Deteksi Asosiasi Virus Mosaik Ketimun-Satelit RNA-5 Pada Tanaman Ketimun

DETEKSI ASOSIASI VIRUS MOSAIK KETIMUN-SATELIT RNA-5 PADA
TANAMAN KETIMUN
Dr. Ir. EDI BATARA MULYA SIREGAR, MS
Program Ilmu Kehutanan
Fakultas Pertanian
Universitas Sumatera Utara

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Virus mosaik ketimun mempunyai kisaran inang yang sangat luas dan
terdapat di hampir semua negara. Strain yang berbeda dalam sifat biologisnya telah
dilaporkan, begitu pula gejala yang ditimbulkannya beragam. Dengan demikian virus
mosaik ketimun mempunyai banyak strain.
Virus mosaik ketimun mempunyai tiga genom RNA, disebut RNA-1, RNA-2,
RNA-3 dan RNA-4 yang merupakan subgenom RNA-3. Selain itu dilaporkan pula
komponen yang lain, diantaranya adalah RNA-5 dan telah banyak dipelajari lebih
lanjut dalam asosiasinya dengan virus mosaik ketimun. RNA-5 merupakan satelit
RNA virus mosaik ketimun, karena multiplikasinya tergantung pada virus penolong,
yaitu virus mosaik ketimun (Murant dan Mayo, 1982).
Adanya asosiasi antara satelit dan virus penolongnya ternyata dapat menekan
gejala penyakit, bahkan dapat menekannya secara sempurna. Dengan demikian

satelit dapat digunakan untuk pengendalian virus tanaman. Pada inang tertentu,
asosiasi virus-satelit RNA-5 dapat dijadikan sumber ketahanan terhadap infeksi
strain yang ganas.
Walaupun telah ada laporan tentang asosiasi hubungan virus-satelit pada
kelompok virus, realisasi bahwa kemungkinannya untuk pengendalian virus tanaman
adalah relatif masih baru. Hal ini disebabkan karena asosiasi virus-satelit juga dapat
menimbulkan penyakit baru seperti nekrosis letal pada tomat.
Metode isolasi dan analisis RNA untai ganda (doubles-tranded RNA/ds-RNA)
telah dikembangkan oleh Morris dan Dodds untuk mendeteksi dan mendiagnosis
virus tanaman (Dodds, Morris dan Jordan, 1984). Berbagai metode untuk
mendeteksi dan menganalisis RNA untai ganda juga telah dikembangkan. Metode
yang sering digunakan adalah pemisahan secara elektroforesis di dalam gel
poliakrilamid. Identifikasi virus satelit yang berasosiasi dengan virus tanaman akan
dimudahkan oleh metode ini.
Tuiuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat virus mosaik ketimun yang
mempunyai satelit RNA-5 disekitar Bogor. Satelit RNA-5 yang berasosiasi dengan
virus mosaik ketimun dideteksi dengan metode pemurnian RNA untai ganda virus
dan elekroforesis gel poliakrilamid.
Hipotesis

Beberapa hipotesis yang diajukan melalui penelitian ini adalah:
1. Isolat virus mosaik ketimun yang berasal dari berbagai tanaman inang akan
mempunyai profit yang sarna pada elektroforesis gel poliakrilamid.
2. Satelit RNA-5 yang berasosiasi dengan virus mosaik ketimun akan terdeteksi
pada gel.

©2003 Digitized by USU digital library

1

TINJAUAN PUSTAKA
Virus Mosaik Ketimun dan Virus Satelitnya
Virus mosaik ketimun adalah virus tanaman yang berbentuk polihedral
dengan diameter 28 nm, menginteksi lebih dari 775 spesies tumbuhan dalam 67
famili dan dapat ditularkan oleh 75 spesies afid secara non-persistent (Murant dan
Mayo, 1982).
Virus mosaik ketimun mempunyai kisaran inang yang sangat luas, terdapat
pada tanaman sayuran, tanaman hias dan tanaman buah-buahan. Selain menyerang
tanaman ketimun, virus mosaik ketimun juga dapat menyerang melon, labu, cabai,
bayam, tomat, seledri, bit, tanaman polong-polongan, pisang, tanaman famili

Crucitereae, delphinium. gladiol, lili, petunia. zinia dan beberapa jenis gulma (Agrios,
1988). Dibeberapa negara, virus mosaik ketimun telah menyebabkan penyakit yang
berat pada tanaman tertentu.
Virus mosaik ketimun terdapat hampir di semua negara dan strain yang
berbeda sifat biologinya telah dilaporkan dari berbagai tempat. Virus mosaik ketimun
mempunyai banyak strain, oleh karena itu mempunyai jumlah inang yang banyak
serta gejala yang ditimbulkan beragam.
Istilah virus satelit pertama kali digunakan oleh Kassanis tahun 1962 untuk
menerangkan suatu virus kecil yang tergantung pada tobacco necrosis virus (TNV)
untuk multiplikasinya dalam tanaman. Beberapa jenis satelit lain telah diketahui dan
istilah tersebut sekarang sering digunakan untuk menyatakan suatu virus atau asam
nukleat yang tidak dapat bermultiplikasi dalam sel tanpa bantuan dari virus penolong
yang khusus (Murant dan Mayo, 1982). Virus satelit dapat mengurangi kemampuan
multiplikasi dan menimbulkan penyakit dari virus penolongnya, seperti bersifat
parasif (Agrios, 1988).
Virus mosaik ketimun mempunyai tiga genom RNA untai tunggal yang disebut
RNA-1, RNA-2 dan RNA-3, serta RNA-4 yang merupakan sub genom dari RNA-3.
bobot molekulnya (X 106) masing-masing adalah 2.7,1.13,0.82 dan 0.36 (Takanami,
Kubo dan Imaizumi, 1977). RNA-1 dan RNA-2 adalah bagian yang terpisah, tetapi
RNA-3 dan RNA-4 terbungkus bersama (Lot dan Kaper, 1976). Selain komponen RNA

tersebut, juga dilaporkan komponen lain dengan bobot molekul (X 106) adalah 0.26
(RNA-4a) , 0.11 (RNA-5),0.01-0.05 (RNA-6) dan 0.5 (RNA-X) (Peden dan Symons,
1973). Hanya RNA-5 yang telah banyak dipelajari lebih lanjut (Murant dan Mayo,
1982).
RNA-5 adalah salah satu satelit RNA dari virus mosaik ketimun, karena
multiplikasinya bergantung pada virus mosaik ketlmun serta tidak esensial untuk
replikasi virus mosaik ketimun (Murant dan Mayo, 1982). Untuk membedakan
dengan RNA lain, maka satelit RNA-5 yang terdapat pada virus mosaik ketimun
disebut CARNA (=RNA-5 yang berasosiasi dengan CMV) (Kaper dan Tousignant,
1977).
Jumlah satelit RNA-5 yang terdapat pada virus mosaik ketimun sangat
beragam, bergantung pada strain virus mosaik ketimun sebagai virus penolong dan
spesies tanaman inang. Pada kebanyakan isolat virus mosaik ketimun jumlah
satelitnya sedikit dan sering tidak terdeteksi bila diperbanyak pada Cucurbita papo,
tetapi meningkat jumlahnya setelah ditularkan ulang pada Nicotiana tabacum (Kaper
dan Tousignant, 1977). Dengan meningkatnya jumlah satelit, jumlah virus penolong
dan infektifitasnya menurun. Hal ini disebabkan adanya persaingan RNA satelit
dengan RNA virus mosaik ketimun dalam replikasinya (Murant dan Mayo, 1982).
Pada tahun 1977 isolat CMV (S) yang mengandung RNA satelit ditemukan
merangsang penyakit nekrotik fetal pada tomat (Lycopersicon esculentum)

menggantikan gejala klorosis dan daun pakis (fern-leaf) yang secara normal
merupakan gejala yang disebabkan oleh CMV (S) sendiri (Murant dan Mayo, 1982).

©2003 Digitized by USU digital library

2

Pada dua strain virus mosaik ketimun lain, penambahan RNA satelit ke inokulum
virus mosaik ketimun menyebabkan gejala nekrotik berat yang sama pada tomat,
tetapi menyebabkan pelemahan gejala pada cabai (Capsicum frutescens), jagung
manis (Zea mays), tembakau dan beberapa inang lain. Strain CMV (JY) yang
mengandung satelit RNA menyebabkan nekrotik letalI pada tomat, tetapi juga
menyebabkan mosaik kuning yang jelas pada tembakau dan beberapa spesies
Nicotiana yang lain. Sedangkan gejalanya tanpa satelit adalah mosaik kuning
(Takanami,1981).
Observasi telah dilakukan pada beberapa spesies inang tanaman, adanya
CARNA 5 juga menyebabkan pelemahan penyakit dan kadang menekan gejala secara
sempurna. Pada infeksi virus mosaik ketimun dan CARNA 5, RNA untai tunggal dan
ganda CARNA5 disintesis lebih cepat daripada RNA virus mosaik ketimun sehingga
jumlahnya kecil sekali. Observasi ini membuktikan konsep dasar mekanisme

biokimia yang menerangkan kemampuan CARNA 5 mengendalikan virus tanaman
(Kaper, 1982).
Ketergantungan CARNA 5 pada virus penolongnya, virus mosaik ketimun dan
ketergantungan pada suatu inang yang menyediakan komponen dan proses
enzimatik yang diperlukan untuk replikasinya, merupakan suatu contoh yang baik
dari parasitisme tingkat molekuler. CARNA 5 memparasit inangnya, yaitu virus yang
memparasit tanaman inang. Akibat hubungan parasit ini, efek yang ditimbulkannya
beragam. Penyakit akan ditekan bila virus terparasit secara efektif oleh CARNA 5.
Dilain pihak, CARNA 5 juga mampu memperlihatkan bentuk penyakit baru, seperti
nekrosis letal pada tomat (Kaper, 1983).
Asosiasi virus-satelit RNA dapat menimbulkan strain yang lemah dan dapat
melindungi tanaman dari infeksi strain yang ganas. Namun harus hati-hati memilih
asosiasi virus-satelit untuk menghindari terjadinya penyakit baru yang kadang lebih
berat.
Ada dua kemungkinan mekanisme proteksi oleh satelit RNA-5 terhadap strain
virus mosaik ketimun yang ganas. Pertama adalah efek langsung darisatelit RNA-5,
yaitu dengan menggangu atau berkompetisi terhadap replikasi RNA virus dan
mengakibatkan penurunan kandungan virus dan modifikasi gejala (Tekanan, 1981).
Kemungkinan kedua adalah efek tidak langsung dari satelit RNA-5, yaitu satelit RNA5 dapat memperlemah gejala dan dapat mengadakan proteksi silang terhadap strain
yang ganas (Tien, Zhang, Qiu, Qin dan Wu, 1987).

Berdasarkan informasi di atas ternyata satelit RNA mempunyai pengaruh
yang berbeda-beda terhadap strain virus mosaik ketimun. Akhir-akhir ini isolat virus
mosaik ketimun yang mengandung satelit RNA terus diteliti dan dibandingkan
terutama untuk menemukan satelit RNA yang mampu menekan gejala virus mosaik
ketimun. Beberapa diantaranya kemungkinan besar dapat digunakan untuk
pengendalian biologis virus tanaman (Murant dan Mayo, 1982).
RNA Untai Ganda Virus dalam Tanaman
Virus dengan RNA untai tunggal (ss-RNA) terdapat hampir 90% pada semua
virus tanaman yang diketahui. Selama replikasi virus didalam sel RNA untai ganda
tersebut disebut sebagai bentuk replikatif (RF) dan secara konsisten terdapat bila
suatu tanaman terinfeksi dengan suatu virus bertipe RNA untai tunggal tanpa
menghiraukan inamgnya (Valverde, Nameth dan Jordan, 1990).
Umumnya telah diterima bahwa selama replikasi virus RNA untai tunggal
melibatkan proses sintesis atau pembentukan komplimenter, templet untai RNA
dalam bentuk replikatif intermediet (RI) yang beruntai ganda (Dodds, Morrisdan
Jordan, 1984). Apabila bentuk replikatif asam nukleat diisolasi dari sel terinfeksi,
maka molekul RNA untai ganda yang disebut bentuk replikatif (RF) dapat
diidentifikasi.

©2003 Digitized by USU digital library

3

Dalam sistem virus yang dipelajari, penjelasan kemungkinan peranan
fungsional RF selama replikasi belumlah jelas. Namun diduga bahwa RF mungkin
hanyalah sebagai bentuk hasil antara atau hasil akhir (Garnier, Mamon dan Bove,
1980).
Bentuk replikatif RNA untai ganda satelit yang berasosiasi dengan RNA virus
tanaman juga teridentifikasi (Dodds, Morris dan Jordan, 1984) seperti pada tanaman
yang terinfeksi oleh cucumber mosaik virus (CMV), tobacco ringspot virus (TRSV)
dan tobacco necrosis virus (TNV) (Schneider dan Thompson, 1977). Identifikasi
satelit RNA yang berasosiasi dengan virus tanaman akan dimudahkan oleh analisis
RNA untai ganda ini. Akan tetapi, harus hati-hati dalam memilih konsentrasi gel
elektroforesis agar molekul kecil ini tertahan di dalam gel (Dodds, Morris dan Jordan,
1984).
Struktur molekul RF virus tanaman belum ekstensif dipelajari dan masih
diperlukan analisis yang lebih mendetail agar lebih dimengerti peranan fungsionalnya
di dalam replikasi virus RNA.
Ekstraksi dan Pemurnian RNA Untai Ganda
Bentuk RF dari SS-RNA virus tanaman adalah tipe paling umum ditemui.

Adanya RNA untai ganda yang diekstrak dari tanaman terinfeksi virus SS-RNA adalah
konsisten. Hal ini membuat deteksi ds-RNA menjadi metode praktis untuk diagnosis
virus (Valverde, Nameth dan Jordan, 1990).
Prosedur ekstraksi ds-RNA (Gambar 2) telah dikemukakan oleh Morris dan
Dodds(1979); Jordan, Dodds dan Ohr (1983).
Seperti terlihat pada gambar, dua siklus kromatografi selulose digunakan
untuk menghilangkan sisa RNA untai tunggal yang dapat mengacaukan interpretasi.
Prosedur ini juga dapat digunakan untuk mengekstraksi RNA untai ganda dari fungi
dah serangga (Valverde, Nameth dan Jordan, 1990).
Isolasi RNA untai ganda dari jaringan tanaman dimulai dengan
menghancurkan jaringan dan isolasi dilakukan terhadap semua asam nukleatseluler
di bawah kondisi yang mencegah terjadinya degradasi. RNA untai ganda adalah
stabil dan biasanya dapat diisolasi dengan mudah daripada isolasi asam nukleat
lainnya.
Jaringan dihomogenisasi dengan tujuan merusak protein dan melepaskan
asam nukleat yang tidak rusak. Beberapa prosedur menggunakan komponen bufer
cair pada pH tinggi dan kandungan garam sedang (0.1 M) sampai tinggi (1.0M)
untuk mengurangi aktivitas ribonuklease (Diaz-Ruiz dan Kaper, 1978). Bahan
tambahan seperti bentonit, dietilpirokarbonat dan ion metal pencelat juga digunakan
untuk mengurangi aktivitas nuklease. Natrium dodesil sulfat (SDS) atau asam paminosalisilik yang merupakan detergent ditambahkan untuk meningkatkan

denaturasi protein dan melepaskan asam nukleat (Bar-Joseph, Rosner, Moskovitz
dan hull, 1983). Bahan tambahan lain, seperti sulfit, polivinilpirrolidin (PVP),
merkaptoetanol dan natrium dietil ditiokar bamat, (DIECA) juga dapat digunakan
untuk mencegah oksidasi dan pencoklatan ekstrak jaringan tanaman (Dodds, Morris
dan Jordan. 1984).
Semua prosedur mengikutkan fenol cair sebagai komponen untuk merusak
protein organik. Penggunaan fenol dan kloroform/pentanol akan meningkatkan
pemisahan fase yang baik setelah sentrifugasi dan menghasilkan pemindahan
protein yang lebih sempurna dari fase cair (Dodds, Morris dan Jordan, 1984).
Banyak prosedur yang telah dipelajari untuk memurnikan RNA untai ganda,
seperti halnya studi terhadap pemurnian asam nukleat (Ralph, 1969). Metode yang
sederhana dan cepat adalah yang dipilih. terutama untuk analisis sampel banyak
selama diagnosa. Dari banyak percobaan yang telah dilakukan, prosedur kolumn
selulose Franklin adalah pendekatan yang lebih praktis (Morris dan Dodds, 1979).

©2003 Digitized by USU digital library

4

Fraksinasi asam nukleat cara Franklin ini didasarkan pada perbedaan

pengikatan dari RNA untai tunggal dan ganda terhadap selulose dalam etanoldengan
konsentrasi yang berbeda. Adsorpsi kebanyakan asam nukleat terhadap pada
konsentrasi etanol diatas 35%. Fraksi DNA dan RNA untai tunggal dilepaskan dalam
buffer yang mengandung 15-18% etanol, sedangkan RNA dengan struktur sekunder
yang tinggi seperti RNA untai ganda tetap terikat. RNA untai ganda kemudian
dilepaskan dalam bufer yang tidak mengandung etanol (Morris dan Dodds, 1979).
Pengikatan RNA untai ganda dapat dikerjakan langsung dari supernatant cair
yang mengandung fenol dan 15% etanol dan dialirkan melalui kolom kecil selulosa
atau langsung menambahkan tepung selulosa ke supernatant kemudian dikumpulkan
dengan sentrifugasi. Selulosa yang berikatan dengan RNA untai ganda kemudian
dicuci dengan beberapa volume bufer etanol 15% untuk melepaskan kotoran dan
kemudian RNA untai ganda dilepaskan ke dalam sebuah volume kecil bufer yang
tidak beretanol (Dodds, Morris dan Jordan, 1984).
Deteksi dan Analisis RNA Untai Ganda
Berbagai metode untuk mendeteksi dan menganalisis RNA untai ganda telah
dikembangkan. Beberapa diantaranya adalah menggunakan elektroforesis, serologi,
penghancuran oleh enzim, metode biologis, metode hibridisasi dan metode Kloning
(Dodds, Morris dan Jordan, 1984).
Metode yang sering digunakan untuk mendeteksi dan menganalisis RNA untai
ganda murni dari tanaman terinfeksi virus adalah pemisahan secara elektroforesis di
dalam gel akrilamide (Morris dan Dodds, 1979). Pendekatannya didasarkan pada
pemikiran bahwa tanaman yang tidak terinfeksi dengan virus RNA tidak mengandung
sejumlah segmen homogenus RNA untai ganda dengan berat molekul tinggi (>0.1 X
106) yang terdeteksi didalam gel (Dodds, Morris dan Jordan, 1984).
Identifikasi RNA untai ganda yang mempunyai ciri-ciri tersendiri pada gel
diinterpretasikan sebagai bukti infeksi virus dan mobilitas relatif adalah fungsiberat
molekulnya. Hal ini telah dibuktikan pad a beberapa kelompok virus yang dianalisis
(Dodds, Morris dan Jordan, 1984).
Satu masalah yang tampak oleh pemakai awal teknik ini adalah interpretasi
pola tanda RNA untai ganda yang terbentuk. Virus tanaman dari kelompok berbeda
mempunyai ciri pola RNA untai ganda yang berbeda (disebut sebagai profit) (Dodds,
Morris dan Jordan, 1984; Valverde, Dodds dan Heick, 1986).
Anggota didalam satu kelompok mempunyai profit RNA untai ganda yang
sama. Keunikan dari satu profit adalah didasarkan pada jumlah dan berat molekul
segment RNA untai ganda. Satu virus dengan genom yang mengandung satu RNA
untai tunggal akan menghasilkan satu RNA untai ganda utama kira-kira dua kali
berat molekul RNA untai tunggal (Valverde, Nameth dan Jordan, 1990).
BAHAN DAN METODE
Bahan-bahan
1. Isolat Virus Mosaik Ketimun
Isolat Virus mosaik ketimun yang digunakan dalam percobaan ini diperoleh
dari lapang di sekitar Bogor, diantaranya berasal dari tanaman tomat, cabai, melon
dan ketimun. Isolat Virus mosaik ketimun-2 (CMV-2) yang mengandung satelit dan
tanpa satelit asal Sub Balai Penelitian Tanaman Hortikultura Segunung digunakan
sebagai pembanding.
2. Tanaman Indikator
Tanaman indikator yang digunakan adalah Chenopodium amaranticolor,
Nicotiana tabacum, Datura stramonium, Cucumis sativus, Lycopersicon esculentum,
Capsicum annuum dan Cucurbita pepo.

©2003 Digitized by USU digital library

5

3. Bahan Kimia
Bahan-bahan kimia yang diperlukan untuk ekstraksi dan deteksi RNA untai
ganda adalah bufer ekstraksi, bufer elektroforesis, bufer ekstraksi-etanol 16%.
poliakrilamid (akrilamid dan bisakrilamid) dan bufer elektroforesis gel. Jumlah dan
jenis bahan kimia yang diperlukan tersebut, selengkapnya terdapat pada Tabel
Lampiran 1. Sedangkan bahan-bahan kimia lainnya adalah etidium bromid, bentonit,
bufer fosfat, seluJosa dan akuades.
Alat-alat
Alat-alat yang diperlukan antara lain adalah alat untuk inokulasi secara
mekanis, timbangan, alat-alat gelas, sentrifus, elektroforesis, jarum suntik, kamera,
mikropipet, spatula dan lain-lain.
Metode
Tahanan percobaan pertama yang dilakukan adalah (A) koleksi isolat lapang,
(8) pembuatan inokulum, (C) perbanyakan isolat virus, (0) ekstraksi RNA untai
ganda dari tanaman, (E) pemurnian RNA untai ganda dari ekstrak, (F) penentuan
profit RNA untai ganda dengan eJektroforesis gel poliakrilamid.
A. Koleksi Isolat Lapang
Isolat Virus mosaik ketimun diperoleh dari lapang sekitar Bogor. Daun
tanaman yang terifeksi diambil dan diinokulasi ke tanaman N.glutinosa. lsolat yang
diperoleh diberi nomor dan dikoleksi.
B. Pembuatan Inokulum
Inokulum yang digunakan dibuat dengan menghancurkan daun tanaman
terinfeksi pada bufer fosfat pH 7.0 dengan perbandingan 1 : 10 (berat (g)/volume
(ml)). Cairan peranan tersebut diinokulasikan secara mekanis ke daun tanaman
dengan mengoleskan cairan tersebut dan sebelumnya ditaburi dengan Carborundum
320 mesh.
C. Perbanyakan Isolat Virus
Semua isolat diinokulasikan secara seri dengan lesio tunggal ke tanaman
C.amaranticolor. Selanjutnya isolat diperbanyak pada tanaman N.tabacum. Daun
tanaman N.tabacum yang terinfeksi digunakan sebagai sumber virus untuk
mempelajari gejala pada tanaman indikator dan material untuk analisa RNA untai
ganda dan satelitnya.
D. Ekstraksi RNA Untai Ganda
Tanaman yang telah diinokulasi 10 hari diambil untuk diekstrak RNA untai
gandanya. Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut:
1. Sebanyak 0.5-1.0 9 jaringan tanaman dihancurkan dengan mortar dan pestel.
2. Cairan tersebut dituang ke dalam gelas piala 5 ml yang berisi 1.3 ml penyangga
ekstraksi yang mengandung 3% natrium dodesil sulfat, 0.5% merkaptoetanol
dan 0.7 ml fenol. Lalu dikocok dengan vorteks kurang lebih 1 menit.
3. Isi tabung tersebut dipindah ke tabung reaksi yang mengandung 0.7 ml (24:1)
kloroform : Isoamil Alkohol, dikocok sampai rata dan diinkubasikan 20 menit
pada 20°C.
4. Selanjutnya disentrifus (5000 rpm, selama 15 menit), supernatan diambil
sebanyak 1.1 ml.

©2003 Digitized by USU digital library

6

E. Pemurnian RNA Untai Ganda
Ekstrak RNA untai ganda yang diperoleh, selanjutnya dimurnikan dengan
metode menambahkao selulosa ke supernatan. Langkah-langkahnya adalah sebagai
berikut:
1. Sebanyak 2.5 g selulosa (Whatman CF-11) dilarutkan dengan 50 ml STE-etanol
(16.5%). Kemudian 1 ml campuran tersebut diambil dan disentrifus selama 5
menit, supernatannya dibuang.
2. Kedalam selulosa tersebut dimasukkan supernatan No.4 dan ditambahkan
ethanol 95% sebanyak 210 ml. Diaduk rata atau digoyang selama 15-20 menit.
Kemudian disentrifus (5000 rpm, selama 5 menit) untuk mengendapkan
selulosanya, supernatan dibuang.
3. Selulosa dicuci 3 kali masing-masing dengan 1 ml STE-etanol (16.5%). Sebagai
pencuci akhir ditambahkan larutan STE sebanyak 100 ml. Kemudian disentrifus
(5000 rpm, 5 menit), supernatannya dibuang.
4. Selulosa disuspensikan dengan larutan STE sebanyak 500 ml, kemudian
disentrifusi selama 10 menit. Kemudian supernatan dipindahkan ke tabung yang
lain.
5. Kedalam larutan tersebut ditambahkan 25 ml 3M natrium asetat dan 1.1 ml
etanol 95%, kemudian diinkubasikan pada suhu -20°C selama 24 jam.
6. RNA untai ganda diendapkan dengan sentrifus (5000 rpm, 10 menit), kemudian
ditambahkan larutan penyangga elektroforesis sebanyak 20 ml.
F. Penentuan Profil RNA Untai Ganda .
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan poliakrilamid gel elektroforesis
selama 150 menit pada 1 OOV. Setelah sampai di dalam gel diwarnai dengan etidium
bromid, kemudian diekspos dibawah sinar ultraviolet. Setelah adanya fluoresensi dari
gel, kemudian difoto. Pola yang terbentuk pada gel dicatat, termasuk adanya virus
satelit.
Langkah-langkah penelitian ini secara skematis dapat digambarkan sebagai
berikut:
Koleksi Isolat dari Lapang
Uji Hayati
Gejala pada Tanaman Indikator
Deteksi Asosiasi Virus-Satelit RNA-5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Koleksi Isolat Lapangan
Isolat yang berasal dari lapangan sebanyak 10 isolat, berasal dari tanaman
ketimun, cabai, tomat dan buncis. Setelah diuji secara hayati untuk seleksi isolat
virus mosaik ketimun, tersisa lima buah isolat. Metode uji hayati yang dilakukan
adalah sebagai berikut : Sam pel dari lapang pertama kali diuji ketanaman Nicotiana
glutinosa. Selanjutnya diinokulasikan ketanaman Cucumis sativus, kemudian ke
tanaman Chenopodium amaranticolor (diulang sebanyak tiga kali). Terakhir kali

©2003 Digitized by USU digital library

7

diinokulasikan kembali ke tanaman N.glutinosa dan C.sativus. Prosedur diuji hayati
selengkapnya terdapat pada Tabel Lampiran 1.
Dari kelima isolat yang diperoleh, setelah diinokulasikan ke tanaman
N.glutinosa menimbulkan gejala mosaik sistemik, bercak yang berwarna hijau tua
dan cembung (Gambar 3). Pada tanaman C.sativus semua isolat menimbulkan gejala
mosaik (Gambar 3). Lesio Lokal adalah gejala yang timbul setelah diinokulasikan ke
tanaman C.sativus dan N.glutinosa gejala yang timbul adalah mosaik sistemik, maka
dapat disimpulkan bahwa isolat tersebut adalah virus mosaik ketimun. Kesimpulan
ini dikuatkan pula oleh analisis yang dilakukan terhadap profit yang berbentuk pada
poliakrilamid gel elektroforesis (lihat bahasan sub bab berikut).
Deteksi Virus Mosaik Ketimun dan Satelitnya
Berdasarkan deteksi dan analisis Virus mosaik ketimun serta satelitnya
dengan poliakrilamid gel elektroforesis diperoleh hasil seperti gambar dibawah ini.
Dari gambar diatas terlihat bahwa tidak terbentuk profil pada gel dari
tanaman sehat (kolom C), sedangkan profil terbentuk pada kolom dari tanaman sakit
yang sebelumnya diinokulasi dengan virus mosaik ketimun (kolom A, B, C, D, E, F,
G. dan H).

Gambar 3. Gejala yang timbul pad a uji hayati; A. Sampel dari lapang, B & E.
Gejala rnosaik pada tanarnan N. GJutinosa; C & F. Gejala pada tanaman
C. Sativus; D. Gejala lesio lokal pada tanarnan C. amaranticolor
RNA untai ganda yang diekstrak dari tanarnan terinfeksi adalah konsisten, hal
ini terlihat dari terbentuknya profit yang sama dari semua tanaman yang terinfeksi.
Hal ini membuat deteksi RNA untai ganda menjadi metode yang praktis untuk
diagnosis virus.

©2003 Digitized by USU digital library

8

Gambar 4. Poliakrilamid gel elektroforesis RNA untai ganda virus mosaik ketimun
yang diekstrak dari tanaman ketimun : A. Isolat Cx1 B. Isolat C1, C.
Tanaman sehat, D. Isolat C2, E. Isolat virus mosaik ketimun berat, F.
Isolat C4, G. Isolat C3, H. Isolat C5. Gel diperlakukan pada 100 V selama
150 menit.
Profit pada gel tidak terbentuk dari tanaman sehat dengan demikian prosedur
ekstraksi dan pemurnian RNA untai ganda telah dilaksanakan dengan baik. Prosedur
ekstraksi dan pemurnian yang dilakukan dapat memisahkan RNA tanaman, sehingga
tidak terbentuk profit pada gel dari tanaman sehat.
Virus mosaik ketimun mempunyai RNA-1, RNA-2, RNA-3 dan RNA-4. Selain
itu terdapat pula RNA-4a, RNA-5. RNA-6 dan RNA-X (Peden dan Symons. 1973).
Ternyata isolat yang mengandung RNA-5 (satelit RNA) ialah isolat C1, C2, dan C4
(kolom B, D, dan F). Isolat C3 dan C5 tidak mengandung satelit RNA (kolom G dan
H), begitu pula isolat yang menyebabkan gejala berat pada tanaman cabai dan
tomat juga tidak mengandung satelit RNA (kolom E). Isolat Cx (kolom A) adalah
isolat pembanding yang mengandung satelit RNA-5.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Lima isolat virus mosaik ketimun mempunyai pola tanda atau profil yang
sarna (RNA-1. RNA-2, dan RNA-3) pada gel setelah dideteksi dengan poliakrilamid
gei elektroforesis. Isolat C1, C2 dan C2 mempunyai virus satelit RNA-5. Tidak semua
isolat yang mempunyai satelit RNA-5 efektif menekan virus penolongnya dan
ditunjukkan oleh gejala yang timbul pada tanaman.
Saran

Koleksi isolat virus mosaik ketimun perlu diperbanyak dan kemudian saling
dipertukarkan satelit RNA-5 untuk mendapatkan asosiasi yang lebih efektif dalam
menekan serangan virus mosaik ketimun yang patogenik.

©2003 Digitized by USU digital library

9

DAFTAR PUSTAKA
Agrios, G.N. 1988. Plant Pathology. Academic Press. New York. 803 p.
Bar-Joseph, M.A.Rosner, M.Moskovitz dan R.Hull. 1983. A. simple procedure for the
extraction of double stranded RNA from viral infected plants, J.Virology
Method. 6:1-8.
Bozarth, R.F. dan E.H.Harley. 1976. The electrophoretic mobiUty of double-stranded
RNA in polyacrylamids gels as a function of molecular weight. Biochim.
Biophys. Acta. 432 : 329-335.
Condit,C. Dan H.Fraenkel-Conrat. 1979. Isolation of replicative form of 3, terminal
subgenomic RNAs of tobacco necrosis Virus. Virology. 97 : 122-130.
Diaz-Ruiz,J.R.dan J.M.Kaper. 1978. Isoiation of viral double-stranded RNAs using
LiCL fractination procedure. Biochem. 8 : 1 -17.
Dodds,J.A., T.J.Morris dan R.L.Jordan. 1984. Plant viral doublls-stranded
RNA.A.nnu.Rev.Phytopathologi 22 : 151 -168.
Doolittle, S.P. 1953. Diseases of peppers. Yearbook of Agricultural USDA.
Washington DC The United States Government Printing Office. 940 p.
Edwardson, J.R. dan R.G. Christie. 1978. Use of virus induced inclusion in
classification and diagnosis. Annu.Rev.Phytopatologi. 16: 31 -55.
Garnier, M.R.Momoun dan J.M.Bove. 1980. TYMV RNA replacation in vivo: Replicative
intermediet is mainly single stranded. Virology. 104 : 357 - 374.
Henriques, M.C. dan T.J. Morris. 1979. Evidence for different replicative strategies in
the plant tombusvirus. Virology. 99: 66-74.
Jordan, R.L., J.A. Dodds dan H.D.Ohr. 1983. Evidence for viruslike agents in
avocado. Phytopathologi. 73 : 1130 -1135.
Kaper, J.M. 1982. Rapid synthosis of double-stranded cucumber mosaic virusassociated RNA 5 : Mechanism Controlling Viral Pathogenesis. Biochem.
Biophys. Res. Comm. 105 : 1014 -1022. Kaper, J.M. 1983. Perspective on CARNA 5,
cucumber mosaic virus-dependent replicating RNA 5 capable of modifying
disease expression. Plant Mol. BioI. Rep. 1 : 45-54.
Kaper, J.M. dan M.E. Tousignant. 1977. Cuccumber mosaic virus-associated RNA 5.
I.Role of host plant and helper strain in determining amount of associated
RNA 5 with virions. Virology. 80 : 186 -195.
Lot, H.dan J.M. Kaper. 1976. Further studies on the RNA component distribution
among the nucleoproteins of cucumber mosaic virus. Virology. 74 : 223 -226.
Matthews, R.E.F. 1973. Induction of diseases by viruses with spesific reference to
turnip yellow mosaic virus.Annu. Rev. Phytopathologi. 11 : 147 -170.
Morris, T.J. dan J.A. Dodds. 1979. Isolation and analysis of double-stranded RNA
from virus-infected plant and fugal tis~ue. Phytopathologi. 69 : 854-858.
Murant, A.F.dan A.M. Mayo. 1982. Satellites of plant viruses. Ann.
Rev.Phytophatologi. 20 : 47-70.
Peden, K.W.C. dan R.H. Symons. 1973. Cucumber mosaic viru contains a uncionally
divided genome. Virology. 53: 487-492.
Ralph, R.K. 1969. Double-stranded viral RNA. Adv.Virus Res. 15: 61-158.
Schneider, I.R dan S.M. Thompson. 1977. Double-stranded nucleic acids found in
tissue infected with the satellite of tobacco ringspot virus. Virology. 78 : 453462.
Takanami, Y. 1981. A striking change in symtomps on cucumber mosaic virusinfected tobacco plants induced by a stellite RNA. Virology. 109 :120-126.
Takanami, Y., S.Kubo dan S. Imaizumi. 1977. Synthesis of single and doublestranded cucumber mosaic virus RNAs in tobacco mesophyll protoplast.
Virology. 80: 376-389.

©2003 Digitized by USU digital library

10

Tien, B.P., X.Zhang, B.Qiu, B.Oin dan G.Wu. 1987. Satellite RNA for control of plant
diseases caused by cucumber mosaic virus. Ann. Appl.Biol. 111.1-10.
Valverde, R.A., J.A. Dodds dan J.A. Heick. 1986. Double-stranded ribonucleic acid
from plants infected with viruses having elongated particle and-undivided
genomes. Phytopathologi. 76 : 459 -465.
Valverde, R.A., S.T.Nameth dan R.L.Jordan. 1990. Analysis of double-stranded RNA
for plant virus diagnosis. Plant Diseases. 74 : 255 -258.

©2003 Digitized by USU digital library

11