Metode Mempertahankan Kualitas Dan Kuantitas Asam Ribonukleat (RNA) Tanaman
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Metode Mempertahankan Kualitas dan
Kuantitas Asam Ribonukleat (RNA) Tanaman. Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI.
Ketidakstabilan RNA merupakan sebuah hambatan untuk menyimpan dan
membawa RNA yang akan digunakan sebagai parameter penelitian bioteknologi.
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan inovasi baru penyimpanan RNA
tanaman. Molekul RNA disimpan dengan 6 perlakuan berbeda. Perlakuan pertama
disimpan pada -400C dan diperoleh konsentrasi bunga kakao sebesar 1.204 ng/µl,
lateks stimulan 3.408 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.374 ng/µl dengan kualitas
RNA yang baik. Perlakuan kedua RNA disimpan pada suhu ruang, RNA
mengalami kerusakan setelah disimpan. Perlakuan ketiga dan keempat, RNA
ditambahkan sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C dan -200C,
setelah penyimpanan, RNA pada kedua perlakuan tersebut masih memiliki
kualitas yang baik. Perlakuan kelima dan keenam, RNA ditambahkan etanol
absolut dan disimpan pada 40C dan suhu ruang, setelah penyimpanan, RNA yang
ditambah etanol absolut pada suhu ruang mengalami kerusakan sedangkan yang
disimpan pada 40C masih mempunyai kualitas yang baik. Konsentrasi RNA
tertinggi setelah penyimpanan diperoleh pada perlakuan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut pada 40C yaitu bunga kakao sebesar 456 ng/µl, lateks
stimulan 2.358 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.368 ng/µl. Hasil RT-PCR RNA
tanpa perlakuan dengan RNA yang disimpan pada 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut memiliki ekspresi gen yang sama. Sehingga
disimpulkan bahwa RNA dapat disimpan pada suhu 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut.
ABSTRACT
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Quality and Quantity Maintenance
Method of Plant Ribonucleic Acid (RNA). Under the direction of MARIA
BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI.
The RNA’s instability was the main obstacle in maintaining and carying
the RNA that will be used as the biotechnological research parameter. The
research expected a new innovation in maintained plants’ RNA. Isolated RNA
incubated in six different treatments. The first treatment, RNA incubated in -400C
and concentration counted 1.204 ng/µl for cocoa flowers, 3.408 ng/µl for
stimulant latex and 1.374 ng/µl nonstimulant for latex with good RNA’s quality
for the samples after incubated. Having incubated in second treatment, normal
room temperature incubation, RNA was broke. In the third and the fourth
treatment, RNA was added with sodium acetate and absolute ethanol then each
incubated in 40C and -200C. Having kept for two months, RNA in third and fourth
treatment were still maitaining their good quality. The fifth and sixth treatment,
RNA was added with absolute ethanol than each kept in 40C and normal room
temperature. Having kept for two months, the RNA added with absolute ethanol
and incubated in normal room temperature was broke, in contrary, the RNA kept
in 40C still maintain its good quality. The highest RNA concentration after
incubation period was showed by sodium acetate and absolute ethanol in 40C
treatment. Which were 456 ng/µl for cocoa flowers, 2.358 ng/µl for stimulant
latex and 1.368 ng/µl for non stimulant latex. The result of RT-PCR RNA without
any treatments and the RNA that kept in 40C with addition of sodium acetate and
absolute ethanol shown the same gene expression. In summary, RNA can be kept
in 40C with the addition of sodium acetate and absolute ethanol.
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Bioimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi : Metode Mempertahankan Kualitas
Ribonukleat (RNA) Tanaman.
Nama
: M. Rezeki Muammar
NIM
: G44103005
dan
Kuantitas Asam
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S.
NIP 131 473 999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya
penulis dapat menyelesaikan penelitian ini beserta laporannya. Laporan ini
disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan mulai Januari sampai Juni
2007 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu
penulis selama penelitian maupun penyusunan laporan ini, antara lain kepada
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S. selaku pembimbing Utama, Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si. selaku pembimbing anggota, mbak Niyyah, mbak Herti, mas
Riza serta seluruh staf di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa
Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu dan seluruh keluarga yang
senantiasa memberi motivasi, doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh
karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan laporan ini.
Akhirnya penulis berharap agar laporan ini berguna untuk semua pihak.
Bogor, Juli 2007
M. Rezeki Muammar
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Aceh Pidie tepatnya di Sigli pada tanggal 17
September 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari ayah yang
bernama Jarir dan ibu bernama Nurila Nurdin.
Tahun 2003 penulis lulus dari MAS Jeumala Amal Lueng Putu dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB (USMI). Penulis menempuh studi di Program Studi Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
pengantar kultur jaringan S1 Biokimia pada tahun 2006/2007. Penulis melakukan
praktek kerja lapang di Laboratorium Plasma Nutfah, Pemuliaan dan Perbenihan,
Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik dari bulan Juli sampai Agustus
2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL.............................................................................................. …vi
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ...vii
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... ..viii
PENDAHULUAN ................................................................................................ ..1
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Ribonukleat (RNA) ........................................................................... ..1
Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT PCR)................... ..2
Sodium Asetat.............................................................................................. ..2
Etanol Absolut ............................................................................................. ..2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ............................................................................................ ..3
Metode Penelitian ........................................................................................ ..3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengukuran Konsentrasi dan Kualitas RNA Setelah Isolasi .............. ..5
Penyimpanan RNA dengan Beberapa Perlakuan ....................................... ..6
Penyimpanan RNA dengan Penambahan Sodium Asetat dan Etanol
Absolut serta disimpan pada suhu 40C ........................................................ ..8
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. ..9
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10
LAMPIRAN.......................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
2
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
3
Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan
selama 2 bulan................................................................................................. ..7
4
Hasil pengukuran konsentrasi RNA yang ditambah sodium asetat dan
etanol absolut kemudian disimpan pada suhu 40C selama 2 bulan................. ..9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Struktur sodium asetat.................................................................................... ..2
2
Struktur etanol................................................................................................ ..2
3
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..6
4
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..7
5
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
-400C ............................................................................................................. ..8
6
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
suhu ruang ..................................................................................................... ..8
7
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman
yang ditambah
sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C selama
2 bulan........................................................................................................... ..8
8
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah sodium
asetat dan etanol absolut serta disimpan pada - 200C selama 2 bulan ........... ..8
9
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada 40C selama 2 bulan ........................................... ..8
10 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada suhu ruang selama 2 bulan................................ ..8
11 Elektroforesis agarosa 1% setelah penyimpanan dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut pada 40C .................................................... ..9
12 Hasil RT-PCR RNA sampel........................................................................... ..9
13 Hasil RT-PCR RNA setelah penyimpanan dengan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut .............................................................................. 11
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Metode Mempertahankan Kualitas dan
Kuantitas Asam Ribonukleat (RNA) Tanaman. Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI.
Ketidakstabilan RNA merupakan sebuah hambatan untuk menyimpan dan
membawa RNA yang akan digunakan sebagai parameter penelitian bioteknologi.
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan inovasi baru penyimpanan RNA
tanaman. Molekul RNA disimpan dengan 6 perlakuan berbeda. Perlakuan pertama
disimpan pada -400C dan diperoleh konsentrasi bunga kakao sebesar 1.204 ng/µl,
lateks stimulan 3.408 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.374 ng/µl dengan kualitas
RNA yang baik. Perlakuan kedua RNA disimpan pada suhu ruang, RNA
mengalami kerusakan setelah disimpan. Perlakuan ketiga dan keempat, RNA
ditambahkan sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C dan -200C,
setelah penyimpanan, RNA pada kedua perlakuan tersebut masih memiliki
kualitas yang baik. Perlakuan kelima dan keenam, RNA ditambahkan etanol
absolut dan disimpan pada 40C dan suhu ruang, setelah penyimpanan, RNA yang
ditambah etanol absolut pada suhu ruang mengalami kerusakan sedangkan yang
disimpan pada 40C masih mempunyai kualitas yang baik. Konsentrasi RNA
tertinggi setelah penyimpanan diperoleh pada perlakuan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut pada 40C yaitu bunga kakao sebesar 456 ng/µl, lateks
stimulan 2.358 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.368 ng/µl. Hasil RT-PCR RNA
tanpa perlakuan dengan RNA yang disimpan pada 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut memiliki ekspresi gen yang sama. Sehingga
disimpulkan bahwa RNA dapat disimpan pada suhu 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut.
ABSTRACT
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Quality and Quantity Maintenance
Method of Plant Ribonucleic Acid (RNA). Under the direction of MARIA
BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI.
The RNA’s instability was the main obstacle in maintaining and carying
the RNA that will be used as the biotechnological research parameter. The
research expected a new innovation in maintained plants’ RNA. Isolated RNA
incubated in six different treatments. The first treatment, RNA incubated in -400C
and concentration counted 1.204 ng/µl for cocoa flowers, 3.408 ng/µl for
stimulant latex and 1.374 ng/µl nonstimulant for latex with good RNA’s quality
for the samples after incubated. Having incubated in second treatment, normal
room temperature incubation, RNA was broke. In the third and the fourth
treatment, RNA was added with sodium acetate and absolute ethanol then each
incubated in 40C and -200C. Having kept for two months, RNA in third and fourth
treatment were still maitaining their good quality. The fifth and sixth treatment,
RNA was added with absolute ethanol than each kept in 40C and normal room
temperature. Having kept for two months, the RNA added with absolute ethanol
and incubated in normal room temperature was broke, in contrary, the RNA kept
in 40C still maintain its good quality. The highest RNA concentration after
incubation period was showed by sodium acetate and absolute ethanol in 40C
treatment. Which were 456 ng/µl for cocoa flowers, 2.358 ng/µl for stimulant
latex and 1.368 ng/µl for non stimulant latex. The result of RT-PCR RNA without
any treatments and the RNA that kept in 40C with addition of sodium acetate and
absolute ethanol shown the same gene expression. In summary, RNA can be kept
in 40C with the addition of sodium acetate and absolute ethanol.
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Bioimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi : Metode Mempertahankan Kualitas
Ribonukleat (RNA) Tanaman.
Nama
: M. Rezeki Muammar
NIM
: G44103005
dan
Kuantitas Asam
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S.
NIP 131 473 999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya
penulis dapat menyelesaikan penelitian ini beserta laporannya. Laporan ini
disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan mulai Januari sampai Juni
2007 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu
penulis selama penelitian maupun penyusunan laporan ini, antara lain kepada
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S. selaku pembimbing Utama, Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si. selaku pembimbing anggota, mbak Niyyah, mbak Herti, mas
Riza serta seluruh staf di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa
Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu dan seluruh keluarga yang
senantiasa memberi motivasi, doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh
karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan laporan ini.
Akhirnya penulis berharap agar laporan ini berguna untuk semua pihak.
Bogor, Juli 2007
M. Rezeki Muammar
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Aceh Pidie tepatnya di Sigli pada tanggal 17
September 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari ayah yang
bernama Jarir dan ibu bernama Nurila Nurdin.
Tahun 2003 penulis lulus dari MAS Jeumala Amal Lueng Putu dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB (USMI). Penulis menempuh studi di Program Studi Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
pengantar kultur jaringan S1 Biokimia pada tahun 2006/2007. Penulis melakukan
praktek kerja lapang di Laboratorium Plasma Nutfah, Pemuliaan dan Perbenihan,
Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik dari bulan Juli sampai Agustus
2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL.............................................................................................. …vi
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ...vii
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... ..viii
PENDAHULUAN ................................................................................................ ..1
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Ribonukleat (RNA) ........................................................................... ..1
Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT PCR)................... ..2
Sodium Asetat.............................................................................................. ..2
Etanol Absolut ............................................................................................. ..2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ............................................................................................ ..3
Metode Penelitian ........................................................................................ ..3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengukuran Konsentrasi dan Kualitas RNA Setelah Isolasi .............. ..5
Penyimpanan RNA dengan Beberapa Perlakuan ....................................... ..6
Penyimpanan RNA dengan Penambahan Sodium Asetat dan Etanol
Absolut serta disimpan pada suhu 40C ........................................................ ..8
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. ..9
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10
LAMPIRAN.......................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
2
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
3
Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan
selama 2 bulan................................................................................................. ..7
4
Hasil pengukuran konsentrasi RNA yang ditambah sodium asetat dan
etanol absolut kemudian disimpan pada suhu 40C selama 2 bulan................. ..9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Struktur sodium asetat.................................................................................... ..2
2
Struktur etanol................................................................................................ ..2
3
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..6
4
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..7
5
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
-400C ............................................................................................................. ..8
6
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
suhu ruang ..................................................................................................... ..8
7
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman
yang ditambah
sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C selama
2 bulan........................................................................................................... ..8
8
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah sodium
asetat dan etanol absolut serta disimpan pada - 200C selama 2 bulan ........... ..8
9
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada 40C selama 2 bulan ........................................... ..8
10 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada suhu ruang selama 2 bulan................................ ..8
11 Elektroforesis agarosa 1% setelah penyimpanan dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut pada 40C .................................................... ..9
12 Hasil RT-PCR RNA sampel........................................................................... ..9
13 Hasil RT-PCR RNA setelah penyimpanan dengan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut .............................................................................. 11
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Tahapan penelitian ......................................................................................... 12
2
Tahapan penelitian ......................................................................................... 13
3
Isolasi RNA bark kakao, daun karet, tembakau dan kopi (Chaidamsari T
2005) .............................................................................................................. 14
4
Isolasi RNA lateks (CIRAD modification 2007) ........................................... 15
5
Isolasi RNA bunga kakao (Chaidamsari T 2005) .......................................... 16
6
Hasil pengukuran konsentrasi RNA setelah penyimpanan. ........................... 17
7
Pembuatan pereaksi. ....................................................................................... 19
PENDAHULUAN
Asam ribonukleat (RNA) merupakan salah
satu biomolekul yang memiliki beberapa
fungsi yang berbeda. Salah satu turunan dari
RNA adalah ribozim yang mengkatalisis
reaksi biokimia sebagaimana kerja enzim pada
umumnya. Sejak fungsi RNA yang dapat
berdisosiasi dengan DNA dan protein dapat
diketahui, RNA dianggap molekul biologis
orisinil sebagai bentuk molekul evolusi antara
DNA dengan protein.
Molekul RNA berperan penting pada
ekspresi gen dan biosintesis protein (Koolman
J et al 2000). Semua fungsi sel dan jaringan
diatur oleh ekspresi gen, oleh karena itu
alasan memilih untuk mempelajari atau
meneliti RNA sebagai salah satu parameter
biokimia seluler adalah karena keragaman
populasi intraseluler RNA itu sendiri (Farrell
RE 1993).
Molekul RNA adalah polimer panjang
yang
tidak
bercabang
dari
gugus
ribonukleotida monofosfat yang digabungkan
dengan ikatan fosfodiester. Secara kimia dan
biologi, molekul RNA bersifat tidak stabil
terutama pada suhu tinggi dan dalam keadaan
basa (Farrell RE 1993). Sifat molekul RNA
yang tidak stabil merupakan sebuah hambatan
untuk
melakukan
penelitian
yang
menggunakan RNA sebagai parameter
penelitian. Karena RNA bila disimpan dalam
waktu yang lama akan terdegradasi. Pada
umumnya penelitian yang melibatkan RNA,
molekul RNA harus disimpan pada suhu di
bawah -700C.
Telah diketahui sebelumnya bahwa pada
isolasi RNA tumbuhan, sodium asetat dan
etanol absolut sangat berperan penting yaitu
untuk mengendapkan RNA. Oleh sebab itu
diharapkan dengan penelitian ini dapat
menghasilkan
suatu
inovasi
baru
penyimpanan
RNA
tanaman
dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut.
Sampel RNA tanaman yang semula
disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu
-700C dapat disimpan pada suhu -200C, 40C
atau pada suhu ruang dengan penambahan
Sodium asetat dan etanol absolut atau etanol
absolut dengan memperoleh konsentrasi dan
tingkat kemurnian yang relatif tetap sama
serta tidak terdegradasi setelah disimpan
dalam jangka waktu tertentu. Sehingga
memudahkan membawa RNA tanaman dari
suatu laboraorium yang mempunyai material
atau sampel RNA tetapi tidak mempunyai
teknologi yang berhubungan dengan RNA ke
laboratorium lainnya yang mempunyai
teknologi yang berhubungan dengan RNA
tetapi tidak mempunyai material atau sampel.
Penelitian ini bertujuan untuk mencari
pelarut yang tepat untuk penyimpanan RNA
tanaman
guna
mempertahankan
kestabilannya.
Hipotesis penelitian ini adalah campuran
sodium asetat dan etanol absolut (0,1:3) atau
etanol absolut dapat memperpanjang masa
penyimpanan RNA tanaman.
Manfaat dari hasil penelitian ini
diharapkan dapat menemukan suatu metode
baru untuk penyimpanan RNA tanaman
sehingga mempermudah penanganan RNA
dari suatu tempat ke tempat lainnya yang
selanjutnya akan membantu penelitianpenelitian yang berhubungan dengan ekspresi
gen.
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Ribonukleat (RNA)
Asam ribonukleat (RNA) senyawa yang
merupakan bahan genetik dan memiliki peran
utama dalam ekspresi gen. Dalam dogma
pokok (central dogma) genetika molekuler,
RNA menjadi perantara antara informasi yang
dibawa DNA dan ekspresi fenotip yang
diwujudkan dalam bentuk protein.
Molekul RNA merupakan polimer panjang
yang
tidak
bercabang
dari
gugus
ribonukleotida monofosfat yang digabungkan
dengan ikatan fosfodiester. Monomer RNA
disebut nukleotida, strukturnya terdiri atas tiga
komponen utama, yaitu pentosa (ribosa atau
gula berkarbon 5), gugus fosfat, dan basa
nitrogen (purin dan pirimidin). Basa nitrogen
berikatan dengan pentosa membentuk
nukleosida. Selanjutnya ketika gugus fosfat
bergabung dengan nukleosida dengan ikatan
fosfodiester
maka
akan
membentuk
nukleotida (Farrell RE 1993). Polimer
tersusun dari ikatan berselang-seling antara
gugus fosfat suatu nukleotida dengan gugus
ribosa dari nukleotida yang lain.
Asam ribonukleotida (RNA) adalah salah
satu molekul asam nukleat yang dibentuk oleh
asam dioksiribonukleotida (DNA) yang
berfungsi untuk mensintesis protein di dalam
inti sel. Berdasarkan letak dan fungsinya RNA
dibagi tiga, yaitu messenger RNA (mRNA),
transport RNA (tRNA), dan ribosome RNA
(rRNA). mRNA berfungsi sebagai cetakan
dalam sintesis protein. tRNA berfungsi untuk
menterjemahkan kode-kode yang dibawa oleh
mRNA. Sedangkan rRNA tersimpan dalam
ribosom dan berperan aktif dalam proses
sintesis protein (Nurhadryani Y et al 2004).
Secara kimiawi, perbedaan utama antara
DNA dengan RNA adalah (1) gugus hidroksil
pada RNA bergabung dengan karbon posisi 2
pada gula ribosa sedangkan pada DNA tidak;
(2) pada RNA tidak terdapat basa timin tetapi
sebagai gantinya adalah basa urasil. Lebih
khusus, RNA disusun oleh prekursor
ribonukleotida sedangkan DNA disusun dari
prekursor deoksiribonukleotida. Selain itu
juga secara kimiawi dan biologis molekul
RNA lebih tidak stabil dibandingkan dengan
molekul DNA, terutama pada suhu tinggi dan
dalam keadaan basa (Farrell RE 1993).
Reverse Transcriptase Polimerase Chain
Reaction (RT PCR)
Teknik ini merupakan pengembangan dari
teknik PCR yang awal mulanya ditemukan
oleh Karry B. Mullis pada tahun 1985.
Metode PCR adalah suatu metode enzimatis
untuk melipatgandakan secara eksponensial
suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara
in-vitro.
Teknik RT PCR merupakan suatu
pengembangan dari teknik PCR untuk
melakukan analisis terhadap RNA hasil
transkripsi yang hanya terdapat dalam jumlah
yang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCR
yang dikembangkan sangat spesifik, sehingga
dapat digunakan walaupun jumlah RNA yang
akan dianalisis sedikit (Yowono T 2006).
Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan
dengan menggunakan RNA sebagai cetakan
maka harus terlebih dahulu dilakukan
transkripsi balik (reverse transcription)
terhadap molekul RNA sehingga diperoleh
molekul cDNA (complementary DNA).
Molekul
cDNA
tersebut
selanjutnya
digunakan sebagai cetakan untuk proses PCR
selanjutnya. Kegunaan teknik RT PCR antara
lain adalah untuk mendeteksi ekspresi gen,
untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan
kloning dan analisis, maupun untuk diagnosis
agensia infektif maupun penyakit genetik
(Yowono T 2006).
Teknik RT PCR memerlukan enzim
transkriptase balik (reverse transcriptase).
Enzim transkriptase balik adalah enzim yang
digunakan untuk mensintesis cDNA dengan
menggunakan RNA sebagai cetakan. cDNA
yang disintesis akan bersifat komplementer
dengan RNA cetakan. Beberapa enzim
transkriptase yang dapat digunakan antara lain
mesophilic viral reverse transcriptase (RTase)
yang dikode oleh virus Avian myoblastosis
(AMV) maupun oleh virus Moloney murine
leukemia (M-MuL V), dan Tth DNA
polymerase (Yowono T 2006).
Sodium Asetat
Sodium asetat merupakan garam sodium
dari asam asetat. Bahan ini merupakan bahan
kimia yang murah dan dapat digunakan secara
luas. Sebagai konjugat basa dari asam asetat,
sodium asetat merupakan senyawa yang relatif
bersifat basa kuat. Sebagai konjugat basa dari
asam lemah, larutan sodium asetat dan asam
asetat dapat berperan sebagai bufer untuk
menjaga pH konstan. Kegunaan ini sangat
penting terutama dalam aplikasi biokimia
yang reaksinya bergantung pada pH. Pada
isolasi RNA sodium asetat dapat digunakan
untuk mengendapkan RNA. Struktur sodium
asetat dapat dilihat pada Gambar 1.
Etanol Absolut
Etanol merupakan jenis alkohol yang
sering digunakan dalam kehidupan seharihari. Etanol berupa cairan jernih yang mudah
terbakar dengan titik didih sebesar 78.50C dan
titik beku sebesar -114.50C dan tergolong
dalam golongan asam lemah, oleh karena itu
etanol dapat digunakan sebagai bahan anti
beku. Selain itu etanol dapat mengubah
protein dan dapat melarutkan lipid. Etanol
dapat dibuat melalui sintesis kimia antara gas
etilen dengan uap air dan asam sebagai
katalis, umumnya katalis yang sering
digunakan adalah asam fosfat.
Etanol terbagi dalam beberapa tipe, salah
satunya adalah etanol absolut. Etanol absolut
atau alkohol anhidrat, biasa juga disebut
etanol terpurifikasi yaitu etanol yang
mengandung tidak lebih dari 1 persen air.
Struktur etanol dapat dilihat pada Gambar 2.
H
H
O
C
C
O -Na+
H
Gambar 1 Struktur sodium asetat
H
H
H
C
C
H
H
OH
Gambar 2 Struktur etanol
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
nitrogen (N2) cair, pereaksi pre-bufer ekstraksi
(pre-BE), LiCl 8 M, Sodium asetat 3,3M pH
5,2,
bufer
ekstraksi
(BE),
fenol:kloroform:isoamilalkohol
(25:24:1),
dietil pirokarbonat (DEPC),
akuabides,
polivinil pirolidin (PVP), polivinil poli
pirolidon (PPVP) kloroform:isoamilalkohol
(24:1), etonol 70%, etanol absolut, Kit sintesis
first stand cDNA (Fermentas), bufer PCR,
deoksi nukleotida trifosfat (dNTP), MgCl2,
primer , enzim Taq polimerase, agarosa,
etidium bromida (EtBr) dan akuades serta
sampel tumbuhan. Sampel yang digunakan
adalah kulit batang karet (stimulan dengan
eter dan nonstimulan), lateks (stimulan
dengan eter dan nonstimulan), daun karet,
bunga kakao, daun kopi (transgenik dan
nontransgenik), sawit hibrida dan embrio
kakao.
Alat-alat yang digunakan adalah penangas
air, sentrifus BECKMAN COULTER
AllegraTM dengan fixed angle rotor model
F0630-300 6x30ml, sentrifus DNA speed-vac®
DNA 110, pipet volumetrik, mikropipet,
pengaduk, tabung sentrifus, lemari pendingin,
autoklaf, tip, GeneAmp PCR (Poyimerase
Chain
Reaction)
system
2400,
spektrofotometer
UV-VIS
BECKMAN
COULTER-DU®530 , UV T2201 Sigma,
neraca analitik, mesin pengaduk, timbangan,
lemari asam, cetakan gel agarosa dan tabung
eppendroft.
Metode Penelitian
Isolasi RNA Tanaman
Isolasi RNA Kulit Batang Karet, Daun
Karet, dan Kopi (Chaidamsari T 2005).
Sebanyak 2 gram sampel digerus dengan N2
cair, lalu ditambahkan dengan 10 ml bufer
ekstraksi untuk RNA kulit batang dan daun.
Campuran tersebut dikocok dengan kuat dan
ditambah dengan 1 volume fenol:kloroform:
isoamilalkohol (25:24:1) yang kemudian di
aduk dengan mesin pengaduk 3 x 30 detik.
Selanjutnya campuran tersebut disentrifus
dengan kecepatan 15.000 rpm selama 15
menit pada suhu 40C, lalu lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru
yang kemudian diekstraksi lagi dengan
kloroform:isoamilalkohol
(24:1)
dan
disentrifus dengan kecepatan 15.000 rpm
selama 15 menit pada suhu 40C. Lapisan atas
yang diperoleh setelah sentrifus dipindahkan
ke dalam tabung sentrifus baru dan
ditambahkan dengan 1/30 volume Sodium
asetat 3,3 M pH 5,2 serta 1/10 etanol absolut
yang kemudian dikocok perlahan dan
disimpan di dalam es selama 30 menit.
Kemudian larutan tersebut disentrifus dengan
kecepatan 15.000 rpm selama 25 menit pada
suhu 40C, supernatan yang diperoleh dibuang
sedangkan pellet dicuci dengan alkohol 70%
dingin (8.000 rpm, 5 menit), lalu sisa etanol
tersebut diuapkan dan endapan dilarutkan
dengan larutan DEPC sebanyak 750 µl.
selanjutnya RNA dipisahkan dari DNA
dengan menambahkan LiCl 8 M sebanyak 250
µl (konsentrasi akhir 2 M), larutan tersebut
disimpan di dalam kulkas selama semalam.
Setelah disimpan selama semalam, larutan
tersebut sentrifus kembali dengan kecepatan
15.000 rpm selama 20 menit pada suhu 40C,
lalu endapan dibilas dengan etanol 70%
dingin (5.000 rpm, 5 menit) yang kemudian
dilarutkan dengan larutan DEPC sebanyak 50100 µl.
Isolasi
RNA
Lateks
(CIRAD
Modification 2007). Lateks beku yang telah
ditambahkan bufer ekstraksi untuk RNA
lateks dipanaskan dalam penangas air pada
suhu 500C selama satu jam, lalu disentrifus
dengan kecepatan 15.000 rpm pada suhu 200C
selama 30 menit. Setelah sentrifugasi, fraksi
putih dipindahkan ke dalam tabung sentrifus
baru dan diekstraksi dengan 1 volume fenol:
kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), lalu
sentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 40C selama 10 menit. Selanjutnya
lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus dan diekstraksi dengan 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C
selama 10 menit. Kemudian lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru
dan ditambah dengan 1/3 volume LiCl 8 M
dan disimpan pada suhu 40C selama satu
malam. Setelah disimpan satu malam,
disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 40C selama 30 menit. Selanjutnya
supernatan dibuang dan pellet dilarutkan
dengan 400 µl akuabides, lalu dipindahkan ke
dalam tabung kecil. Ekstraksi kembali dengan
1 volume fenol: kloroform: isoamilalkohol
(25:24:1), lalu sentrifus dengan kecepatan
10.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit.
Selanjutnya diekstraksi dengan 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C
selama 10 menit. Lapisan atas dipindahkan ke
dalam tabung baru dan ditambahkan dengan
0,1 volume sodium asetat dan 3 volume etanol
absolut. Kemudian disimpan pada suhu -400C
selama 3 jam. Setelah itu disentrifus dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama
30 menit, lalu cuci dengan etanol 70% dingin
(8.000 rpm, 5 menit). Sisa etanol diuapkan
dan pellet dilarutkan dengan 50-100 µl
akuabides.
Isolasi
RNA
Bunga
Kakao
(Chaidamsari T 2005). Sebanyak 1 gram
sampel bunga dan 0,3 gram PVP digerus
dengan nitrogen cair, lalu dimasukkan ke
dalam 20 ml bufer ekstraksi untuk bunga yang
telah ditambahkan 250 µl β-merkaptoetanol
dan telah dipanaskan pada penangas air 650C.
Kocok kuat dengan mesin pengaduk, lalu
inkubasi dalam penangas air pada suhu 650C
serta kocok setiap 15 menit. Selanjutnya
didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit,
kemudian diekstraksi dengan 1 volume fenol:
kloroform: isoamilalkohol (25:24:1), lalu
sentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm pada
suhu 250C selama 15 menit. Selanjutnya
lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus dan diekstraksi dengan 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 250C
selama 15 menit. Kemudian lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru
dan ditambah dengan LiCl 10 M hingga
konsentrasi akhir 2 M dan disimpan pada suhu
40C selama satu malam. Setelah disimpan satu
malam, disentrifus dengan kecepatan 17.000
rpm pada suhu 40C selama 30 menit.
Selanjutnya supernatan dibuang dan pellet
dilarutkan dengan 500 µl akuabides, lalu
dipindahkan ke dalam tabung kecil. Ekstraksi
kembali dengan 1 volume fenol: kloroform:
isoamilalkohol (25:24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C
selama 15 menit. Selanjutnya diekstraksi
dengan 1 volume kloroform:isoamilalkohol
(24:1), lalu sentrifus dengan kecepatan 12.000
rpm pada suhu 40C selama 15 menit. Lapisan
atas dipindahkan ke dalam tabung baru dan
ditambahkan dengan 0,1 volume sodium
asetat dan 3 volume etanol absolut. Kemudian
disimpan pada suhu -400C selama kurang
lebih 3 jam. Setelah itu disentrifus dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama
30 menit, lalu cuci dengan etanol 70% dingin
(8.000 rpm, 5 menit). Sisa etanol diuapkan
dan pellet dilarutkan dengan 50-100 µl
akuabides.
Pengukuran Konsentrasi dan Pengecekan
Kemurnian RNA.
Pengukuran
Konsentrasi
RNA.
Sebanyak 3 µl RNA dilarutkan dengan 297 µl
larutan DEPC. Selanjutnya larutan tersebut
diukur
absorbansinya
pada
panjang
gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm.
Konsentrasi RNA dapat dengan rumus:
Konsentrasi RNA = A 260 x 40 ng/ml x fp
dengan A260 adalah absorbansi pada panjang
gelombang 260 dan fp adalah faktor
pengenceran.
Kemurnian RNA dapat dihitung dengan
perbandingan absorbans 260 nm/230 nm. Bila
perbandingannya lebih dari 2,0 maka dapat
dikatakan bahwa RNA tersebut murni.
Pengecekan
Kualitas
RNA
Elektroforesis Gel Agarosa 1%.
dengan
Sebelum
melakukan
elektroforesis
agarosa, harus terlebih dahulu dibuat gel
agarosa 1%. Gel agarosa 1% dibuat dengan
cara mencampurkan 0,3000 gram agarosa
dengan 30 ml TBE 0,5x. Selanjutnya
campuran tersebut dipanaskan sampai larut,
lalu didinginkan dan ditambah dengan 1,5 µl
etidium bromida (EtBr). Kemudian larutan
tersebut dimasukkan ke dalam cetakan dan di
tunggu sampai padat.
Larutan RNA dicampurkan loading buffer
dengan perbandingan 1: 5. Sementara itu gel
tersebut dimasukkan ke dalam wadah yang
berisi TBE 0.5x sampai gel tersebut terendam.
Selanjutnya campuran tersebut dimasukkan ke
dalam sumur yang ada pada gel agarosa
dengan mikropipet yang kemudian dialiri
dengan arus listrik sebesar 50 atau 25 volt
selama 60 sampai 120 menit.
Penyimpanan RNA
Sampel
RNA bunga kakao, lateks
stimulan dan lateks nonstimulan yang telah
diketahui konsentrasinya dan kemurniannya
kemudian di bagi menjadi 6 bagian, bagian
pertama langsung disimpan pada suhu -400C
sebagai kontrol positif. Bagian kedua dan
ketiga ditambahkan dengan 0,1 volume
Sodium asetat 3,3 M pH 5,2 dan 3 volume
etanol absolut dan masing-masing disimpan
pada suhu -200C dan pada 40C. Bagian
Keempat dan bagian kelima ditambahkan
dengan etanol absolut dan masing-masing
disimpan pada suhu 40C dan pada suhu ruang.
Bagian keenam langsung disimpan pada suhu
ruang sebagai kontrol negatif. Penyimpanan
dilakukan selama 2 bulan.
Setelah dilakukan penyimpanan, RNA
kembali diukur konsentrasinya dan dipisahkan
dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Pengukuran konsentrasi dan elektroforesis
dilakukan untuk melihat konsentrasi dan
kemurnian RNA setelah penyimpanan selama
2 bulan dengan perlakuan dan kontrol yang
kemudian
akan
dibandingkan
dengan
konsentrasi RNA sebelum penyimpanan.
Sehingga diperoleh metode penyimpanan
RNA yang terbaik.
Metode terbaik yang diperoleh kemudian
diulangi kembali pada sampel kulit batang
karet (stimulan dan nonstimulan), daun karet,
sawit hibrida, kopi (transgenik dan
nontransgenik),
lateks
(stimulan
dan
nonstimulan), dan embrio kakao. Selanjutnya
setelah disimpan dengan perlakuan RNA
tersebut
diukur
konsentrasi
dan
di
elektroforesis gel agarosa untuk mengetahui
konsentrasi, kemurnian dan keutuhannya,
setelah itu RNA tersebut di RT-PCR untuk
mengetahui dapat atau tidaknya terekspresi
gen.
Reverse Transcriptase Polimerase Chain
Reaction (RT PCR)
Selain dengan mengukur konsentrasi dan
elektroforesis gel agarosa RNA juga di RTPCR untuk mengetahui dapat atau tidaknya
RNA tersebut terekspresi gen setelah
perlakuan dan penyimpanan. Sintesis cDNA
dilakukan dengan cara melarutkan 2 µg RNA
dengan 1µl dNTP dan 1µl oligo dT, lalu
ditambahkan dengan akuabides hingga
volume 12 µl. Selanjutnya dipanaskan dengan
mesin PCR pada suhu 650C selama 5 menit.
Setelah itu segera dimasukan ke dalam es dan
ditambahkan dengan 4 µl bufer RT, 2 µl DTT
dan 1 µl inhibitor RNAse, lalu kocok pelanpelan dan inkubasi pada suhu 420C selama 2
menit pada mesin PCR. Kemudian buka tutup
PCR dan langsung tambahkan dengan 1 µl
enzim reverse transcriptase (revert Aid MMulV). Selanjutnya inkubasi pada suhu 420C
selama 50 menit, lalu dengan suhu 700C
selama 15 menit. Setelah itu keluarkan dari
mesin PCR dan simpan pada suhu -400C.
Total cDNA yang diperoleh adalah 20 µl.
Reaksi PCR dilakukan dengan cara
melarutkan 1 µl cDNA dengan 5 µl bufer, 0,5
µl MgCL2, 1 µl dNTP, 1 µl primer gene
forward, 1 µl primer gene backward, 1 µl
primer actin forward, 1 µl primer actin
backward dan 1 µl enzim Taq polimerase, lalu
ditambahkan dengan larutan DEPC hingga
volume total 50 µl. Selanjutnya dimasukkan
ke dalam mesin PCR yang telah diprogram
dengan suhu denaturasi 940C, suhu annealing
550C dan suhu elongasi 720C.
Untuk mengetahui hasil RT-PCR RNA
yang telah disimpan dengan perlakuan dan
kontrol, cDNA hasil RT-PCR dengan RNA
(kontrol dan perlakuan) yang telah disimpan
sebagai
cetakan
dipisahkan
dengan
elektroforesis gel agarosa 1%. Hasil
elektroforesis ini juga akan dibandingkan
antara cDNA dengan cetakan RNA yang
mengalami perlakuan dengan cDNA dengan
RNA tidak mengalami perlakuan (kontrol).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengukuran Konsentrasi dan
Kualitas RNA Setelah Isolasi
Kuantitas RNA dapat diperoleh dengan
cara mengukur konsentrasi RNA sampel,
untuk bunga kakao diperoleh konsentrasi
sebesar 1.488 ng/µl, lateks stimulan sebesar
3.616 ng/µl dan lateks nonstimulan sebesar
1.628 ng/µl (Tabel 1). Sedangkan untuk
sampel kulit karet, daun karet, kopi, sawit
hibrida, dan embrio kakao diperoleh
konsentrasi yang bervariasi mulai dari yang
terendah sebesar 288 ng/µl untuk RNA sawit
hibrida sampai yang terbesar sebesar 744
ng/µl untuk RNA lateks stimulan (Tabel 2).
Pengukuran konsentrasi RNA dilakukan
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 nm. Selanjutnya
dengan absorbansi RNA pada panjang
gelombang tersebut dihitung konsentrasinya
dengan rumus: [RNA] = A 260 x 40 x fp.
dengan A 260 adalah absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dan fp adalah faktor
pengenceran. Selain pada panjang gelombang
260 nm RNA juga diukur
absorbansinya
pada
panjang gelombang 280 nm untuk
mengetahui kemurnian RNA tersebut.
Molekul RNA yang murni mempunyai
perbandingan
absorban
pada
panjang
gelombang 260/280 nm lebih dari 2,0. Bila
perbandingan absorbans pada panjang
gelombang 260/280nm kurang dari 2.0, pada
RNA tersebut masih terdapat pengotor (Farrell
RE 1993).
Sampel RNA bunga kakao, lateks stimulan
dan lateks nonstimulan mempunyai kualitas
yang baik dengan menghasilkan 2 pita yang
utuh ketika dipisahkan dengan elektroforesis
gel agarosa 1% (Gambar 3). Begitu pula untuk
Tabel 1 Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer
Sampel
A 260 nm
A 280 nm
A260/280
Bungan kakao
Lateks stimulan
Lateks nonstimulan
0,372
0,904
0,407
0,229
0,471
0,214
1,624
1,919
1,902
Konsentrasi
(ng/µl)
1.488
3.616
1.628
Tabel 2 Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer
No Sampel
A 260
A 280
A 230
260/280
260/230
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,339
0,336
0,988
1,132
1,240
2,005
1,964
1,576
1,788
Kulit karet stimulan
Kulit karet nonstimulan
Daun karet
Sawit hibrida
Kopi non trangenik
Kopi transgenik
Lateks stimulan
Lateks nonstimulan
Embrio kakao
0,120
0,146
0,177
0,072
0,118
0,068
0,186
0,117
0,137
0,089
0,110
0,104
0,058
0,081
0,035
0,087
0,056
0,066
untuk sampel RNA kulit karet, daun karet,
kopi, sawit hibrida, dan embrio kakao juga
mempunyai kualitas RNA yang baik dengan
menghasilkan 2 pita yang utuh ketika
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa
1% (Gambar 4). Kualitas RNA diamati
dengan melakukan elektroforesis gel agarosa
1%. Adanya RNA yang utuh ditandai dengan
adanya 2 buah pita yang utuh pada gel agarosa
ketika dilihat dengan menggunakan sinar
ultraviolet, semakin tebal pita tersebut terlihat
semakin bagus pula RNA yang diperoleh. Bila
pada gel agarosa hanya terlihat 2 pita yang
tidak utuh maka RNA yang diperoleh telah
terdegradasi atau rusak (Farrell RE 1993).
Sebelum
dilakukan
pengukuran
konsentrasi dan kualitas RNA, terlebih dahulu
dilakukan isolasi RNA dari sampel tanaman
yang akan digunakan untuk penelitian. Isolasi
RNA tanaman terdiri atas 3 tahap yaitu tahap
pemecahan dinding sel yang meliputi
penggerusan sampel dengan N2 cair dan
penambahan bufer ektraksi yang berfungsi
untuk memecah dinding sel, selanjutnya
adalah tahap isolasi RNA yang meliputi
ekstraksi
dengan
fenol:kloroform:
isoamilalkohol
(25:24:1),
kloroform:
isoamilalkohol (24:1) yang berfungsi untuk
memisahkan lemak, protein dan glukosa serta
pengotor lainnya, dan pengendapan RNA
dengan etanol absolut dan sodium asetat,
tahap selanjutnya adalah tahap pemurnian
RNA
yang meliputi penambahan LiCl 8
M yang berfungsi untuk memisahkan DNA
dengan RNA dan pencucian dengan etanol
70%.
0,300
0,436
0,180
0,063
0,095
0,034
0,094
0,066
0,077
1,339
1,325
1,700
1,239
1,457
1,954
2,144
2,075
2,070
[]
(ng/µl)
480
584
708
288
472
272
744
468
548
Penyimpanan RNA dengan Beberapa
Perlakuan
Setelah RNA yang diperoleh disimpan
selama 2 bulan dengan beberapa perlakuan.
RNA tersebut diukur kembali konsentrasi dan
kualitas
dengan
menggunakan
spektrofotometer dan elektroforesis gel
agarosa 1%. Konsentrasi RNA tertinggi
setelah dilakukan penyimpanan selama 2
bulan diperoleh pada perlakuan dengan
menambahkan sodium asetat dan etanol
absolut serta disimpan pada suhu 40C.
Konsentrasi RNA yang diperoleh pada
perlakuan tersebut adalah 456 ng/µl untuk
RNA bunga kakao, 2.358 ng/µl untuk RNA
lateks stimulan dan 1.368 ng/µl untuk RNA
lateks nonstimulan . Konsentrasi tersebut
masih lebih rendah dibandingkan dengan
konsentrasi RNA kontrol positif yaitu 1.204
ng/µl untuk RNA bunga kakao, 3.408 ng/µl
untuk RNA lateks stimulan dan 1.374 ng/µl
untuk RNA lateks nonstimulan . Konsentarsi
yang lebih rendah dari pada konsentrasi RNA
1
2 3
Gambar 3 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%
RNA tanaman. Keterangan: (1)
RNA bunga kakao, (2) RNA
leteks stimulan, (3) RNA lateks
nonstimulan
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar 4 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%
RNA tanaman. Keterangan: (1&2)
RNA kulit batang karet stimulan
dan nonstimulan , (3) RNA daun
karet, (4) RNA sawit hibrida,
(5&6) RNA kopi transgenik dan
non trasngenik, (7&8) RNA lateks
stimulan dan nonstimulan , (9)
RNA embrio kakao
dengan penambahan sodium asetat dan etanol
absolut dan disimpan pada 40C diperoleh
pada perlakuan-perlakuan yang lainnya.
Konsentrasi RNA yang diperoleh dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut
serta disimpan pada suhu -200C adalah 402
ng/µl untuk RNA bunga kakao, 1.200 ng/µl
untuk RNA lateks stimulan dan 1.074 ng/µl
untuk RNA lateks nonstimulan , dengan
penambahan etanol absolut dan disimpan
pada suhu 40C diperoleh konsentrasi RNA
sebesar 276 ng/µl untuk RNA bunga kakao,
1.446 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan
546 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan, dan
dengan penambahan etanol serta disimpan
pada suhu ruang diperoleh konsentrasi RNA
sebesar -54 ng/µl untuk RNA bunga kakao,
3.732 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan
684 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan
(Tabel 3).
Selain diperoleh kuantitas, juga diperoleh
kualitas RNA setelah penyimpanan selama 2
bulan dengan perlakuan. Sampel RNA yang
disimpan pada suhu 400C sebagai kontrol
positif mempunyai kualitas RNA yang sangat
baik dengan menghasilkan 2 pita yang utuh
dan tebal ketika dipisahkan dengan
elektroforesis gel agarosa 1% (Gambar 5).
Berbeda dengan sampel RNA yang disimpan
pada suhu ruang sebagai kontrol negatif akan
terdegradasi dan mengalami kerusakan, ketika
dipisahkan dengan elektroforesis
tidak
menunjukkan 2 pita yang utuh (Gambar 6).
Penyimpanan RNA pada 40C dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut
mempunyai kualitas RNA yang baik setelah
penyimpanan walaupun pita yang terbentuk
ketika elektroforesis tidak setebal pita yang
terbentuk pada kontrol positif (Gambar 7).
Begitu pula untuk penyimpanan pada suhu 200C dengan penambahan sodium asetat dan
etanol absolut (Gambar 8) dan penyimpanan
pada suhu 40C dengan penambahan etanol
absolut (Gambar 9) juga memiliki kualitas
RNA
yang
baik.
Sedangkan
pada
penyimpanan pada suhu ruang dengan
penambahan etanol absolut akan mengalami
kerusakan (Gambar 10).
Walaupun RNA yang diberi perlakuan
kualitasnya
berkurang
tetapi
karena
konsentrasinya masih tinggi, RNA tersebut
masih bisa digunakan untuk penelitian
selanjutnya. Metode penyimpanan RNA
terbaik berdasarkan perlakuan yang dilakukan
adalah RNA yang ditambahkan sodium asetat
Tabel 3 Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan selama 2 bulan
Perlakuan
Suhu
Sampel
Konsentrasi setelah
penyimpanan
penyimpanan
Bunga kakao
1.204
RNA
- 400C
Lateks stimulan
3.408
Lateks nonstimulan
1.374
Bunga kakao
756
RNA
Suhu ruang
Lateks stimulan
5.192
Lateks nonstimulan
2.248
Bunga kakao
456
RNA dengan
penambahan sodium
40C
Lateks stimulan
2.358
asetat dan etanol absolut
Lateks nonstimulan
1.368
Bunga kakao
402
RNA dengan
penambahan sodium
-200C
Lateks stimulan
1.200
asetat dan etanol absolut
Lateks nonstimulan
1.074
Bunga kakao
276
RNA dengan
penambahan etanol
40C
Lateks stimulan
1.446
absolut
Lateks nonstimulan
546
Bunga kakao
-54
RNA dengan
penambahan etanol
Suhu ruang
Lateks stimulan
3.732
absolut
Lateks nonstimulan
684
1
2
3
Gambar 5 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman yang disimpan pada 400C. Keterangan: (1) RNA bunga
kakao, (2) RNA leteks stimulan,
(3) RNA lateks nonstimulan
1
2
3
Gambar 6 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman yang disimpan pada suhu
ruang Keterangan: (1) RNA bunga
kakao, (2) RNA leteks stimulan,
(3) RNA lateks nonstimulan
1
2
3
Gambar 7 Elektoforesis gel agarosa
1%
RNA
tanaman
yang
ditambah sodium asetat dan etanol
absolut serta disimpan pada 40C
sel
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Metode Mempertahankan Kualitas dan
Kuantitas Asam Ribonukleat (RNA) Tanaman. Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI.
Ketidakstabilan RNA merupakan sebuah hambatan untuk menyimpan dan
membawa RNA yang akan digunakan sebagai parameter penelitian bioteknologi.
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan inovasi baru penyimpanan RNA
tanaman. Molekul RNA disimpan dengan 6 perlakuan berbeda. Perlakuan pertama
disimpan pada -400C dan diperoleh konsentrasi bunga kakao sebesar 1.204 ng/µl,
lateks stimulan 3.408 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.374 ng/µl dengan kualitas
RNA yang baik. Perlakuan kedua RNA disimpan pada suhu ruang, RNA
mengalami kerusakan setelah disimpan. Perlakuan ketiga dan keempat, RNA
ditambahkan sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C dan -200C,
setelah penyimpanan, RNA pada kedua perlakuan tersebut masih memiliki
kualitas yang baik. Perlakuan kelima dan keenam, RNA ditambahkan etanol
absolut dan disimpan pada 40C dan suhu ruang, setelah penyimpanan, RNA yang
ditambah etanol absolut pada suhu ruang mengalami kerusakan sedangkan yang
disimpan pada 40C masih mempunyai kualitas yang baik. Konsentrasi RNA
tertinggi setelah penyimpanan diperoleh pada perlakuan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut pada 40C yaitu bunga kakao sebesar 456 ng/µl, lateks
stimulan 2.358 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.368 ng/µl. Hasil RT-PCR RNA
tanpa perlakuan dengan RNA yang disimpan pada 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut memiliki ekspresi gen yang sama. Sehingga
disimpulkan bahwa RNA dapat disimpan pada suhu 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut.
ABSTRACT
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Quality and Quantity Maintenance
Method of Plant Ribonucleic Acid (RNA). Under the direction of MARIA
BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI.
The RNA’s instability was the main obstacle in maintaining and carying
the RNA that will be used as the biotechnological research parameter. The
research expected a new innovation in maintained plants’ RNA. Isolated RNA
incubated in six different treatments. The first treatment, RNA incubated in -400C
and concentration counted 1.204 ng/µl for cocoa flowers, 3.408 ng/µl for
stimulant latex and 1.374 ng/µl nonstimulant for latex with good RNA’s quality
for the samples after incubated. Having incubated in second treatment, normal
room temperature incubation, RNA was broke. In the third and the fourth
treatment, RNA was added with sodium acetate and absolute ethanol then each
incubated in 40C and -200C. Having kept for two months, RNA in third and fourth
treatment were still maitaining their good quality. The fifth and sixth treatment,
RNA was added with absolute ethanol than each kept in 40C and normal room
temperature. Having kept for two months, the RNA added with absolute ethanol
and incubated in normal room temperature was broke, in contrary, the RNA kept
in 40C still maintain its good quality. The highest RNA concentration after
incubation period was showed by sodium acetate and absolute ethanol in 40C
treatment. Which were 456 ng/µl for cocoa flowers, 2.358 ng/µl for stimulant
latex and 1.368 ng/µl for non stimulant latex. The result of RT-PCR RNA without
any treatments and the RNA that kept in 40C with addition of sodium acetate and
absolute ethanol shown the same gene expression. In summary, RNA can be kept
in 40C with the addition of sodium acetate and absolute ethanol.
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Bioimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi : Metode Mempertahankan Kualitas
Ribonukleat (RNA) Tanaman.
Nama
: M. Rezeki Muammar
NIM
: G44103005
dan
Kuantitas Asam
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S.
NIP 131 473 999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya
penulis dapat menyelesaikan penelitian ini beserta laporannya. Laporan ini
disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan mulai Januari sampai Juni
2007 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu
penulis selama penelitian maupun penyusunan laporan ini, antara lain kepada
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S. selaku pembimbing Utama, Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si. selaku pembimbing anggota, mbak Niyyah, mbak Herti, mas
Riza serta seluruh staf di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa
Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu dan seluruh keluarga yang
senantiasa memberi motivasi, doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh
karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan laporan ini.
Akhirnya penulis berharap agar laporan ini berguna untuk semua pihak.
Bogor, Juli 2007
M. Rezeki Muammar
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Aceh Pidie tepatnya di Sigli pada tanggal 17
September 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari ayah yang
bernama Jarir dan ibu bernama Nurila Nurdin.
Tahun 2003 penulis lulus dari MAS Jeumala Amal Lueng Putu dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB (USMI). Penulis menempuh studi di Program Studi Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
pengantar kultur jaringan S1 Biokimia pada tahun 2006/2007. Penulis melakukan
praktek kerja lapang di Laboratorium Plasma Nutfah, Pemuliaan dan Perbenihan,
Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik dari bulan Juli sampai Agustus
2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL.............................................................................................. …vi
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ...vii
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... ..viii
PENDAHULUAN ................................................................................................ ..1
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Ribonukleat (RNA) ........................................................................... ..1
Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT PCR)................... ..2
Sodium Asetat.............................................................................................. ..2
Etanol Absolut ............................................................................................. ..2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ............................................................................................ ..3
Metode Penelitian ........................................................................................ ..3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengukuran Konsentrasi dan Kualitas RNA Setelah Isolasi .............. ..5
Penyimpanan RNA dengan Beberapa Perlakuan ....................................... ..6
Penyimpanan RNA dengan Penambahan Sodium Asetat dan Etanol
Absolut serta disimpan pada suhu 40C ........................................................ ..8
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. ..9
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10
LAMPIRAN.......................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
2
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
3
Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan
selama 2 bulan................................................................................................. ..7
4
Hasil pengukuran konsentrasi RNA yang ditambah sodium asetat dan
etanol absolut kemudian disimpan pada suhu 40C selama 2 bulan................. ..9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Struktur sodium asetat.................................................................................... ..2
2
Struktur etanol................................................................................................ ..2
3
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..6
4
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..7
5
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
-400C ............................................................................................................. ..8
6
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
suhu ruang ..................................................................................................... ..8
7
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman
yang ditambah
sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C selama
2 bulan........................................................................................................... ..8
8
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah sodium
asetat dan etanol absolut serta disimpan pada - 200C selama 2 bulan ........... ..8
9
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada 40C selama 2 bulan ........................................... ..8
10 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada suhu ruang selama 2 bulan................................ ..8
11 Elektroforesis agarosa 1% setelah penyimpanan dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut pada 40C .................................................... ..9
12 Hasil RT-PCR RNA sampel........................................................................... ..9
13 Hasil RT-PCR RNA setelah penyimpanan dengan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut .............................................................................. 11
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Metode Mempertahankan Kualitas dan
Kuantitas Asam Ribonukleat (RNA) Tanaman. Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARI.
Ketidakstabilan RNA merupakan sebuah hambatan untuk menyimpan dan
membawa RNA yang akan digunakan sebagai parameter penelitian bioteknologi.
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan inovasi baru penyimpanan RNA
tanaman. Molekul RNA disimpan dengan 6 perlakuan berbeda. Perlakuan pertama
disimpan pada -400C dan diperoleh konsentrasi bunga kakao sebesar 1.204 ng/µl,
lateks stimulan 3.408 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.374 ng/µl dengan kualitas
RNA yang baik. Perlakuan kedua RNA disimpan pada suhu ruang, RNA
mengalami kerusakan setelah disimpan. Perlakuan ketiga dan keempat, RNA
ditambahkan sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C dan -200C,
setelah penyimpanan, RNA pada kedua perlakuan tersebut masih memiliki
kualitas yang baik. Perlakuan kelima dan keenam, RNA ditambahkan etanol
absolut dan disimpan pada 40C dan suhu ruang, setelah penyimpanan, RNA yang
ditambah etanol absolut pada suhu ruang mengalami kerusakan sedangkan yang
disimpan pada 40C masih mempunyai kualitas yang baik. Konsentrasi RNA
tertinggi setelah penyimpanan diperoleh pada perlakuan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut pada 40C yaitu bunga kakao sebesar 456 ng/µl, lateks
stimulan 2.358 ng/µl dan lateks nonstimulan 1.368 ng/µl. Hasil RT-PCR RNA
tanpa perlakuan dengan RNA yang disimpan pada 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut memiliki ekspresi gen yang sama. Sehingga
disimpulkan bahwa RNA dapat disimpan pada suhu 40C dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut.
ABSTRACT
MUHAMMAD REZEKI MUAMMAR. Quality and Quantity Maintenance
Method of Plant Ribonucleic Acid (RNA). Under the direction of MARIA
BINTANG and TETTY CHAIDAMSARI.
The RNA’s instability was the main obstacle in maintaining and carying
the RNA that will be used as the biotechnological research parameter. The
research expected a new innovation in maintained plants’ RNA. Isolated RNA
incubated in six different treatments. The first treatment, RNA incubated in -400C
and concentration counted 1.204 ng/µl for cocoa flowers, 3.408 ng/µl for
stimulant latex and 1.374 ng/µl nonstimulant for latex with good RNA’s quality
for the samples after incubated. Having incubated in second treatment, normal
room temperature incubation, RNA was broke. In the third and the fourth
treatment, RNA was added with sodium acetate and absolute ethanol then each
incubated in 40C and -200C. Having kept for two months, RNA in third and fourth
treatment were still maitaining their good quality. The fifth and sixth treatment,
RNA was added with absolute ethanol than each kept in 40C and normal room
temperature. Having kept for two months, the RNA added with absolute ethanol
and incubated in normal room temperature was broke, in contrary, the RNA kept
in 40C still maintain its good quality. The highest RNA concentration after
incubation period was showed by sodium acetate and absolute ethanol in 40C
treatment. Which were 456 ng/µl for cocoa flowers, 2.358 ng/µl for stimulant
latex and 1.368 ng/µl for non stimulant latex. The result of RT-PCR RNA without
any treatments and the RNA that kept in 40C with addition of sodium acetate and
absolute ethanol shown the same gene expression. In summary, RNA can be kept
in 40C with the addition of sodium acetate and absolute ethanol.
METODE MEMPERTAHANKAN KUALITAS DAN
KUANTITAS ASAM RIBONUKLEAT (RNA) TANAMAN
M. REZEKI MUAMMAR
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Bioimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi : Metode Mempertahankan Kualitas
Ribonukleat (RNA) Tanaman.
Nama
: M. Rezeki Muammar
NIM
: G44103005
dan
Kuantitas Asam
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si.
Anggota
Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S.
NIP 131 473 999
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya
penulis dapat menyelesaikan penelitian ini beserta laporannya. Laporan ini
disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan mulai Januari sampai Juni
2007 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu
penulis selama penelitian maupun penyusunan laporan ini, antara lain kepada
Prof.Dr.drh. Maria Bintang, M.S. selaku pembimbing Utama, Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si. selaku pembimbing anggota, mbak Niyyah, mbak Herti, mas
Riza serta seluruh staf di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa
Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. Ucapan
terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu dan seluruh keluarga yang
senantiasa memberi motivasi, doa dan kasih sayangnya.
Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh
karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran demi kesempurnaan laporan ini.
Akhirnya penulis berharap agar laporan ini berguna untuk semua pihak.
Bogor, Juli 2007
M. Rezeki Muammar
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Aceh Pidie tepatnya di Sigli pada tanggal 17
September 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari ayah yang
bernama Jarir dan ibu bernama Nurila Nurdin.
Tahun 2003 penulis lulus dari MAS Jeumala Amal Lueng Putu dan pada
tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk
IPB (USMI). Penulis menempuh studi di Program Studi Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
pengantar kultur jaringan S1 Biokimia pada tahun 2006/2007. Penulis melakukan
praktek kerja lapang di Laboratorium Plasma Nutfah, Pemuliaan dan Perbenihan,
Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik dari bulan Juli sampai Agustus
2006.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL.............................................................................................. …vi
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... ...vii
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... ..viii
PENDAHULUAN ................................................................................................ ..1
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Ribonukleat (RNA) ........................................................................... ..1
Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT PCR)................... ..2
Sodium Asetat.............................................................................................. ..2
Etanol Absolut ............................................................................................. ..2
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ............................................................................................ ..3
Metode Penelitian ........................................................................................ ..3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengukuran Konsentrasi dan Kualitas RNA Setelah Isolasi .............. ..5
Penyimpanan RNA dengan Beberapa Perlakuan ....................................... ..6
Penyimpanan RNA dengan Penambahan Sodium Asetat dan Etanol
Absolut serta disimpan pada suhu 40C ........................................................ ..8
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. ..9
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10
LAMPIRAN.......................................................................................................... 11
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
2
Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer....................... ..6
3
Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan
selama 2 bulan................................................................................................. ..7
4
Hasil pengukuran konsentrasi RNA yang ditambah sodium asetat dan
etanol absolut kemudian disimpan pada suhu 40C selama 2 bulan................. ..9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Struktur sodium asetat.................................................................................... ..2
2
Struktur etanol................................................................................................ ..2
3
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..6
4
Hasil elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman ........................................ ..7
5
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
-400C ............................................................................................................. ..8
6
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang disimpan pada
suhu ruang ..................................................................................................... ..8
7
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman
yang ditambah
sodium asetat dan etanol absolut serta disimpan pada 40C selama
2 bulan........................................................................................................... ..8
8
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah sodium
asetat dan etanol absolut serta disimpan pada - 200C selama 2 bulan ........... ..8
9
Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada 40C selama 2 bulan ........................................... ..8
10 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA tanaman yang ditambah etanol
absolut serta disimpan pada suhu ruang selama 2 bulan................................ ..8
11 Elektroforesis agarosa 1% setelah penyimpanan dengan penambahan
sodium asetat dan etanol absolut pada 40C .................................................... ..9
12 Hasil RT-PCR RNA sampel........................................................................... ..9
13 Hasil RT-PCR RNA setelah penyimpanan dengan penambahan sodium
asetat dan etanol absolut .............................................................................. 11
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1
Tahapan penelitian ......................................................................................... 12
2
Tahapan penelitian ......................................................................................... 13
3
Isolasi RNA bark kakao, daun karet, tembakau dan kopi (Chaidamsari T
2005) .............................................................................................................. 14
4
Isolasi RNA lateks (CIRAD modification 2007) ........................................... 15
5
Isolasi RNA bunga kakao (Chaidamsari T 2005) .......................................... 16
6
Hasil pengukuran konsentrasi RNA setelah penyimpanan. ........................... 17
7
Pembuatan pereaksi. ....................................................................................... 19
PENDAHULUAN
Asam ribonukleat (RNA) merupakan salah
satu biomolekul yang memiliki beberapa
fungsi yang berbeda. Salah satu turunan dari
RNA adalah ribozim yang mengkatalisis
reaksi biokimia sebagaimana kerja enzim pada
umumnya. Sejak fungsi RNA yang dapat
berdisosiasi dengan DNA dan protein dapat
diketahui, RNA dianggap molekul biologis
orisinil sebagai bentuk molekul evolusi antara
DNA dengan protein.
Molekul RNA berperan penting pada
ekspresi gen dan biosintesis protein (Koolman
J et al 2000). Semua fungsi sel dan jaringan
diatur oleh ekspresi gen, oleh karena itu
alasan memilih untuk mempelajari atau
meneliti RNA sebagai salah satu parameter
biokimia seluler adalah karena keragaman
populasi intraseluler RNA itu sendiri (Farrell
RE 1993).
Molekul RNA adalah polimer panjang
yang
tidak
bercabang
dari
gugus
ribonukleotida monofosfat yang digabungkan
dengan ikatan fosfodiester. Secara kimia dan
biologi, molekul RNA bersifat tidak stabil
terutama pada suhu tinggi dan dalam keadaan
basa (Farrell RE 1993). Sifat molekul RNA
yang tidak stabil merupakan sebuah hambatan
untuk
melakukan
penelitian
yang
menggunakan RNA sebagai parameter
penelitian. Karena RNA bila disimpan dalam
waktu yang lama akan terdegradasi. Pada
umumnya penelitian yang melibatkan RNA,
molekul RNA harus disimpan pada suhu di
bawah -700C.
Telah diketahui sebelumnya bahwa pada
isolasi RNA tumbuhan, sodium asetat dan
etanol absolut sangat berperan penting yaitu
untuk mengendapkan RNA. Oleh sebab itu
diharapkan dengan penelitian ini dapat
menghasilkan
suatu
inovasi
baru
penyimpanan
RNA
tanaman
dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut.
Sampel RNA tanaman yang semula
disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu
-700C dapat disimpan pada suhu -200C, 40C
atau pada suhu ruang dengan penambahan
Sodium asetat dan etanol absolut atau etanol
absolut dengan memperoleh konsentrasi dan
tingkat kemurnian yang relatif tetap sama
serta tidak terdegradasi setelah disimpan
dalam jangka waktu tertentu. Sehingga
memudahkan membawa RNA tanaman dari
suatu laboraorium yang mempunyai material
atau sampel RNA tetapi tidak mempunyai
teknologi yang berhubungan dengan RNA ke
laboratorium lainnya yang mempunyai
teknologi yang berhubungan dengan RNA
tetapi tidak mempunyai material atau sampel.
Penelitian ini bertujuan untuk mencari
pelarut yang tepat untuk penyimpanan RNA
tanaman
guna
mempertahankan
kestabilannya.
Hipotesis penelitian ini adalah campuran
sodium asetat dan etanol absolut (0,1:3) atau
etanol absolut dapat memperpanjang masa
penyimpanan RNA tanaman.
Manfaat dari hasil penelitian ini
diharapkan dapat menemukan suatu metode
baru untuk penyimpanan RNA tanaman
sehingga mempermudah penanganan RNA
dari suatu tempat ke tempat lainnya yang
selanjutnya akan membantu penelitianpenelitian yang berhubungan dengan ekspresi
gen.
TINJAUAN PUSTAKA
Asam Ribonukleat (RNA)
Asam ribonukleat (RNA) senyawa yang
merupakan bahan genetik dan memiliki peran
utama dalam ekspresi gen. Dalam dogma
pokok (central dogma) genetika molekuler,
RNA menjadi perantara antara informasi yang
dibawa DNA dan ekspresi fenotip yang
diwujudkan dalam bentuk protein.
Molekul RNA merupakan polimer panjang
yang
tidak
bercabang
dari
gugus
ribonukleotida monofosfat yang digabungkan
dengan ikatan fosfodiester. Monomer RNA
disebut nukleotida, strukturnya terdiri atas tiga
komponen utama, yaitu pentosa (ribosa atau
gula berkarbon 5), gugus fosfat, dan basa
nitrogen (purin dan pirimidin). Basa nitrogen
berikatan dengan pentosa membentuk
nukleosida. Selanjutnya ketika gugus fosfat
bergabung dengan nukleosida dengan ikatan
fosfodiester
maka
akan
membentuk
nukleotida (Farrell RE 1993). Polimer
tersusun dari ikatan berselang-seling antara
gugus fosfat suatu nukleotida dengan gugus
ribosa dari nukleotida yang lain.
Asam ribonukleotida (RNA) adalah salah
satu molekul asam nukleat yang dibentuk oleh
asam dioksiribonukleotida (DNA) yang
berfungsi untuk mensintesis protein di dalam
inti sel. Berdasarkan letak dan fungsinya RNA
dibagi tiga, yaitu messenger RNA (mRNA),
transport RNA (tRNA), dan ribosome RNA
(rRNA). mRNA berfungsi sebagai cetakan
dalam sintesis protein. tRNA berfungsi untuk
menterjemahkan kode-kode yang dibawa oleh
mRNA. Sedangkan rRNA tersimpan dalam
ribosom dan berperan aktif dalam proses
sintesis protein (Nurhadryani Y et al 2004).
Secara kimiawi, perbedaan utama antara
DNA dengan RNA adalah (1) gugus hidroksil
pada RNA bergabung dengan karbon posisi 2
pada gula ribosa sedangkan pada DNA tidak;
(2) pada RNA tidak terdapat basa timin tetapi
sebagai gantinya adalah basa urasil. Lebih
khusus, RNA disusun oleh prekursor
ribonukleotida sedangkan DNA disusun dari
prekursor deoksiribonukleotida. Selain itu
juga secara kimiawi dan biologis molekul
RNA lebih tidak stabil dibandingkan dengan
molekul DNA, terutama pada suhu tinggi dan
dalam keadaan basa (Farrell RE 1993).
Reverse Transcriptase Polimerase Chain
Reaction (RT PCR)
Teknik ini merupakan pengembangan dari
teknik PCR yang awal mulanya ditemukan
oleh Karry B. Mullis pada tahun 1985.
Metode PCR adalah suatu metode enzimatis
untuk melipatgandakan secara eksponensial
suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara
in-vitro.
Teknik RT PCR merupakan suatu
pengembangan dari teknik PCR untuk
melakukan analisis terhadap RNA hasil
transkripsi yang hanya terdapat dalam jumlah
yang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCR
yang dikembangkan sangat spesifik, sehingga
dapat digunakan walaupun jumlah RNA yang
akan dianalisis sedikit (Yowono T 2006).
Oleh karena PCR tidak dapat dilakukan
dengan menggunakan RNA sebagai cetakan
maka harus terlebih dahulu dilakukan
transkripsi balik (reverse transcription)
terhadap molekul RNA sehingga diperoleh
molekul cDNA (complementary DNA).
Molekul
cDNA
tersebut
selanjutnya
digunakan sebagai cetakan untuk proses PCR
selanjutnya. Kegunaan teknik RT PCR antara
lain adalah untuk mendeteksi ekspresi gen,
untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan
kloning dan analisis, maupun untuk diagnosis
agensia infektif maupun penyakit genetik
(Yowono T 2006).
Teknik RT PCR memerlukan enzim
transkriptase balik (reverse transcriptase).
Enzim transkriptase balik adalah enzim yang
digunakan untuk mensintesis cDNA dengan
menggunakan RNA sebagai cetakan. cDNA
yang disintesis akan bersifat komplementer
dengan RNA cetakan. Beberapa enzim
transkriptase yang dapat digunakan antara lain
mesophilic viral reverse transcriptase (RTase)
yang dikode oleh virus Avian myoblastosis
(AMV) maupun oleh virus Moloney murine
leukemia (M-MuL V), dan Tth DNA
polymerase (Yowono T 2006).
Sodium Asetat
Sodium asetat merupakan garam sodium
dari asam asetat. Bahan ini merupakan bahan
kimia yang murah dan dapat digunakan secara
luas. Sebagai konjugat basa dari asam asetat,
sodium asetat merupakan senyawa yang relatif
bersifat basa kuat. Sebagai konjugat basa dari
asam lemah, larutan sodium asetat dan asam
asetat dapat berperan sebagai bufer untuk
menjaga pH konstan. Kegunaan ini sangat
penting terutama dalam aplikasi biokimia
yang reaksinya bergantung pada pH. Pada
isolasi RNA sodium asetat dapat digunakan
untuk mengendapkan RNA. Struktur sodium
asetat dapat dilihat pada Gambar 1.
Etanol Absolut
Etanol merupakan jenis alkohol yang
sering digunakan dalam kehidupan seharihari. Etanol berupa cairan jernih yang mudah
terbakar dengan titik didih sebesar 78.50C dan
titik beku sebesar -114.50C dan tergolong
dalam golongan asam lemah, oleh karena itu
etanol dapat digunakan sebagai bahan anti
beku. Selain itu etanol dapat mengubah
protein dan dapat melarutkan lipid. Etanol
dapat dibuat melalui sintesis kimia antara gas
etilen dengan uap air dan asam sebagai
katalis, umumnya katalis yang sering
digunakan adalah asam fosfat.
Etanol terbagi dalam beberapa tipe, salah
satunya adalah etanol absolut. Etanol absolut
atau alkohol anhidrat, biasa juga disebut
etanol terpurifikasi yaitu etanol yang
mengandung tidak lebih dari 1 persen air.
Struktur etanol dapat dilihat pada Gambar 2.
H
H
O
C
C
O -Na+
H
Gambar 1 Struktur sodium asetat
H
H
H
C
C
H
H
OH
Gambar 2 Struktur etanol
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
nitrogen (N2) cair, pereaksi pre-bufer ekstraksi
(pre-BE), LiCl 8 M, Sodium asetat 3,3M pH
5,2,
bufer
ekstraksi
(BE),
fenol:kloroform:isoamilalkohol
(25:24:1),
dietil pirokarbonat (DEPC),
akuabides,
polivinil pirolidin (PVP), polivinil poli
pirolidon (PPVP) kloroform:isoamilalkohol
(24:1), etonol 70%, etanol absolut, Kit sintesis
first stand cDNA (Fermentas), bufer PCR,
deoksi nukleotida trifosfat (dNTP), MgCl2,
primer , enzim Taq polimerase, agarosa,
etidium bromida (EtBr) dan akuades serta
sampel tumbuhan. Sampel yang digunakan
adalah kulit batang karet (stimulan dengan
eter dan nonstimulan), lateks (stimulan
dengan eter dan nonstimulan), daun karet,
bunga kakao, daun kopi (transgenik dan
nontransgenik), sawit hibrida dan embrio
kakao.
Alat-alat yang digunakan adalah penangas
air, sentrifus BECKMAN COULTER
AllegraTM dengan fixed angle rotor model
F0630-300 6x30ml, sentrifus DNA speed-vac®
DNA 110, pipet volumetrik, mikropipet,
pengaduk, tabung sentrifus, lemari pendingin,
autoklaf, tip, GeneAmp PCR (Poyimerase
Chain
Reaction)
system
2400,
spektrofotometer
UV-VIS
BECKMAN
COULTER-DU®530 , UV T2201 Sigma,
neraca analitik, mesin pengaduk, timbangan,
lemari asam, cetakan gel agarosa dan tabung
eppendroft.
Metode Penelitian
Isolasi RNA Tanaman
Isolasi RNA Kulit Batang Karet, Daun
Karet, dan Kopi (Chaidamsari T 2005).
Sebanyak 2 gram sampel digerus dengan N2
cair, lalu ditambahkan dengan 10 ml bufer
ekstraksi untuk RNA kulit batang dan daun.
Campuran tersebut dikocok dengan kuat dan
ditambah dengan 1 volume fenol:kloroform:
isoamilalkohol (25:24:1) yang kemudian di
aduk dengan mesin pengaduk 3 x 30 detik.
Selanjutnya campuran tersebut disentrifus
dengan kecepatan 15.000 rpm selama 15
menit pada suhu 40C, lalu lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru
yang kemudian diekstraksi lagi dengan
kloroform:isoamilalkohol
(24:1)
dan
disentrifus dengan kecepatan 15.000 rpm
selama 15 menit pada suhu 40C. Lapisan atas
yang diperoleh setelah sentrifus dipindahkan
ke dalam tabung sentrifus baru dan
ditambahkan dengan 1/30 volume Sodium
asetat 3,3 M pH 5,2 serta 1/10 etanol absolut
yang kemudian dikocok perlahan dan
disimpan di dalam es selama 30 menit.
Kemudian larutan tersebut disentrifus dengan
kecepatan 15.000 rpm selama 25 menit pada
suhu 40C, supernatan yang diperoleh dibuang
sedangkan pellet dicuci dengan alkohol 70%
dingin (8.000 rpm, 5 menit), lalu sisa etanol
tersebut diuapkan dan endapan dilarutkan
dengan larutan DEPC sebanyak 750 µl.
selanjutnya RNA dipisahkan dari DNA
dengan menambahkan LiCl 8 M sebanyak 250
µl (konsentrasi akhir 2 M), larutan tersebut
disimpan di dalam kulkas selama semalam.
Setelah disimpan selama semalam, larutan
tersebut sentrifus kembali dengan kecepatan
15.000 rpm selama 20 menit pada suhu 40C,
lalu endapan dibilas dengan etanol 70%
dingin (5.000 rpm, 5 menit) yang kemudian
dilarutkan dengan larutan DEPC sebanyak 50100 µl.
Isolasi
RNA
Lateks
(CIRAD
Modification 2007). Lateks beku yang telah
ditambahkan bufer ekstraksi untuk RNA
lateks dipanaskan dalam penangas air pada
suhu 500C selama satu jam, lalu disentrifus
dengan kecepatan 15.000 rpm pada suhu 200C
selama 30 menit. Setelah sentrifugasi, fraksi
putih dipindahkan ke dalam tabung sentrifus
baru dan diekstraksi dengan 1 volume fenol:
kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), lalu
sentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 40C selama 10 menit. Selanjutnya
lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus dan diekstraksi dengan 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C
selama 10 menit. Kemudian lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru
dan ditambah dengan 1/3 volume LiCl 8 M
dan disimpan pada suhu 40C selama satu
malam. Setelah disimpan satu malam,
disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 40C selama 30 menit. Selanjutnya
supernatan dibuang dan pellet dilarutkan
dengan 400 µl akuabides, lalu dipindahkan ke
dalam tabung kecil. Ekstraksi kembali dengan
1 volume fenol: kloroform: isoamilalkohol
(25:24:1), lalu sentrifus dengan kecepatan
10.000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit.
Selanjutnya diekstraksi dengan 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C
selama 10 menit. Lapisan atas dipindahkan ke
dalam tabung baru dan ditambahkan dengan
0,1 volume sodium asetat dan 3 volume etanol
absolut. Kemudian disimpan pada suhu -400C
selama 3 jam. Setelah itu disentrifus dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama
30 menit, lalu cuci dengan etanol 70% dingin
(8.000 rpm, 5 menit). Sisa etanol diuapkan
dan pellet dilarutkan dengan 50-100 µl
akuabides.
Isolasi
RNA
Bunga
Kakao
(Chaidamsari T 2005). Sebanyak 1 gram
sampel bunga dan 0,3 gram PVP digerus
dengan nitrogen cair, lalu dimasukkan ke
dalam 20 ml bufer ekstraksi untuk bunga yang
telah ditambahkan 250 µl β-merkaptoetanol
dan telah dipanaskan pada penangas air 650C.
Kocok kuat dengan mesin pengaduk, lalu
inkubasi dalam penangas air pada suhu 650C
serta kocok setiap 15 menit. Selanjutnya
didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit,
kemudian diekstraksi dengan 1 volume fenol:
kloroform: isoamilalkohol (25:24:1), lalu
sentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm pada
suhu 250C selama 15 menit. Selanjutnya
lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus dan diekstraksi dengan 1 volume
kloroform:isoamilalkohol (24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 250C
selama 15 menit. Kemudian lapisan atas
dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru
dan ditambah dengan LiCl 10 M hingga
konsentrasi akhir 2 M dan disimpan pada suhu
40C selama satu malam. Setelah disimpan satu
malam, disentrifus dengan kecepatan 17.000
rpm pada suhu 40C selama 30 menit.
Selanjutnya supernatan dibuang dan pellet
dilarutkan dengan 500 µl akuabides, lalu
dipindahkan ke dalam tabung kecil. Ekstraksi
kembali dengan 1 volume fenol: kloroform:
isoamilalkohol (25:24:1), lalu sentrifus
dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C
selama 15 menit. Selanjutnya diekstraksi
dengan 1 volume kloroform:isoamilalkohol
(24:1), lalu sentrifus dengan kecepatan 12.000
rpm pada suhu 40C selama 15 menit. Lapisan
atas dipindahkan ke dalam tabung baru dan
ditambahkan dengan 0,1 volume sodium
asetat dan 3 volume etanol absolut. Kemudian
disimpan pada suhu -400C selama kurang
lebih 3 jam. Setelah itu disentrifus dengan
kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama
30 menit, lalu cuci dengan etanol 70% dingin
(8.000 rpm, 5 menit). Sisa etanol diuapkan
dan pellet dilarutkan dengan 50-100 µl
akuabides.
Pengukuran Konsentrasi dan Pengecekan
Kemurnian RNA.
Pengukuran
Konsentrasi
RNA.
Sebanyak 3 µl RNA dilarutkan dengan 297 µl
larutan DEPC. Selanjutnya larutan tersebut
diukur
absorbansinya
pada
panjang
gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm.
Konsentrasi RNA dapat dengan rumus:
Konsentrasi RNA = A 260 x 40 ng/ml x fp
dengan A260 adalah absorbansi pada panjang
gelombang 260 dan fp adalah faktor
pengenceran.
Kemurnian RNA dapat dihitung dengan
perbandingan absorbans 260 nm/230 nm. Bila
perbandingannya lebih dari 2,0 maka dapat
dikatakan bahwa RNA tersebut murni.
Pengecekan
Kualitas
RNA
Elektroforesis Gel Agarosa 1%.
dengan
Sebelum
melakukan
elektroforesis
agarosa, harus terlebih dahulu dibuat gel
agarosa 1%. Gel agarosa 1% dibuat dengan
cara mencampurkan 0,3000 gram agarosa
dengan 30 ml TBE 0,5x. Selanjutnya
campuran tersebut dipanaskan sampai larut,
lalu didinginkan dan ditambah dengan 1,5 µl
etidium bromida (EtBr). Kemudian larutan
tersebut dimasukkan ke dalam cetakan dan di
tunggu sampai padat.
Larutan RNA dicampurkan loading buffer
dengan perbandingan 1: 5. Sementara itu gel
tersebut dimasukkan ke dalam wadah yang
berisi TBE 0.5x sampai gel tersebut terendam.
Selanjutnya campuran tersebut dimasukkan ke
dalam sumur yang ada pada gel agarosa
dengan mikropipet yang kemudian dialiri
dengan arus listrik sebesar 50 atau 25 volt
selama 60 sampai 120 menit.
Penyimpanan RNA
Sampel
RNA bunga kakao, lateks
stimulan dan lateks nonstimulan yang telah
diketahui konsentrasinya dan kemurniannya
kemudian di bagi menjadi 6 bagian, bagian
pertama langsung disimpan pada suhu -400C
sebagai kontrol positif. Bagian kedua dan
ketiga ditambahkan dengan 0,1 volume
Sodium asetat 3,3 M pH 5,2 dan 3 volume
etanol absolut dan masing-masing disimpan
pada suhu -200C dan pada 40C. Bagian
Keempat dan bagian kelima ditambahkan
dengan etanol absolut dan masing-masing
disimpan pada suhu 40C dan pada suhu ruang.
Bagian keenam langsung disimpan pada suhu
ruang sebagai kontrol negatif. Penyimpanan
dilakukan selama 2 bulan.
Setelah dilakukan penyimpanan, RNA
kembali diukur konsentrasinya dan dipisahkan
dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Pengukuran konsentrasi dan elektroforesis
dilakukan untuk melihat konsentrasi dan
kemurnian RNA setelah penyimpanan selama
2 bulan dengan perlakuan dan kontrol yang
kemudian
akan
dibandingkan
dengan
konsentrasi RNA sebelum penyimpanan.
Sehingga diperoleh metode penyimpanan
RNA yang terbaik.
Metode terbaik yang diperoleh kemudian
diulangi kembali pada sampel kulit batang
karet (stimulan dan nonstimulan), daun karet,
sawit hibrida, kopi (transgenik dan
nontransgenik),
lateks
(stimulan
dan
nonstimulan), dan embrio kakao. Selanjutnya
setelah disimpan dengan perlakuan RNA
tersebut
diukur
konsentrasi
dan
di
elektroforesis gel agarosa untuk mengetahui
konsentrasi, kemurnian dan keutuhannya,
setelah itu RNA tersebut di RT-PCR untuk
mengetahui dapat atau tidaknya terekspresi
gen.
Reverse Transcriptase Polimerase Chain
Reaction (RT PCR)
Selain dengan mengukur konsentrasi dan
elektroforesis gel agarosa RNA juga di RTPCR untuk mengetahui dapat atau tidaknya
RNA tersebut terekspresi gen setelah
perlakuan dan penyimpanan. Sintesis cDNA
dilakukan dengan cara melarutkan 2 µg RNA
dengan 1µl dNTP dan 1µl oligo dT, lalu
ditambahkan dengan akuabides hingga
volume 12 µl. Selanjutnya dipanaskan dengan
mesin PCR pada suhu 650C selama 5 menit.
Setelah itu segera dimasukan ke dalam es dan
ditambahkan dengan 4 µl bufer RT, 2 µl DTT
dan 1 µl inhibitor RNAse, lalu kocok pelanpelan dan inkubasi pada suhu 420C selama 2
menit pada mesin PCR. Kemudian buka tutup
PCR dan langsung tambahkan dengan 1 µl
enzim reverse transcriptase (revert Aid MMulV). Selanjutnya inkubasi pada suhu 420C
selama 50 menit, lalu dengan suhu 700C
selama 15 menit. Setelah itu keluarkan dari
mesin PCR dan simpan pada suhu -400C.
Total cDNA yang diperoleh adalah 20 µl.
Reaksi PCR dilakukan dengan cara
melarutkan 1 µl cDNA dengan 5 µl bufer, 0,5
µl MgCL2, 1 µl dNTP, 1 µl primer gene
forward, 1 µl primer gene backward, 1 µl
primer actin forward, 1 µl primer actin
backward dan 1 µl enzim Taq polimerase, lalu
ditambahkan dengan larutan DEPC hingga
volume total 50 µl. Selanjutnya dimasukkan
ke dalam mesin PCR yang telah diprogram
dengan suhu denaturasi 940C, suhu annealing
550C dan suhu elongasi 720C.
Untuk mengetahui hasil RT-PCR RNA
yang telah disimpan dengan perlakuan dan
kontrol, cDNA hasil RT-PCR dengan RNA
(kontrol dan perlakuan) yang telah disimpan
sebagai
cetakan
dipisahkan
dengan
elektroforesis gel agarosa 1%. Hasil
elektroforesis ini juga akan dibandingkan
antara cDNA dengan cetakan RNA yang
mengalami perlakuan dengan cDNA dengan
RNA tidak mengalami perlakuan (kontrol).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Pengukuran Konsentrasi dan
Kualitas RNA Setelah Isolasi
Kuantitas RNA dapat diperoleh dengan
cara mengukur konsentrasi RNA sampel,
untuk bunga kakao diperoleh konsentrasi
sebesar 1.488 ng/µl, lateks stimulan sebesar
3.616 ng/µl dan lateks nonstimulan sebesar
1.628 ng/µl (Tabel 1). Sedangkan untuk
sampel kulit karet, daun karet, kopi, sawit
hibrida, dan embrio kakao diperoleh
konsentrasi yang bervariasi mulai dari yang
terendah sebesar 288 ng/µl untuk RNA sawit
hibrida sampai yang terbesar sebesar 744
ng/µl untuk RNA lateks stimulan (Tabel 2).
Pengukuran konsentrasi RNA dilakukan
dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 260 nm. Selanjutnya
dengan absorbansi RNA pada panjang
gelombang tersebut dihitung konsentrasinya
dengan rumus: [RNA] = A 260 x 40 x fp.
dengan A 260 adalah absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dan fp adalah faktor
pengenceran. Selain pada panjang gelombang
260 nm RNA juga diukur
absorbansinya
pada
panjang gelombang 280 nm untuk
mengetahui kemurnian RNA tersebut.
Molekul RNA yang murni mempunyai
perbandingan
absorban
pada
panjang
gelombang 260/280 nm lebih dari 2,0. Bila
perbandingan absorbans pada panjang
gelombang 260/280nm kurang dari 2.0, pada
RNA tersebut masih terdapat pengotor (Farrell
RE 1993).
Sampel RNA bunga kakao, lateks stimulan
dan lateks nonstimulan mempunyai kualitas
yang baik dengan menghasilkan 2 pita yang
utuh ketika dipisahkan dengan elektroforesis
gel agarosa 1% (Gambar 3). Begitu pula untuk
Tabel 1 Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer
Sampel
A 260 nm
A 280 nm
A260/280
Bungan kakao
Lateks stimulan
Lateks nonstimulan
0,372
0,904
0,407
0,229
0,471
0,214
1,624
1,919
1,902
Konsentrasi
(ng/µl)
1.488
3.616
1.628
Tabel 2 Hasil pengukuran konsentrasi RNA dengan spektrofotometer
No Sampel
A 260
A 280
A 230
260/280
260/230
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,339
0,336
0,988
1,132
1,240
2,005
1,964
1,576
1,788
Kulit karet stimulan
Kulit karet nonstimulan
Daun karet
Sawit hibrida
Kopi non trangenik
Kopi transgenik
Lateks stimulan
Lateks nonstimulan
Embrio kakao
0,120
0,146
0,177
0,072
0,118
0,068
0,186
0,117
0,137
0,089
0,110
0,104
0,058
0,081
0,035
0,087
0,056
0,066
untuk sampel RNA kulit karet, daun karet,
kopi, sawit hibrida, dan embrio kakao juga
mempunyai kualitas RNA yang baik dengan
menghasilkan 2 pita yang utuh ketika
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa
1% (Gambar 4). Kualitas RNA diamati
dengan melakukan elektroforesis gel agarosa
1%. Adanya RNA yang utuh ditandai dengan
adanya 2 buah pita yang utuh pada gel agarosa
ketika dilihat dengan menggunakan sinar
ultraviolet, semakin tebal pita tersebut terlihat
semakin bagus pula RNA yang diperoleh. Bila
pada gel agarosa hanya terlihat 2 pita yang
tidak utuh maka RNA yang diperoleh telah
terdegradasi atau rusak (Farrell RE 1993).
Sebelum
dilakukan
pengukuran
konsentrasi dan kualitas RNA, terlebih dahulu
dilakukan isolasi RNA dari sampel tanaman
yang akan digunakan untuk penelitian. Isolasi
RNA tanaman terdiri atas 3 tahap yaitu tahap
pemecahan dinding sel yang meliputi
penggerusan sampel dengan N2 cair dan
penambahan bufer ektraksi yang berfungsi
untuk memecah dinding sel, selanjutnya
adalah tahap isolasi RNA yang meliputi
ekstraksi
dengan
fenol:kloroform:
isoamilalkohol
(25:24:1),
kloroform:
isoamilalkohol (24:1) yang berfungsi untuk
memisahkan lemak, protein dan glukosa serta
pengotor lainnya, dan pengendapan RNA
dengan etanol absolut dan sodium asetat,
tahap selanjutnya adalah tahap pemurnian
RNA
yang meliputi penambahan LiCl 8
M yang berfungsi untuk memisahkan DNA
dengan RNA dan pencucian dengan etanol
70%.
0,300
0,436
0,180
0,063
0,095
0,034
0,094
0,066
0,077
1,339
1,325
1,700
1,239
1,457
1,954
2,144
2,075
2,070
[]
(ng/µl)
480
584
708
288
472
272
744
468
548
Penyimpanan RNA dengan Beberapa
Perlakuan
Setelah RNA yang diperoleh disimpan
selama 2 bulan dengan beberapa perlakuan.
RNA tersebut diukur kembali konsentrasi dan
kualitas
dengan
menggunakan
spektrofotometer dan elektroforesis gel
agarosa 1%. Konsentrasi RNA tertinggi
setelah dilakukan penyimpanan selama 2
bulan diperoleh pada perlakuan dengan
menambahkan sodium asetat dan etanol
absolut serta disimpan pada suhu 40C.
Konsentrasi RNA yang diperoleh pada
perlakuan tersebut adalah 456 ng/µl untuk
RNA bunga kakao, 2.358 ng/µl untuk RNA
lateks stimulan dan 1.368 ng/µl untuk RNA
lateks nonstimulan . Konsentrasi tersebut
masih lebih rendah dibandingkan dengan
konsentrasi RNA kontrol positif yaitu 1.204
ng/µl untuk RNA bunga kakao, 3.408 ng/µl
untuk RNA lateks stimulan dan 1.374 ng/µl
untuk RNA lateks nonstimulan . Konsentarsi
yang lebih rendah dari pada konsentrasi RNA
1
2 3
Gambar 3 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%
RNA tanaman. Keterangan: (1)
RNA bunga kakao, (2) RNA
leteks stimulan, (3) RNA lateks
nonstimulan
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar 4 Hasil elektoforesis gel agarosa 1%
RNA tanaman. Keterangan: (1&2)
RNA kulit batang karet stimulan
dan nonstimulan , (3) RNA daun
karet, (4) RNA sawit hibrida,
(5&6) RNA kopi transgenik dan
non trasngenik, (7&8) RNA lateks
stimulan dan nonstimulan , (9)
RNA embrio kakao
dengan penambahan sodium asetat dan etanol
absolut dan disimpan pada 40C diperoleh
pada perlakuan-perlakuan yang lainnya.
Konsentrasi RNA yang diperoleh dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut
serta disimpan pada suhu -200C adalah 402
ng/µl untuk RNA bunga kakao, 1.200 ng/µl
untuk RNA lateks stimulan dan 1.074 ng/µl
untuk RNA lateks nonstimulan , dengan
penambahan etanol absolut dan disimpan
pada suhu 40C diperoleh konsentrasi RNA
sebesar 276 ng/µl untuk RNA bunga kakao,
1.446 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan
546 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan, dan
dengan penambahan etanol serta disimpan
pada suhu ruang diperoleh konsentrasi RNA
sebesar -54 ng/µl untuk RNA bunga kakao,
3.732 ng/µl untuk RNA lateks stimulan dan
684 ng/µl untuk RNA lateks nonstimulan
(Tabel 3).
Selain diperoleh kuantitas, juga diperoleh
kualitas RNA setelah penyimpanan selama 2
bulan dengan perlakuan. Sampel RNA yang
disimpan pada suhu 400C sebagai kontrol
positif mempunyai kualitas RNA yang sangat
baik dengan menghasilkan 2 pita yang utuh
dan tebal ketika dipisahkan dengan
elektroforesis gel agarosa 1% (Gambar 5).
Berbeda dengan sampel RNA yang disimpan
pada suhu ruang sebagai kontrol negatif akan
terdegradasi dan mengalami kerusakan, ketika
dipisahkan dengan elektroforesis
tidak
menunjukkan 2 pita yang utuh (Gambar 6).
Penyimpanan RNA pada 40C dengan
penambahan sodium asetat dan etanol absolut
mempunyai kualitas RNA yang baik setelah
penyimpanan walaupun pita yang terbentuk
ketika elektroforesis tidak setebal pita yang
terbentuk pada kontrol positif (Gambar 7).
Begitu pula untuk penyimpanan pada suhu 200C dengan penambahan sodium asetat dan
etanol absolut (Gambar 8) dan penyimpanan
pada suhu 40C dengan penambahan etanol
absolut (Gambar 9) juga memiliki kualitas
RNA
yang
baik.
Sedangkan
pada
penyimpanan pada suhu ruang dengan
penambahan etanol absolut akan mengalami
kerusakan (Gambar 10).
Walaupun RNA yang diberi perlakuan
kualitasnya
berkurang
tetapi
karena
konsentrasinya masih tinggi, RNA tersebut
masih bisa digunakan untuk penelitian
selanjutnya. Metode penyimpanan RNA
terbaik berdasarkan perlakuan yang dilakukan
adalah RNA yang ditambahkan sodium asetat
Tabel 3 Perbandingan konsentrasi RNA antar perlakuan setelah penyimpanan selama 2 bulan
Perlakuan
Suhu
Sampel
Konsentrasi setelah
penyimpanan
penyimpanan
Bunga kakao
1.204
RNA
- 400C
Lateks stimulan
3.408
Lateks nonstimulan
1.374
Bunga kakao
756
RNA
Suhu ruang
Lateks stimulan
5.192
Lateks nonstimulan
2.248
Bunga kakao
456
RNA dengan
penambahan sodium
40C
Lateks stimulan
2.358
asetat dan etanol absolut
Lateks nonstimulan
1.368
Bunga kakao
402
RNA dengan
penambahan sodium
-200C
Lateks stimulan
1.200
asetat dan etanol absolut
Lateks nonstimulan
1.074
Bunga kakao
276
RNA dengan
penambahan etanol
40C
Lateks stimulan
1.446
absolut
Lateks nonstimulan
546
Bunga kakao
-54
RNA dengan
penambahan etanol
Suhu ruang
Lateks stimulan
3.732
absolut
Lateks nonstimulan
684
1
2
3
Gambar 5 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman yang disimpan pada 400C. Keterangan: (1) RNA bunga
kakao, (2) RNA leteks stimulan,
(3) RNA lateks nonstimulan
1
2
3
Gambar 6 Elektoforesis gel agarosa 1% RNA
tanaman yang disimpan pada suhu
ruang Keterangan: (1) RNA bunga
kakao, (2) RNA leteks stimulan,
(3) RNA lateks nonstimulan
1
2
3
Gambar 7 Elektoforesis gel agarosa
1%
RNA
tanaman
yang
ditambah sodium asetat dan etanol
absolut serta disimpan pada 40C
sel