Analisis Protease Aspergillus oryzae dengan Elektoforesis Gel Poliakrilamid

Olek

TIEAI TIER TAMOJO
F 25. 1160

5 9 9 2

FAKULTAS

TEKNOLOGI

INSTlTUT PERTANIAN
B O G O R

PERTAM14M

BOGQR

Tien Tien Tanojo. F25.1160. Analisis protease Aspergillus
oryzae dengan elektroforesis gel poliakrilamid. Di bawah
bimbingan : Maggy T. Suhartono.

RINGKASAN

Penelitian ini terdiri dari 4 tahap yang meliputi
isolasi kapang proteolitik, produksi, dan pemurnian
protease yang dihasilkan, serta analisis berat molekul
protease tersebut.

Kapang diisolasi dari tahap ke 2 dalam

fermentasi kecap Zebra, Bogor, yaitu fermentasi garam/
fase moromi.

Dari hasil identifikasi yang dilakukan, yang

dikonfirmasikan dengari Laboratorium Mikologi, Jurusan
Biologi, IPB, kapang yang diisolasi adalah Aspergillus
oryzae.

Isolat

A. oryzae tersebut terbukti bersifat

proteolitik baik pada media SMA ataupun media fermentasi
yang dipergunakan.
Protease diproduksi pada media campuran dedak dan
tepung kedelai (7 : 3, w/w) yang disuplementasikan dengan
KH2P04.
fermentasi

Ekstrak protease kasar diperoleh dari media
dengan larutan Tween 80.

Aktivitas

kasar tersebut adalah 0,2 IU/mg protein.

protease

Uji aktivitas

protease dilakukan berdasarkan hidrolisis k a s e i n
(Bergmeyer, 1983).

Jumlah protein didasarkan pada

pengikatan zat pewarna (Bradford, 1976).

Pemurnian yang

dilakukan adalah berturut-turut pengendapan dengan
ammonium sulfat (70%, w/v) dan pengendapan dengan 100%
aseton (v/v), yang masing-masing meningkatkan aktivitas
protease menjadi 0,5 IU/mg protein, dan 1,2 IU/mg protein.
Pemisahan protease dengan

kromatografi filtrasi gel pada

kolom Sephadex G-100 menghasilkan 2 puncak protein dan 2
puncak protease.

Kedua jenis protease tersebut mempunyai

aktivitas 1,5 IU/mg protein dan 2,4 IU/mg protein, dengan
kemurnian

7,8 dan 12,3 kali enzim kasar.

Elektroforesis dilakukan sesuai dengan metode yang
dipergunakan Laemmli (1970), dengan konsentrasi akrilamid
10%.

Jumlah sampel yang diaplikasikan 30

-

40 pg.

Pada

konsentrasi tersebut protease A. oryzae dapat diwarnai
dengan pewarnaan Coomassie dan pewarnaan Ag, tetapi tidak
dengan pewarnaan Cu.

Berat molekul protease diestimasi

dengan SDS-PAGE, dengan pewarnaan Coomassie.

~ntuk

menentukan pita protease dilakukan pewarnaan spesifik
berdasarkan hidrolisis kasein.

Hasil yang diperoleh

adalah 2 macam protease yang mempunyai BM 105.300 Da dan
27.800 Da, yang diduga adalah
protease asam.

protease netral dan

ANALISIS PRWEASE Aspergillus oryzue DENGAN
ELEKTROFORE'IS GEL POLIAKRILAMKD

Oleh
TIEN TIEN TANOJO
F 25.1160

SKRKI'SI
Sehagai salah salu syarat unluk rncmperolch gclar
SARJANA TEKNOLOGI PEIUANIAN
pada JURIJSAN TEKNOLOGI I'ANCiAN DAN CilZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PEKI'ANIAN
KNSTITOT I'EKI'ANIAN BOGOR

1992
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR
IZAKIJLTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
ANALISIS PROTEASE Aspergilluv oryzue DENGAN
ELEKTROFORESIS GEL 1'OLIAKIIILAMID
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Oleh
TIEN TIEN TANOJO
F 25.1160

Dilahirkan pada tanggal 6 Desember 1969
di Surabaya
Tiriggal lulus : 8 Desernber 1992
Disetujui,
Boeor. 18 Desernber 1992

KATA

Puji,
luar biasa.
penulis

hormat

PENGANTAR

dan kemuliaan bagi Tuhan,

Karena hanya oleh kasih dan

dapat

menyelesaikan

Allah

yang

penyertaan-Nya,

penelitian

dan

penyusunan

hasil

penelitian

skripsi ini.
Tulisan
tentang

ini

berdasarkan

"~nalisisprotease Aspergillus oryzae dengan

poliakrilamid",
Mikroba

disusun

dan

yang

telah dilakukan di

Lab.

~ i o k i m i a ,PAU Bioteknologi IPB,

gel

Teknologi
dari

bulan

~ p r i lsampai dengan bulan Oktober 1992.
~ e n u l i smengucapkan terima kasih yang tulus
1.

Dr.

Ir.

Maggy T. Suhartono,

yang

telah

kepada :

membimbing

penulis selama penelitian dan penyusunan skripsi.
2.

Dr.
yang

Ir.

Srikandi Fardiaz dan Ir.

berkenan

menjadi

dosen

Sutrisno

Koswara,

penguji

dan

membantu

Zebra,

Bogor,

menyempurnakan tu1i:;an ini.
3.

Pimpinan

Perusahaan

Kecap

yang

mengijinkan penulis mengambil sampel.
4.

Veralin,
Filosa,

Witono,
Eni,

Wirjanto,

Ika, dan Ujang,

Daniel,
yang

Lily,

banyak

Handi,
membantu

penulis selama berlangsungnya penelitian.
5.

Saudara-saudara penulis di Kopelkhu pada khususnya dan
PMK

pada umumnya, serta di "MUSASHI",

doa dan bantuan yang diberikan.

atas

dukungan

Penulis
sempurna,

menyadari bahwa tulisan ini masih jauh

tetapi

penulis

berharap

tulisan

ini

dimanfaatkan oleh semua pihak' yang membutuhkannya.
IMMANUEL !

Bogor, 14 Desember 1992

Penulis

dari
dapat

DAFTAR IS1

Halaman

....................................... i
. vi
Daftar Gambar ....................................
Daftar Tabel ......................................... vii
Daftar Lampiran ...................................... viii
I . PENDAHULUAN....................................
1
Kata Pengantar

.
B.
A

LATAR BELAKANG

.............................

.....................................
I1 . TINJAUAN PUSTAKA ...............................
A . PROTEASE...................................
1 . Definisi dan Klasifikasi ................
TUJUAN

2

B

.

. Sumber dan Peranan......................

PROTEASE Aspergillus oryzae

................

..............................
D . PEMURNIAN PROTEASE DARI ASPERGILLUS ........
E . TEXNIK ELEKTROFORESIS DI DALAM ANALISIS
ENZIM ......................................
1 . Elektroforesis..........................
C

.

PEMURNIAN ENZIM

1
4
5

5

5
6
7

10
12

13
13

. Elektroforasis Gel Poliakrilamid........
3 . PAGE dengan Sodium Dodesil Sulfat .......
4. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi .........

20

. Pewarnaan Protein.......................

22

2

5

5.1.

Pewarnaaan Coomassie

5.2.

~ewarnaanCu

..................

..........................

16

19

23
24

Xalaman

..........................
....................
5.4. Pewarnaan ~pesifik
6. ~nalisisXasil Elektroforesis...........
I11. METODE PENELITIAN..............................
A . BAHAN DAN ALAT .............................
1 . Bahan ...................................
2 . Alat ....................................
B . METODE PENELITIAN..........................
1 . ISOLASI XAPANG PROTEOLITIK..............
5.3.

2

Pewarnaan Ag

. PRODUXSI PlZOTEASE.......................
a . Penyiapiin Media Fermentasi...........

. Pembuatan Inokulum dan Inokulasi.....
c . Ekstraksi............................
d . Pengukuran Jumlah Protein............
e . Pengujinn Aktivitas Protease.........

b

3

. PEMURNIAN PROTEASE......................
a . Pengendapan dengan Ammonium Sulfat ...
. Dialisis.............................
c . Pengendapan dengan Aseton ............
d . Pemisahan dengan Sephadex G-lo0 ......

b

4

.................
Pewarnaan Coomassie...................
Pewarnaan cu ..........................
Pewarnaan Ag ..........................

. ELEKTROFORESIS

4.1.
4.2.
4.3.

PROTEASE

25
25
27
29
29
29

30
30
30

31
31
32
32
33
33
36
36
38
38
38
39
39
40
40

Halaman
IV

.

HASIL DAN PEMBAHAGAN
A

.

...........................

42

.................

42

......

49

ISOLASI KAPANG PROTEOLITIK

B

.

PEMURNIAN PROTEASE Aspergillus oryzae

C

.

ELEKTROFORESIS PROTEASE Aspergillus

..................................... 5 8
1 . Uji Metode Pewarnaan ..................... 58
2 . Uji Aktifitas Proteolitik ...............
61
3 . Estimasi Berat Molekul Protease ......... 63
oryzae

V

VI

.
.

.........................
A . KESIMPULAN .................................
B . SARAN .....................................

69

.................................

70

KESIMPULAN

DAN

DAFTAR PUSTAKA

SARAN

68
68

DAFTAR GAMBAR

Halaman
Gambar

1

.

Cara pembuatan kurva standar untuk

Gambar

..............................
2 . Penetapan jumlah protein .................
3 . Prosedur pernurnian protease ..............
4 . Pembuatan kecap di pabrik kecap Zebra ....
5 . Fermentasi garam .........................
6 . substrat fermentasi garam ................
7 . Hasil isolasi kapang proteolitik .........

Gambar

8

estimasi BM

Gambar
Gambar
Gambar
Gambar
Gambar

.

9

.

...................................

45

46

48

Profil

pemisahan

protease Aspergillus

.............

56

.....................

59

oryzae dengan Sephadex 6-100

Gambar 12

Uji metode pewarnaan

Gambar

Perbandingan pewarnaan Coomassie dengan

.............................
14 . Uji aktivitas proteolitik ................
pewarnaan Ag

.

44

.......

Gambar

Gambar 15

43

47

Uji proteolitik Aspergillus oryzae

Gambar

42

...................................

Gambar 10

.
13 .

37

Deskripsi mikroskopik Aspergillus
oryzae

.
11 .

33

Deskripsi makroskopik Aspergillus
oryzae

Gambar

28

Penentuan Bl4 protease

....................

60

62
66

DAFTAR TABEL

Halaman

...............

Tabel 1.

Pengujian aktivitas protease

Tabel 2.

Pemurnian protease Aspergillus oryzae......

Tabel 3.

Pengendapan burtahap protease dengan Ammonium

35
50

sulfat...................................

53

Tabel 4.

Penentuan BM protease Aspergillus oryzae...

66

Tabel 5.

Perbandingan dengan protease Aspergillus
lainnya

....................................

67

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

.
2.
3.
4.
5.

Lampiran 1
Lampiran
Lampiran
Lampiran
Lampiran

...........
Seperangkat Alat Elektroforesis .........
Kurva Standar Tirosin ...................
Kurva Standar Bovine Serum Albumin ......
Seperangkat Alat Kromatografi

76

77
78

Kurva Standar Protein Standar untuk
Penentuan Berat Molekul

.
7.

75

.................

Lampiran 6

Xunci Identifikasi Spesies Aspergillus

l am pi ran

Pembuatan ~ e r e a k s iUji ~ k t i v i t a s

..

................................
Elektroforesis Gel Poliakrilamid ........
Protease

viii

79
80

82
83

Enzim
yang

merupakan salah satu produk

dewasa

ini bnnyak dimanfaatkan

bioteknologi

dalam

cabang ilmu pengetahuan dan industri.

berbagai

Beberapa bi.dang

ilmu yang berhubungan dengan enzim diantaranya
kedokteran,

pertanian, pangan dan lain-lain.

industri

yang

industri

penyamakan

detergen,

pemanis

farmasi

adalah

memanfaatkan
kulit,

aktivitas
roti,

enzim

bir,

bukan tebu, keju,

Sedang
adalah

sari

buah,

fotografi,

dan

.

Dengan berkembangnya industri-industri

tersebut

di Indonesia, maka lcebutuhan enzim dari tahun k e tahun
makin

bertambah.

Sayangnya, sampai saat ini

seluruh

kebutuhan enzim Indonesia masih disuplai dari

negara-

negara lain.

Dari data statistik diketahui bahwa pada

tahun 1990, impor enzim Indonesia dari berbagai negara
mencapai

34.811.625

sedang

tahun

kg atau

$

51.970.458,

kg

atau

mengingat

bahwa

sebenarnya Indonesia mempunyai potensi sebagai

negara

$ 61.645.720

Hal

ini

berikutnya

sebesar

39.333.411

(BPS, 1991).
patut

disayangkan,

Sejak dulu bangsa

penghasil

enzim.

menguasai

teknologi fermentasi

untuk memproduksi makanan

dan

Indonesia

telah

mempergunakannya

tradisional

seperti tempe,

oncom,

kecap,

banyaknya

tauco, dan lain-lain.

mikroorgnnisme

dan bahan

Di

samping

baku

itu

fermentasi

juga merupakan potensi untuk memproduksi enzim.
Mikroba

yang

dapat

memproduksi

protease

licheniformis,

5.

Asperqillus

dimanfaatkan

diantaranya

untuk
Bacillus

:;tearothermophillus, Mucor

oryzae, dan A. niger.

Diantara

miehei,
mikroba-

mikroba tersebut, pcnggunaan kapang sebagai

penghasil

protease

masih belum banyak dikembanykan.

Pemakaian

protease Bacillus dunia sudah mencapai 500

tonltahun,

sedang protease kapilng 11 ton/tahun (Aunstrup,
oleh

sebab

itu pengembangan dan

penelitian

1980).

tentang

protease kapang masih sangat dibutuhkan.
Da lam
kapang

penelitian

proteolitik,

ini

yaitu

dilakukan
oryzae.

A.

Kapang

merupakan kapang utama pada pembuatan kecap.
yang diproduksi oleh kapang ini dimurnikan
molekulnya diperkirnkan dengan SDS
Penyempurnaan
pemurniannya

dari

meliputi

PAGE.

pengembangan

Pada dasarnya

pengendapan

merubah

berat

dan

industri

Penelitian tentang pemurnian protease

dilakukan.

elektroforesis.
dengan

dan

A. oryzae dan spesies Aspergillus lainnya

banyak

ini

Protease

teknik-teknik produksi enzim

sangat mendukung

biokatalisator.

-

isolasi

protein,

pemurnian

pH

atau

kekuatan

tersebut

kromatograf i

Pengendapan protein dapat
ion,

telah

dan

dilakukan

menambahkan

larutan

atau

mendenaturasi
untuk

polimer

protein.

organik,
Sedang

atau

metode

pemurnian meliputi kromatoyrafi

dengan

kromatografi
gel

filtrasi,

affinitas, penukar ion, dan adsorbsi.
Teknik elektroforesis umumnya dipergunakan dalam
tahap

pemurnian lanjut, untuk karakterisasi

misalnya

untuk

estimasi

berat

protein,

molekul,

isoelektrik,

uji

kemurnian,

dan

Elektroforesis

juqo merupakan metode analisis

sifat enzim yang telah dimurnikan.
teknik

titik

lain-lain.
sifat-

Ada bermacam-macam

elektroforesis, tetapi yang paling baik

memisahkan

protein

poliakrilamid.
protein

adalah

elektroforesis

Elektroforesis ini

berdasarkan

ukuran

dapat

yang

untuk
gel

memisahkan

seragam

dan

menghasilkan resolusi yang baik.
Pewarnaan protein yang telah terpisah diperlukan
untuk

menampilkan

banyak

pewarna

dipergunakan.
berbeda

pita-pita protein
dan

metode

pewarnaan

Interaksi antara

untuk

sensitifitasnya

protein
pun

yang

tidak

tersebut.
yang

pewarna-pewarna
berbeda,

sama.

Ada
dapat
ini

sehingga

Pewarnaan

Ag

dinyatakan 100 kali lebih sensitif dibanding pewarnaan
Coomassie.
dipergunakan

Sampai
untuk

saat

ini,

mendeteksi

pewarna
hasil

protein adalah Coomassie Brilliant Blue.

yang

umum

elektroforesis

11. TINJAUAN PUSTAKA

A.

PROTEASE
1. Definisi dan Klafisikasi

Protease

adalah

enzim

proteolitik

merupakan

biokatalisator

protein.

Berdasarkan reaksi yang

enzim

untuk

reaksi

substrat

dengan

hidrolisisnya,

menghidrolisis
besar

atau

yaitu

protein

air.

berdasarkan

proteinase

menjadi

polipeptida

mengkatalis

pertolongan

Protease dapat dibagi menjadi 2 macam,
cara

pemecahan

dikatalisisnya,

ini tergolong hidrolase, karena

pemecahan

dan

Yang

fragmen-fragmen
peptidase

menghidrolisis fragmen-£ragmen polipeptida
asam-asam

amino.

Protease

biasanya

mempunyai

dari

campuran

yang

yang
menjadi

mikroorganisme

keduanya

(casida,

1968).

Protease,

menurut

diklasifikasikan

dalam

eksopeptidase

dan

eksopeptidase

dapat

Winarno
2

golongan

besar,

endopeptidase.
dibagi

dapat

(1986),

yaitu

Golongan

lagi

menjadi

karboksipeptidase dan aminopeptidase yang berturutturut

memotong peptida dari arah

terminal

dan

endopeptidase

gugus

amino

gugus

karboksil

terminal.

memecah protein atau ikatan

dari arah dalam.

Golongan
peptida

Klasifikasi protease berdasarkan

sifat-sifat

kimia dari lokasi aktifnya, menurut Winarno

(1986)

adalah sebagai berikut :
a.

Protease

Serin,

yang mempunyai

residu

serin

pada lokasi aktifnya.
b.

Protease

Sulfhidril,

yang

mempunyai

residu

sulfhidril pnda lokasi aktifnya.
c.

Protease
pada

Metal, yang

adanya

logam.

keaktifannya
Logam

tergantung

tersebut

dapat

terdiri dari Mg, Zn, Co, Fe, Hg, dan Ni.
d.

Protease

Asam,

terdapat

yang

pada

lokasi

2 gugus karboksil.

Enzim

aktifnya
ini

hanya

aktif pada pll rendah.
2.

Sumber dan Peranan
Protease
hewan,

dihasilkan

dan mikroorganisme.

misalnya
fisin

dapat

papain

yang

bromelin
hewan,

tanaman,

Protease dari

yang berasal dari

berasal dari getah

getah

pohon

yang bcrasal dari nenas.

penghasil

tanaman
pepaya,

ficus,

Protease

contohnya renin, yang berasal dari

anak sapi.

berbagai

oleh

dan
dari

lambung

Sedangkan mikroorganisme yang merupakan
protease
bakteri

Clostridium,

yang
seperti

Proteus

dan

cukup

potensial

adalah

Bacillus,

Pseudomonas,

Serratia,

dan

seperti Aspergillus, Mucor, dan Penicillium.

kapang

Secara
dari

mikroorganisme

keuntungan,
yang

karena

enzim

cepat dan mudah

diatur

sendiri

beberapa

mikrorganisme
menyebabkan

yang dihasilkan lebih seragam.

mikroorganismenya

diproduksi

mempunyai

diantaranya pertumbuhan

relatif

enzim
itu

komersil, beberapa

Di

dapat

samping

direkayasa,

sehingga enzim dari mikroba mudah diproduksi
jumlah besar.

dalam

Selain itu prosedur isolasinya

pun

relatif mudah.
Peranan
untuk
dan

protease dalam industri

diantaranya

mempercepat pengempukan daging,

klarifikasi

pematangan

bir,

bahan

aditif

detergen,

pembersih lensa kontak, dan untuk memproduksi bahan
pangan

dari kedelai.

dimanfaatkan

dalam

Di Jepang, enzim
pembuatan

ini

kecap

telah
untuk

mempercepat proses fermentasi.

B.

PROTEASE Aspergillus olyzae
Aspergillus
untuk

memproduksi

Amerika,
subtilis,
boleh

oryzae merupakan sumber
protease

enzim-enzim
A.oryzae,

(Aunstrup,

yanq diproduksi

dalam

baik

1980).

Di

oleh

dan A. niger dianggap

dipergunakan dalam makanan.

termasuk

yang

as Save (Winarno, 1986).

aman

Senyawa

9o:Longan GRAS / Generally

Becillus
dan

tersebut

Recognized

Menurut
dalam
ke

Aunstrup

(1980), enzim

diproduksi

sel dengan dua sifat, yaitu dapat

luar

yang

sel atau tetap berada di dalam

disekresikan

ke

luar

sel

di

disekresikan
sel.

Enzim

disebut

enzim

ekstraseluler, sedang enzim yang tetap berada di dalam
sel

disebut enzim intraseluler.

Enzim

intraseluler

lebih sulit dimanfadtkan dalam industri karena

metode

ekstraksinya lebih sulit dan sifatnya lebih labil.
Protease
ekstraseluler
disekitarnya.

A.

dari
yang

oryzae

dapat

tergolong

menghidrolisis

enzim
substrat

Enziln ini bersifat terinduksi,

pada substrat yang sesuai produksinya akan
Tanpa

penginduksi,

enzim

tetap

dalam

jumlah yang lebih kecil (Meyrath dan

artinya

meningkat.

diproduksi,

tetapi

Volavsek,

1975).
Ada

3

macam

protease

Aspergillus,

yaitu

protease alkali,

netral (Ward, 1983).

yang

dihasilkan
karboksil,

menurut

dan

Aunstrup (1980) menyatakan bahwa

A. oryzae dapat memproduksi protease asam dan
sedang

oleh

Njoku

(1989)

A.

alkali,

oryzae

menghasilkan ketiga macam protease tersebut.

dapat
Kasai

et al. (1984) menerangkan bahwa A. oryzae menghasilkan
metalloproteinase, yang mempunyai pH optimum 6,5, dan
Lestario (1991) menambahkan bahwa

aktivitas

protease

ini ditingkatkan olfh logam-logam Mn, Co, Zn, dan
tetapi dihambat oleh EDTA, KCN, dan pCMB.

Ca,

Tipe

protease

yang terbentuk

media pertumbuhannya.

tergantung

pada

Kandungan nitrogen dalam bentuk

protein / peptida yong tinggi dan senyawa karbon
rendah
dan

akan mengintiuksi pembentukan

alkali.

tinggi

dan

adanya

pembentukan
Hal

ini

(1987)

asam amino

protease

(Meyrath dan

yang

substrat yang

seperti

dapat

Volavsek,

protease

mengandung

corn steep liquor,

yang

menekan
1975).

(1980) dan

menyatakan produksi

pada

netral

karbohidrat

bebas

didukung oleh Aunstrup

dilakukan
tinggi,

Sebaliknya kandungan

protease

yang

Fardiaz
sebaiknya

rasio

ekstrak

N/C

khamir,

pepton, atau tepung kedelai.
Fermentasi
memproduksi

padat sangat

cocok

untuk

enzim-enzim dari Aspergillus, Mucor,

Penicillium;

dan

sudah

A.oryzne.

pertumbuhan
dari

substrat

campuran

7

dibuktikan

baik

Media fermentasi yang

bagian dedak dan

3

dan

untuk
terdiri

bagian

tepung

kedelai, yang disuplementasi dengan KH2P04 paling baik
untuk memproduksi protease A. oryzae (Lestario, 1991).
Ion fosfat yang ditambahkan dapat menginduksi produksi
protease (Ueno et a l . , 1987).
Umumnya

enzi~ndari kapang dibentuk

setelah

jam dan terus meninqkat sampai mencapai maksimum
saat

persediaan

makanan

pada

media

habis.

24

pada
Dalam

berbagai penelitian mengenai protease A. oryzae, waktu
fermentasi

bervariasi

dari

65 jam

sampai

5

hari,

tergantung lingkungan tumbuh dan strain mikroorganisme
yang

dipergunakan (Kasai et al., 1984;

1987;

C.

Ueno et

al.,

Lestario, 1991).

PEMURNIAN ENZIM

Pada umumnya enzim terdapat dalam

campuran yang

kompleks, sehingga untuk mempelajari karakteristik dan
cara

kerja

suatu enzim

tersebut.

diperlukan

Adanya enzim lain akan

pemurnian
mengganggu

memberikan

hasil

reaksi

yang

dengan
substrat

beberapa cara, seperti turut bereaksi dengan
sehingga

enzim

lain,

dan

menyerang koenzim atau bahkan enzim itu sendiri (Clark
dan Switzer, 1977).
Langkah awal dalam pemurnian adalah
protein

yang

bersangkutan
terhadap

dikehendaki.

dan

metode

beberapa

sifat-sifatnya
ekstraksi

larutan

ekstraksi,

Lokasi

yang

misalnya

yang

dapat

dengan

mengekstrak

protein

sangat

berpengaruh

dipergunakan.
dipergunakan

buffer

yang

fosfat

Ada
dalam

pH . 7

(Impoolsup et al., :1981), 2% NaCl (Wang et al., 1974),
dan Tween 80 (Saputro, 1987; Lestario 1991).
Penggunaan

bahan

pengekstrak

sifat enzim yang diltehendaki.
menyatakan
merusak

tergantung

Impoolsup et al. (1981)

bahwa penggunaan buffer fosfat pH 7
protease

penelitiannya

tidalc

asam,

pada

sehingga

ditemui adanya

pada
enzim

dapat
hasil

tersebut.

Larutan

detergen

encer,

seperti

Tween,

keuntungan lain bila dipergunakan sebagai

memberi

pengekstrak

enzim, yaitu dapat mengekstrak enzim yang terikat pada
struktur mitokondria (Dixon et dl., 1979)
Untuk
ke

protein ekstraseluler, yang

dalam

medium

diperlukan

fermentasi,

sebelum

dimurnikan

tahap pfnjernihan atau pemisahkan sel

partikel-partikel
ini

disekresikan

dapat

yang tidak dikehendaki.

dilakukdn dengan metode

mikrofiltrasi.

Pemisahan

pengendapan

Metode pemurnian enzim pada

tidak

berbeda dengan pemurnian protein.

umum

dipergunakan

kromatografi,

dan

meliputi

atau

dasarnya

Tahap

pengendapan

elektroforesis

dan

yang

protein,

(Scopes,

1987).

Beberapa metode yanq umum dipergunakan dalam pemisahan
protein dengan pengendapan, yaitu berdasarkan

peruba-

pH, perubahan lcekuatan ion (salting in /

salting

han

out),

menggunakan

organik,
metode

serta

pelarut

denyan

pemurnian

organik

atau

pendenaturasian.

dengan

kromatografi

Sedangkan
dapat

dalam tiga bagian besar, yaitu kromatografi
kromatografi
dapat

gas,

dan HPLC.

polimer

dibagi

adsorbsi,

Kromatografi

adsorbsi

dibagi lagi menjadi kromatografi filtrasi

penukar
merupakan
molekul,

ion,

affinitas,

pengikatan

pemisahan berdasarkan
muatan,

substrat

mengikat suatu pewarna.

pewarna;

keseragaman

spesifik,

dan

gel,
yang

ukuran

kemampuan

a

1).

I'EMUItNIAN PROTEASE DARI ASPERGILLUS

Impoolsup
flavus
dan

et al. (1981) memurnikan protease

var columnaris dan memperoleh protease

alkali.

enzim

dari

Pemurnian diawali

kasar

ammonium

didialisis

diperoleh
hasilnya

dengan

dengan

dengan

endapan

fosfat

Larutan enzim yang sudah pekat

yang

pH

dipekatkan dengan ultrafiltrasi dan

membran.

netral

pengendapan

sulfat,
buffer

A.

7,

diaflo-

dituang

ke

kolom kromatografi dengan bahan pengisi berturut-turut
DEAE Sephadex

Pada
A.

A-50, CMC-CM 52, Sephadex G-100.

pemurnian

karboksipeptidase

oryzae, Takeuch-i dan Ichisima
Sephadex

DEAE

dengan

dan CMC.

ammonium

kromatografi.

Uji

Elektroforesis

dari

menggunakan

enzim

lalu

kemurnian

Gel

(1981)

Mula-mula

sulfat,

0-1

diendapkan

diikuti

dengan

dilakukan

dengan

Poliakrilamid

(PAGE)

dan

Isoelektrik Fokusing Gel Poliakrilamid (PAGIF).
Beberapa
memurnikan

peneliti

karboksil

lain, Yagi

proteinase

dengan

kromatografi DEAE Sephadex

C-50,

dan

Sephadex

G-100.

et

al.

dari

A.

A-50,

(198G),

kawachii

SP-Sephadex

Homogenitas

enzim

ditentukan dengan PAGE.
Pemurnian
pernah

dilakukan

metalloproteinase
oleh

Kasai et

A.

oryzae

(1384)

dengan

dari
al.

menggunakan Talopeptin-Aminohexyl-Sepharose. Cara ini

dikombinasikan

denqan pemekatan dengan diafilter

kromatografi dengan Sephadex G-100, serta

dan

pengendapan

dengan ammonium sulfat.
Isolasi
telah

protaase

dilakukan

berhasil

oleh Feinstein

dilakukan

A.

alkali dari

dengan

dan

satu

oryzae

Gertler

tahap

dengan kromatografi affinitas pada kolom

yang
(1973)

saja,

yaitu

Ovoinhibitor

Sepharose.

E.

TEICNIK ELEKTROFOI1ESIS Dl DALAM ANALISIS ENZlM
1. Elektroforesis

Elektrofornsis

fraksi-fraksi

memisahkan
migrasi

adalah

partilcel
di

makromolekul

suatu

suatu

zat

bermuatan

bawah

berdasarkan

atau

ion-ion

medan

listrik

Miqrasi

partikel

pengaruh

dan

bermuatan

tersebut dapat terjadi karena

perbedaan

bentuk, muatan, atau sifat kimia

molekul.

Sedangkan

menurut

perpindahan

1380).

untuk

(Pomeranz

ukuran,

Meloan,

cara

Morris

dan

Morris

molekul bermuatan pada

(1976),

elektroforesis

merupakan aksi dari medan listrik.
Jika sebuah molekul bermuatan q berada
larutan

atau

suspensi di sebuah medium

menjadi subyek dari medan listrik
H, maka gaya yang bekerja pada

dengan

molekul

dalam

cair

dan

kekuatan
tersebut,

yang mengakibatkan pergerakannya, adalah sebesar qH.

Di

dalam

medium,

molekul

yang

bergerak

dengan

kecepatan v menginlami hambatan yang disebabkan oleh
koefisien
molekul

geselcan

f, sebesar

Pergerakan

fv.

terjadi sampai gaya listrik

kesetimbangan

dengan

hambatan

qH

gesek

mengalami

yang

ada,

sehingga berlaku persamaan :

v

SB

(Morris dan Morris, 1976)

= -

f

Menurut
jari-jari

hukum Stokes, molekul

r yang

melalui

medium

bulat

dengan

polar

dengan

viskositas n akan mengalami gesekan sebesar :

sehingga :

Dengan

demikian

mobilitas

( H atau p ) dari sebuah molekul, yang

elektroforetik
didefinisikan

sebagai pergerakan per unit kekuatan medan
dapat dituliskan dengan persamaan :

listrik

Dalam

pemisahan

molekul-molekul
berbeda

akan

elektroda

protein
terpisah

yang

berdasarkan
yang

mempunyai

selama

polaritasnya

muatan,
muatan

bergerak

ke

berlawanan

arah

dengan

muatan molekul tersebut (Boyer, 1986).
Boyer

(1986)

elektroforesis

juga

umumnya

mengatakan

bahwa

dipergunakan

untuk

karakterisasi dan analisis molekul-molekul besar
polimer,

diantsranya

molekul,

mendeteksi

protein,

untuk

menentukan

berat

dan

kerusakan

menetapkan titik isoelektrik,

memisahkan

spesies-spesies

kemurnian

/

molekuler

yang

berbeda

secara

kualitatif maupun kuantitatif.
Berdasarkan
(1986)

jenis media penyangganya,

mengklasifikasikan

Elektroforesis

Cairan

dan

Boyer

elektroforesis

dalam

Elektroforesis

Zona.

Dalam Elektroforesis Cairan media yang dipergunakan
adalah larutan buffer, sedang dalam
Zona

Elektroforesis

media penyinngga berupa padatan, yaitu

atau gel.

kertas

Dengan adanya medium penyangga, gangguan

karena konveksi dapat dihilangkan.
Elektroforesis Zona sering dipergunakan dalam
analisis

kemurnian

dan penentuan

berat

molekul.

Pada elektroforesis ini migrasi molekul dipengaruhi
oleh

besarnya

penyangga

medan listrik dan

yang dipergunakan.

kekakuan

Lebih

lanjut

medium
Boyer

(1986)

membagi

Elektroforesis

Zona

berdasarkan

media penyangganya, menjadi Elektroforesis Kertas /
selulosa Asetat dan Elektroforesis Gel
2. Elektroforesis Gel Poliakrilamid (PAGE)

Ada

macam

dua

dipergunakan

bahan

dalam Elektroforesis Gel,

pati dan gel poliakrilamid.
resolusi
selulosa
karena

yang

lebih

asetat,

ukuran

isoenzim

porinya

dan

dalam
gel

Gel pati

baik

tetapi

yang

umum

yaitu

gel

menghasilkan

dibanding

kertas

penggunaannya

tidak

beberapa

menggunakan bahan ini.
beberapa

penyangga

terbatas

seragam.

protein

/

Analisis

tertentu

masih

Gel poliakrilamid mempunyai

keunggulan dibanding gel

pengontrolan ukuran pori.

pati,

terutama

Ukuran pori

pada

poliakrilamid dapat dibuat seragam, dua

macam

(gel diskontinyu), ataupun bervariasi sepanjang gel
(gel gradien)

.

Poliakrilalnid merupakan bahan penyangga
relatif baru dalam elektroforesis.
menguntungkan,
dapat

karena

diatur,

bahan

di samping
ini

yang

Bahan ini lebih
ukuran

bersifat

porinya

transparan

sehingga

dapat diwarnai pada daerah

sinar

maupun

daerah

Selain

itu

secara

kimia

poliakrilamid
bersifat

ultra

violet.

merupakan medium yang

tampak

inert, tidak bereaksi dengan sampel,

tidak bermuatan (Nur dan Adijuwana, 1988).

dan

Gel

poliakrilamid

diperoleh

dengan

cara

polimerisasi akrilamid.dengan adanya sejumlah kecil
cross-linking agent N,N1-metilen-bis-akrilamid

ammonium persulfat sebagai katalisator.
diperlukan
juga

dan

Selain itu

(Tetrametil-etilendiamid)

yang

bertindak sebagai katalisator terutama

dalam

TEMEII

mengawali

terjndinya

polimerisasi

(Nur

dan

Adijuwana, 1988).
Menurut

Nur

dan

Adijuwana

pembentukan poliakrilamid adalah :
bebas

reaksi

radikal-radikal

yang terbentuk dari ammonium persulfat

bereaksi

dengan

akrilamid

molekul

sama,

sehingga

pan jang .

akrilamid,
Akrilamid

aktif.

dengan

ini

(1988),

ini

akrilamid lain
dihasilkan

sehingga

rantai

Larutnn yang mengandung

kental

tetapi

tidak

terbentuk

dapat

dengan

bereaksi

cara

polimer
rantai

membentuk

akan

yang
yang

polimer

gel.

Untuk

membentuk gel diperlukan N,N1-metilen-bis-akrilamid
yang

bertindak

Polimerisasi
rantai

sebagai

menyebabkan

akrilamid.

cross-linking

terbentuknya

per

jala

Ukuran pori dari jala

ditentukan oleh jumlah akrilamid yang
unit volume medium reaksi dan

silangnya (Boyer, 1986).

agent.

dari

tersebut

dipergunakan

derajat

ikatan

PAGE

dapat

dipergunakan

untuk

uji

homogenitas, estimasi BM, mobilitas relatif, muntan
netto,

dan

koefisien

difusi

1974).

Menurut Mayes et al.

protein

paling

baik

apparent
(1987),

diuji

dengan

homogenitas

PAGE.

rendah konsentrasi poliakrilamid yang
dan

makin

kecil

ukuran

(Maurer,

Makin

dipergunakan

molekul

yang

akan

dipisahkan, mobilitas molekul tersebut makin besar.
konsentasi

Pada

standar

(7,5%)

berat molekul 10.000

mempunyai
dipisahkan

dengan

poliakrilamid
memisahkan

baik.

dapat

3,5%

makromolekul

molekul 1.000.000

-

Gel

-

senyawa

yang

1.000.000

dapat

dengan

konsentrasi

dipergunakan

yang

untuk
berat

mempunyai

5.000.000 (Boyer, 1986).

PAGE dapat dilakukan pada 2 macam gel,
gel

yang

diantara
berbentuk
sampel
lebih

adanya

dua

batang

plat kaca.

batanq

tiap

yang

atau

Tidak seperti

hanya

batang, pada

lempeng

gel

dapat

tipis

pada

memuat

berbentuk

(Boyer, 1986).

Gel

berbentuk

dielektroforesis secara vertikal

satu

secara
lempeng

atau

pengaruh grafitasi tidak diinginkan,

dilakukan elektroforesis horisontal.

gel

lempeng

dari 1 sampel dapat dielektroforesis

simultan
dapat

berbentuk

yaitu

bila
dapat

3.

PAGE dengan Sodium Dodesil SulEat (SDS-PAGE)
Variasi yang terkenal dalam PAGE adalah
PAGE,

yaitu PAGE yang'dilakukan pada

terdenaturasi

(Mayes et al., 1987)

Dodesil

Sulfat)

bersama

dengan

sampel

.

SDS

merupakan anionik

SDS-

yang

(Sodium

deterjen

D-merkaptoetanol

dan

yang

pemanasan

menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi protein.
Hal

ini disebablian oleh pecahnya ikatan

disulfida

yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus sulfhidril
(Smith,

1984).

sekunder ,

tersier,

menghasilkan
Selanjutnya
disulfida

rantai

'

dan

SDS

merusak

kuaterner

polipeptida

struktur
protein,

yang

acak.

8-merkaptoetanol memecah semua
yang

menyebabkan
SDS

Mula-mula

ada.

Kedua

reaksi

protein terdenaturasi

ikatan

tersebut

(Boyer,

1986).

mengikat protein yang terdenaturasi pada

hidrofobik

dengan perbandingan yang

selalu

sisi
sama,

yaitu 1,4 gram SDS per gram protein (Smith, 1984).
SDS-PAGE
Pada

pH

protein

sekitar

netral.

kompleks

dengan

dan kompleks ini bermuatan negatif

karena

7,

dilakukan pada pH

SDS akan

membentuk

adanya gugus-gugus anion dari SDS.
seluruh

sampel yang ditambahkan akan

elektroda positif.
besar

Dengan demikian

mempunyai

bergerak

ke

Kompleks SDS-protein yang lebih
mobilitas

yang

lebih

dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil

kecil
(Nur

dan Adijuwana, 1988).
untuk

mengetahui

ataukah

apakah suatu

oligomerik.
berat

menetapkan

SDS-PAGE dapat

protein

Selain
molekul

dipergunakan

itu

dan

monomerik

juga

untuk

jumlah

rantai

polipeptida suatu protein.
4. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi

Keberhasilan
elektroforesis

pemisahan suatu senyawa

dipengaruhi

oleh

dengan

banyak

hal.

Diantaranya sistem buffer, suhu, waktu dan besarnya
arus listrik yanq dipergunakan.
tersebut saling mempengaruhi.
dipergunalcan,

yang

semakin

Keempat

parameter

Semakin tinggi

arus

pendek

yang

waktu

dibutuhkan, tetaj~i suhu akan meningkat.
Waktu yang diperlukan untuk menghasilkan pola
pemisahan
molekul

yang
yang

dipergunakan.

dan

Menurut Morris dan

suatu

ionisasi

dan

tergantung

tergantung

dipisahkan

mobilitas

Sedangkan

optimum

molekul

pada

jenis

buffer

Yang

Morris

dipengaruhi

deionisasi

besarnya

pada

molekul

arus listrik

banyaknya

yang

kolom

(1976),

oleh

waktu

tersebut.
dibutuhkan

elektroforesis

yang ditanggungnya (Nur dan Adijuwana, 1988).
Pengaruh

suhu

terhadap

dilihat dari hukum Stokes.
kekentalan

media

dapat

Suhu dapat mempengaruhi

(n) dan

sehingga mobilitas (H atau

mobilitas

.LC)

jari-jari

ion

berubah juga.

(r),
Morris

dan

Morris

terjadi

(19'76) menyatakan bahwa

secara

peningkdtan mobilitas ionik

kasar

sebesar

2,5%

per derajat kenaikan suhu.
Buffer berfungsi mempertahankan pH baik dalam
reservoir

ataupun

elektrolit

dalam

pembawa

gel,

aliran

dan

merupakan

listrik.

Untuk

tercapainya kedud fungsi tersebut, menurut Nur
Adijuwana

diperlukan

(1988),

kondisi

3

dan

sebagai

berikut :
(1) Buffer yang dipilih harus tidak bereaksi dengan

makromolekul
terjadi

ydng

akan

pergerakan

dipisahkan.

menyebabkan

molekul

Interaksi

perubahan

dalam

medan

yang

kecepatan

listrik;

dan

mengakibatkan 1 spesies terlihat menjadi 2.
(2) pH yang dipergunakan dalam elektroforesis harus

sedemikian rupa
dapat

terpisah

sehingga

campuran

satu sama lain.

makromolekul

Kisaran

pH

yang

umum dipergunakan untuk protein 4,5-9,O.
(3)

Kekuatan

ionik dan konsentrasi

diperhitungkan
elektrolit

di

makromolekul
Akibatnya

dengan tepat.
dalam
akan

pita-pita

buffer

Apabila

gel

bergerak

konsentrasi

terlalu
terlalu

rendah,
cepat .

tidak

tajam,

melainkan tampak seperti daerah difusi yang

sangat

menurunkan
konsentrasi

yang terbentuk

harus

resolusi.

Sebaliknya,

elelctrolit sangat tinggi, maka

apabila
timbul

panas

yang dapat menimbulkan denaturasi;

meskipun

pita

yang

diperoleh

tajam,

sehingga

pergerakan

molekul hanya mencapai jarak yang pendek.
ionik

buffer

yang

dipergunakan

Kekuatan

berkisar

antara

0,05-0,15.
5. Pewarnaan Protein
Pewarnaan

berguna

untuk

memperjelas

pita

protein hasil pernisahan dengan elektroforesis. Ada
bermacam-macam

pewarna

yang

dapat

dipergunakan

untuk mendeteksi adanya protein, diantaranya

Amido

Black,

R-250

dan

Nigrosinc, Coomassie Brilliant

Blue

G-250, CuC12, AgN03, dan lain-lain

(Blakesley

dan Boezi, 1977; Merril, 1983; Scopes, 1987; Lee et
dl., 1987).
Menurut
suatu

Maurer

(1974),

kapasitas

pewarna terhadap protein sangat

Meskipun

demik ian,

coefficient

selama

ikatan

bervariasi.

molar

extinction

pewdrna yang dipergunakan masih

besar daripada molekul sampel, pewarnaan

lebih

merupakan

metode deteksi yang paling sensitif.
Sebelum pevarnaan dilakukan fiksasi
yaitu denaturasi protein dengan asam.
yang
Asam

umum

dipergunakan adalah

Asetat,

Formaldehid;
Perklorat

dan

air;

Glutaraldehid;

5-10%

Bahan-bahan

campuran

Asam

Metanol,

Sulfosalisilat;

TCA;

(Laemmli, 1970;

protein,

atau

Asam

Smith,

1984;

Scopes,

1987; Dunn, 1989).

mengendapkan

Fiksasi berguna

dan mengimobilisasikan

untuk

protein

yang

telah terpisah pada gel dan menghilangkan komponenkomponen

non

protein

pengikatan

pewarna

mengandung

SDS,

yang

dapat

oleh protein.

SDS harus

menghalangi

Pada

gel

dikeluarkan

Demikian pula senyawa amfolit.

dari

gel.

Senyawa-senyawa ini

terdifusi keluar pada saat fiksasi

dapat

yang

(Scopes,

1987).

Pewarna
bereaksi
tetapi

yang

dengan

dipergunakan

molekul sampel

tidak bereaksi dengan

harus

yang

gel

dapat

dipisahkan,

elektroforesis.

Ikatan antara pewarna dan gel bukan ikatan kovalen,
sehingga

mudah

intensif

dan penyinaran (Maurer, 1974).

pewarnaan,
pelunturan
peluntur

dilepaskan

di Lakukan
dengan

oleh

pencucian

penghilangan

merendam

gel

sampai latar belakangnya

yang
Setelah

warna

dalam
relatif

/

larutan
jernih

dibanding pita ydng dihasilkan (Nur dan

Adijuwana,

Menurut Ounn (1989), waktu yang

diperlukan

1988).

untuk destaining tergantung pada ketebalan gel

dan

konsentrasi polidkrilamid.
5.1.

Pewarnaan Coomassie
Pewarna yang umum digunakan untuk

protein

adalah Coomassie Brilliant

mendeteksi

Blue.

Tetapi

kelemahannya,

pewarna ini hanya

protein yang berjumlah besar.
pewarna

ini

dapat

dapat

Menurut Dunn (1989),

mendeteksi

'

konsentrasi 0,5 pg/cm2.

mendeteksi

protein

pada

Selain itu, menurut Scopes

(1987), pewarna ini tidak sesuai untuk protein yang

bersifat asam.
Interaksi

antara pewarna ini

protein yang berbeda.

berbeda

untuk

Jumlah molekul pewarna

yang

terikat tergantung pada muatan positif protein yang
bersangkutan,

sekitar

1,5

-

3 molekul

pewarna

/

muatan (Tal et al).
5.2.

Pewarnaan Cu
Interaksi

banyak

antara cu2+ dengan

protein

dijelasknn dan bahkan merupakan dasar

beberapa metode pengukuran jumlah protein,
metode

telah

Biuret,

Lowry,

dan

Asam

dari

seperti

Bicinchoninat.

Selain itu CuC12 mampu mengimobilisasi protein pada
gel elektroforesis.
(1987)

mempergunakan

Dengan dasar itu, Lee et
CuC12

menyebutnya Copper Staining.
tergantung

pada

sebagai

pewarna

aan

Metode pewarnaan

ini

2 reaksi yang

berlawanan,

pengendapan CU++ oleh SDS dan pembentukan
antara Cu dan protein.
pada

kompleks

al.

yaitu

kompleks

Menurut Mehl et al. (1949),

Cu-Protein,

1

atom

dengan 4 atom N pada ikatan peptida.

Cu

berikatan

Pewarnaan cu bermanfaat untuk analisa protein
secara

cepat pada SDS-PAGE.

juga

memungkinkan

untuk

yang

dipisahkan

dengan

dikarakterisasi
ini

mempunyai

paling

mendapatkan

3 kali

pewarnaan

Coomassie,

memerlukan

tahap pelunturan.

yang

telah

cepat,

dipisahkan

Prosedur

keunggulan,
lebih

dapat

untuk

pewarnaan

diantaranya

sensitif
mudah,
Selain

ini

polipeptida

elektroforesis

lebih lanjut.
beberapa

sedikit

Metode pewarnaan

dibanding

dan
itu

tidak
protein

diperoleh

kembali

secara kuantitatif setelah Cu dikelat dengan EDTA.
5.3.

Pewarnaan Ag
Ion

perak mampu mengikat protein pada

pita

transparan sehinqga dapat terlihat pada gel.

Sifat

transparan tersebut dapat disebabkan oleh perubahan
struktur air dan interaksi antara ion
Merril
kali
dan

dan

(1983) menyatakan bahwa pewarnaan
lebih sensitif dibanding pewarnaan

10

kali

pewarnaan

dibanding

pewarnaan

ini

100

Coomassie

Cu.

ini, protein yang terdapat

~1-.

dalam

Dengan
skala

nanogram masih dapat terdeteksi (Lee et al., 1987).
5.4.

Pewarnaan Spesif ik
Ada

dipergunakan

suatu
untuk

metode

pewarnaan

mendeteksi

yang

enzim,

dapat
yaitu

Pewarnaan Spesifik, yang bekerja berdasarkan reaksi

spesifik

-

enzim

substrat.

pewarnaan ini terbatas pada
baik

oleh

gel tanpa

SDS atau Ukea, sebab

menghilangkan
ini

Pemakaian

metode

denaturasi,

denaturasi

alctifitas katalitik

enzim.

Metode

umumnya dipergunakan untuk protein yang

difiksasi,

oleh

sebab

dipergunakan

harus

dapat

sebelum

itu

/ enzim

protein

pereaksi

berdifusi
itu

dapat

tidak
yan9

lebih

cepat

sendiri terdifusi

(Scopes, 1987) .
Menurut Scopes (1987), ada 2 metode pewarnaan
ini.

Pertama, dengan merendam gel pada

Metode ini cukup memuaskan jika hasil

yang sesuai.

reaksi akhir bersifat insoluble.
diimobilisasi
Agarose,

salah

dengan

cara

atau

Scopes

yang

membelah gel yang
salah

pewarnaan

Spesifik

seperti gel

kertas

saring.

(1987) memberikan

dapat

satu

telah

belahan

dan

dilakukan

dengan

pewarnaan tersebut.

untuk
yaitu

dielektroforesis,
diwarnai

belahan yang lain

pewarnaan protein biasa.

ditentukan

pereaksi

pita mana yang mengandung enzim,

kemudian

metode

Kedua,

bahan penyangga,

dengan itu,

satu

menentukan

pada

Seluloaa Asetat,

Sehubungan

pereaksi

Pita enzim

membandingkan

kedua

dengan
dengan
dapat
hasil

6. Analisis Hasil Elektroforesis

Analisis
didasarkan
Menurut

hasil elektroforesis

pada

umumnya

pada mobilitas elektroforetik

protein.

Nur dan Adijuwana (1988), mobilitas

partikel

adalah

kecepatan

yang

dicapai

partikel tersebut pada suatu medan listrik.
menurut

suatu
oleh
Sedang

Suhartono (1988), mobilitas relatif

suatu

protein adalah perbandingan jarak antara titik awal
ke

pita protein dengan titik awal k e

elektroforesis.

dapat

Pada kondisi yang sama,

selalu sama untuk setiap

mobilitas

dibuat

titik

hubungan antara

besarnya

ion,

berat

akhir

sehingga

molekul

dan

mobilitasnya (Nur dan Adijuwana, 1988).
Mobilitas
relatif
Menurut

:=

iarak miarasi protein
jarakyigrasi %t warna

Conn

et

(1987),

al.

estimasi

BM

protein dapat dilakukan berdasarkan protein standar
yang

sudah

pembuatan
pertama

BM-nya.

Ada

kurva standar untuk estimasi
dilakukan dalam dua tahap,

hubungan
dengan

diketahui

dua

cara

BM.

cara

yaitu

mencari

antara mobilitas relatif protein

standar

konsentrnsi

gel

yang

dipergunakan.

membuat kurva stilndar yang-menghubungkan BM
kemiringan

kurva pertama.

Sedangkan

cara

Dan
dengan
kedua

adalah cara esti~nasi BM dengan SDS-PAGE, yang mampu
memisahkan

protein

berdasarkan

ukuran

/

berat

111. METODE PENELITIAN

A.

B A H A N DAN ALAT
1.

Bahan
Bahan-bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini
adalah :

-

Substrat

fermentasi kecap (fase moromi)

dari

pabrik kecap Zebra, Bogor

-

Substrat

/

media

tepung kedelai, dan

-

pertumbuhan,

yaitu

dedak,

media sintetik PDA

Bahan-bahan kimia untuk isolasi : media sintetik
Potato Dextrose Agar dan Skim Milk Agar

-

Bahan-bahan

kimia

untuk

pengujian

aktivitas

enzim : Na2HP04, NaH2P04, Kasein, Tirosin

,

CaC12, Na2C03, Folin-ciocalteau, H2S04,

Etanol

TCA,

95%, Coomassie Brilliant Blue G-250

-

Bahan-bahan

kimia

untuk

pemurnian

enzim

Ammonium Sulfat, Aseton, Sephadex G-100

-

Bahan-bahan

kimia

untuk

analisis

dengan

elektroforesis : Buffer Fosfat, Buffer Tris-HC1,
Buffer ~ris-~lisin,
SDS, Akrilamid, N,Nt-Metilen
Bis-Akrilamid,

Ammonium

Persulfat,

TEMED,

Bromofenol Blue, B-Mercaptoetanol, Metanol, Asam
Asetat Glasial, Coomassie Brilliant Blue
CuC12,

TCA,

Etanol,

KMn04,

AgN03,

R-250,
DTT,

Glutaraldehid, Na2C03, Formaldehid, Asam Sitrat.

2.

Alat
Alat-alat

yang

untuk

diperlukan

penelitian

ini adalah :

-

-

Alat-alat gelos
pengering beku

- Timbangan analitik
- Pengaduk magnetik

B.

Pembakar Bunsen, jarum ose
Satu set alat kromatografi
Satu set pengumpul fraksi
Satu set alat elektroforesis

Autoclaf
Inkubator
Lemari pendingin
Spektrofotometer
pH meter
Penangas air
Pompa vakum
Sentrifus

METODE PENELITIAN

Penelitian

ini

terdiri

dari

4

tahap,

yaitu

isolasi kapang proteolitik, produksi, pemurnian,
analisis protease.

dan

Masing-masing tahap dijelaskan

di

bawah ini.
I.

ISOLASI KAPANG PROTEOLITIK
5

g substrat fermentasi kecap (fase moromi)

dipanaskan

sebentar pada

disuspensikan
diencerkan
PDA

dalam

10-I

-

45 ml

hari.

air

70°c,

diblender,

steril, kemudian

dan ditumbuhkan pada

dengan metode tuang.

selama 3

suhu

Inkubasi pada suhu

Hal yang sama juga dilakukan

substrat yang tidak dipanaskan.

media
30°c

pada

Kapang yang tumbuh

diinokulasikan
permukaan
hari.

pada

media

SMA

dengan

dan diinkubasi pada suhu 30°c
Kapang

disekeliling

yang

menghasilkan

metode

selama

areal

koloni ditumbuhkan pada

3

bening

agar

miring

isolat kapang dilakukan

sesuai

PDA.
Identifikasi

dengan metode yang dikemukakan oleh Klich dan
(1988).
Yeast

Kapany

Agar

Sukrosa

ditumbuhkan

(CYA) dan

CYA

pada

yang

media

Pitt
Czapek

mengandung

(CYZOS), kemudian diinkubasikan pada

20%

suhu

ruang selama 7 hari.

Hasil pengamatan

disesuaikan

dengan

kunci

identifikasi

spesies

Aspergillus,

seperti yang terlampir pada

lampiran

6.

makroskopik

Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan

culture pada media CYA.

Pewarna yang

slide

dipergunakan

adalah Lacto-fenol Cotton Blue.
2.

PRODUKSI I'ROTEASE

Pada

tahap ini diproduksi protease

dari

A.

oryzae pada media campuran dedak dan tepung kedelai
sesuai dengan hanil penelitian Lestario (1391).
a.

Penyiapan Media Fermentasi
10

g

tepung
10

ml

media

fermentasi

(campuran

dedak

kedelai, 7:3, berdasar berat)
KH2PO4

4 mM,

pH

diatur

Disterilisasi pada suhu 121°c

dan

ditambah

menjadi

selama 15

6.

menit.

b.

Pembuatan Inokulum dan Inokulasi
Sebelum pembuatan inokulum, dilakukan pengujian
aktivitas

proteolitik pada media SMA.

aktivitas

proteolitik

Adanya

ditandai

dengan

terbentuknya areal bening di sekeliling kultur.
Biakan

A. oryzae pada agar miring, yang

diinkubasikan
hari,

dan

berumur

diberi air steril sebanyak 10 ml.

suspensi
telah

suhu 30°c

pada

telah

ini

diinokulasikan pada

2

4
ml

media

yang

disiapkan dan diinkubasi pada suhu

3o0c

selama 3 hari (72 jam).
c.

Ekstraksi
Enzim

diekstraksi dengan 100 ml

Tween

80

ddn pengadukan

kecepatan

0,1%

selama

jam

1

Suspensi enzim yang

160 rpm.

terekstrak

dipisahkan

penyaringan

menggunakan kain kassa dan

Untuk
media

larutan

dari

media

memisahkan sel-sel mikroba
fermentasi yang

dan

tertinggal,

pada
telah

dengan
kapas.
sedikit
filtrat

tersebut discntrifus dengan kecepatan 4000
selama

10 menit.

dilakukan

pengukuran

jumlah protein.
dengan

Pada filtrat yang
aktivitas

hidrolisis

kasein

diperoleh

protease

Aktivitas protease

rpm

dan

ditentukan

(Bergmeyer, 1983),

sedang jumlah protein dengan metode
zat pewarna (Bradford, 1976).

pengikatan

d.

Pengukuran Jumlah Protein
Protein

terlarut ditetapkan berdasarkan

standar BSA.
sebagai

Pembbatan larutan Bradford adalah

berikut:

100 mg

Coomassie

G250 dilarutkan dalam 50 ml

Blue

kemudian

dipisnhkan

metode

Brilliant

Etanol

ditambah 100 ml Asam Fosfat

diencerkan snmpai 1 liter.
larut

kurva

dengan

95%,

85%

Pewarna yang
penyaringan.

ini dapat dilihat pada gambar di

dan

tidak
Skema
bawah

ini.
SAMPEL

STANDAR

0,2 ml enzim

0,2 ml BSA
konsentrasi 0,l-1 mg/ml

I
-r----- -'
I
+

--

5 ml larutan Bradford

I

I

didiamkan 20 menit pada suhu ruang

I
I

dilakukan pengukuran Absorbansi
pada panjang gelombang 595 nm
Gambar 2.

e.

Penetapan jumlah protein
(Dradford, 1976)

Pengujian Aktifitas Protease
Prinsip pengujian ini adalah :
Kasein

Hz0

Peptida + Asam Amino

Protease
Laju

pembentukan peptida dan asam

reaksi

tersebut

dapat

dijadikan

amino

dari

tolok

ukur

akktivitas katalisis protease.

Asam-asam amino

yang

diisolasi

telah

terbentuk

harus

dipisahkan

dari substrat yang

Cara

paling

yang

umum

masih

adalah

dan

tersisa.

dengan

TCA.

Pengukuran asam-asam amino yang telah diisolasi
tersebut dapat dilakukan pada panjang gelombang
280

nm atau pada daerah sinar tampak,

setelah

terlebih dahulu diwarnai dengan pereaksi Folin.
Tahap penqujian aktivitas protease ini terdapat
pada tabel 1.
Berdasarkan perjanjian Internasional, aktivitas
protease
(IU).

dinyatakan dalam

Internasional

Unit

Satu IU protease menyatakan jumlah enzim

yang dapat menghasilkan 1 wmol produk (tirosin)
per menit.

IJnit aktivitas tiap sampel dihitung

dengan persamaan :

dimana

:

UA

=

jumlah tirosin yang dihasilkan
per ml enzim per menit

=

nilai absorbansi sampel

Abl

=

nilai absorbansi blanko

P

=

faktor koreksi

T

= lamanya reaksi (menit)

Nilai IU ditentukan dari kurva standar tirosin.

T a b e l 1.

~ e n g u j i a na k t i v i t a s p r o t e a s e
(Bergmeyer, 1983)

...............................................
Pereaksi
Sampel
Blanko
...............................................
Buffer f o s f a t

( 0 , O l M,

pH 7 )

S u b s t r a t k a s e i n ( 2 % , pH 7 )
Aquades
Enzim d a l a m CaC12

1,00 m l

1,00 m l

1,00 m l

1,00 m l

---

0,20 m l

0,20 m l

---

...............................................
D i i n k u b a s i k a n selama 1 0 m e n i t p a d a s u h u
...............................................
TCA ( 0 , 1 M )

Enzim d a l a m CaC12

2,00

ml

---

37'~

2,00 m l

0,20 m l

Diinkubasiknn selama 10 m e n i t pada suhu 3 7 O ~ ,
l a l u d i s e n t r i f u s p a d a 4000 rpm selama 1 0 m e n i t

...............................................
Filtrat

1,50ml

1,50ml

P e r e a k s i F o l i n (1: 2 )

1 , O O m l

1 , O O m l

...............................................
D i i n k u b a s i k a n selama 2 0 m e n i t pada suhu 3 7 O ~ ,
l a l u d i u k u r a b s o r b a n s i n y a pada
p a n j a n g g e l o m b a n g 578 nm

................................................

3.

PEMURNIAN PROTEASE

~emurnian

enzim

yang

dilakukan

meliputi

pengendapan enziin yang diinginkan dan kromatografi.
Enzim

harus

selama

dijaga

tahap

tetap

pemurnian.

dalam
Prosedur

dapat dilihat pada gambar 3.
pemurnian

kondisi

dingin

pemurnian

Pada akhir tiap tahap

dilakukan pengukuran jumlah protein
protease

aktivitas

untuk

ini

mengetahui

dan

kelipatan

pemurniannya.
a.

Pengendapan dengan Ammonium Sulfat
Filtrat

enzim kasar yang diperoleh dari

sebelumnya
kemudian

didinginkan
70%

ditambahkan

bubuk

pada

halus

refrigerator,

Ammonium

Sulfat

sambil

cliaduk

sedikit-sedikit

dengan pengaduk magnetik sampai semua
Sulfat selesai ditambahkan.

tahap

Selama

Ammonium

pengadukan

suhu dijaga tetap rendah dengan

menempatkannya

pada

ini

wadah berisi es.

selama

30

kecepatan
dilarutkan

menit

Filtrat

sebelum

disentrifus

4000 rpm selama 20

menit.

pada buffer fosfat 0,02 M ,

dengan volume minimum.

didiamkan
denban
Endapan
pH

7,5

Filtrat enziln kasar hasil fermentasi

I

1

Ditambah 70% Ammonium'Sulfat sambil diaduk
dengan pengaduk magnetik pada suhu rendah

I

1

Didiamkan selama 30 menit pada suhu
menyempurnakan pengendapan

~

O

untuk

C

I

i
Disentrifus 4000 rpm, 20 menit

!

4

Endapan enzim dikumpulkan

I

1

Dilarutkan pada 0,02 M buffer fosfat pH 7,5
dengan volume minimum
I
I
1

Dialisis dalam 0,02 M bu