Optimation of Enzymatic Diacylglycerol Production from CPO with Continuous Systems

OPTIMASI PRODUKSI ENZIMATIS DIASILGLISEROL
DARI CPO DENGAN SISTEM KONTINU

SEPTIANY CHRISTIN PALILINGAN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Optimasi Produksi
Enzimatis Diasilgliserol dari CPO dengan Sistem Kontinu adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Tesis ini merupakan bagian dari
penelitian di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI).
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2013

Septiany C Palilingan
G851110091

RINGKASAN
SEPTIANY C PALILINGAN. Optimasi Produksi Enzimatis Diasilgliserol dari
CPO dengan Sistem Kontinu. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TRI PANJI.
Diasilgliserol (DAG) dikategorikan sebagai salah satu jenis minyak sehat
(healthy oil) yang telah dijadikan menu diet sehari-hari oleh masyarakat terutama
di Jepang. Selain itu, DAG telah dimanfaatkan sebagai emulsifier dan surfaktan
makanan serta digunakan dalam bidang farmasi dan kedokteran (Anggirasti et al.
2008; Noureddini et al. 2004). DAG dapat diproduksi dari Crude Palm Oil (CPO)
yang ketersediaannya melimpah di Indonesia. Namun produksi DAG di Indonesia
terkendala dengan tingginya harga lipase yang masih diimpor dari luar negeri.
Untuk mengatasi masalah tersebut, telah dilakukan penelitian produksi DAG
menggunakan ekstrak kasar lipase yang dihasilkan oleh jenis fungi lokal Rhyzopus
oryzae. Jenis fungi R. oryzae ini bersifat edible sehingga aman untuk
dimanfaatkan dalam produksi produk pangan seperti DAG. Penelitian ini
bertujuan untuk melakukan otomatisasi proses gliserolisis enzimatis dalam
produksi DAG yang dilakukan secara kontinu; menetapkan kondisi optimum
produksi DAG melalui gliserolisis kontinu meliputi variasi laju alir substrat

(CPO), waktu gliserolisis serta bentuk lipase untuk katalisasi proses gliserolisis;
serta menguji kinerja lipase dari fungi lokal R. oryzae dalam mengkatalisis proses
gliserolisis kontinu untuk produksi DAG.
Proses gliserolisis kontinu dilakukan dalam suatu bioreaktor dengan
mereaksikan gliserol dengan substrat CPO dalam pelarut heksana yang dialirkan
secara kontinu dengan pompa peristaltik dan dikatalisis oleh lipase yang terlarut
dalam buffer Tris-HCl. Lipase yang digunakan adalah dalam bentuk lipase bebas
(terlarut dalam buffer) dan lipase amobil (terjerap dalam zeolit). Proses gliserolisis
kontinu dilakukan dengan variasi laju alir substrat (CPO) 1 dan 3 mL/menit serta
variasi waktu gliserolisis tiap 3 jam selama 24 jam gliserolisis, yaitu jam ke-0, 3,
6, 9, 12, 15, 18, 21 dan 24.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa otomatisasi sistem proses gliserolisis
yang dirancang dalam penelitian ini berhasil dilakukan. Proses gliserolisis dapat
berjalan secara otomatis sehingga membuat proses tersebut dapat dilakukan
dengan lebih mudah, cepat dan efisien. Kondisi optimum produksi DAG melalui
gliserolisis kontinu terdapat pada laju alir CPO 3 mL/menit, waktu gliserolisis jam
ke-9 untuk gliserolisis dengan lipase bebas yaitu dua kali lipat lebih cepat dari
penelitian sebelumnya dengan sistem batch, dan waktu gliserolisis jam ke-21
untuk gliserolisis dengan lipase amobil, karena lipase amobil menunjukkan
kestabilan yang meningkat seiring dengan bertambahnya waktu gliserolisis

dibandingkan lipase bebas. Konversi produk DAG yang dapat dihasilkan sebesar
29 % untuk lipase bebas dan 33 % untuk lipase amobil. Dalam proses gliserolisis
kontinu juga dilakukan perlakuan penggantian substrat sebanyak 3 kali untuk
menguji kinerja lipase dalam mengkatalisis proses gliserolisis, dan teramati bahwa
lipase dari kapang lokal R. oryzae ini mampu mengkatalisis proses gliserolisis
baik reaksi hidrolisis ataupun esterifikasi untuk membentuk produk DAG.
Perlakuan penggantian substrat CPO sebanyak 3 kali ini, ternyata menyebabkan
terjadinya peningkatan konversi produk DAG hingga 37 %, hal ini diduga karena

adanya suplai/donor asil baru yang berasal dari setiap substrat CPO yang 3 kali
diganti dalam proses gliserolisis. Adanya penurunan kestabilan lipase amobil
setelah dipakai berulang sebanyak 3 kali, dapat disebabkan oleh beberapa faktor
antara lain lemahnya ikatan lipase-zeolit yang menyebabkan lipase terdesorpsi
dari zeolit, ketidakseimbangan sifat hidrofobik/hidrofilik zeolit, penggunaan
pelarut organik yang dapat merusak lipase, serta kurangnya kandungan buffer
dalam butiran zeolit.
Kata Kunci : diasilgliserol, gliserolisis kontinu, enzim lipase, CPO, Rhizopus
oryzae

SUMMARY

SEPTIANY C PALILINGAN. Optimation of Enzymatic Diacylglycerol
Production from CPO with Continuous Systems. Guided by I MADE ARTIKA
and TRI PANJI .
Diacylglycerol (DAG ) is categorized as one of the healthy oil types that has
been used in daily diet by the society, especially in Japan. In addition, the DAG
has been used as an emulsifier and surfactant in the food and in pharmaceutical
and medical fields (Anggirasti et al. 2008; Noureddini et al. 2004) . DAG can be
produced from Crude Palm Oil (CPO) that is abundantly produced in Indonesia.
However, DAG production in Indonesia is constrained by the high cost of lipase
that is still imported from abroad. To overcome this problem, research of DAG
production has been conducted using crude extract of lipase produced by
indigenous species of fungi Rhyzopus oryzae. The R. oryzae is edible indicating
that it is safe to be used in the production of food products such as DAG. This
study was aimed to automate the process of enzymatic glycerolysis in DAG
production carried out using continuous system; to establish optimum conditions
for DAG production through continuous glycerolysis which includes flow rate of
CPO, glycerolysis time and the form of lipase for catalyzing the glycerolysis
process; and to test the performance of lipase from indigenous fungi R. oryzae in
catalyzing glycerolysis using continuous process for the production of DAG.
The process of continuous glycerolysis was carried out in a bioreactor by

reacting glycerol with CPO substrate in a hexane solvent that flowed continuously
with a peristaltic pump and catalyzed by lipase dissolved in Tris-HCl buffer. The
lipase used was in the form of free lipase (dissolved in buffer) and immobilized
lipase (adsorbed in the zeolite). The process of continuous glycerolysis was
carried out with variations of substrate (CPO) flow rate, i.e 1 and 3 mL/min and
variations of glycerolysis time, using time increment of 3 hours for 24 hours.
The results showed that the designed automation system for glycerolysis
process was successful. The process of glycerolysis could run automatically,
making the process could be run more easily, quickly and efficiently. The
optimum conditions for continuous production of DAG via glycerolysis was
achieved at the CPO flow rate of 3 mL/min, glycerolysis time at the 9th hour with
free lipase which was two times faster than that from previous research with batch
systems, and at the 21th hour with immobilized lipase, possibly due to
immobilized lipase demonstrated increased stability during glycerolysis than free
lipase. Products conversion of DAG was 29 % with free lipase and 33 % with
immobilized lipase. In the process of continuous glycerolysis, substrate
replacement treatment was also carried out 3 times to observe the performance of
lipase in catalyzing the process of glycerolysis, and the results showed that lipase
from indigenous mold R. oryzae was able to catalyze the glycerolysis process in
hydrolysis or esterification reactions to form DAG products. This CPO substrate

replacement treatment for 3 times caused an increase in conversion of DAG
products to 37 %, it is suspected because of the new supply/acyl donor derived
from each CPO substrate that replaced 3 times in the process of glycerolysis. A
decrease in the stability of the immobilized lipase after 3 times repeated use, can

be caused by several factors such as the weak bond of lipase-zeolite which causes
desorption of lipase from zeolite, the imbalance of hydrophobic/hydrophilic
properties of zeolite, the use of organic solvents that can damage the lipase, and
the lack of buffer content in the zeolite granules.
Keywords : continuous glycerolysis, CPO, diacylglycerol, lipase, Rhizopus oryzae

@ Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

OPTIMASI PRODUKSI ENZIMATIS DIASILGLISEROL
DARI CPO DENGAN SISTEM KONTINU

SEPTIANY CHRISTIN PALILINGAN

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Judul PeneIitian

Optimasi Produksi Enzimatis Diasilgliserol dari CPO
dengan Sistem Kontinu

Nama

Septiany Christin PaIilingan

NIM

0851110091

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

-ｖｾｙＺｌｬＭ

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua

Dr Tri Panji, MS
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Tanggal Ujian : 23 September 2013

Tanggal Lulus:

J 0 SEP 2013

Judul Penelitian

: Optimasi Produksi Enzimatis Diasilgliserol dari CPO
dengan Sistem Kontinu

Nama

: Septiany Christin Palilingan

NIM

: G851110091

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Tri Panji, MS
Anggota

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian : 23 September 2013

Tanggal Lulus :

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan YME atas segala
penyertaan dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Optimasi
Produksi Diasilgliserol dari CPO dengan Sistem Kontinu” dapat diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada segala pihak yang telah
membantu selama proses penyusunan karya ilmiah ini, khususnya kepada
Bapak Dr Ir I Made Artika, MAppSc dan Bapak Dr Tri Panji, MS selaku
pembimbing dan kepada Ibu Prof Dr drh Maria Bintang, MS selaku penguji luar
komisi yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, ungkapan terima kasih
juga penulis sampaikan kepada semua staf pengajar dan teman-teman mahasiswa
di Biokimia IPB yang telah banyak membantu penulis selama perkuliahan, juga
kepada semua staf di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, untuk
segala bantuannya selama penulis melakukan penelitian. Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan
Indonesia yang telah memberikan bantuan dana dalam penelitian. Selain itu
ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada orang tua dan keluarga tercinta
atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2013
Septiany C Palilingan

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI

xiii

DAFTAR GAMBAR

xv

DAFTAR LAMPIRAN

xvi

PENDAHULUAN

1

Latar Belakang

1

Tujuan Penelitian

3

Hipotesis Penelitian

3

Manfaat Penelitian

3

METODE PENELITIAN

3

Waktu dan Tempat Penelitian

3

Alat dan Bahan

4

Metode Kerja

4

Produksi Enzim Kasar Lipase

4

Pengendapan dan Isolasi Enzim Lipase

4

Amobilisasi Enzim Lipase

4

Analisis Aktivitas Enzim Lipase

5

Optimasi Produksi DAG

5

Penentuan Kinerja Lipase Bebas dan Amobil

8

Analisis Produk Hasil Gliserolisis (TAG, DAG, MAG dan ALB)

9

HASIL DAN PEMBAHASAN
Spesifitas dan Aktivitas Lipase yang dihasilkan dari Rhyzopus oryzae
Optimasi Produksi DAG

9
9
13

Optimasi Produksi DAG dengan Gliserolisis Kontinu menggunakan
Lipase Bebas

14

Kinerja Lipase dalam Katalisasi Proses Gliserolisis Kontinu

21

Optimasi Produksi DAG dengan Gliserolisis Kontinu menggunakan
Lipase Amobil

24

Stabilitas Lipase Amobil

28

SIMPULAN DAN SARAN

30

DAFTAR PUSTAKA

31

xiv
LAMPIRAN

34

RIWAYAT HIDUP

41

DAFTAR GAMBAR
1.

Skema proses gliserolisis kontinu dengan lipase bebas

7

2.

Skema proses gliserolisis kontinu dengan lipase amobil

8

3.

Hasil hidrolisis TAG oleh aktivitas lipase non spesifik dan spesifik 1,3gliserida

11

4.

Rhizopus oryzae hasil isolasi dari tempe kedelai

12

5.

Lipase hasil isolasi dengan aseton

12

6.

Reaksi gliserolisis antara gliserol dengan TAG

14

7.

Optimasi produksi DAG melalui gliserolisis kontinu dengan variasi laju
alir substrat (CPO)

15

8.

Fraksi massa DAG dengan variasi waktu gliserolisis

17

9.

Reaksi hidrolisis TAG oleh lipase

18

10. Reaksi esterifikasi asam lemak dan gliserol oleh lipase

18

11. Perubahan fraksi massa produk TAG, DAG, MAG dan ALB dengan
variasi waktu gliserolisis dibandingkan kondisi awal

19

12. Laju konversi DAG dengan variasi waktu gliserolisis dibandingkan
dengan kondisi awal

20

13. Konversi DAG dengan variasi waktu gliserolisis dibandingkan dengan
kondisi awal

21

14. Perbandingan fraksi massa produk DAG selama 9 jam gliserolisis dengan
perlakuan penggantian substrat CPO sebanyak 3 kali

22

15. Perbandingan laju konversi DAG selama 9 jam gliserolisis dengan
perlakuan penggantian substrat CPO sebanyak 3 kali

23

16. Peningkatan nilai konversi DAG hasil gliserolisis kontinu dengan 3 kali
pergantian substrat CPO dibandingkan kandungan DAG awal

23

17. Perbandingan fraksi massa DAG antara gliserolisis dengan lipase amobil
dan lipase bebas dengan variasi waktu gliserolisis

25

18. Perbandingan perubahan fraksi massa DAG melalui gliserolisis dengan
lipase amobil dan lipase bebas dibandingkan dengan kondisi awal
masing-masing

26

xvi
19. Perbandingan laju konversi DAG antara gliserolisis dengan lipase amobil
dan lipase bebas dengan variasi waktu gliserolisis
20. Perbandingan

nilai

konversi

DAG

dalam

27
gliserolisis

kontinu

menggunakan lipase amobil dan lipase bebas

28

21. Stabilitas lipase amobil dalam gliserolisis kontinu dibandingkan dengan
lipase bebas dilihat dari aspek fraksi massa dan konversi produk DAG
yang dihasilkan

29

DAFTAR LAMPIRAN
1.

Diagram alir penelitian optimasi produksi DAG

34

2.

Uji aktivitas enzim lipase

35

3.

Komposisi produk DAG yang terbentuk melalui gliserolisis kontinu
dengan variasi laju alir substrat (CPO)

35

4.

Fraksi massa produk DAG dengan variasi waktu gliserolisis

36

5.

Perubahan fraksi massa produk TAG, DAG, MAG dan ALB
dibandingkan fraksi massa awal

36

6.

Laju konversi DAG dibandingkan dengan kondisi awal

37

7.

Nilai konversi fraksi massa produk DAG dibandingkan dengan fraksi
massa DAG awal

8.

Perbandingan komposisi massa produk DAG selama 9 jam gliserolisis
dengan perlakuan penggantian substrat CPO sebanyak 3 kali

9.

37

37

Perbandingan laju konversi pembentukan DAG selama 9 jam gliserolisis
dengan perlakuan penggantian substrat CPO sebanyak 3 kali

38

10. Peningkatan nilai konversi pembentukan DAG hasil gliserolisis kontinu
dengan 3 kali pergantian substrat CPO dibandingkan kandungan DAG
awal

38

11. Perbandingan fraksi massa DAG hasil gliserolisis kontinu dengan lipase
bebas dan lipase amobil

39

12. Perbandingan perubahan fraksi massa DAG antara lipase bebas dan
amobil dibandingkan dengan fraksi massa awalnya
13. Perbandingan laju konversi DAG antara lipase bebas dan amobil

39
39

xvii
14. Perbandingan nilai konversi DAG antara lipase bebas dan amobil ketika
dibandingkan dengan kandungan DAG awal

40

15. Perbandingan komposisi massa DAG antara lipase bebas dan amobil
dengan perlakuan penggantian substrat sebanyak 3 kali

40

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelapa sawit merupakan salah satu komoditi perkebunan yang berpotensi
besar untuk dikembangkan ke arah agroindustri karena beragam produk yang
dihasilkan bermanfaat dan bernilai ekonomis tinggi. Indonesia menjadi salah satu
negara produsen utama minyak kelapa sawit dunia karena setiap tahun luas areal
perkebunan kelapa sawit terus meningkat diiringi dengan peningkatan produksi
Crude Palm Oil (CPO) (Anggirasti et al. 2008). Produk olahan CPO yang
dikelompokkan secara khusus seperti specialty fats, confectionery fat, dan minyak
sehat (healthy oil) memiliki harga yang lebih tinggi dibandingkan dengan minyak
makan (cooking oil) atau shortening (Suharyanto et al. 2011).
Diasilgliserol (DAG) merupakan salah satu produk yang dapat dihasilkan
dari CPO. Minyak kaya DAG dapat digolongkan sebagai minyak sehat (healthy
oil). Pola hidup modern sekarang ini telah menjadi penyebab utama terjadinya
peningkatan kasus obesitas akibat tingkat konsumsi minyak makan di berbagai
negara yang tinggi. Hal tersebut dapat memicu timbulnya berbagai penyakit
degeneratif seperti jantung koroner, stroke, hiperkolesterolemia dan diabetes
melitus yang telah mendorong masyarakat untuk mengkonsumsi minyak sehat
seperti DAG (Yasunaga et al. 2001). Menurut Nagao et al. (2000); Murase et al.
(2001) dan Yuan et al. (2010), penyebab DAG dapat berfungsi sebagai minyak
sehat karena DAG dapat dimetabolisme secara efisien sebagai sumber energi,
sehingga dapat mencegah akumulasi lemak dalam tubuh (body fat). Selain itu
DAG juga dapat menurunkan kadar low density lipoprotein (LDL), trigliserida
(TG) dan inhibitor plasminogen. Di samping sebagai minyak sehat, campuran
DAG dengan monoasilgliserol (MAG) dapat digunakan sebagai surfaktan
(Anggirasti et al. 2008), emulsifier (Nuraeni 2008) dan bahan antimikroba
(Nuraida et al. 2008) yang telah banyak dimanfaatkan dalam industri pangan dan
farmasi. DAG dapat diproduksi secara kimiawi dengan proses gliserolisis sistem
batch dengan mereaksikan minyak atau lemak nabati dengan gliserol pada suhu
tinggi (240–260 °C) menggunakan katalis anorganik seperti natrium hidroksida,
kalium hidroksida atau kalsium hidroksida. Namun teknik tersebut memiliki
kelemahan, yaitu pemakaian energi yang tinggi, terbentuknya produk samping
hasil reaksi peroksidasi dan polimerisasi yang bersifat toksik bagi kesehatan
manusia serta produk yang diperoleh berwarna gelap (Elisabeth et al. 1999;
Noureddini et al. 2004). Selain itu proses gliserolisis pada suhu tinggi dapat
merusak kandungan senyawa-senyawa minor dalam CPO seperti tokoferol,
tokotrienol dan karoten (Suharyanto et al. 2011).
Untuk mengatasi kerusakan minyak dan senyawa minor dalam produksi
MAG dan DAG, Hasanuddin et al. (2003) telah mengembangkan proses etanolisis
pada suhu ruang. Pramana dan Mulyani (2007) juga telah melakukan proses
gliserolisis dengan katalis MgO dan pelarut Tert-butanol pada suhu 70-90 °C dan
dapat meningkatkan konversi produk hingga 97 %. Akan tetapi, proses
pemecahan ikatan ester pada minyak dengan proses kimia seperti ini tetap
memiliki kelemahan meskipun telah dicoba dilakukan pada suhu lebih rendah,
karena proses kimia berlangsung secara acak sehingga masih sulit untuk

2
memperoleh produk DAG yang murni dan terkontrol (Suharyanto et al. 2011).
Penggunaan CPO untuk produksi DAG memiliki keunggulan karena ketersediaan
CPO di Indonesia melimpah, kandungan asam lemak tak jenuh tunggal yang
tinggi serta mengandung nutrisi penting seperti β-karoten, vitamin E dan
tokotrienol (Suharyanto et al. 2011).
Alternatif lain dalam produksi DAG adalah dengan melakukan proses
gliserolisis secara enzimatik menggunakan lipase sebagai biokatalisator.
Pemanfaatan enzim lipase sebagai katalis memiliki beberapa keuntungan, yakni
spesifitas yang tinggi, kondisi operasional pada suhu dan tekanan yang rendah,
biaya pengolahan limbah yang murah dan produk yang dihasilkan lebih aman.
Lipase merupakan jenis enzim yang banyak ditemukan di alam, baik pada hewan,
tumbuhan maupun mikroorganisme. Sejumlah fungi seperti Penicillium sp,
Rhizopus sp dan Aspergillus niger dilaporkan aktif menghasilkan lipase dalam
substrat CPO (Ibrahim et al. 1991). Akan tetapi harga lipase komersial fungi yang
relatif mahal karena teknik produksi, ekstraksi dan isolasinya yang rumit sehingga
masih harus diimpor dari luar negeri (Elizabeth et al. 1999).
Untuk mengatasi masalah tersebut diperlukan suatu metode dalam
memproduksi lipase dengan murah. Salah satunya dapat dilakukan dengan
memfermentasikan mikroba tertentu yang mampu menghasilkan lipase.
Tri-Panji et al. (2008) telah melakukan fermentasi CPO dengan Neurospora
sitophila dan dilaporkan mampu memproduksi lipase spesifik 1,3-gliserida.
Kapang lokal jenis ini dikenal aman (edible) karena biasa digunakan dalam
pembuatan oncom merah. Kapang lokal lain yang juga aman adalah Rhizopus sp
yang dikenal sebagai jamur tempe kedelai. Perwitasari (2008) telah melakukan
optimasi produksi DAG dengan lipase dari Rhizopus oryzae melalui gliserolisis
dengan sistem batch, dan rendemen DAG yang didapatkan sebesar 20,76 %.
Melihat berbagai manfaat dari DAG dalam bidang kesehatan dan farmasi
serta potensi lipase yang dihasilkan dari jenis fungi lokal sebagai biokatalisator
dalam produksi DAG, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang
metode produksi DAG. Dalam penelitian ini produksi DAG dilakukan melalui
proses gliserolisis enzimatis yang dilakukan secara kontinu. Metode gliserolisis
enzimatis yang dilakukan dengan sistem kontinu dapat menjadi salah satu metode
alternatif yang dapat dikembangkan dalam skala industri. Hal tersebut disebabkan
karena sistem produksi yang banyak diterapkan dalam industri adalah sistem
kontinu, dimana sistem kontinu merupakan sistem produksi yang memungkinkan
suatu komponen umpan dialirkan dan diproses hingga diperoleh produk secara
berkesinambungan. Keuntungan sistem ini dibandingkan sistem batch adalah
kemudahannya dalam otomatisasi proses, penghematan wadah produksi serta
kecepatan proses (Suharyanto et al. 2006).
Oleh karena itu, pada penelitian ini telah dilakukan proses gliserolisis
enzimatis untuk biokonversi CPO menjadi DAG menggunakan biokatalis lipase
dari kapang lokal Rhizopus oryzae dengan sistem kontinu dalam suatu bioreaktor,
dimana substrat CPO dialirkan secara sinambung (kontinu) ke dalam bioreaktor
dengan bantuan pompa peristaltik. Lipase yang digunakan sebagai biokatalis
dalam proses gliserolisis kontinu ini dicobakan dalam dua bentuk berbeda, yaitu
lipase bebas yang terlarut dalam buffer dan lipase amobil yang terjerap dalam
butiran zeolit. Proses produksi DAG dengan gliserolisis kontinu ini diharapkan
dapat menciptakan otomatisasi proses sehingga produksi DAG dapat berlangsung

3
lebih cepat, mudah dan efisien serta diharapkan dapat menghasilkan produk DAG
yang optimal.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan otomatisasi proses gliserolisis
enzimatis dalam produksi DAG yang dilakukan secara kontinu; menetapkan
kondisi optimum produksi DAG melalui gliserolisis kontinu meliputi variasi laju
alir substrat CPO, waktu gliserolisis dan penggunaan bentuk lipase (bebas dan
amobil) untuk katalisasi proses gliserolisis serta menguji kinerja lipase (bebas dan
amobil) dari fungi lokal Rhizopus oryzae dalam mengkatalisis proses gliserolisis
kontinu untuk produksi DAG.

Hipotesis Penelitian
Proses produksi DAG melalui gliserolisis kontinu dapat dilakukan secara
otomatis, yang menyebabkan proses produksi menjadi lebih cepat, mudah dan
efisien; kandungan DAG dalam CPO dapat ditingkatkan dengan teknik
biokonversi enzimatis melalui gliserolisis kontinu; ekstrak kasar lipase dari isolat
lokal R. oryzae mampu mengkatalisis proses gliserolisis kontinu untuk produksi
DAG; stabilitas lipase amobil akan lebih baik dibandingkan lipase bebas.

Manfaat Penelitian
Dapat memberikan informasi tentang metode alternatif dalam produksi
DAG yang dapat dilakukan secara otomatis, dapat diperoleh produk DAG sebagai
minyak kesehatan dari CPO melalui biokonversi enzimatis yang relatif murah
serta dapat menambah nilai fungsi dari kemampuan fungi lokal dalam
memproduksi lipase sebagai biokatalis dalam produksi DAG.

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioproses Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), Jalan Taman Kencana No. 1 Bogor.
Penelitian dilaksanakan selama 8 bulan dimulai pada bulan Oktober 2012 sampai
Mei 2013.

4
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bioreaktor gliserolisis,
labu Erlenmeyer, shaker, chamber KLT (Kromatografi Lapis Tipis), autoklaf,
kertas pH, gelas piala, gelas ukur, corong Buchner, pompa vakum, pompa
peristaltik, centrifuge, oven, batang pengaduk, cawan petri, pipet tetes, labu ukur,
neraca analitik, inkubator, magnetic stirrer, freezer, pipet mikro, jarum ose,
bunsen, laminar air flow, buret dan peralatan lainnya.
Bahan-bahan yang dibutuhkan yaitu CPO; enzim lipase yang diproduksi
dari isolat R. oryzae; akuades; PDA, MgSO4, KH2PO4, pepton, gliserol, heksana,
buffer Tris-HCl, aseton, polivinil alkohol, buffer fosfat-sitrat, etanol, NaOH,
fenolftalein, petroleum benzene, dietil eter, asam asetat glasial, kristal iodin,
kertas HVS 80 g, lempeng KLT silika gel G-60, kertas saring Whatman No. 40,
alkohol 70%, aluminium foil dan bahan-bahan lainnya.

Metode Kerja
Produksi Enzim Kasar Lipase
Isolat kapang yang tumbuh dalam media agar kentang (PDA) diremajakan
kembali dengan diinokulasikan ke dalam media PDA baru, kemudian diinkubasi
pada suhu ruang (27-30 °C) selama 3-4 hari. Spora yang tumbuh dalam media
PDA diambil sebanyak 1 ose lalu diinokulasikan dalam @ 100 mL medium
fermentasi steril yang mengandung CPO 3 % dengan total volume sebanyak
500 mL dan diinkubasi pada suhu ruang (27-30 °C) selama 5 hari sambil digoyang
dengan kecepatan 75 rpm. Setelah dilakukan proses fermentasi, enzim yang
dihasilkan dipanen. Untuk memisahkan biomassa (spora) dengan filtrat dilakukan
penyaringan vakum dengan menggunakan kertas saring yang telah diketahui
bobot massanya. Biomassa sel dikeringkan dalam oven dengan suhu 60 °C hingga
bobotnya konstan dan dihitung biomassa sel keringnya sedangkan filtrat diambil
untuk dilakukan proses pengendapan dan isolasi enzim.
Pengendapan dan Isolasi Enzim Lipase
Pengendapan dan isolasi enzim lipase dari kapang R. oryzae dilakukan
menurut metode pengendapan enzim menggunakan aseton. Semua tahap
dikerjakan pada suhu 4 °C. Filtrat enzim kasar lipase yang diperoleh dari tahap
pemanenan enzim diendapkan proteinnya menggunakan aseton dingin dengan
perbandingan filtrat dan aseton 1 : 2 (v/v). Setelah itu disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Setiap endapan yang
diperoleh dilarutkan ke dalam 1 ml buffer Tris HCl 0,05 M pH 7 (Muderhwa dan
Ratomahenina 1985). Larutan enzim yang didapat, diambil 1-2 mL untuk diuji
aktivitasnya, sisanya disimpan untuk percobaan selanjutnya yaitu untuk proses
optimasi produksi DAG (gliserolisis dalam reaktor/kolom secara kontinu).
Amobilisasi Enzim Lipase (Apriyanti 2012)
Butiran zeolit berukuran 3-5 mm yang diperoleh dari pasaran sebelum
digunakan sebagai padatan pendukung dicuci dengan air sampai air cucian
tersebut jernih dan tidak keruh, kemudian zeolit direndam dalam larutan NaCl

5
1 M selama 12 jam dengan dua kali penggantian larutan perendam sambil
digoyang perlahan. Butiran zeolit kemudian diaktivasi dengan memanaskan di
dalam oven pada suhu 200 °C selama 15 menit. Amobilisasi lipase dilakukan
dengan cara merendam 200 g zeolit teraktivasi ke dalam 200 mL larutan enzim
dan dikocok pada kecepatan 180 rpm selama satu jam pada suhu ruang (25-30 °C),
kemudian cairan dipisahkan. Butiran zeolit yang telah mengamobilisasi enzim
digunakan untuk produksi DAG dalam proses gliserolisis kontinu.
Analisis Aktivitas Enzim Lipase
Penentuan aktivitas lipase dilakukan menurut Ibrahim et al. (1991), dimulai
dengan prosedur penentuan kadar asam lemak bebas dalam sampel seperti
berikut ini :
Penentuan kadar asam lemak bebas dilakukan dengan melarutkan 3 g CPO
dan 1 g polivinil alkohol ke dalam 40 mL buffer fosfat-sitrat pH 5 dan ditambah
dengan 1 mL larutan enzim. Sampel diinkubasi pada suhu kamar (25-30 °C)
selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 20 mL campuran
aseton : etanol (1 : 1 v/v). Kemudian sampel dititrasi menggunakan NaOH 1 N
menggunakan indikator fenolftalein hingga titik akhir berwarna merah muda.
Untuk blanko dilakukan prosedur yang sama tanpa perlakuan penambahan enzim.
Penentuan kadar asam lemak bebas dapat dihitung menggunakan persamaan
sebagai berikut :
Kadar asam lemak bebas

Aktivitas enzim lipase

:

:

-

Keterangan :
V
N NaOH
BM

= Volume NaOH yang terpakai saat titrasi
= Normalitas NaOH
= Berat molekul NaOH

Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang digunakan
untuk membebaskan 1 mol asam lemak bebas per menit (1 U = 1 mol FFA/menit).

Optimasi Produksi DAG
a.
Optimasi Produksi DAG melalui Gliserolisis Kontinu menggunakan Lipase
Bebas
Penentuan kondisi optimum produksi DAG diamati dalam medium
gliserolisis menggunakan sistem pengumpanan substrat yang dilakukan secara
kontinu. Proses gliserolisis dilakukan dalam suatu bioreaktor kaca berbentuk
tabung dengan panjang 46 cm dan diameter 8,5 cm, dengan volume total

6
± 2.500 mL. Komposisi medium gliserolisis untuk produksi DAG terdiri dari
gliserol, heksana, buffer tris-HCl dan CPO. Mappiratu (1999) telah melakukan
proses gliserolisis dengan sistem batch, dimana komposisi medium gliserolisisnya
terdiri dari 0,8 g gliserol, 40 mL heksana, 50 mL buffer tris-HCl 0,05 M pH 7 dan
2 g CPO. Komposisi yang lain telah dilakukan oleh Perwitasari (2008) dengan
melakukan optimasi jumlah substrat CPO dan jumlah heksana dalam medium
gliserolisis dan hasil optimasi jumlah heksana dan CPO untuk produksi DAG
masing-masing adalah 20 mL heksana dan 3 g CPO.
Berdasarkan hasil tersebut pada penelitian ini dilakukan proses gliserolisis
kontinu dengan komposisi campuran dalam medium adalah 0,8 g gliserol, 20 mL
heksana, 50 mL buffer tris-HCl dan 3 g CPO, dengan penambahan larutan enzim
sebanyak 10 µL. Berdasarkan komposisi komponen diatas, dilakukan perbesaran
30 kali (skala lab) untuk mengisi bioreaktor gliserolisis, yaitu 24 gram gliserol,
600 mL heksana, 1.500 mL buffer tris-HCl dan 90 g CPO. Selanjutnya
penambahan CPO dalam bioreaktor gliserolisis dilakukan secara sinambung
(kontinu) dan dialirkan masuk dari bagian bawah hingga ke bagian atas bioreaktor
(upward flow) dengan bantuan pompa peristaltik sambil reaktor terus diaduk
dengan stirrer pada kecepatan rendah (Gambar 1). Adanya pengadukan
dimaksudkan agar campuran komponen yang terdapat dalam bioreaktor
gliserolisis tetap homogen.
Proses gliserolisis kontinu dimulai dengan menentukan laju alir (flow rate)
(µ), dimana µ = jumlah volume substrat CPO yang dialirkan ke dalam reaktor
(mL) per satuan waktu (menit). Berdasarkan perhitungan tersebut telah ditentukan
laju alir substrat yang digunakan dan dilakukan optimasi laju alir substrat CPO
dalam proses gliserolisis kontinu, dan variasi laju alir substrat yang dicobakan
yaitu 1 mL/menit dan 3 mL/menit.
Kemudian dengan mengetahui laju alir substrat dalam proses diatas, maka
dapat diketahui waktu yang dibutuhkan untuk memproses “1 siklus” dari total
volume CPO yang digunakan, dimana total volume CPO yang dicobakan adalah
90 gram yang setara dengan 100 mL CPO, maka waktu untuk memproses
“1 siklus” gliserolisis adalah volume total substrat dibagi laju alir substrat. Dari
perhitungan tersebut ditentukan waktu untuk memproses “1 siklus” gliserolisis
yaitu ± 30 menit. Setelah diketahui waktu yang dibutuhkan untuk memproses
“1 siklus” gliserolisis tersebut, maka optimasi waktu gliserolisis dapat ditentukan
berdasarkan siklus yang dilakukan selama ± 24 jam dan variasi waktu gliserolisis
yang diamati dilakukan per beberapa siklus yaitu siklus ke-0, 6, 12, 18, 24, 30, 36,
42, 48 dan 51. Setelah proses gliserolisis dilakukan berdasarkan variasi waktu
gliserolisis tersebut, dilakukan pengambilan sampel untuk analisis produk DAG
dengan menggunakan metode KLT. Dengan dilakukannya analisis DAG hasil
gliserolisis tersebut, maka dapat diperoleh kondisi optimum waktu gliserolisis
kontinu.

7

(a)
(b)
Gambar 1. Skema proses gliserolisis kontinu dengan lipase bebas
Keterangan :

b.

a. µ = 1 mL/menit; b. µ = 3 mL/menit
(1) Sampel CPO (Sampling point); (2) Bioreaktor gliserolisis;
(3) Pompa peristaltik; (4) Pengaduk (Magnetic stirrer)

Optimasi Produksi DAG melalui Gliserolisis Kontinu menggunakan Lipase
Amobil
Proses optimasi produksi DAG dengan gliserolisis kontinu menggunakan
lipase amobil, memiliki prinsip yang hampir sama dengan gliserolisis kontinu
lipase bebas, bedanya adalah model enzim yang digunakan serta model
bioreaktornya. Dalam gliserolisis kontinu lipase amobil, bioreaktor yang
digunakan berupa kolom kaca dengan panjang 40 cm dan diameter 4 cm, dimana
lipase amobil yang terjerap dalam butiran zeolit dimasukkan sebanyak 200 g
dalam kolom/reaktor, tinggi zeolit yang terisi dalam kolom tersebut sepanjang
20 cm atau setengah dari total tinggi kolom. Perbandingan komposisi komponen
dalam gliserolisis kontinu ini dilakukan dengan perbesaran 30 kali (skala lab),
sama seperti prosedur gliserolisis kontinu lipase bebas diatas. Hal lain yang
membedakan dengan gliserolisis kontinu lipase bebas adalah komposisi
CPO 90 g, heksana 600 mL dan gliserol 24 g langsung dicampur dalam wadah
tersendiri sambil diaduk dengan pengaduk/stirrer kemudian dialirkan dengan
bantuan pompa peristaltik ke dalam kolom yang berisi zeolit yang mengandung
lipase amobil tersebut (Gambar 2). Proses gliserolisis kontinu ini dilakukan
dengan variasi waktu per 3 jam selama 24 jam gliserolisis, yaitu pada jam ke-0, 3,
6, 9, 12, 15, 18, 21 dan 24 jam. Tiap sampel produk dianalisis dengan metode
KLT.

8

Gambar 2.

Skema proses gliserolisis kontinu dengan lipase amobil

Keterangan :
1. Substrat (CPO + Heksana + Gliserol)/Sampling Point
2. Kolom yang berisi zeolit yang mengandung lipase amobil
3. Produk hasil gliserolisis kontinu
4. Pompa peristaltik
5. Magnetic stirrer
6. Statif dan klem
Penentuan Kinerja Lipase Bebas dan Amobil
Untuk menentukan kinerja lipase dalam mengkatalisis proses gliserolisis
kontinu, dilakukan perlakuan penggantian substrat CPO sebanyak 3 kali setiap
dilakukan proses gliserolisis kontinu selama 3 jam, sehingga proses keseluruhan
dilakukan selama 3x3 jam yaitu 9 jam untuk total proses gliserolisis kontinu.
Selanjutnya setiap 30 menit (1 siklus) selama 3 kali penggantian substrat CPO
dilakukan pengambilan sampel (3 µL) untuk dianalisis komponen produknya
dengan metode KLT. Metode gliserolisis kontinu untuk penentuan kinerja lipase
mengacu pada prosedur yang dilakukan pada tahap optimasi produksi DAG.
Untuk lipase amobil juga dilakukan prinsip yang sama seperti prosedur
diatas, yaitu selama proses gliserolisis kontinu berlangsung per 3 jam dilakukan
pergantian substrat tapi lipase amobil tetap dipertahankan (tidak diganti). Tujuan
pergantian substrat adalah untuk menguji stabilitas lipase amobil dalam
mengkatalisis proses gliserolisis ketika proses tersebut diasumsikan dilakukan
secara berulang sebanyak 3 kali.

9
Analisis Produk Hasil Gliserolisis (TAG, DAG, MAG dan ALB)
Fraksi masa komponen Triasilgliserol (TAG), DAG, MAG, dan asam lemak
bebas (ALB) dari reaksi gliserolisis kontinu dianalisis dengan metode KLT.
Lempeng yang digunakan adalah lempeng silika gel G-60. Sebanyak 3 µL sampel
ditotolkan sedikit demi sedikit ke dalam lempeng tersebut dan dielusikan dengan
campuran petroleum benzene : dietileter : asam asetat glasial (90:10:1 v/v).
Lempeng KLT yang sudah dielusikan dibiarkan mengering terlebih dahulu,
kemudian visualisasi noda dilakukan dengan menggunakan uap iodine. Kristal
iodine dituangkan ke dalam cawan petri hingga rata. Lempeng KLT yang sudah
kering diletakkan di atas cawan petri selama dua menit (hingga terlihat noda
cokelat). Noda yang terlihat langsung diberi tanda menggunakan pensil. Noda
yang terlihat dijiplak menggunakan kertas HVS 80 g lalu ditimbang berat/bobot
massanya. Fraksi masa komponen dihitung dengan persamaan sebagai berikut :

Setelah komponen TAG, DAG, MAG dan ALB dianalisis dengan metode
KLT, dapat ditentukan laju dan nilai konversi masing-masing komponen produk
tersebut dengan menggunakan persamaan sebagai berikut :
-

Laju konversi komponen (%/Jam) =
Nilai konversi komponen (%) =

-

HASIL DAN PEMBAHASAN
Spesifitas dan Aktivitas Lipase yang dihasilkan dari Rhyzopus oryzae
Rhizopus oryzae merupakan fungi yang termasuk dalam jenis kapang yang
banyak digunakan dalam proses pembuatan tempe kedelai. R. oryzae dipilih
karena kapang lokal jenis ini tidak bersifat toksik, mudah diperoleh,
pertumbuhannya relatif cepat, serta dapat menghasilkan enzim lipase yang bersifat
spesifik 1,3 gliserida. Spesifitas lipase dari R. oryzae yang bersifat spesifik 1,3
telah dilaporkan melalui penelitian yang dilakukan antara lain oleh Arini (2005);
Putranto et al. (2006); Perwitasari (2008) serta Suharyanto et al. (2011). Enzim
lipase dari R. oryzae yang bersifat spesifik dalam menghidrolisis TAG pada posisi
1,3 dapat pula dibuktikan dengan rumusan yang dikemukakan oleh Arini (2005)
dan Tri-Panji et al. (2008), yaitu suatu lipase akan bersifat spesifik 1,3 jika nilai
perbandingan DAG/TAG lebih besar dari ALB/TAG. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa nilai perbandingan DAG/TAG lebih besar dari ALB/TAG,
yaitu 0,24 > 0,06 (Tabel 1), sehingga dapat disimpulkan bahwa lipase yang
digunakan bersifat spesifik 1,3-gliserida. Kerja lipase yang spesifik 1,3 ini sangat
penting dalam penggunaannya untuk produksi DAG karena reaksi gliserolisis

10
enzimatis dapat dikendalikan dan tidak menghasilkan pemecahan total gliserida
menjadi ALB seperti yang biasa terjadi pada pemecahan secara non enzimatis
(kimiawi) (Tri-Panji et al. 2008).
Tabel 1. Hasil hidrolisis CPO dengan lipase dari R. oryzae
Gliserolisis
Kontinu
x
Rasio
DAG/TAG
Rasio
ALB/TAG
Kesimpulan

% TAG

% DAG

% MAG

% ALB

72,549

17,647

5,229

4,575

0,24
0,06
0,24 > 0,06
Lipase spesifik 1,3-gliserida

Ketika suatu lipase digolongkan berdasarkan sifat spesifitasnya dalam
menghidrolisis substrat, maka lipase tersebut dapat dibagi atas dua jenis, yaitu
lipase non spesifik dan lipase spesifik. Lipase non spesifik akan menghidrolisis
TAG pada ketiga posisi ikatan ester sehingga yang dihasilkan adalah asam-asam
lemak dan gliserol, sedangkan lipase spesifik akan menghidrolisis ikatan ester
pada posisi 1,3 sehingga produk yang terbentuk adalah asam-asam lemak, MAG
dan DAG (Suharyanto et al. 2011). Gambaran hasil hidrolisis TAG oleh lipase
non spesifik dan spesifik 1,3 dapat dilihat pada Gambar 3.

11

Gambar 3. Hasil hidrolisis TAG oleh aktivitas lipase non spesifik dan spesifik
1,3-gliserida
Dari Gambar 3 dapat dilihat bahwa hidrolisis TAG oleh aktivitas lipase
spesifik 1,3 hanya dapat menghasilkan produk DAG, yaitu 1,2(2,3)-DAG dan
ALB kemudian pemecahan DAG hanya dapat menghasilkan produk MAG, yaitu
2-MAG serta MAG yang terbentuk tidak dapat dipecah lagi menjadi asam lemak
dan gliserol. Pemecahan TAG hingga terbentuk asam lemak dan gliserol hanya
dapat dihasilkan dari pemecahan oleh lipase non spesifik.
Dalam penelitian ini, enzim lipase yang digunakan merupakan lipase yang
dihasilkan dari R. oryzae yang diisolasi dari tempe kedelai (Gambar 4). Isolasi
lipase yang dihasilkan dilakukan dengan pengendapan menggunakan aseton.
Pemilihan aseton untuk digunakan dalam mengisolasi lipase dikarenakan sifat
aseton sebagai pelarut yang mudah menguap sehingga setelah tahap isolasi enzim,
diharapkan sisa aseton dapat menguap sehingga yang tersisa hanya endapan
lipase, dan endapan yang diperoleh tersebut kemudian dilarutkan ke dalam larutan
buffer Tris-HCl. Selain itu menurut Su et al. (2007), aseton merupakan pelarut
polar yang dapat meningkatkan stabilitas lipase. Larutan lipase yang diperoleh
dalam bentuk ekstrak kasar, kemudian diuji aktivitas lipolitiknya sebelum
digunakan dalam proses optimasi produksi DAG.

12

Gambar 4.

Rhizopus oryzae hasil isolasi dari tempe kedelai

Dalam penelitian ini, ekstrak kasar lipase untuk mengkatalisis proses
produksi DAG, dibuat dalam dua bentuk berbeda, yaitu lipase bebas (lipase yang
terlarut dalam buffer Tris-HCl) dan lipase amobil (ekstrak lipase yang dijerap
dalam butiran zeolit) (Gambar 5). Aktivitas lipolitik lipase dapat ditentukan
dengan uji aktivitas enzim melalui uji kadar ALB yang terkandung dalam sampel
CPO setelah melalui proses pemecahan ikatan ester oleh lipase. Tingkat kadar
ALB yang terukur per satuan waktu dapat menentukan nilai aktivitas lipolitik dari
lipase tersebut. Dari hasil perhitungan, jumlah mol ALB/FFA (Free Fatty Acid)
yang terbentuk per menit pada kondisi percobaan, menunjukkan enzim ini
memiliki aktivitas lipolitik yang cukup baik, yaitu sebesar 1,091 mol ALB/menit
(1,091 U) (Lampiran 2).

(a)
Gambar 5.

(b)
Lipase hasil isolasi dengan aseton
(a) Lipase bebas; (b) Lipase amobil

13
Optimasi Produksi DAG
Otomatisasi Proses Gliserolisis
Proses gliserolisis enzimatis yang dilakukan secara kontinu dalam penelitian
ini, dimaksudkan untuk melakukan otomatisasi proses produksi DAG. Pengertian
gliserolisis sendiri adalah suatu reaksi penting antara gliserol dengan
minyak/lemak untuk menghasilkan produk MAG dan DAG (Kimmel 2004)
(Gambar 6). Salah satu faktor penting pada proses gliserolisis adalah kelarutan
atau kontak antara TAG dan gliserol (Cheirshilp et al. 2007; Susi 2010), karena
alasan tersebut maka dalam penelitian ini digunakan heksana sebagai pelarut
organik. Dipilihnya heksana sebagai pelarut organik karena heksana merupakan
pelarut yang dapat melarutkan substrat CPO; membantu dalam meningkatkan
rendemen produk DAG serta dapat meningkatkan kelarutan minyak dan gliserol
dalam proses gliserolisis, sehingga proses gliserolisis dapat berlangsung lebih
optimal (Nuraeni 2008). Adanya penambahan heksana dapat membuat kandungan
TAG pada CPO berkurang. Hal ini dikarenakan heksana adalah pelarut non polar
dan TAG dalam CPO dapat terlarut di dalamnya, karena TAG lebih bersifat non
polar daripada DAG dan MAG, membuat TAG dapat terpisah dari DAG dan
MAG. Selain itu, penggunaan pelarut heksana memiliki bau yang tidak tajam
sehingga tidak mengganggu nilai organoleptik produk akhir yang dihasilkan (Susi
2010).
Suatu reaksi gliserolisis akan berjalan lambat jika dilakukan tanpa
menggunakan katalis, dimana penambahan katalis ini berguna untuk mempercepat
reaksi. Katalis yang digunakan dalam penelitian ini seperti yang telah disebutkan
sebelumnya adalah enzim lipase. Keistimewaan dari enzim lipase adalah mampu
mentransformasikan air ke dalam substrat CPO yang tak larut air. Produk antara
yang dihasilkan mempunyai sifat sebagai zat aktif permukaan atau penurun
tegangan permukaan yang lebih baik dari TAG (Brockman 1984).
Reaksi gliserolisis antara gliserol dan TAG dapat dilihat pada Gambar 6.
Dari Gambar 6 dapat dilihat bahwa proses gliserolisis dapat terjadi secara dua
arah dan dapat melibatkan reaksi antara gliserol dengan TAG dan DAG juga
reaksi antara TAG dengan MAG untuk membentuk produk DAG dan MAG.
Dalam penelitian ini, rancangan proses gliserolisis yang dilakukan secara
kontinu untuk otomatisasi proses produksi DAG diamati dapat berjalan dengan
baik, sehingga sistem tersebut telah berhasil diterapkan dalam skala lab. Hal ini
dibuktikan dengan proses gliserolisis yang dapat berjalan secara otomatis sesuai
tujuan awal, tanpa menimbulkan kendala teknis yang berarti. Dengan adanya
otomatisasi proses tersebut, diharapkan proses gliserolisis kontinu untuk produksi
DAG dapat berlangsung dengan lebih cepat, mudah dan efisien. Hal tersebut
terbukti dari komposisi produk DAG yang terbentuk dapat mencapai kondisi
optimum dengan waktu yang lebih cepat. Selain itu sistem otomatisasi tersebut
terbukti dapat memudahkan proses produksi DAG, karena melalui sistem ini tidak
diperlukan lagi banyak wadah ataupun penggantian wadah produksi seperti pada
proses batch, karena proses tersebut hanya menggunakan satu bioreaktor dan
proses gliserolisis kontinu untuk produksi DAG dapat dijalankan secara otomatis,
mulai dari pengaliran substrat CPO hingga terbentuk produk otomatis dilakukan
dengan bantuan pompa peristaltik. Hal ini dapat memperkecil keterlibatan tenaga

14
manusia, dan menjadi suatu metode alternatif yang dapat dikembangkan dalam
skala industri.

Gambar 6.

Reaksi gliserolisis antara gliserol dengan TAG

Optimasi Produksi DAG dengan Gliserolisis Kontinu menggunakan Lipase
Bebas
Optimasi Laju Alir CPO
Proses optimasi produksi DAG melalui gliserolisis kontinu dimulai dengan
menentukan laju alir (µ) substrat (CPO) yang optimum. Variasi laju alir CPO
yang dicobakan, yaitu 1 dan 3 mL/menit dimana yang dimaksudkan dengan laju
alir CPO adalah laju alir yang dilakukan oleh pompa peristaltik dalam
mengalirkan substrat CPO atau produknya masuk dan atau keluar dari bioreaktor
gliserolisis. Laju alir 1 mL/menit didapatkan dengan menentukan berapa banyak
volume (mL) CPO yang mampu dialirkan oleh pompa peristaltik selama 5 menit,
hasilnya tercatat sebanyak 5 mL CPO habis dialirkan oleh pompa peristaltik
selama 5 menit sehingga ketika 5 mL dibagi dengan 5 menit didapatkan nilai laju
alir 1 mL/menit, dimana untuk laju alir 1 mL/menit digunakan bantuan selang
sebanyak 1 jalur sedangkan untuk laju alir 3 mL/menit, banyaknya volume (mL)
CPO yang dapat dialirkan adalah sebanyak 3 kali lipatnya sehingga jalur selang
yang digunakan adalah 3 jalur (Gambar 1).
Penentuan laju alir substrat dalam gliserolisis kontinu, dimaksudkan untuk
mengetahui pengaruh kecepatan pengaliran substrat dalam bioreaktor gliserolisis
terhadap pembentukan komposisi produk DAG. Waktu gliserolisis yang
dicobakan meliputi pengamatan pada jam ke-0, 4, 18, 21 dan 24 jam. Analisis
komponen produk yang terbentuk dengan metode KLT dapat menentukan laju alir
CPO yang optimal (Gambar 7). Data pada Gambar 7 menunjukkan optimasi
produksi DAG melalui gliserolisis kontinu dengan variasi laju alir substrat (CPO).

15

a. Perbandingan fraksi massa produk DAG
hasil gliserolisis kontinu dengan variasi
laju alir CPO

b. Perbandingan perubahan fraksi massa
produk DAG hasil gliserolisis kontinu
dengan variasi laju alir CPO

c. Perbandingan laju konversi produk DAG d. Perbandingan konversi produk DAG
hasil gliserolisis kontinu dengan variasi laju
hasil gliserolisis kontinu dengan variasi
alir CPO
laju alir CPO

Gambar 7.

Optimasi produksi DAG melalui gliserolisis kontinu dengan
variasi laju alir substrat (CPO) ditinjau dari (a) fraksi massa; (b)
perubahan fraksi massa; (c) laju konversi dan (d) nilai konversi
produk DAG ketika dibandingkan dengan kondisi awal masingmasing.

Dari Gambar 7 dapat dilihat bahwa komposisi produk DAG baik ditinjau
dari fraksi massa dan perubahannya serta laju konversi dan nilai konversinya
menunjukkan bahwa laju alir 3 mL/menit cenderung lebih baik dibandingkan laju
alir 1 mL/menit. Hal ini diduga karena adanya hubungan antara kecepatan alir
substrat (CPO) dengan pembentukan komposisi produk DAG. Adanya laju alir
substrat yang lebih cepat menyebabkan proses kerja lipase dalam mengkatalisis
pembentukan produk DAG baik melalui hidrolisis TAG maupun esterifikasi ALB
dengan gliserol menjadi lebih cepat serta terjadi kontak antara enzim dengan
substrat yang lebih banyak, karena substrat yang dibutuhkan enzim lipase untuk
membentuk produk disuplai/diumpan dengan jalur aliran selang yang lebih

16
banyak (3 jalur) ke dalam bioreaktor gliserolisis, sehingga ada kecenderungan
bahwa semakin besar laju alir substrat akan semakin tinggi pula komposisi massa
produknya. Dari hasil tersebut dipilih laju alir substrat yang optimum adalah
3 mL/menit.
Optimasi Waktu Gliserolisis
Setelah didapatkan laju alir substrat (CPO) optimum yaitu 3 mL/menit,
penelitian dilanjutkan dengan melakukan gliserolisis kontinu dengan variasi
waktu gliserolisis yaitu pada siklus ke-0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 dan 51. Satu
siklus setara dengan waktu yang dibutuhkan untuk mengalirkan total substrat CPO
yang digunakan ke dalam bioreaktor gliserolisis sampai terbentuk produk, yaitu
± 30 menit. Hal ini merupakan waktu total yang dibutuhkan ketika substrat CPO
dialirkan melalui selang dari bagian bawah bioreaktor yang kemudian mengalir
naik ke atas (upward flow) sampai terbentuk produk yang terkumpul pada bagian
atas bioreaktor gliserolisis.
Gambar 8 menunjukkan fraksi massa produk DAG yang terbentuk selama
proses gliserolisis dengan variasi waktu gliserolisis. Data pada Gambar 8
menunjukkan bahwa produk DAG mencapai nilai tertinggi pada siklus ke-18,
kemudian mengalami penurunan pada siklus ke-24 dan cenderung naik secara
perlahan hingga siklus ke-42 dan terus menurun hingga siklus-siklus terakhir.
Adanya kecenderungan ketidakstabilan dalam persentase perubahan fraksi massa
DAG, dapat disebabkan karena adanya ketidakstabilan enzim lipase ketika
digunakan dalam bentuk larutan. Ketika enzim lipase berada dalam bentuk
campuran larutan bersama substrat dan produknya (sistem emulsi), maka enzim
lipase sangat sulit untuk dipisahkan dari campuran tersebut sehingga ketika
pompa peristaltik mengalirkan dan menghisap kembali substrat/produk hasil
gliserolisis ke dalam bioreaktor/sampling point, maka kemungkinan ada bagian
enzim yang ikut terbawa sehingga diduga hal ini yang dapat mempengaruhi
komposisi massa produk DAG yang dihasilkan. Akan tetapi terlepas dari hal
tersebut, dapat dilihat bahwa produk DAG mencapai nilai optimum pada waktu
gliserolisis siklus ke-18, dimana ketika satu siklus gliserolisis membutuhkan
waktu ± 30 menit, maka untuk siklus ke-18 setara dengan 9 jam, sehingga waktu
gliserolisis optimum yang terpilih adalah pada siklus ke-18 (jam ke-9). Hasil
tersebut menunjukkan waktu gliserolisis untuk produksi DAG ini dua kali lipat
lebih cepat dibandingkan dengan yang dilaporkan Perwitasari (2008)
menggunakan lipase dari R. oryzae yang sama yaitu 18 jam da