics
and Evolution 33:782-790.
Utoyo DP, Djarsanto, Nasution SN. 1996.
Animal Genetic Resources and Domestic
Animal Diversity in Indonesia. Jakarta:
Ministry
of
Ariculture.
6
PENCARIAN VARIAN GEN MIOSTATIN
PADA DOMBA KOMPOSIT SUMATERA
ANDALUSIA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
2
ABSTRAK
ANDALUSIA. Pencarian Varian Gen Miostatin Pada Domba Komposit Sumatera. Dibimbing oleh
ACHMAD FARAJALLAH dan BESS TIESNAMURTI.
Domba komposit sumatera merupakan bentuk silangan domba lokal ekor tipis Sumatera
(DETS) dengan domba St. Croix (SC) dan Barbados Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al. 2000). Miostatin atau growth differentiations factor 8
(GDF 8) merupakan anggota dari superfamili transforming growth factor-ȕ (TGF-ȕ) berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot (McPherron et al.1997). Mutasi gen miostatin dapat
mengganggu ekspresi dan aktifitasnya sehingga otot kerangka akan mengalami hipertropi ataupun
hiperplasia (pertumbuhan otot yang melebihi normal), hal ini dikenal dengan fenomena double
muscling. Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi secara alami dalam jangka waktu yang
panjang, sehingga menghasilkan varian-varian baru dari makhluk hidup tersebut. Hasil pencarian
varian gen miostatin pada domba komposit sumatera menggunakan dengan metode PCR-RFLP
dengan enzim restriksi Hae III dan Mbo I tidak menunjukkan adanya keragaman. Metode PCRSSCP menunjukkan adanya varian gen miostatin ekson 3 pada domba komposit dalam penelitian
ini yaitu W, X, Y, dan Z dengan frekuensi berturut-turut 3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, dan 21.69 %.
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tipe SSCP gen miostatin ekson 3 tidak
nyata mempengaruhi tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot badan pada
domba komposit sumatera.
Kata-kata kunci: Domba komposit sumatera, miostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
ABSTRACT
ANDALUSIA. Exploring Myostatin Gene in Sumatera Composite Sheep. Under supervising of
ACHMAD FARAJALLAH and BESS TIESNAMURTI.
Sumatera composite sheep is a synthetic breed of Sumatera thin tail (STT) sheep with St.
Croix (SC) and Barbados Blackbelly (BB) with genetic constituent of 50% STT : 25% SC:
25%BB (Subandriyo et al. 2000). Myostatin or growth differentiations factor 8 (GDF 8) is a
member from super family transforming growth factor-ȕ (TGF-ȕ) act as a feedback negative that
controlling muscle growth (McPherron et al.1997). Mutation in myostatin gene interact with the
expression and activity of muscle growth. It can cause hypertrophy or hyperplasia (abnormally
muscle growth), known as double muscling. Naturally, mutation can occur in a long and slow
process that produce new variants. The result from exploring the myostatin gene in Sumatera
composite sheep by PCR-RFLP using Hae III and Mbo I restriction enzyme showed no differences
among the samples. PCR-SSCP methods showed four variants in myostatin gene reside at exon 3
of Sumatera composite sheep which are W, X, Y,and Z (3.62 %, 37.35 %, 37.35 %, and 21.69 %,
respectively). SSCP types of myostatin gene exon 3 were not significantly influencing birth type.
It can be concluded that SSCP technique of myostatin gene at exon 3 did not significantly affect
(P>0.05) litter size, birth weight as well as average daily gain of Sumatera Composite Sheep.
Keywords: Sumatera composite sheep, myostatin, PCR-RFLP, PCR-SSCP
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba merupakan salah satu hewan
ternak populer di Indonesia setelah ayam, sapi
dan kambing. Domba lokal di Indonesia dapat
dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain
domba ekor tipis, domba ekor gemuk, domba
garut (Utoyo et al. 1996) dan domba sumatera
(Priyanto et al. 1999). Beberapa hasil silangan
antar jenis domba-domba tersebut banyak
ditemukan dalam rangka meningkatkan
kualitas produksi domba, misalnya laju
pertumbuhan yang cepat, kualitas karkas,
tahan penyakit dan sifat prolifik (kemampuan
beranak lebih banyak). Salah satu domba hasil
persilangan yang sengaja dirakit untuk
meningkatkan laju pertumbuhan adalah
domba komposit sumatera. Domba komposit
sumatera merupakan hasil silangan domba
lokal ekor tipis Sumatera (DETS) dengan
domba St. Croix (SC) dan Barbados
Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al.
2000).
Miostatin atau growth differentiations
factor 8 (GDF 8) merupakan anggota dari
superfamili transforming growth factor-β
(TGF-β) yang mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot kerangka. Cara kerja
miostatin dalam mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot adalah dengan menghambat
aktifitas miogenin. Miogenin yang tidak
bekerja menyebabkan mioblas tidak dapat
berdiferensiasi menjadi miotube. Miotube ini
nantinya akan berkembang menjadi serabut
otot. Dengan kata lain, miostatin berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot.
Miostatin diekspresikan oleh gen miostatin
yang pada sapi terdapat pada kromosom No. 2
(McPherron et al.1997). Pada sebagian besar
vertebrata, ekspresi gen miostatin terjadi
pascanatal (McNally 2004). Jika gen miostatin
mengalami mutasi yang mengganggu ekspresi
dan/atau aktifitasnya, maka otot kerangka
akan mengalami hipertropi (serabut otot
bertambah besar) ataupun hiperplasia (jumlah
serabut otot bertambah banyak). Fenomena
double muscling pada sapi Belgian Blue dan
Piedmontese adalah salah satu contoh mutasi
pada ekson ketiga gen miostatin sehingga otot
mengalami pertumbuhan yang melebihi
normal (McPherron et al.1997, Oldham et al.
2001). Walaupun jenis mutasi pada kedua sapi
diatas berbeda, mutasi keduanya ternyata
sama-sama mengganggu proses ekspresi gen
akibat bergesernya kodon stop.
Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi
secara alami dalam setiap gen dan dapat
menyebabkan perubahan fisiologis atau
morfologis yang semakin baik, semakin
buruk, bahkan tidak menyebabkan perubahan
sama sekali. Makhluk hidup yang mengalami
mutasi ini disebut mutan. Mutan yang dapat
bertahan hidup ini tentunya memiliki
perbedaan dalam susunan nukleotida basa
suatu gen sehingga di dalam populasi akan
ada banyak keragaman (varian) dari makhluk
hidup tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mencari varian gen
miostatin pada domba komposit sumatera.
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Januari sampai Juni 2007 di Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel DNA
Sampel DNA domba yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan koleksi DNA
dalam EtOH yang diekstraksi dari darah
domba komposit sumatera yang laju
pertumbuhannya sudah dikarakterisasi dengan
baik (koleksi Dr. Bess Tiesnamurti
BALITNAK Bogor yang disimpan di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
FMIPA IPB). Sampel yang tersedia berjumlah
89 sampel yang terdiri dari jenis M (komposit
sumatera) hasil persilangan antara DETS, SC
dan BB.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler.
Sepasang primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi ruas ekson ketiga gen
miostatin sebesar 610 pb mengikuti Tellgren
et al. (2004), yaitu M03-30f 5’ATGTGACATAAGCAAAAT GATTAG-3’
dan M03-33r 5’-CTTGTGCTTAAGTGAC
GTAG-3’. Sampel DNA domba komposit
dipindahkan ke dalam tabung PCR sebanyak
10-100 ng kemudian dicampur dengan
pereaksi PCR yang terdiri atas dNTP mix 320
pM, enzim taq polimerase 1 unit beserta
bufernya (NewEngland Biolabs) dan masingmasing primer forward dan reverse 1 nM.
Amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Domba merupakan salah satu hewan
ternak populer di Indonesia setelah ayam, sapi
dan kambing. Domba lokal di Indonesia dapat
dibedakan menjadi beberapa jenis, antara lain
domba ekor tipis, domba ekor gemuk, domba
garut (Utoyo et al. 1996) dan domba sumatera
(Priyanto et al. 1999). Beberapa hasil silangan
antar jenis domba-domba tersebut banyak
ditemukan dalam rangka meningkatkan
kualitas produksi domba, misalnya laju
pertumbuhan yang cepat, kualitas karkas,
tahan penyakit dan sifat prolifik (kemampuan
beranak lebih banyak). Salah satu domba hasil
persilangan yang sengaja dirakit untuk
meningkatkan laju pertumbuhan adalah
domba komposit sumatera. Domba komposit
sumatera merupakan hasil silangan domba
lokal ekor tipis Sumatera (DETS) dengan
domba St. Croix (SC) dan Barbados
Blackbelly (BB) dengan komposisi 50%
DETS: 25% SC: 25%BB (Subandriyo et al.
2000).
Miostatin atau growth differentiations
factor 8 (GDF 8) merupakan anggota dari
superfamili transforming growth factor-β
(TGF-β) yang mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot kerangka. Cara kerja
miostatin dalam mengontrol pertumbuhan dan
diferensiasi otot adalah dengan menghambat
aktifitas miogenin. Miogenin yang tidak
bekerja menyebabkan mioblas tidak dapat
berdiferensiasi menjadi miotube. Miotube ini
nantinya akan berkembang menjadi serabut
otot. Dengan kata lain, miostatin berfungsi
sebagai pengontrol negatif pertumbuhan otot.
Miostatin diekspresikan oleh gen miostatin
yang pada sapi terdapat pada kromosom No. 2
(McPherron et al.1997). Pada sebagian besar
vertebrata, ekspresi gen miostatin terjadi
pascanatal (McNally 2004). Jika gen miostatin
mengalami mutasi yang mengganggu ekspresi
dan/atau aktifitasnya, maka otot kerangka
akan mengalami hipertropi (serabut otot
bertambah besar) ataupun hiperplasia (jumlah
serabut otot bertambah banyak). Fenomena
double muscling pada sapi Belgian Blue dan
Piedmontese adalah salah satu contoh mutasi
pada ekson ketiga gen miostatin sehingga otot
mengalami pertumbuhan yang melebihi
normal (McPherron et al.1997, Oldham et al.
2001). Walaupun jenis mutasi pada kedua sapi
diatas berbeda, mutasi keduanya ternyata
sama-sama mengganggu proses ekspresi gen
akibat bergesernya kodon stop.
Mutasi pada makhluk hidup dapat terjadi
secara alami dalam setiap gen dan dapat
menyebabkan perubahan fisiologis atau
morfologis yang semakin baik, semakin
buruk, bahkan tidak menyebabkan perubahan
sama sekali. Makhluk hidup yang mengalami
mutasi ini disebut mutan. Mutan yang dapat
bertahan hidup ini tentunya memiliki
perbedaan dalam susunan nukleotida basa
suatu gen sehingga di dalam populasi akan
ada banyak keragaman (varian) dari makhluk
hidup tersebut.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan mencari varian gen
miostatin pada domba komposit sumatera.
BAHAN DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
Januari sampai Juni 2007 di Laboratorium
Zoologi, Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor (FMIPA IPB).
Sampel DNA
Sampel DNA domba yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan koleksi DNA
dalam EtOH yang diekstraksi dari darah
domba komposit sumatera yang laju
pertumbuhannya sudah dikarakterisasi dengan
baik (koleksi Dr. Bess Tiesnamurti
BALITNAK Bogor yang disimpan di
Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi
FMIPA IPB). Sampel yang tersedia berjumlah
89 sampel yang terdiri dari jenis M (komposit
sumatera) hasil persilangan antara DETS, SC
dan BB.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA secara in vitro
menggunakan mesin TaKaRa Thermal Cycler.
Sepasang primer yang digunakan untuk
mengamplifikasi ruas ekson ketiga gen
miostatin sebesar 610 pb mengikuti Tellgren
et al. (2004), yaitu M03-30f 5’ATGTGACATAAGCAAAAT GATTAG-3’
dan M03-33r 5’-CTTGTGCTTAAGTGAC
GTAG-3’. Sampel DNA domba komposit
dipindahkan ke dalam tabung PCR sebanyak
10-100 ng kemudian dicampur dengan
pereaksi PCR yang terdiri atas dNTP mix 320
pM, enzim taq polimerase 1 unit beserta
bufernya (NewEngland Biolabs) dan masingmasing primer forward dan reverse 1 nM.
Amplifikasi dilakukan pada kondisi suhu
2
predenaturasi 92 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 4 menit, penempelan
primer pada suhu 51 oC selama 1 menit,
pemanjangan ruas target pada suhu 72 oC
selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada
72 oC selama 7 menit .
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Produk PCR diuji menggunakan PAGE
6% (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilanjutkan
dengan
pewarnaan
perak
mengikuti
Tegelstrom
(1986)
yang
dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998).
PCR-RFLP
Produk
PCR
kemudian
dipotong
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI
mengikuti
petunjuk
produsen
(NewEngland Biolabs). Pola pita hasil
pemotongan
enzim
restriksi
diuji
menggunakan PAGE 6% yang dilanjutkan
dengan pewarnaan perak.
PCR-SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan metode
pengendapan alkohol. Sebanyak 20 μl produk
PCR ditambah dengan 5M NaCl 2 μl dan
alkohol absolut 200 μl kemudian diinkubasi
semalaman dalam suhu -20 oC. Molekul DNA
diendapkan dengan sentrifuse selama 5 menit
pada kecepatan 8000 rpm. Endapan DNA
kemudian disuspensikan dengan
larutan
formamida 25 μl (formamida solution 80%,
EDTA 10 mM bromtimol blue 1 mg/mL, dan
xylene cyanol 1mg/mL) dan direndam dalam
water bath bersuhu 94 oC selama ± 10 menit
agar untai ganda DNA terpisah menjadi untai
tunggal (single strand). Setelah 10 menit
sampel dipindahkan dengan cepat ke dalam
ice bath selama ± 5 menit untuk mencegah
kedua untai yang sudah terpisah menyatu
kembali. Konformasi untai tunggal kemudian
diuji dengan PAGE 12% (akrilamid:bis
akrilamid = 59:1). Elektroforesis dijalankan
dengan kekuatan listrik sebesar 150 volt
selama 240 menit pada suhu konstan 4 oC.
Visualisasi dilakukan dengan pewarnaan
perak seperti pada visualisasi produk PCR.
yij
μ
ai
ε ij
= Variabel terikat (tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan
pertambahan bobot badan.)
= Rataan umum
= Variabel bebas (tipe pita DNA)
= Galat eror
HASIL
Amplifikasi DNA
Produk
PCR
hasil
amplifikasi
menggunakan primer M03-30 dan M03-33
mempunyai ukuran 610 pb (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen miostatin ekson 3.
Keterangan: M= marker 100 pb (Biorad),
kolom 1 – 4: produk PCR
PCR-RFLP
Hasil
pemotongan
produk
PCR
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI memberikan pola yang sama (Gambar 2
dan 3).
Gambar 2
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Hae III.
Keterangan: M= marker 100 pb
Gambar 3
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Mbo I.
Keterangan: M= marker 100 pb
Analisa statistik
Uji statistik dilakukan untuk melihat
keterpautan tipe gen dengan beberapa karakter
ternak
dengan
model
linier
umum
menggunakan program Minitab 14.
Model matematis yang diajukan adalah:
yij = μ + ai + ε i j
Keterangan:
2
predenaturasi 92 oC selama 10 menit,
denaturasi 94 oC selama 4 menit, penempelan
primer pada suhu 51 oC selama 1 menit,
pemanjangan ruas target pada suhu 72 oC
selama 2 menit, dan pemanjangan akhir pada
72 oC selama 7 menit .
Elektroforesis dan Visualisasi DNA
Produk PCR diuji menggunakan PAGE
6% (polyacrylamide gel electrophoresis) yang
dilanjutkan
dengan
pewarnaan
perak
mengikuti
Tegelstrom
(1986)
yang
dimodifikasi oleh Farajallah et al. (1998).
PCR-RFLP
Produk
PCR
kemudian
dipotong
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI
mengikuti
petunjuk
produsen
(NewEngland Biolabs). Pola pita hasil
pemotongan
enzim
restriksi
diuji
menggunakan PAGE 6% yang dilanjutkan
dengan pewarnaan perak.
PCR-SSCP
Produk PCR dimurnikan dengan metode
pengendapan alkohol. Sebanyak 20 μl produk
PCR ditambah dengan 5M NaCl 2 μl dan
alkohol absolut 200 μl kemudian diinkubasi
semalaman dalam suhu -20 oC. Molekul DNA
diendapkan dengan sentrifuse selama 5 menit
pada kecepatan 8000 rpm. Endapan DNA
kemudian disuspensikan dengan
larutan
formamida 25 μl (formamida solution 80%,
EDTA 10 mM bromtimol blue 1 mg/mL, dan
xylene cyanol 1mg/mL) dan direndam dalam
water bath bersuhu 94 oC selama ± 10 menit
agar untai ganda DNA terpisah menjadi untai
tunggal (single strand). Setelah 10 menit
sampel dipindahkan dengan cepat ke dalam
ice bath selama ± 5 menit untuk mencegah
kedua untai yang sudah terpisah menyatu
kembali. Konformasi untai tunggal kemudian
diuji dengan PAGE 12% (akrilamid:bis
akrilamid = 59:1). Elektroforesis dijalankan
dengan kekuatan listrik sebesar 150 volt
selama 240 menit pada suhu konstan 4 oC.
Visualisasi dilakukan dengan pewarnaan
perak seperti pada visualisasi produk PCR.
yij
μ
ai
ε ij
= Variabel terikat (tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan
pertambahan bobot badan.)
= Rataan umum
= Variabel bebas (tipe pita DNA)
= Galat eror
HASIL
Amplifikasi DNA
Produk
PCR
hasil
amplifikasi
menggunakan primer M03-30 dan M03-33
mempunyai ukuran 610 pb (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil amplifikasi gen miostatin ekson 3.
Keterangan: M= marker 100 pb (Biorad),
kolom 1 – 4: produk PCR
PCR-RFLP
Hasil
pemotongan
produk
PCR
menggunakan enzim restriksi HaeIII dan
MboI memberikan pola yang sama (Gambar 2
dan 3).
Gambar 2
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Hae III.
Keterangan: M= marker 100 pb
Gambar 3
Hasil pemotongan gen miostatin ekson
3 dengan enzim restriksi Mbo I.
Keterangan: M= marker 100 pb
Analisa statistik
Uji statistik dilakukan untuk melihat
keterpautan tipe gen dengan beberapa karakter
ternak
dengan
model
linier
umum
menggunakan program Minitab 14.
Model matematis yang diajukan adalah:
yij = μ + ai + ε i j
Keterangan:
3
Tabel 1 Tampilan ternak domba komposit sumatera, BALITNAK, Bogor
Tipe Pita
Keterangan
W
X
Y
Jumlah sampel
3
31
31
Z
18
Frekuensi (%)
3.615
37.349
37.349
21.687
Rataan bobot lahir (kg)
1.933
2.329
2.387
2.450
Rataan bobot sapih (kg)
10.133
8.984
8.897
9.594
Rataan pertambahan bobot badan
(gr/ekor/hari)
136.667
110.914
108.495
119.074
PCR-SSCP
Visualisasi DNA hasil SSCP dari 88
sampel domba komposit menunjukkan adanya
keragaman tipe DNA (polimorfik). Tipe-tipe
DNA ini kemudian dikelompokkan menjadi
empat tipe berdasarkan bentuk pemisahan
rantai DNAnya yaitu W,X,Y, dan Z (Gambar
4).
Respon Bobot lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3.
Analisis dilakukan dengan uji statistik
model linier umum yaitu dengan tipe SSCP
sebagai peubah bebas serta tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan
bobot badan sebagai peubah terikat. Hasil
analisis disajikan dalam Tabel 2.
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA
Ukuran produk PCR sepanjang 610 pb
sesuai dengan sekuen DNA miostatin domba
dan sapi yang disimpan dalam GenBank
(www.ncbi.nlm.gov no. acc. AF266758 dan
AB076403).
Gambar 4
(A) Hasil elektroforesis produk PCR-SSCP
sample domba komposit sumatera, (B)
Interpretasi migrasi untai tunggal pita DNA
hasil elektroforesis produk PCR-SSCP.
Keterangan W, X, Y, dan Z = tipe SSCP.
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
pada gen
varian/keragaman pola tipe
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.615 % (W), 37.349 % (X), 37.349 %
(Y), dan 21.687% (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak). Menunjukkan bahwa
semua tipe W berjenis kelamin betina. Selain
itu, jika ditelusuri menurut induknya bapak
dan ibu berbangsa BC (Barbados x Croix)
memiliki anak yang semuanya bertipe Z.
Gambar 5 Sekuen gen miostatin ekson 3 gabungan dari
Ovis aries (domba) dan Bos taurus (sapi).
Sumber: www.ncbi.nlm.nih.gov
3
Tabel 1 Tampilan ternak domba komposit sumatera, BALITNAK, Bogor
Tipe Pita
Keterangan
W
X
Y
Jumlah sampel
3
31
31
Z
18
Frekuensi (%)
3.615
37.349
37.349
21.687
Rataan bobot lahir (kg)
1.933
2.329
2.387
2.450
Rataan bobot sapih (kg)
10.133
8.984
8.897
9.594
Rataan pertambahan bobot badan
(gr/ekor/hari)
136.667
110.914
108.495
119.074
PCR-SSCP
Visualisasi DNA hasil SSCP dari 88
sampel domba komposit menunjukkan adanya
keragaman tipe DNA (polimorfik). Tipe-tipe
DNA ini kemudian dikelompokkan menjadi
empat tipe berdasarkan bentuk pemisahan
rantai DNAnya yaitu W,X,Y, dan Z (Gambar
4).
Respon Bobot lahir, Bobot Sapih,
Pertambahan Bobot Badan dan Tipe
Kelahiran Terhadap Tipe SSCP Gen
Miostatin Ekson 3.
Analisis dilakukan dengan uji statistik
model linier umum yaitu dengan tipe SSCP
sebagai peubah bebas serta tipe kelahiran,
bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan
bobot badan sebagai peubah terikat. Hasil
analisis disajikan dalam Tabel 2.
PEMBAHASAN
Amplifikasi DNA
Ukuran produk PCR sepanjang 610 pb
sesuai dengan sekuen DNA miostatin domba
dan sapi yang disimpan dalam GenBank
(www.ncbi.nlm.gov no. acc. AF266758 dan
AB076403).
Gambar 4
(A) Hasil elektroforesis produk PCR-SSCP
sample domba komposit sumatera, (B)
Interpretasi migrasi untai tunggal pita DNA
hasil elektroforesis produk PCR-SSCP.
Keterangan W, X, Y, dan Z = tipe SSCP.
Analisis SSCP memberikan hasil adanya
pada gen
varian/keragaman pola tipe
miostatin ekson 3 (polimorfik), keempat tipe
tersebut yaitu W=3 sampel, X=31 sampel,
Y=31 sampel, dan Z=18 sampel. Frekuensi
keempat pola tipe pita hasil SSCP tersebut
adalah 3.615 % (W), 37.349 % (X), 37.349 %
(Y), dan 21.687% (Z) (Tabel 1).
Perbandingan hasil SSCP ini dengan data
sekunder milik BALITNAK Bogor (Jenis,
Jenis kelamin, jenis domba komposit, bangsa
ibu, dan bangsa bapak). Menunjukkan bahwa
semua tipe W berjenis kelamin betina. Selain
itu, jika ditelusuri menurut induknya bapak
dan ibu berbangsa BC (Barbados x Croix)
memiliki anak yang semuanya bertipe Z.
Gambar 5 Sekuen gen miostatin ekson 3 gabungan dari
Ovis aries (domba) dan Bos taurus (sapi).
Sumber: www.ncbi.nlm.nih.gov
4
Tabel 2
Hasil analisis respon tipe kelahiran, bobot lahir, bobot sapih, dan pertambahan bobot
badan terhadap tipe SSCP
Peubah bebas
Tipe Kelahiran
Bobot Lahir
Bobot Sapih
Pertambahan bobot badan
Sumber
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
Tipe sscp
Error
Total
DB
3
79
82
3
79
82
3
79
82
3
79
82
PCR-RFLP
Pola yang sama pada hasil pemotongan
produk PCR menggunakan enzim restriksi
HaeIII dan MboI memberikan arti bahwa
sekuen DNA yang menjadi pengenal kedua
enzim tersebut sama pada semua sampel
domba yang dianalisis.
Eksplorasi berbagai situs enzim retsriksi
lain yang dilakukan dengan analisis homologi
dari berbagai sekuen gen miostatin yang
disimpan dalam Gen Bank tidak berpeluang
untuk bisa menemukan keragaman gen
miostatin
lebih
lanjut
(data
tidak
diperlihatkan). Selain itu, Cieslak et al. (2003)
melaporkan bahwa bagian ekson gen
miostatin pada selain sapi lebih terjaga dan
stabil. Untuk mencari varian gen miostatin
lebih lanjut dilakuan dengan metode deteksi
PCR-SSCP.
PCR-SSCP
Single-Strand
Conformation
Polymorphisms (SSCPs) adalah metode
elektroforesis
yang
populer
untuk
mengidentifikasi mutasi sekuen karena
mudah, murah dan memiliki sensitifitas tinggi
walau hanya satu nukleotida saja (Nataraj
1999) dapat mendeteksi polimorfisme dan
mutasi titik pada berbagai posisi dalam
fragmen DNA, meskipun mutasi yag terjadi
hanya pada satu basa. (Orita et al.1998).
Kesensitifitasan dari analsis SSCP merupakan
hal yang cukup sulit dalam teknik karena
sangat peka seperti kondisi elektroforesis,
sensitifitas dipengaruhi beberapa faktor
termasuk didalamnya tipe subtitusi basa,
panjang fragmen, sekuen basa, kandungan G
dan C dalam fragmen dan lokasi v