Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test.
ii
ABSTRACT
RIZAL DWI HARDYANA. Optimal Time Determination to Test Spermatozoa
Membrane Integrity of Limousin and Frisien Holstein Frozen Semen Using HypoOsmotic Swelling (HOS) Test. Directed by Prof. Dr. Dra. R. Iis Arifiantini, MSi.
The study was conducted to determine the optimal time to test the integrity
of plasma membrane of Limousin and Frisien Holstein (FH) bull frozen semen
spermpatozoa using hypoosmotic swelling (HOS) test. A total of 15 samples from
each bull used. All samples were incubated in a hypoosmotic solution with
osmolarity of 150 mOsm Kg-1 for 60 minutes. The hypoosmotic solution made by
admix 1.351 g fructose, 0.735 Na-citrate and water until the volume was 100 ml.
Every 15 minutes the whole sample was evaluated the percentage of spermatozoa
that reacts to the solution. Optimal time was obtained at 30’ and 45’, both on
Limousin and FH frozen semen. The mean percentage of reacted Limousin bull
spermatozoa at 30’ and 45’ respectively were 53.90 ± 6.81 % and 52.47 ± 8.00 %.
Whereas the FH bull spermatozoa was 44.52 ± 6.26 % and 44.46 ± 8.42 %.
Spermatozoa from frozoen semen needs time to react to hypoosmotic solution due
to the added of freezing diluent. This causes the spermaozoa did not react
immediately to the hypoosmotic solution. Plasma membrane integrity is very
important for sperm fertility. Fertility enzymes contained in the head of
spermatozoa, thus if the plasma membrane of the head broken, spermatozoa will
lose their fertility. Similarly in the tail, if the plasma membrane broken,
spermatozoa will lose their motility.
Key words : HOS test, plasma membrane integrity, Limousin frozen semen, FH
frozen semen
iii
RINGKASAN
RIZAL DWI HARDYANA. Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan
Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein
Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test. Dibimbing oleh Iis
Arifiantini.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui waktu yang paling optimal
untuk pengujian keutuhan membran plasma spermatozoa semen beku sapi
Limousin dan Frisien Holstein (FH) dengan menggunakan metode hypo-osmotic
swelling (HOS) test. Teknologi Inseminasi Buatan (IB) mulai diperkenalkan di
Indonesia pada tahun 1952 tetapi aplikasinya secara masal di lapangan baru
dimulai sejak tahun 1973 dengan menggunakan semen beku yang diimpor dari
New Zealand (Selandia Baru). Untuk tujuan IB, spermatozoa dapat disimpan
dahulu dalam bentuk semen cair maupun semen beku. Untuk menghasilkan semen
beku yang berkualitas tinggi diperlukan bahan pengencer semen yang mampu
mempertahankan kualitas spermatozoa selama proses pendinginan, pembekuan,
maupun pada saat thawing. Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus
bergerak mencapai tempat pembuahan dengan menggunakan energi yang
diperoleh dari pengencer, sehingga motilitas sering dijadikan indikator fertilitas
spermatozoa namun demikian pergerakan spermatozoa dipengeruhi oleh integritas
struktur morfologi spermatozoa. Metode HOS test adalah salah satu teknik untuk
mengevaluasi keutuhan membran plasma spermatozoa pada hewan domestik,
namun pengujian untuk semen baku sapi jarang dilakukan. Penentuan waktu
optimal ini dialakukan dengan menginkubasi spermatozoa dari semen beku dalam
larutan dengan osmolaritas 150 mOsm Kg-1 pada suhu 37 °C selama 60 menit.
Hasil pengamatan persentase laju reaksi spermatozoa sapi Limousin
terhadap larutan hipoosmotik pada menit ke-0, 15, 30, 45, dan 60 berturut-turut
adalah 33.16 ± 10.55 %, 46.88 ± 9.63 %, 53.90 ± 6.81 %, 52.47 ± 8.00 %, 42.46 ±
9.43 %. Sedangkan persentase sapi FH berturut-turut adalah 27.19 ± 6.11 %,
35.97 ± 6.14 %, 44.52 ± 6.26 %, 44.42 ± 8.41 %, 33.17 ± 9.63 %. Dari hasil
pengamatan tersebut diketahui bahwa pada spermatozoa Limousin dan FH waktu
yang paling optimal untuk melakukan pengujian keutuhan membran plasma
spermatozoa semen baku adalah pada menit ke-30 sampai 45. Pada waktu tersebut
jumlah persentase spermatozoa yang bereaksi mencapai puncak.
PENENTUAN WAKTU OPTIMAL
PENGUJIAN KEUTUHAN MEMBRAN PLASMA
SPERMATOZOA SEMEN BEKU SAPI LIMOUSIN DAN
FRISIEN HOLSTEIN MENGGUNAKAN HYPO-OSMOTIC
SWELLING (HOS) TEST
RIZAL DWI HARDYANA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
i
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul Penentuan Waktu
Optimal Pengujian Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi
Limousin dan Frisien Holstein Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test
adalah karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal
dan dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir skripsi ini.
Bogor, Agustus 2012
Rizal Dwi Hardyana
B04080064
ii
ABSTRACT
RIZAL DWI HARDYANA. Optimal Time Determination to Test Spermatozoa
Membrane Integrity of Limousin and Frisien Holstein Frozen Semen Using HypoOsmotic Swelling (HOS) Test. Directed by Prof. Dr. Dra. R. Iis Arifiantini, MSi.
The study was conducted to determine the optimal time to test the integrity
of plasma membrane of Limousin and Frisien Holstein (FH) bull frozen semen
spermpatozoa using hypoosmotic swelling (HOS) test. A total of 15 samples from
each bull used. All samples were incubated in a hypoosmotic solution with
osmolarity of 150 mOsm Kg-1 for 60 minutes. The hypoosmotic solution made by
admix 1.351 g fructose, 0.735 Na-citrate and water until the volume was 100 ml.
Every 15 minutes the whole sample was evaluated the percentage of spermatozoa
that reacts to the solution. Optimal time was obtained at 30’ and 45’, both on
Limousin and FH frozen semen. The mean percentage of reacted Limousin bull
spermatozoa at 30’ and 45’ respectively were 53.90 ± 6.81 % and 52.47 ± 8.00 %.
Whereas the FH bull spermatozoa was 44.52 ± 6.26 % and 44.46 ± 8.42 %.
Spermatozoa from frozoen semen needs time to react to hypoosmotic solution due
to the added of freezing diluent. This causes the spermaozoa did not react
immediately to the hypoosmotic solution. Plasma membrane integrity is very
important for sperm fertility. Fertility enzymes contained in the head of
spermatozoa, thus if the plasma membrane of the head broken, spermatozoa will
lose their fertility. Similarly in the tail, if the plasma membrane broken,
spermatozoa will lose their motility.
Key words : HOS test, plasma membrane integrity, Limousin frozen semen, FH
frozen semen
iii
RINGKASAN
RIZAL DWI HARDYANA. Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan
Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein
Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test. Dibimbing oleh Iis
Arifiantini.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui waktu yang paling optimal
untuk pengujian keutuhan membran plasma spermatozoa semen beku sapi
Limousin dan Frisien Holstein (FH) dengan menggunakan metode hypo-osmotic
swelling (HOS) test. Teknologi Inseminasi Buatan (IB) mulai diperkenalkan di
Indonesia pada tahun 1952 tetapi aplikasinya secara masal di lapangan baru
dimulai sejak tahun 1973 dengan menggunakan semen beku yang diimpor dari
New Zealand (Selandia Baru). Untuk tujuan IB, spermatozoa dapat disimpan
dahulu dalam bentuk semen cair maupun semen beku. Untuk menghasilkan semen
beku yang berkualitas tinggi diperlukan bahan pengencer semen yang mampu
mempertahankan kualitas spermatozoa selama proses pendinginan, pembekuan,
maupun pada saat thawing. Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus
bergerak mencapai tempat pembuahan dengan menggunakan energi yang
diperoleh dari pengencer, sehingga motilitas sering dijadikan indikator fertilitas
spermatozoa namun demikian pergerakan spermatozoa dipengeruhi oleh integritas
struktur morfologi spermatozoa. Metode HOS test adalah salah satu teknik untuk
mengevaluasi keutuhan membran plasma spermatozoa pada hewan domestik,
namun pengujian untuk semen baku sapi jarang dilakukan. Penentuan waktu
optimal ini dialakukan dengan menginkubasi spermatozoa dari semen beku dalam
larutan dengan osmolaritas 150 mOsm Kg-1 pada suhu 37 °C selama 60 menit.
Hasil pengamatan persentase laju reaksi spermatozoa sapi Limousin
terhadap larutan hipoosmotik pada menit ke-0, 15, 30, 45, dan 60 berturut-turut
adalah 33.16 ± 10.55 %, 46.88 ± 9.63 %, 53.90 ± 6.81 %, 52.47 ± 8.00 %, 42.46 ±
9.43 %. Sedangkan persentase sapi FH berturut-turut adalah 27.19 ± 6.11 %,
35.97 ± 6.14 %, 44.52 ± 6.26 %, 44.42 ± 8.41 %, 33.17 ± 9.63 %. Dari hasil
pengamatan tersebut diketahui bahwa pada spermatozoa Limousin dan FH waktu
yang paling optimal untuk melakukan pengujian keutuhan membran plasma
spermatozoa semen baku adalah pada menit ke-30 sampai 45. Pada waktu tersebut
jumlah persentase spermatozoa yang bereaksi mencapai puncak.
iv
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
v
PENENTUAN WAKTU OPTIMAL
PENGUJIAN KEUTUHAN MEMBRAN PLASMA
SPERMATOZOA SEMEN BEKU SAPI LIMOUSIN DAN
FRISIEN HOLSTEIN MENGGUNAKAN HYPO-OSMOTIC
SWELLING (HOS) TEST
RIZAL DWI HARDYANA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
vi
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan Membran
Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan
Frisien Holstein Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling
(HOS) Test.
: Rizal Dwi Hardyana
: B04080064
Disetujui,
Prof. Dr. Dra. R. Iis Arifiantini, MSi
Pembimbing
Diketahui,
Drh. Agus Setiono, MSi, PhD, APvet
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan IPB
Tanggal Lulus :
vii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur senantiasa penulis panjatkan kepada Allah SWT. Karena
atas segala karunianyalah sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian yang
berjudul Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan Membran Plasma
Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein Menggunakan
Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test.
Terimaksih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Prof. Dr.
Dra. R. Iis Arifiantini, MSi. sebagai pembimbing skripsi atas segala kesabaran,
pengorbanan, bimbingan serta dukungan moral sehingga penulis dapat
menyelesaikan penulisan karya tulis ini dengan baik. Kepada Bapak drh.
Mochidin Noordin, Ibu Dr. drh. Savitri Novelina, MSi, PAvet dan Ibu drh.
Herwin Pisestyani, MSi selaku dosen penguji yang telah memberi banyak
masukan pada penulisan karya ilmiah ini. Kepada Bapak Dr. drh. Amrozi selaku
kepala Unit Rehabilitasi dan Reproduksi (URR) yang telah memberikan izin
melakukan penelitian di laboratorium fisiologi reproduksi, serta kepada Bapak
Bondan, Bapak dan Ibu Anda dan segenap staf URR.
Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dikdik Taupik
Siddik, Mamah Yani Sutiyani, Teteh Dian Eka Astuti, Ade Moch. Bintang Aulia,
Bibi Linlin, serta seuruh keluarga besar yang tanpa henti memberikan kasih
sayang, doa, semangat serta dukungan yang tak terhingga sehingga penulis dapat
menyelesaikan studi sarjana di FKH IPB. Selanjutnya penulis ucapkan terima
kasih kepada teman-teman satu penelitian, Innes, Irin dan Rice. Serta tak lupa
sahabat tercinta selama di FKH, Aming dan Ibon. Teman-teman Team Mawar,
segenap teman-teman AVENZOAR, dan teman-teman NoesCamp 146. Kepada
Oktaviani Solestiawati yang telah memberikan semangat dan kasih sayang.
Penulis menyadari skripsi ini masih jauh dari sempurna, untuk itu penulis
mengucapkan terima kasih atas kritik dan saran yang sifatnya membangun dari
semua pihak demi kesempurnaan karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Agustus 2012
Rizal Dwi Hardyana
viii
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Bandung, Jawa Barat pada tanggal 24 September 1990 dari
Ayah Dikdik Taupik Siddik dan Ibu Yani Sutiyani. Penulis merupakan putra
kedua dari tiga bersaudara.
Penulis menempuh sekolah dasar di SD Negeri 7 Rancaekek Kab. Bandung
dan lulus tahun 2002, kemudian melanjutkan ke SLTP Negeri 1 Rancaekek Kab.
Bandung dan lulus tahun 2005. Pendidikan SMA penulis selesaikan di SMA
Negeri 1 Cisarua Kab. Bandung Barat dan lulus pada tahun 2008. Pada tahun
yang sama, penulis masuk Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Undangan Saringan Masuk IPB (USMI).
Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif di Lingkung Seni Sunda (LISES)
Gentra Kaheman IPB, Paguyuban Mahasiswa Bandung (PAMAUNG), Himpunan
Minat dan Profesi (HIMPRO) Satwa Liar, serta Badan Eksekutif Mahasiswa
(BEM) Kabinet Katalis periode 2009-2010.
ix
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
Latar Belakang .................................................................................................... 1
Tujuan .................................................................................................................. 2
Manfaat ................................................................................................................ 2
Hipotesis .............................................................................................................. 2
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 3
Karakteristik Semen Sapi .................................................................................... 3
Semen Beku ......................................................................................................... 4
Hypo-osmotic Swelling Test ................................................................................ 5
MATERI DAN METODE ...................................................................................... 7
Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................................. 7
Sampel Semen ..................................................................................................... 7
Bahan dan Alat .................................................................................................... 7
Metode ................................................................................................................. 7
Pembuatan Larutan Hipoosmotik .................................................................... 7
Pengujian HOS Test ......................................................................................... 7
Perhitungan ...................................................................................................... 7
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 9
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 21
Simpulan ............................................................................................................ 21
Saran .................................................................................................................. 21
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 22
LAMPIRAN .......................................................................................................... 26
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1
Persentase jumlah spermatozoa sapi Limousin yang bereaksi
terhadap larutan hipoosmotik selama masa inkubasi ...........................11
Tabel 2
Persentase jumlah spermatozoa sapi FH yang bereaksi terhadap
larutan hipoosmotik selama masa inkubasi .........................................12
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Spermatozoa bereaksi dengan membran plasma utuh (ekor
melingkar, a), spermatozoa tidak bereaksi dengan membran
plasma tidak utuh (ekor lurus, b) (Saili et al. 2010). .............................8
Gambar 2 Diagram Venn untuk menunjukkan sub-populasi spermatozoa
dalam satu ejakulat berdasarkan parameter kualitas spermatozoa
(Morrell & Rodriguez-Martinez 2009). ...............................................10
Gambar 3 Grafik laju reaksi spermatozoa sapi Limousin terhadap larutan
hipoosmotik selama masa inkubasi......................................................13
Gambar 4 Grafik laju reaksi spermatozoa sapi FH terhadap larutan
hipoosmotik selama masa inkubasi......................................................13
Gambar 5 Reaksi spermatozoa dengan ekor membengkok yang berada pada
larutan hipoosmotik. ............................................................................14
Gambar 6 Ilustrasi regulasi pengaturan volume pada spermatozoa. ................... 16
Gambar 7 Perubahan volume spermatozoa sebagai respon terhadap kondisi
hipoosmotik. ........................................................................................17
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1
Persentase spermatozoa sapi Limousin bereaksi terhadap
larutan hipoosmotik........................................................................27
Lampiran 2
Persentase spermatozoa sapi FH bereaksi terhadap larutan
hipoosmotik ....................................................................................28
Lampiran 3
Uji statistik data spermatozoa sapi Limousin dangan uji
Duncan ............................................................................................29
Lampiran 4
Uji statistik data spermatozoa sapi FH dengan uji Duncan ............31
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Teknologi Inseminasi Buatan (IB) mulai diperkenalkan di Indonesia pada
tahun 1952 tetapi aplikasinya secara masal di lapangan baru dimulai sejak tahun
1973 dengan menggunakan semen beku yang diimpor dari New Zealand (Selandia
Baru). Untuk menghindari ketergantungan pada semen beku impor maka pada
tahun 1976 didirikan Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang (Jawa Barat) dan
diikuti BIB Singosari (Jawa Timur) pada tahun 1982, keduanya menjadi BIB
nasional yang melayani kebutuhan semen beku di Indonesia (Batubara 2002).
Dengan adanya UU no. 44 tahun 1999 mengenai otonomi daerah yang
memberikan kewenangan mengatur dan memajukan daerahnya sendiri tanpa ada
campur tangan pemerintah pusat, maka daerah terpacu dalam mendirikan balai
inseminasi buatan dengan nama BIBD, seperti di Lampung, Palembang, Padang,
Medan, Bali, Jawa Tengah, Kalimantan Selatan dan Blora (Arifiantini 2004).
Untuk tujuan IB, spermatozoa dapat disimpan terlebih dahulu dalam bentuk
semen cair maupun semen beku. Semen diencerkan menggunakan bahan
pengencer yang mengandung buffer, sumber energi, antibiotik dan lipoprotein
yang dapat mempertahankan kualitasnya selama penyimpanan. Dalam bentuk
semen cair, semen ejakulat dapat disimpan selama empat hari pada suhu 4 ºC
dengan motilitas lebih dari 40 % sehingga masih layak digunakan untuk IB
(Yulnawati & Setiadi 2005).
Setelah ditemukannya gliserol oleh Polge, pemanfaatan semen beku mulai
berkembang (Arifiantini et al. 2005a) dengan kemasan yang pertama kali
digunakan berbentuk pellet. Untuk menghasilkan semen beku yang berkualitas
tinggi dibutuhkan bahan pengencer semen yang mampu mempertahankan kualitas
spermatozoa selama proses pendinginan, pembekuan, maupun pada saat thawing
(Aboagla & Terada 2004).
Salah satu tujuan teknologi reproduksi dari hewan domestik adalah untuk
mengetahui kemampuan fertilitasnya (Rodriguez-Martinez 2003). Dengan
demikian, peternakan biasanya menilai kualitas (konsentrasi spermatozoa,
motilitas, morfologi, viabilitas, dan keutuhan akrosom) dari semen sebelum
2
dugunakan untuk inseminasi buatan (Ruiz-Sanchez et al. 2006), dan tes yang
lainnya telah dikembangkan (Gadea 2005).
Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus bergerak mencapai tempat
pembuahan dengan menggunakan energi yang diperoleh dari pengencer, sehingga
motilitas sering dijadikan indikator fertilitas spermatozoa. Namun demikian
pergerakan
spermatozoa
dipengaruhi
oleh
integritas
struktur
morfologi
spermatozoa (Yulnawati & Setiadi 2005).
Hypoosmotic Swelling (HOS) Test adalah salah satu teknik untuk
mengevaluasi keutuhan membran plasma spermatozoa pada hewan domestik
termasuk sapi (Correa & Zavos 1994), kuda (Neild et al. 1999), dan babi (Zou &
Yang 2000), tetapi dilakukan pada semen segar. Pengujian untuk semen beku sapi
jarang dilakukan. Keutuhan membran plasma bagi spermatozoa mutlak diperlukan
untuk memenuhi fungsinya sebagai pelindung organel di dalam sel dan penyaring
bagi pertukaran zat intraseluler dan ekstraseluler. Demikian halnya dengan
kondisi tudung akrosom yang harus tetap utuh untuk menjaga keamanan enzimenzim fertilisasi yang terdapat di dalam vesikel akrosom.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu yang paling optimal
untuk pengujian keutuhan membran plasma spermatozoa semen beku sapi
Limousin dan Frisien Holstein (FH) dengan menggunakan metode hypoosmotic
swelling (HOS) test.
Manfaat
Mendukung hasil evaluasi motilitas dan scoring individu yang saat ini telah
dilakukan untuk pengujian semen beku.
Hipotesis
Bahan pengencer yang terdapat dalam semen beku akan mengurangi
sensitivitas membran plasma terhadap larutan hipoosmotik.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen Sapi
Menurut Garner dan Hafez (2000), semen merupakan cairan suspensi sel
yang di dalamnya mengandung spermatozoa dan sekresi kelenjar assesorius dari
organ kelamin jantan. Semen terdiri atas dua bagian yaitu spermatozoa dan
plasma semen. Sejumlah parameter digunakan untuk menilai kualitas dari semen,
diantaranya volume, konsentrasi spermatozoa, motilitas spermatozoa, jumlah
spermatozoa hidup, jumlah spermatozoa abnormal dan komposisi biokimiawinya,
serta tes fungsional.
Kepadatan spermatozoa pun ternyata penting untuk menentukan dosis
dan/atau kapasitas fertilitas dari semen tersebut. Motilitas progresif penting karena
dapat memperkirakan penilaian usia hidup semen. Spermatozoa dikatakan motil
apabila spermatozoa tersebut bergerak ke depan (progresive motility), sedangkan
spermatozoa yang bergerak melingkar disebut sebagai non-progresive motility
(Arifiantini et al. 2005b).
Semen sapi yang normal berwarna seperti susu atau krem keputih–putihan
dan keruh dengan konsentrasi encer. Hal ini disebabkan oleh volume yang kecil
tetapi mempunyai konsentrasi spermatozoa yang tinggi. Konsentrasi spermatozoa
merupakan salah satu parameter yang sering kali dipakai sebagai salah satu
kriteria penentuan kualitas semen. Konsentrasi spermatozoa adalah jumlah
spermatozoa yang terkandung dalam setiap mililiter semen. Konsentrasi
spermatozoa sapi adalah 0.8-2.0 × 109 spermatozoa/ml (Salisbury & VanDemark
1985),
sedangkan
menurut
Schuh
(2001)
adalah
3.6-12
×
109
spermatozoa/ejakulasi.
Motilitas adalah daya gerak maju spermatozoa, merupakan ciri spermatozoa
hidup dan normal yang menjadi salah satu kriteria untuk menentukan kualitas
semen. Pemeriksaan terhadap motilitas sermatozoa dapat dilakukan dengan
melihat gerakan massa pada semen segar atau dengan menghitung persentase
spermatozoa yang motil progresif pada semen yang telah diencerkan atau setelah
pembekuan dan thawing (Evans & Maxwell 1987). Menurut Zesfin et al. (2001),
motilitas spermatozoa pada sapi kelompok umur muda 65 ± 13.81 % dan
kelompok umur sapi dewasa rata-rata 62.22 ± 14.77 %.
4
Semen Beku
Semen beku adalah semen yang berasal dari pejantan terpilih yang
diencerkan sesuai prosedur, dibekukan dan disimpan pada suhu -196 °C. Tujuan
dari pengawetan semen adalah agar semen yang diperoleh masih dapat digunakan
dalam jangka waktu yang lama, sehingga fertilitas semen tetap terjaga. Semen
beku yang dibutuhkan adalah sekurang-kurangnya lima sampai sepuluh juta
spermatozoa yang motil progresif tiap inseminasi untuk mendapat rata-rata
fertilisasi yang optimal (Yanti 2005).
Terdapat beberapa cara pengawetan semen. Menurut Salisbury dan
VanDemark (1985), dua teknik pengawetan semen agar keoptimalan fertilitas
spermatozoa
dapat
dipertahankan.
Teknik
yang pertama
yaitu
dengan
menyediakan ion-ion esensial, enzim-enzim, zat-zat makanan dan vitaminvitamin. Teknik lain adalah dengan penghambatan secara fisik dan kimiawi semua
aktifitas minimal yang penting dalam spermatozoa. Teknik pertama memerlukan
pengetahuan yang lengkap tentang fungsi dan kebutuhan-kebutuhan spermatozoa
serta usaha untuk memenuhi kebutuhan tersebut. Teknik kedua ini relatif lebih
mudah dilaksanakan dengan cara menurunkan temperatur sehingga proses
metabolisme dapat dihambat.
Sampai saat ini proses pembekuan semen mengalami beberapa masalah
seperti terjadinya cold shock, osmotic shock, kerusakan intraseluler akibat
terbentuknya kristal es, perubahan permeabilitas membran yang mengakibatkan
kematian sel saat pencairan kembali (thawing) (Achmadi 2001). Beberapa upaya
dapat dilakukan untuk mengatasi permasalahan diatas diantaranya penggunaan
gliserol secara perlahan untuk mencegah osmotic shock serta pemberian
kesempatan equilibrasi atau adaptasi untuk keseimbangan molekuler antara
spermatozoa dengan bahan pengencer (Salisbury & VanDemark 1985).
Menurut Awad (2011), kebanyakan protokol kriopreservasi semen masih
menggunakan gliserol sebagai media krioprotektan, seperti yang dicontohkan
Polge et al. (1949). Gliserol, bersama metanol dan etilen glikol termasuk
kelompok yang dapat menembus ke dalam sel spermatozoa. Gliserol adalah
krioprotektan yang paling umum digunakan untuk spermatozoa ternak. Namun,
jika gliserol digunakan dalam konsentrasi tinggi memiliki beberapa toksisitas dan
5
mungkin krioprotektan tersebut yang menyebabkan kerusakan osmotik terbesar
untuk spermatozoa karena permeabilitasnya menembus membran plasma
spermatozoa lebih rendah daripada air dan krioprotektan lainnya (Guthrie et al.
2002).
Dalam proses kriopreservasi (pembekuan) semen, akibat perlakuan suhu
yang sangat rendah (-196 °C) akan terbentuk kristal-kristal es dan peningkatan
konsentrasi elektrolit intraseluler yang menyebabkan kerusakan sel spermatozoa.
Untuk mengurangi efek ini, di dalam pengencer harus ditambahkan senyawa
krioprotektan. Selain gliserol yang berperan sebagai krioprotektan intraseluler,
juga dikenal berbagai macam gula seperti laktosa yang dapat berfungsi sebagai
krioprotektan ekstraseluler (Rizal & Herdis 2005).
Hypo-osmotic Swelling Test
Hypo-osmotic Swelling (HOS) Test pada awalnya dirancang penggunaannya
pada spermatozoa manusia untuk mengevaluasi aktivitas biokimia dari fisik
membran plasma secara utuh (Jeyendran et al. 1984). Hal ini didasarkan pada
pengamatan bahwa jika spermatozoa dengan membran sel fungsional ditempatkan
pada larutan hipoosmotik, air mengalir melalui membran dan masuk ke dalam sel,
sehingga membangun kembali keseimbangan antara kompartemen cairan
ekstraseluler dan cairan intraseluler. Sel tersebut meningkatkan volumenya dan
membran yang menutupi ekor spermatozoa mengembang, menyebabkan
flagellum menggulung di dalamnya. Ekor melingkar dimulai pada ujung distal
ekor dan berlanjut menuju bagian tengah dan kepala saat tekanan osmotik pada
media pembekuan menurun (Fonseca et al. 2005).
Spermatozoa pada semen beku mengalami kondisi hipertonik selama
pembekuan–pencairan, dan kondisi isotonik selama pembersihan sperma in vitro
atau ketika berada pada saluran reproduksi betina selama IB (Ball & Peters 2004).
Osmotic shock berarti perubahan seluler (melingkarnya ekor spermatozoa) yang
terjadi selama paparan kondisi isotonik spermatozoa setelah terpapar kondisi
hipertonik.
Saat terekspos larutan hipoosmotik, secara biokimia spermatozoa aktif
meningkatkan volume mereka dalam rangka untuk membangun keseimbangan
antara kompartemen cairan intraseluler dan cairan ekstraseluler (Fonseca et al.
6
2005). Fonseca et al. (2005) juga menyatakan bahwa pembengkakan
menyebabkan perubahan baik dalam ukuran maupun bentuk sel yang dapat
dievaluasi dengan menggunakan phase contrast microscope.
7
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2011 sampai dengan April 2012.
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Fisiologi Reproduksi Unit Rehabilitasi
Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Sampel Semen
Sampel semen berasal dari Balai Inseminasi Buatan Lembang, Jawa Barat
sebanyak 15 straw dari sapi Limousin dan 15 straw dari sapi Frisien Holstein
(FH) yang diambil secara acak. Sampel dimasukkan ke dalam container yang
berisi nitrogen cair dengan suhu -196 °C.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 straw sampel semen
beku dari BIB Lembang, Na-sitrat, fruktosa, dan nitrogen cair.
Alat–alat yang digunakan pada penelitian ini adalah, mikroskop (Olympus
CH 20), water bath, counter, object dan cover glass, tabung Eppendorf,
mikropipet dan tip, meja pemanas, container, dan pipet tetes.
Metode
Pembuatan Larutan Hipoosmotik
Sebanyak 1.351 g fruktosa dan 0.735 g Na-sitrat ditimbang dan dimasukkan
ke dalam gelas piala. Lalu ditambahkan aquabidest ke dalam gelas piala sampai
dengan volume 100 ml maka akan terbentuk larutan dengan osmolaritas 150
mOsm Kg-1 (Revell & Mrode 1994).
Pengujian HOS Test
Sebanyak 400µl larutan hipoosmotik disiapkan di dalam tabung Eppendorf.
Semen beku di-thawing dalam water bath dengan suhu 37 °C selama 30 detik.
Straw dikeringkan dengan menggunakan tissue. Straw dipotong pada kedua
sumbatnya dan isi straw dikeluarkan seluruhnya, lalu 50 µl semen dimasukkan ke
dalam tabung Eppendorf. Larutan yang telah dicampur dihomogenkan dengan
cara membentuk angka delapan. Ambil satu tetes dengan pipet, teteskan pada
8
object glass, lalu tutup dengan cover glass dan lihat di bawah mikroskop
(Olympus CH 20) dengan perbesaran 40 × 10, hitung spermatozoa yang normal
dan yang telah bereaksi dengan larutan hipoosmotik pada 10 lapang pandang,
untuk mendapatkan data HOS test pada menit ke-0.
Campuran semen dalam larutan hipoosmotik disusun dalam rak pada water
bath berisi air dengan suhu 37 °C. Pengujian keutuhan membran plasma semen
beku dilakukan pada menit ke 0, 15, 30, 45, dan 60. Pengujian dilakukan dengan
cara mengambil satu tetes dengan pipet tetes dan diletakkan pada object glass,
lalu tutup dengan cover glass dan lihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 40
× 10, hitung spermatozoa yang normal dan yang telah bereaksi pada 10 lapang
pandang.
Perhitungan
Perhitungan spermatozoa yang bereaksi dilakukan pada 10 lapang pandang
dan persentasenya dihitung dengan rumus:
Gambar 1
Spermatozoa bereaksi dengan membran plasma utuh (ekor melingkar, a),
spermatozoa tidak bereaksi dengan membran plasma tidak utuh (ekor
lurus, b) (Saili et al. 2010).
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Semen merupakan salah satu komponen penting dalam penghantaran
spermatozoa baik secara konseptus alami maupun inseminasi buatan (IB).
Keberhasilan IB sangat dipengaruhi oleh kualitas semen yang digunakan.
Inseminasi di Indonesia sebagian besar menggunakan semen beku. Dalam
pembuatannya semen beku mengalami berbagai macam kerusakan mulai dari efek
larutan pengencer yang hipertonik, kerusakan akibat pembekuan dan akibat
thawing. Untuk menjamin kualitas semen maka dilakukan serangkaian uji kualitas
setelah thawing diantaranya adalah motilitas dan scoring individu.
Spermatozoa diselaputi oleh membran plasma. Membran plasma ini akan
mengalami
kerusakan
akibat
pembekuan.
Kerusakan
membran
plasma
spermatozoa bisa terjadi di bagian ekor atau bagian kepala. Kerusakan di bagian
kepala akan menyebabkan hilangnya enzim-enzim yang terdapat di bagian
akrosom sehingga spermatozoa kehilangan kemampuan untuk membuahi ovum,
tetapi spermatozoa masih bisa bergerak kerena mitokondria di bagian ekor masih
berfungsi. Sebaliknya jika kerusakan terjadi pada bagian ekor maka enzim
aspartat aminotransferase yang berfungsi untuk merombak adenosin trifosfat
(ATP) menjadi adenosin difosfat (ADP) dan adenosin monofosfat (AMP) hilang
akibatnya spermatozoa akan kehilangan daya geraknya.
Pengujian terhadap rasio spermatozoa yang hidup dan mati atau keutuhan
membran plasma spermatozoa dengan teknik HOS test perlu dilakukan untuk
menjamin bahwa membran plasma spermatozoa dari semen beku masih baik,
selain indikator motilitas dan scoring individu yang selama ini sudah dilakukan.
Metode HOS test dapat memberikan informasi tentang integritas membran
spermatozoa.
Terdapat berbagai pendapat berbeda mengenai konsep penilaian kualitas
spermatozoa dan kemungkinan perbedaan spesies pada kepentingan parameter
individual, kualitas spermatozoa juga dapat dinilai dari jumlah spermatozoa,
motilitas dan normalitas morfologi spermatozoa (Colenbrander et al. 2003).
Selain itu terdapat perameter tambahan, yaitu keutuhan membran plasma dan
keutuhan kromatin (Graham 2001; Rodriguez-Martinez 2007). Menurut Morrell
dan Rodriguez-Martinez (2009), terdapat hubungan yang kuat antara fertilitas dan
10
motilitas post-thawing, jumlah akrosom normal, keutuhan membran plasma, serta
abnormalitas spermatozoa pada sejumlah spesies seperti kerbau (Ahmed et al.
2003), sapi (Al-Makhzoomi et al. 2008), dan antara morfologi, integritas kromatin
dan pregnancy rates pada kuda (Morrell et al. 2008).
Motilitas
Viabilitas
Keutuhan Kromatin
Morfologi normal
Gambar 2
Diagram Venn untuk menunjukkan sub-populasi spermatozoa dalam satu
ejakulat berdasarkan parameter kualitas spermatozoa (Morrell &
Rodriguez-Martinez 2009).
Semen beku berbeda dengan semen segar. Semen beku sudah ditambahkan
berbagai macam bahan sehingga melapisi/menyelimuti permukaan membran
plasma. Oleh karena itu perlu dicari waktu yang optimal agar hasil pengujian
menjadi lebih valid.
Hasil pengujian keutuhan membran plasma utuh (MPU) dengan metode
HOS test pada semen beku sapi Limousin dan FH, didapatkan waktu yang paling
optimal untuk melakukan pengujian tersebut adalah pada menit ke 30-45 masa
inkubasi (Tabel 1 dan 2). Inkubasi ini dilakukan dalam larutan hipoosmotik
dengan osmolaritas 150 mOsm Kg-1 pada suhu 37 °C.
11
Tabel 1
Ulangan
Persentase jumlah spermatozoa sapi Limousin yang bereaksi terhadap
larutan hipoosmotik selama masa inkubasi
Masa Inkubasi (menit)
0
15
30
45
60
1
31.51
37.62
51.22
51.78
49.47
2
19.79
50.00
54.84
62.96
57.14
3
24.00
30.23
38.89
50.38
49.02
4
39.13
45.16
51.51
63.64
61.22
5
23.86
49.81
50.76
45.83
34.16
6
21.43
48.15
45.83
45.83
42.37
7
27.42
65.18
51.09
34.1
31.25
8
53.09
61.97
66.67
45.45
39.58
9
31.82
42.86
52.43
53.12
33.80
10
22.73
37.04
57.89
56.06
38.00
11
44.12
51.85
56.18
63.46
36.58
12
30.43
33.33
64.44
58.06
50.00
13
36.58
50.00
59.42
52.94
47.37
14
50.00
50.00
53.64
48.98
31.34
15
41.46
50.00
53.68
54.54
35.56
Rata-rata
33.16
d
b,c
46.88
SD
10.55
9.63
53.90
6.81
a
52.47
a,b
8.00
42.46c
9.43
Superskrip dengan notasi yang berbeda menyatakan perbedaan yang nyata (p
ABSTRACT
RIZAL DWI HARDYANA. Optimal Time Determination to Test Spermatozoa
Membrane Integrity of Limousin and Frisien Holstein Frozen Semen Using HypoOsmotic Swelling (HOS) Test. Directed by Prof. Dr. Dra. R. Iis Arifiantini, MSi.
The study was conducted to determine the optimal time to test the integrity
of plasma membrane of Limousin and Frisien Holstein (FH) bull frozen semen
spermpatozoa using hypoosmotic swelling (HOS) test. A total of 15 samples from
each bull used. All samples were incubated in a hypoosmotic solution with
osmolarity of 150 mOsm Kg-1 for 60 minutes. The hypoosmotic solution made by
admix 1.351 g fructose, 0.735 Na-citrate and water until the volume was 100 ml.
Every 15 minutes the whole sample was evaluated the percentage of spermatozoa
that reacts to the solution. Optimal time was obtained at 30’ and 45’, both on
Limousin and FH frozen semen. The mean percentage of reacted Limousin bull
spermatozoa at 30’ and 45’ respectively were 53.90 ± 6.81 % and 52.47 ± 8.00 %.
Whereas the FH bull spermatozoa was 44.52 ± 6.26 % and 44.46 ± 8.42 %.
Spermatozoa from frozoen semen needs time to react to hypoosmotic solution due
to the added of freezing diluent. This causes the spermaozoa did not react
immediately to the hypoosmotic solution. Plasma membrane integrity is very
important for sperm fertility. Fertility enzymes contained in the head of
spermatozoa, thus if the plasma membrane of the head broken, spermatozoa will
lose their fertility. Similarly in the tail, if the plasma membrane broken,
spermatozoa will lose their motility.
Key words : HOS test, plasma membrane integrity, Limousin frozen semen, FH
frozen semen
iii
RINGKASAN
RIZAL DWI HARDYANA. Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan
Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein
Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test. Dibimbing oleh Iis
Arifiantini.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui waktu yang paling optimal
untuk pengujian keutuhan membran plasma spermatozoa semen beku sapi
Limousin dan Frisien Holstein (FH) dengan menggunakan metode hypo-osmotic
swelling (HOS) test. Teknologi Inseminasi Buatan (IB) mulai diperkenalkan di
Indonesia pada tahun 1952 tetapi aplikasinya secara masal di lapangan baru
dimulai sejak tahun 1973 dengan menggunakan semen beku yang diimpor dari
New Zealand (Selandia Baru). Untuk tujuan IB, spermatozoa dapat disimpan
dahulu dalam bentuk semen cair maupun semen beku. Untuk menghasilkan semen
beku yang berkualitas tinggi diperlukan bahan pengencer semen yang mampu
mempertahankan kualitas spermatozoa selama proses pendinginan, pembekuan,
maupun pada saat thawing. Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus
bergerak mencapai tempat pembuahan dengan menggunakan energi yang
diperoleh dari pengencer, sehingga motilitas sering dijadikan indikator fertilitas
spermatozoa namun demikian pergerakan spermatozoa dipengeruhi oleh integritas
struktur morfologi spermatozoa. Metode HOS test adalah salah satu teknik untuk
mengevaluasi keutuhan membran plasma spermatozoa pada hewan domestik,
namun pengujian untuk semen baku sapi jarang dilakukan. Penentuan waktu
optimal ini dialakukan dengan menginkubasi spermatozoa dari semen beku dalam
larutan dengan osmolaritas 150 mOsm Kg-1 pada suhu 37 °C selama 60 menit.
Hasil pengamatan persentase laju reaksi spermatozoa sapi Limousin
terhadap larutan hipoosmotik pada menit ke-0, 15, 30, 45, dan 60 berturut-turut
adalah 33.16 ± 10.55 %, 46.88 ± 9.63 %, 53.90 ± 6.81 %, 52.47 ± 8.00 %, 42.46 ±
9.43 %. Sedangkan persentase sapi FH berturut-turut adalah 27.19 ± 6.11 %,
35.97 ± 6.14 %, 44.52 ± 6.26 %, 44.42 ± 8.41 %, 33.17 ± 9.63 %. Dari hasil
pengamatan tersebut diketahui bahwa pada spermatozoa Limousin dan FH waktu
yang paling optimal untuk melakukan pengujian keutuhan membran plasma
spermatozoa semen baku adalah pada menit ke-30 sampai 45. Pada waktu tersebut
jumlah persentase spermatozoa yang bereaksi mencapai puncak.
PENENTUAN WAKTU OPTIMAL
PENGUJIAN KEUTUHAN MEMBRAN PLASMA
SPERMATOZOA SEMEN BEKU SAPI LIMOUSIN DAN
FRISIEN HOLSTEIN MENGGUNAKAN HYPO-OSMOTIC
SWELLING (HOS) TEST
RIZAL DWI HARDYANA
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
i
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul Penentuan Waktu
Optimal Pengujian Keutuhan Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi
Limousin dan Frisien Holstein Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test
adalah karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal
dan dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian
akhir skripsi ini.
Bogor, Agustus 2012
Rizal Dwi Hardyana
B04080064
ii
ABSTRACT
RIZAL DWI HARDYANA. Optimal Time Determination to Test Spermatozoa
Membrane Integrity of Limousin and Frisien Holstein Frozen Semen Using HypoOsmotic Swelling (HOS) Test. Directed by Prof. Dr. Dra. R. Iis Arifiantini, MSi.
The study was conducted to determine the optimal time to test the integrity
of plasma membrane of Limousin and Frisien Holstein (FH) bull frozen semen
spermpatozoa using hypoosmotic swelling (HOS) test. A total of 15 samples from
each bull used. All samples were incubated in a hypoosmotic solution with
osmolarity of 150 mOsm Kg-1 for 60 minutes. The hypoosmotic solution made by
admix 1.351 g fructose, 0.735 Na-citrate and water until the volume was 100 ml.
Every 15 minutes the whole sample was evaluated the percentage of spermatozoa
that reacts to the solution. Optimal time was obtained at 30’ and 45’, both on
Limousin and FH frozen semen. The mean percentage of reacted Limousin bull
spermatozoa at 30’ and 45’ respectively were 53.90 ± 6.81 % and 52.47 ± 8.00 %.
Whereas the FH bull spermatozoa was 44.52 ± 6.26 % and 44.46 ± 8.42 %.
Spermatozoa from frozoen semen needs time to react to hypoosmotic solution due
to the added of freezing diluent. This causes the spermaozoa did not react
immediately to the hypoosmotic solution. Plasma membrane integrity is very
important for sperm fertility. Fertility enzymes contained in the head of
spermatozoa, thus if the plasma membrane of the head broken, spermatozoa will
lose their fertility. Similarly in the tail, if the plasma membrane broken,
spermatozoa will lose their motility.
Key words : HOS test, plasma membrane integrity, Limousin frozen semen, FH
frozen semen
iii
RINGKASAN
RIZAL DWI HARDYANA. Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan
Membran Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein
Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test. Dibimbing oleh Iis
Arifiantini.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui waktu yang paling optimal
untuk pengujian keutuhan membran plasma spermatozoa semen beku sapi
Limousin dan Frisien Holstein (FH) dengan menggunakan metode hypo-osmotic
swelling (HOS) test. Teknologi Inseminasi Buatan (IB) mulai diperkenalkan di
Indonesia pada tahun 1952 tetapi aplikasinya secara masal di lapangan baru
dimulai sejak tahun 1973 dengan menggunakan semen beku yang diimpor dari
New Zealand (Selandia Baru). Untuk tujuan IB, spermatozoa dapat disimpan
dahulu dalam bentuk semen cair maupun semen beku. Untuk menghasilkan semen
beku yang berkualitas tinggi diperlukan bahan pengencer semen yang mampu
mempertahankan kualitas spermatozoa selama proses pendinginan, pembekuan,
maupun pada saat thawing. Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus
bergerak mencapai tempat pembuahan dengan menggunakan energi yang
diperoleh dari pengencer, sehingga motilitas sering dijadikan indikator fertilitas
spermatozoa namun demikian pergerakan spermatozoa dipengeruhi oleh integritas
struktur morfologi spermatozoa. Metode HOS test adalah salah satu teknik untuk
mengevaluasi keutuhan membran plasma spermatozoa pada hewan domestik,
namun pengujian untuk semen baku sapi jarang dilakukan. Penentuan waktu
optimal ini dialakukan dengan menginkubasi spermatozoa dari semen beku dalam
larutan dengan osmolaritas 150 mOsm Kg-1 pada suhu 37 °C selama 60 menit.
Hasil pengamatan persentase laju reaksi spermatozoa sapi Limousin
terhadap larutan hipoosmotik pada menit ke-0, 15, 30, 45, dan 60 berturut-turut
adalah 33.16 ± 10.55 %, 46.88 ± 9.63 %, 53.90 ± 6.81 %, 52.47 ± 8.00 %, 42.46 ±
9.43 %. Sedangkan persentase sapi FH berturut-turut adalah 27.19 ± 6.11 %,
35.97 ± 6.14 %, 44.52 ± 6.26 %, 44.42 ± 8.41 %, 33.17 ± 9.63 %. Dari hasil
pengamatan tersebut diketahui bahwa pada spermatozoa Limousin dan FH waktu
yang paling optimal untuk melakukan pengujian keutuhan membran plasma
spermatozoa semen baku adalah pada menit ke-30 sampai 45. Pada waktu tersebut
jumlah persentase spermatozoa yang bereaksi mencapai puncak.
iv
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
v
PENENTUAN WAKTU OPTIMAL
PENGUJIAN KEUTUHAN MEMBRAN PLASMA
SPERMATOZOA SEMEN BEKU SAPI LIMOUSIN DAN
FRISIEN HOLSTEIN MENGGUNAKAN HYPO-OSMOTIC
SWELLING (HOS) TEST
RIZAL DWI HARDYANA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
vi
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan Membran
Plasma Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan
Frisien Holstein Menggunakan Hypo-Osmotic Swelling
(HOS) Test.
: Rizal Dwi Hardyana
: B04080064
Disetujui,
Prof. Dr. Dra. R. Iis Arifiantini, MSi
Pembimbing
Diketahui,
Drh. Agus Setiono, MSi, PhD, APvet
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan IPB
Tanggal Lulus :
vii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur senantiasa penulis panjatkan kepada Allah SWT. Karena
atas segala karunianyalah sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian yang
berjudul Penentuan Waktu Optimal Pengujian Keutuhan Membran Plasma
Spermatozoa Semen Beku Sapi Limousin dan Frisien Holstein Menggunakan
Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test.
Terimaksih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Prof. Dr.
Dra. R. Iis Arifiantini, MSi. sebagai pembimbing skripsi atas segala kesabaran,
pengorbanan, bimbingan serta dukungan moral sehingga penulis dapat
menyelesaikan penulisan karya tulis ini dengan baik. Kepada Bapak drh.
Mochidin Noordin, Ibu Dr. drh. Savitri Novelina, MSi, PAvet dan Ibu drh.
Herwin Pisestyani, MSi selaku dosen penguji yang telah memberi banyak
masukan pada penulisan karya ilmiah ini. Kepada Bapak Dr. drh. Amrozi selaku
kepala Unit Rehabilitasi dan Reproduksi (URR) yang telah memberikan izin
melakukan penelitian di laboratorium fisiologi reproduksi, serta kepada Bapak
Bondan, Bapak dan Ibu Anda dan segenap staf URR.
Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dikdik Taupik
Siddik, Mamah Yani Sutiyani, Teteh Dian Eka Astuti, Ade Moch. Bintang Aulia,
Bibi Linlin, serta seuruh keluarga besar yang tanpa henti memberikan kasih
sayang, doa, semangat serta dukungan yang tak terhingga sehingga penulis dapat
menyelesaikan studi sarjana di FKH IPB. Selanjutnya penulis ucapkan terima
kasih kepada teman-teman satu penelitian, Innes, Irin dan Rice. Serta tak lupa
sahabat tercinta selama di FKH, Aming dan Ibon. Teman-teman Team Mawar,
segenap teman-teman AVENZOAR, dan teman-teman NoesCamp 146. Kepada
Oktaviani Solestiawati yang telah memberikan semangat dan kasih sayang.
Penulis menyadari skripsi ini masih jauh dari sempurna, untuk itu penulis
mengucapkan terima kasih atas kritik dan saran yang sifatnya membangun dari
semua pihak demi kesempurnaan karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Agustus 2012
Rizal Dwi Hardyana
viii
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir di Bandung, Jawa Barat pada tanggal 24 September 1990 dari
Ayah Dikdik Taupik Siddik dan Ibu Yani Sutiyani. Penulis merupakan putra
kedua dari tiga bersaudara.
Penulis menempuh sekolah dasar di SD Negeri 7 Rancaekek Kab. Bandung
dan lulus tahun 2002, kemudian melanjutkan ke SLTP Negeri 1 Rancaekek Kab.
Bandung dan lulus tahun 2005. Pendidikan SMA penulis selesaikan di SMA
Negeri 1 Cisarua Kab. Bandung Barat dan lulus pada tahun 2008. Pada tahun
yang sama, penulis masuk Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Undangan Saringan Masuk IPB (USMI).
Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif di Lingkung Seni Sunda (LISES)
Gentra Kaheman IPB, Paguyuban Mahasiswa Bandung (PAMAUNG), Himpunan
Minat dan Profesi (HIMPRO) Satwa Liar, serta Badan Eksekutif Mahasiswa
(BEM) Kabinet Katalis periode 2009-2010.
ix
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
Latar Belakang .................................................................................................... 1
Tujuan .................................................................................................................. 2
Manfaat ................................................................................................................ 2
Hipotesis .............................................................................................................. 2
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 3
Karakteristik Semen Sapi .................................................................................... 3
Semen Beku ......................................................................................................... 4
Hypo-osmotic Swelling Test ................................................................................ 5
MATERI DAN METODE ...................................................................................... 7
Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................................. 7
Sampel Semen ..................................................................................................... 7
Bahan dan Alat .................................................................................................... 7
Metode ................................................................................................................. 7
Pembuatan Larutan Hipoosmotik .................................................................... 7
Pengujian HOS Test ......................................................................................... 7
Perhitungan ...................................................................................................... 7
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 9
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 21
Simpulan ............................................................................................................ 21
Saran .................................................................................................................. 21
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 22
LAMPIRAN .......................................................................................................... 26
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1
Persentase jumlah spermatozoa sapi Limousin yang bereaksi
terhadap larutan hipoosmotik selama masa inkubasi ...........................11
Tabel 2
Persentase jumlah spermatozoa sapi FH yang bereaksi terhadap
larutan hipoosmotik selama masa inkubasi .........................................12
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Spermatozoa bereaksi dengan membran plasma utuh (ekor
melingkar, a), spermatozoa tidak bereaksi dengan membran
plasma tidak utuh (ekor lurus, b) (Saili et al. 2010). .............................8
Gambar 2 Diagram Venn untuk menunjukkan sub-populasi spermatozoa
dalam satu ejakulat berdasarkan parameter kualitas spermatozoa
(Morrell & Rodriguez-Martinez 2009). ...............................................10
Gambar 3 Grafik laju reaksi spermatozoa sapi Limousin terhadap larutan
hipoosmotik selama masa inkubasi......................................................13
Gambar 4 Grafik laju reaksi spermatozoa sapi FH terhadap larutan
hipoosmotik selama masa inkubasi......................................................13
Gambar 5 Reaksi spermatozoa dengan ekor membengkok yang berada pada
larutan hipoosmotik. ............................................................................14
Gambar 6 Ilustrasi regulasi pengaturan volume pada spermatozoa. ................... 16
Gambar 7 Perubahan volume spermatozoa sebagai respon terhadap kondisi
hipoosmotik. ........................................................................................17
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1
Persentase spermatozoa sapi Limousin bereaksi terhadap
larutan hipoosmotik........................................................................27
Lampiran 2
Persentase spermatozoa sapi FH bereaksi terhadap larutan
hipoosmotik ....................................................................................28
Lampiran 3
Uji statistik data spermatozoa sapi Limousin dangan uji
Duncan ............................................................................................29
Lampiran 4
Uji statistik data spermatozoa sapi FH dengan uji Duncan ............31
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Teknologi Inseminasi Buatan (IB) mulai diperkenalkan di Indonesia pada
tahun 1952 tetapi aplikasinya secara masal di lapangan baru dimulai sejak tahun
1973 dengan menggunakan semen beku yang diimpor dari New Zealand (Selandia
Baru). Untuk menghindari ketergantungan pada semen beku impor maka pada
tahun 1976 didirikan Balai Inseminasi Buatan (BIB) Lembang (Jawa Barat) dan
diikuti BIB Singosari (Jawa Timur) pada tahun 1982, keduanya menjadi BIB
nasional yang melayani kebutuhan semen beku di Indonesia (Batubara 2002).
Dengan adanya UU no. 44 tahun 1999 mengenai otonomi daerah yang
memberikan kewenangan mengatur dan memajukan daerahnya sendiri tanpa ada
campur tangan pemerintah pusat, maka daerah terpacu dalam mendirikan balai
inseminasi buatan dengan nama BIBD, seperti di Lampung, Palembang, Padang,
Medan, Bali, Jawa Tengah, Kalimantan Selatan dan Blora (Arifiantini 2004).
Untuk tujuan IB, spermatozoa dapat disimpan terlebih dahulu dalam bentuk
semen cair maupun semen beku. Semen diencerkan menggunakan bahan
pengencer yang mengandung buffer, sumber energi, antibiotik dan lipoprotein
yang dapat mempertahankan kualitasnya selama penyimpanan. Dalam bentuk
semen cair, semen ejakulat dapat disimpan selama empat hari pada suhu 4 ºC
dengan motilitas lebih dari 40 % sehingga masih layak digunakan untuk IB
(Yulnawati & Setiadi 2005).
Setelah ditemukannya gliserol oleh Polge, pemanfaatan semen beku mulai
berkembang (Arifiantini et al. 2005a) dengan kemasan yang pertama kali
digunakan berbentuk pellet. Untuk menghasilkan semen beku yang berkualitas
tinggi dibutuhkan bahan pengencer semen yang mampu mempertahankan kualitas
spermatozoa selama proses pendinginan, pembekuan, maupun pada saat thawing
(Aboagla & Terada 2004).
Salah satu tujuan teknologi reproduksi dari hewan domestik adalah untuk
mengetahui kemampuan fertilitasnya (Rodriguez-Martinez 2003). Dengan
demikian, peternakan biasanya menilai kualitas (konsentrasi spermatozoa,
motilitas, morfologi, viabilitas, dan keutuhan akrosom) dari semen sebelum
2
dugunakan untuk inseminasi buatan (Ruiz-Sanchez et al. 2006), dan tes yang
lainnya telah dikembangkan (Gadea 2005).
Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus bergerak mencapai tempat
pembuahan dengan menggunakan energi yang diperoleh dari pengencer, sehingga
motilitas sering dijadikan indikator fertilitas spermatozoa. Namun demikian
pergerakan
spermatozoa
dipengaruhi
oleh
integritas
struktur
morfologi
spermatozoa (Yulnawati & Setiadi 2005).
Hypoosmotic Swelling (HOS) Test adalah salah satu teknik untuk
mengevaluasi keutuhan membran plasma spermatozoa pada hewan domestik
termasuk sapi (Correa & Zavos 1994), kuda (Neild et al. 1999), dan babi (Zou &
Yang 2000), tetapi dilakukan pada semen segar. Pengujian untuk semen beku sapi
jarang dilakukan. Keutuhan membran plasma bagi spermatozoa mutlak diperlukan
untuk memenuhi fungsinya sebagai pelindung organel di dalam sel dan penyaring
bagi pertukaran zat intraseluler dan ekstraseluler. Demikian halnya dengan
kondisi tudung akrosom yang harus tetap utuh untuk menjaga keamanan enzimenzim fertilisasi yang terdapat di dalam vesikel akrosom.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu yang paling optimal
untuk pengujian keutuhan membran plasma spermatozoa semen beku sapi
Limousin dan Frisien Holstein (FH) dengan menggunakan metode hypoosmotic
swelling (HOS) test.
Manfaat
Mendukung hasil evaluasi motilitas dan scoring individu yang saat ini telah
dilakukan untuk pengujian semen beku.
Hipotesis
Bahan pengencer yang terdapat dalam semen beku akan mengurangi
sensitivitas membran plasma terhadap larutan hipoosmotik.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Karakteristik Semen Sapi
Menurut Garner dan Hafez (2000), semen merupakan cairan suspensi sel
yang di dalamnya mengandung spermatozoa dan sekresi kelenjar assesorius dari
organ kelamin jantan. Semen terdiri atas dua bagian yaitu spermatozoa dan
plasma semen. Sejumlah parameter digunakan untuk menilai kualitas dari semen,
diantaranya volume, konsentrasi spermatozoa, motilitas spermatozoa, jumlah
spermatozoa hidup, jumlah spermatozoa abnormal dan komposisi biokimiawinya,
serta tes fungsional.
Kepadatan spermatozoa pun ternyata penting untuk menentukan dosis
dan/atau kapasitas fertilitas dari semen tersebut. Motilitas progresif penting karena
dapat memperkirakan penilaian usia hidup semen. Spermatozoa dikatakan motil
apabila spermatozoa tersebut bergerak ke depan (progresive motility), sedangkan
spermatozoa yang bergerak melingkar disebut sebagai non-progresive motility
(Arifiantini et al. 2005b).
Semen sapi yang normal berwarna seperti susu atau krem keputih–putihan
dan keruh dengan konsentrasi encer. Hal ini disebabkan oleh volume yang kecil
tetapi mempunyai konsentrasi spermatozoa yang tinggi. Konsentrasi spermatozoa
merupakan salah satu parameter yang sering kali dipakai sebagai salah satu
kriteria penentuan kualitas semen. Konsentrasi spermatozoa adalah jumlah
spermatozoa yang terkandung dalam setiap mililiter semen. Konsentrasi
spermatozoa sapi adalah 0.8-2.0 × 109 spermatozoa/ml (Salisbury & VanDemark
1985),
sedangkan
menurut
Schuh
(2001)
adalah
3.6-12
×
109
spermatozoa/ejakulasi.
Motilitas adalah daya gerak maju spermatozoa, merupakan ciri spermatozoa
hidup dan normal yang menjadi salah satu kriteria untuk menentukan kualitas
semen. Pemeriksaan terhadap motilitas sermatozoa dapat dilakukan dengan
melihat gerakan massa pada semen segar atau dengan menghitung persentase
spermatozoa yang motil progresif pada semen yang telah diencerkan atau setelah
pembekuan dan thawing (Evans & Maxwell 1987). Menurut Zesfin et al. (2001),
motilitas spermatozoa pada sapi kelompok umur muda 65 ± 13.81 % dan
kelompok umur sapi dewasa rata-rata 62.22 ± 14.77 %.
4
Semen Beku
Semen beku adalah semen yang berasal dari pejantan terpilih yang
diencerkan sesuai prosedur, dibekukan dan disimpan pada suhu -196 °C. Tujuan
dari pengawetan semen adalah agar semen yang diperoleh masih dapat digunakan
dalam jangka waktu yang lama, sehingga fertilitas semen tetap terjaga. Semen
beku yang dibutuhkan adalah sekurang-kurangnya lima sampai sepuluh juta
spermatozoa yang motil progresif tiap inseminasi untuk mendapat rata-rata
fertilisasi yang optimal (Yanti 2005).
Terdapat beberapa cara pengawetan semen. Menurut Salisbury dan
VanDemark (1985), dua teknik pengawetan semen agar keoptimalan fertilitas
spermatozoa
dapat
dipertahankan.
Teknik
yang pertama
yaitu
dengan
menyediakan ion-ion esensial, enzim-enzim, zat-zat makanan dan vitaminvitamin. Teknik lain adalah dengan penghambatan secara fisik dan kimiawi semua
aktifitas minimal yang penting dalam spermatozoa. Teknik pertama memerlukan
pengetahuan yang lengkap tentang fungsi dan kebutuhan-kebutuhan spermatozoa
serta usaha untuk memenuhi kebutuhan tersebut. Teknik kedua ini relatif lebih
mudah dilaksanakan dengan cara menurunkan temperatur sehingga proses
metabolisme dapat dihambat.
Sampai saat ini proses pembekuan semen mengalami beberapa masalah
seperti terjadinya cold shock, osmotic shock, kerusakan intraseluler akibat
terbentuknya kristal es, perubahan permeabilitas membran yang mengakibatkan
kematian sel saat pencairan kembali (thawing) (Achmadi 2001). Beberapa upaya
dapat dilakukan untuk mengatasi permasalahan diatas diantaranya penggunaan
gliserol secara perlahan untuk mencegah osmotic shock serta pemberian
kesempatan equilibrasi atau adaptasi untuk keseimbangan molekuler antara
spermatozoa dengan bahan pengencer (Salisbury & VanDemark 1985).
Menurut Awad (2011), kebanyakan protokol kriopreservasi semen masih
menggunakan gliserol sebagai media krioprotektan, seperti yang dicontohkan
Polge et al. (1949). Gliserol, bersama metanol dan etilen glikol termasuk
kelompok yang dapat menembus ke dalam sel spermatozoa. Gliserol adalah
krioprotektan yang paling umum digunakan untuk spermatozoa ternak. Namun,
jika gliserol digunakan dalam konsentrasi tinggi memiliki beberapa toksisitas dan
5
mungkin krioprotektan tersebut yang menyebabkan kerusakan osmotik terbesar
untuk spermatozoa karena permeabilitasnya menembus membran plasma
spermatozoa lebih rendah daripada air dan krioprotektan lainnya (Guthrie et al.
2002).
Dalam proses kriopreservasi (pembekuan) semen, akibat perlakuan suhu
yang sangat rendah (-196 °C) akan terbentuk kristal-kristal es dan peningkatan
konsentrasi elektrolit intraseluler yang menyebabkan kerusakan sel spermatozoa.
Untuk mengurangi efek ini, di dalam pengencer harus ditambahkan senyawa
krioprotektan. Selain gliserol yang berperan sebagai krioprotektan intraseluler,
juga dikenal berbagai macam gula seperti laktosa yang dapat berfungsi sebagai
krioprotektan ekstraseluler (Rizal & Herdis 2005).
Hypo-osmotic Swelling Test
Hypo-osmotic Swelling (HOS) Test pada awalnya dirancang penggunaannya
pada spermatozoa manusia untuk mengevaluasi aktivitas biokimia dari fisik
membran plasma secara utuh (Jeyendran et al. 1984). Hal ini didasarkan pada
pengamatan bahwa jika spermatozoa dengan membran sel fungsional ditempatkan
pada larutan hipoosmotik, air mengalir melalui membran dan masuk ke dalam sel,
sehingga membangun kembali keseimbangan antara kompartemen cairan
ekstraseluler dan cairan intraseluler. Sel tersebut meningkatkan volumenya dan
membran yang menutupi ekor spermatozoa mengembang, menyebabkan
flagellum menggulung di dalamnya. Ekor melingkar dimulai pada ujung distal
ekor dan berlanjut menuju bagian tengah dan kepala saat tekanan osmotik pada
media pembekuan menurun (Fonseca et al. 2005).
Spermatozoa pada semen beku mengalami kondisi hipertonik selama
pembekuan–pencairan, dan kondisi isotonik selama pembersihan sperma in vitro
atau ketika berada pada saluran reproduksi betina selama IB (Ball & Peters 2004).
Osmotic shock berarti perubahan seluler (melingkarnya ekor spermatozoa) yang
terjadi selama paparan kondisi isotonik spermatozoa setelah terpapar kondisi
hipertonik.
Saat terekspos larutan hipoosmotik, secara biokimia spermatozoa aktif
meningkatkan volume mereka dalam rangka untuk membangun keseimbangan
antara kompartemen cairan intraseluler dan cairan ekstraseluler (Fonseca et al.
6
2005). Fonseca et al. (2005) juga menyatakan bahwa pembengkakan
menyebabkan perubahan baik dalam ukuran maupun bentuk sel yang dapat
dievaluasi dengan menggunakan phase contrast microscope.
7
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2011 sampai dengan April 2012.
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Fisiologi Reproduksi Unit Rehabilitasi
Reproduksi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Sampel Semen
Sampel semen berasal dari Balai Inseminasi Buatan Lembang, Jawa Barat
sebanyak 15 straw dari sapi Limousin dan 15 straw dari sapi Frisien Holstein
(FH) yang diambil secara acak. Sampel dimasukkan ke dalam container yang
berisi nitrogen cair dengan suhu -196 °C.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 straw sampel semen
beku dari BIB Lembang, Na-sitrat, fruktosa, dan nitrogen cair.
Alat–alat yang digunakan pada penelitian ini adalah, mikroskop (Olympus
CH 20), water bath, counter, object dan cover glass, tabung Eppendorf,
mikropipet dan tip, meja pemanas, container, dan pipet tetes.
Metode
Pembuatan Larutan Hipoosmotik
Sebanyak 1.351 g fruktosa dan 0.735 g Na-sitrat ditimbang dan dimasukkan
ke dalam gelas piala. Lalu ditambahkan aquabidest ke dalam gelas piala sampai
dengan volume 100 ml maka akan terbentuk larutan dengan osmolaritas 150
mOsm Kg-1 (Revell & Mrode 1994).
Pengujian HOS Test
Sebanyak 400µl larutan hipoosmotik disiapkan di dalam tabung Eppendorf.
Semen beku di-thawing dalam water bath dengan suhu 37 °C selama 30 detik.
Straw dikeringkan dengan menggunakan tissue. Straw dipotong pada kedua
sumbatnya dan isi straw dikeluarkan seluruhnya, lalu 50 µl semen dimasukkan ke
dalam tabung Eppendorf. Larutan yang telah dicampur dihomogenkan dengan
cara membentuk angka delapan. Ambil satu tetes dengan pipet, teteskan pada
8
object glass, lalu tutup dengan cover glass dan lihat di bawah mikroskop
(Olympus CH 20) dengan perbesaran 40 × 10, hitung spermatozoa yang normal
dan yang telah bereaksi dengan larutan hipoosmotik pada 10 lapang pandang,
untuk mendapatkan data HOS test pada menit ke-0.
Campuran semen dalam larutan hipoosmotik disusun dalam rak pada water
bath berisi air dengan suhu 37 °C. Pengujian keutuhan membran plasma semen
beku dilakukan pada menit ke 0, 15, 30, 45, dan 60. Pengujian dilakukan dengan
cara mengambil satu tetes dengan pipet tetes dan diletakkan pada object glass,
lalu tutup dengan cover glass dan lihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 40
× 10, hitung spermatozoa yang normal dan yang telah bereaksi pada 10 lapang
pandang.
Perhitungan
Perhitungan spermatozoa yang bereaksi dilakukan pada 10 lapang pandang
dan persentasenya dihitung dengan rumus:
Gambar 1
Spermatozoa bereaksi dengan membran plasma utuh (ekor melingkar, a),
spermatozoa tidak bereaksi dengan membran plasma tidak utuh (ekor
lurus, b) (Saili et al. 2010).
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Semen merupakan salah satu komponen penting dalam penghantaran
spermatozoa baik secara konseptus alami maupun inseminasi buatan (IB).
Keberhasilan IB sangat dipengaruhi oleh kualitas semen yang digunakan.
Inseminasi di Indonesia sebagian besar menggunakan semen beku. Dalam
pembuatannya semen beku mengalami berbagai macam kerusakan mulai dari efek
larutan pengencer yang hipertonik, kerusakan akibat pembekuan dan akibat
thawing. Untuk menjamin kualitas semen maka dilakukan serangkaian uji kualitas
setelah thawing diantaranya adalah motilitas dan scoring individu.
Spermatozoa diselaputi oleh membran plasma. Membran plasma ini akan
mengalami
kerusakan
akibat
pembekuan.
Kerusakan
membran
plasma
spermatozoa bisa terjadi di bagian ekor atau bagian kepala. Kerusakan di bagian
kepala akan menyebabkan hilangnya enzim-enzim yang terdapat di bagian
akrosom sehingga spermatozoa kehilangan kemampuan untuk membuahi ovum,
tetapi spermatozoa masih bisa bergerak kerena mitokondria di bagian ekor masih
berfungsi. Sebaliknya jika kerusakan terjadi pada bagian ekor maka enzim
aspartat aminotransferase yang berfungsi untuk merombak adenosin trifosfat
(ATP) menjadi adenosin difosfat (ADP) dan adenosin monofosfat (AMP) hilang
akibatnya spermatozoa akan kehilangan daya geraknya.
Pengujian terhadap rasio spermatozoa yang hidup dan mati atau keutuhan
membran plasma spermatozoa dengan teknik HOS test perlu dilakukan untuk
menjamin bahwa membran plasma spermatozoa dari semen beku masih baik,
selain indikator motilitas dan scoring individu yang selama ini sudah dilakukan.
Metode HOS test dapat memberikan informasi tentang integritas membran
spermatozoa.
Terdapat berbagai pendapat berbeda mengenai konsep penilaian kualitas
spermatozoa dan kemungkinan perbedaan spesies pada kepentingan parameter
individual, kualitas spermatozoa juga dapat dinilai dari jumlah spermatozoa,
motilitas dan normalitas morfologi spermatozoa (Colenbrander et al. 2003).
Selain itu terdapat perameter tambahan, yaitu keutuhan membran plasma dan
keutuhan kromatin (Graham 2001; Rodriguez-Martinez 2007). Menurut Morrell
dan Rodriguez-Martinez (2009), terdapat hubungan yang kuat antara fertilitas dan
10
motilitas post-thawing, jumlah akrosom normal, keutuhan membran plasma, serta
abnormalitas spermatozoa pada sejumlah spesies seperti kerbau (Ahmed et al.
2003), sapi (Al-Makhzoomi et al. 2008), dan antara morfologi, integritas kromatin
dan pregnancy rates pada kuda (Morrell et al. 2008).
Motilitas
Viabilitas
Keutuhan Kromatin
Morfologi normal
Gambar 2
Diagram Venn untuk menunjukkan sub-populasi spermatozoa dalam satu
ejakulat berdasarkan parameter kualitas spermatozoa (Morrell &
Rodriguez-Martinez 2009).
Semen beku berbeda dengan semen segar. Semen beku sudah ditambahkan
berbagai macam bahan sehingga melapisi/menyelimuti permukaan membran
plasma. Oleh karena itu perlu dicari waktu yang optimal agar hasil pengujian
menjadi lebih valid.
Hasil pengujian keutuhan membran plasma utuh (MPU) dengan metode
HOS test pada semen beku sapi Limousin dan FH, didapatkan waktu yang paling
optimal untuk melakukan pengujian tersebut adalah pada menit ke 30-45 masa
inkubasi (Tabel 1 dan 2). Inkubasi ini dilakukan dalam larutan hipoosmotik
dengan osmolaritas 150 mOsm Kg-1 pada suhu 37 °C.
11
Tabel 1
Ulangan
Persentase jumlah spermatozoa sapi Limousin yang bereaksi terhadap
larutan hipoosmotik selama masa inkubasi
Masa Inkubasi (menit)
0
15
30
45
60
1
31.51
37.62
51.22
51.78
49.47
2
19.79
50.00
54.84
62.96
57.14
3
24.00
30.23
38.89
50.38
49.02
4
39.13
45.16
51.51
63.64
61.22
5
23.86
49.81
50.76
45.83
34.16
6
21.43
48.15
45.83
45.83
42.37
7
27.42
65.18
51.09
34.1
31.25
8
53.09
61.97
66.67
45.45
39.58
9
31.82
42.86
52.43
53.12
33.80
10
22.73
37.04
57.89
56.06
38.00
11
44.12
51.85
56.18
63.46
36.58
12
30.43
33.33
64.44
58.06
50.00
13
36.58
50.00
59.42
52.94
47.37
14
50.00
50.00
53.64
48.98
31.34
15
41.46
50.00
53.68
54.54
35.56
Rata-rata
33.16
d
b,c
46.88
SD
10.55
9.63
53.90
6.81
a
52.47
a,b
8.00
42.46c
9.43
Superskrip dengan notasi yang berbeda menyatakan perbedaan yang nyata (p