Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Ekstra Daun Miana (Coleus scuatellariodes [L] Benth)

ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA
ANTIBAKTERI EKSTRAK DAUN MIANA
(Coleus scutellariodes [L] Benth.)

FRI RAHMAWATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis isolasi dan karakterisasi senyawa
antibakteri ekstrak daun miana (Coleus scutellariodes [L] Benth.) adalah karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhit tesis ini.

Bogor, Agustus 2008

Fri Rahmawati
NIM G851060071

ABSTRACT

FRI RAHMAWATI. Isolation and Characterization of Antibacterial
Compound from Miana Leave Extract (Coleus scuatellariodes [L] Benth).
Under direction of MARIA BINTANG and MASNIARI POELOENGAN
Miana is a Lamiaceae. It is commonly used as traditional medicine for
infection and inflamation, cause by bacterial. The aim of this study to isolate and
characterize of antibacterial compound from miana leave extract. It is expected
that the result will give information on characteristics and minimum inhibition
concentration (MIC) of miana leave extract which have the highest antibacterial
activity. The method of this research were extraction by Harborne method,
antibacterial activity test by agar well diffution to Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli dan Salmonella entereditidis
and
determination of MIC by dilution method. The result showed that miana extract

has the highest antibacterial activity on S. aureus and S. epidermidis. Miana
extract was better than fresh and “infusan” miana leave on inhibition activity of
S. aureus and S. epidermidis. MIC value of S. aureus and S. epidermidis were 3
mg/ml. The active fraction of miana leave extract contain phthalic acid derivates
by GC-MS
Keywords : Coleus scuatellariodes, antibacterial compound

RINGKASAN
FRI RAHMAWATI. Isolasi Dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Ekstrak
Daun Miana (Coleus scuatellariodes [L] Benth). Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan MASNIARI POELOENGAN
Miana tergolong ke dalam jenis bayam-bayaman. Miana biasanya
digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional untuk mengobati antiinfeksi
dan antiinflamasi karena bakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi
dan mengkarakterisasi senyawa antibakteri dari ekstrak daun miana.Penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi atas karakteristik dan konsentrasi hambat
minimum (MIC) yang memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar. Metode
ekstraksi yang dilakukan berdasarkan Harborne, metode uji antibakteri
berdasarkan metode agar difusi terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis (Gram positif), Escherichia coli dan Salmonella entereditidis (Gram

negatif) dan penentuan MIC berdasarkan metode dilusi.
Penelitian ini diawali dengan pembuatan simplisia daun miana dengan
cara mengeringkan daun miana segar dan bersih pada udara terbuka yang tidak
terkena terik matahari langsung selama 4-5 hari sampai diperoleh berat akhirnya
yang konstan. Daun miana kering kemudian dihaluskan menjadi bubuk. Bubuk
daun miana kemudian diekstraksi dengan aseton dingin selama 3x24 jam. Ekstrak
disaring dan dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 450C. Ekstrak aseton daun
miana yang diperoleh kemudian dilakukan uji fitokimia dan uji pendahuluan
antibakteri. Setelah dilakukan uji fitokimia dan uji pendahuluan antibakteri
ekstraks aseton diperoleh dipartisi dengan pelarut air dan heksan dengan
perbandingan yang sama, sehingga akan diperoleh 3 fraksi yaitu fraksi air, fraksi
heksan dan fraksi aseton lalu ketiga fraksi dan crude diuji aktivitas antibakterinya.
Fraksi atau crude yang memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar
selanjutnya dipisahkan komponennya menggunakan KLT analitik dan preparatif
untuk seterusnya dikarakterisasi dengan menggunakan GC-MS.
Hasil penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa ekstrak daun miana
memiliki aktivitas paling besar terhadap bakteri S. aureus dan S. epidermidis.
Ekstrak daun miana memberikan aktivitas antibakteri terbesar terhadap bakteri uji
dibandingkan dengan penggunaan dalam bentuk segar atau infusan. Ekstrak
aseton yang dipartisi menghasilkan 3 fraksi yaitu fraksi air, heksan dan aseton.

Aktivitas fraksi aseton lebih besar dari fraksi air dan fraksi heksan terhadap
bakteri uji. Daya hambat fraksi aseton untuk bakteri S. aureus 3.7 % dari
kloramfenikol dan untuk bakteri S. epidermidis 3.5% dari kloramfenikol. Nilai
MIC terhadap bakteri S. aureus dan S. epidermidis adalah sebesar 3 mg/ml.
Dengan menggunakan GC-MS diperoleh bahwa fraksi aaseton daun miana
mengandung derivat asam ftalat yaitu 67.368 %.

Kata kunci: Coleus scuatellariodes, senyawa antibakteri

@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2008
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencamtumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya
tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN KARAKTERISASI SENYAWA ANTIBAKTERI
EKSTRAK DAUN MIANA (Coleus scuatellariodes [L] Benth)

FRI RAHMAWATI

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Departemen Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

HALAMAN PENGESAHAN
Judul : Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Antibakteri Ekstrak Daun miana
(Coleus scuatellariodes [L] Benth)
Nama : Fri Rahmawati
NIM

: G851060071

Disetujui
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.
Ketua

Dra. Masniari Poeloengan, M.S.
Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.

Tanggal Ujian: 21 Agustus 2008

Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Mega Safithri Hasibuan, M.S.

KATA PENGANTAR

Sujud syukur penulis ucapkan kepada Yang Maha Kuasa Allah SWT,
hanya karena kuasa-Nya maka tesis yang berjudul “ISOLASI DAN
KARAKTERISASI SENYAWA ANTIBAKTERI EKSTRAK DAUN
MIANA (Coleus scuatellariodes [L] Beth” dapat terselesaikan. Tesis ini disusun
sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Magister Sains.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada segala pihak yang telah
membantu selama proses penyusunan tesis ini, khususnya kepada:
1. Ibu Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. sebagai ketua komisi
pembimbing dan ketua program studi Biokimia yang banyak
memberikan motivasi, inspirasi, semangat serta masukkan dalam

menyelesaikan kuliah dan penulisan tesis ini
2. Ibu Dra. Masniari Poeloengan, M.S. selaku anggota pembimbing yang
banyak memberi banyak dukungan, semangat serta masukan selama
penelitian dan penyusunan makalah hasil penelitian ini.
3. Orang tua serta kakak dan adikku yang banyak memberi doa dan
semangat untuk lebih maju.
4. Para staf pengajar Biokimia IPB dan teman-teman di Biokimia IPB
yang telah banyak membantu penulis selama kuliah.
Penulis menyadari bahwa tesis ini jauh dari kesempurnaan, oleh sebab itu
penulis mengharapkan adanya kritik dan saran yang membangun untuk
perbaikkan di masa yang akan datang. Semoga tesis ini bermanfaat bagi kita
semua.
Bogor, Agustus 2008

Fri Rahmawati

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 14 Februari 1983 dari ayah
Khairul Bakri (alm) dan ibu Yarnis. Penulis merupakan putri kedua dari tiga

bersaudara.
Tahun 2001 penulis lulus dari SMUN 1 Pariangan Kab. Tanah DatarSUMBAR dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB pada Program Studi Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan lulus pada tahun 2006. Pada tahun
yang sama penulis berkesempatan untuk melanjutkan pendidikan pascasarjana di
Program Studi Biokimia pada Program Pascasarjana IPB.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................. ii
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... iii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... iv
PENDAHULUAN
Latar Belakang ....................................................................................... 1
Tujuan Penelitian ................................................................................... 2
Manfaat Penelitian ................................................................................. 2
TINJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Miana ..........................................................................
Bakteri Uji ..............................................................................................
Senyawa Antibakteri ..............................................................................

Penentuan Aktivitas Antibakteri ............................................................
Ekstraksi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri ....................................
METODE PENELITIAN

3
5
7
9
10

Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................
Alat dan Bahan .......................................................................................
Metode Penelitian .................................................................................
Preparasi Sampel ..............................................................................
Ekstraksi Daun Miana ......................................................................
Analisis Fitokimia .............................................................................
Penetapan Kadar Air ........................................................................
Penetapan Kadar Abu ......................................................................
Uji Antibakteri .................................................................................
Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (MIC) ...........................

Kromatografi Lapis Tipis dan Analisis GC-MS ..............................
HASIL DAN PEMBAHASAN

13
13
13
13
14
14
15
15
16
16
17

Analisis Kadar air dan Kadar Abu Daun Miana .....................................
Ekstraksi Daun miana .............................................................................
Analisis Fitokimia Ekstrak Daun miana ................................................
Aktivitas Antibakteri dan MIC Daun Miana ..........................................
Kromatografi Lapis Tipis dan GC-MS ...................................................
SIMPULAN DAN SARAN ...............................................................................

18
19
20
21
29
32

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 33
LAMPIRAN ........................................................................................................ 37

i

DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Analisis fitokimia ekstrak aseton daun miana ...................................... 20
Tabel 2 Nilaia standar MIC beberapa antibiotik................................................ 29
Tabel 3 Komponen utama fraksi aseton dengan GC-MS .................................. 30

ii

DAFTAR GAMBAR
1
2

Halaman
Tanaman Miana ............................................................................................ 4
Aktivitas antibakteri ekstrak aseton daun miana terhadap S. aureus,
S. epidermidis, E. coli dan S. entereditidis ................................................... 23

3 Aktivitas antibakteri dari daun segar, infusan dan ekstrak aseton
daun miana terhadap bakteri S. aureu dan S. epidermidis ............................ 25
4 Aktivitas antibakteri (crude) dan fraksi-fraksi partisi dari ekstrak
aseton daum miana ........................................................................................ 26
5

Daya hambat beberapa antibiotik standar terhadap bakteri S. aureus,
S. epidermidis, E. coli dan S. entereditidis ................................................... 27

6 Aktivitas antibakteri ekstrak aseton daun miana pada berbagai
konsentrasi..................................................................................................... 28

iii

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Diagram alir penelitian .................................................................................. 38
2 Simplisia dan ekstrak aseton daun miana ...................................................... 39
3 Formula media untuk menumbuhkan bakteri ................................................ 40
4 Formula pembuatan larutan standar Mc Farland No. 1 ................................. 40
5 Kadar air......................................................................................................... 41
6 Kadar abu ....................................................................................................... 41
7 Rendemen ekstrak aseton............................................................................... 42
8 Uji pendahuluan aktivitas antibakteri ekstrak daun miana............................. 42
9 Diameter zona hambat daun segar, infusan dan ekstrak daun miana............... 42
10 Diameter zona hambat fraksi-fraksi ektrak daun miana ................................ 43
11 Foto zona hambat fraksi-fraksi ektrak daun miana........................................ 43
12 Diameter zona hambat antibiotik standar ...................................................... 44
13 Foto zona hambat antibiotik standar .............................................................. 44
14 Perhitungan perbandingan daya hambat fraksi aseton terhadap
kloramfenikol ................................................................................................ 45
15 Diameter zona hambat ekstrak daun miana dengan berbagai konsentrasi..... 46
16 Foto zona hambat ekstrak daun miana dengan berbagai konsentrasi ............ 47
17 Kromatogram GC-MS fraksi aseton ekstrak daun miana .............................. 48

iv

PENDAHULUAN
Penyakit infeksi merupakan penyakit yang banyak diderita oleh
masyarakat Indonesia sejak dulu. Penyakit infeksi yang banyak diderita
masyarakat di antaranya infeksi usus yang disebabkan karena Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, infeksi lambung
seperti S. aureus, infeksi kulit karena S. aureus, Pseudomonas aeruginosa dan
sebagainya (Dzulkarnain, Dian & Au 1996).
Pada waktu sekarang penyakit infeksi tersebut dapat ditanggulangi
menggunakan antibiotik. Zaman dahulu penggunaan antibiotik belum terlalu luas
dan dikenal sehingga masyarakat pada waktu itu masih sangat tergantung pada
berbagai bahan yang diperoleh di sekitar rumah termasuk pekarangan atau hutan
sekitarnya. Menurut Farnwarth (1985) diperkirakan hampir 80% masyarakat di
negara berkembang menggantungkan dirinya dari tumbuhan untuk memelihara
kesehatannya. Kecenderungan ini kemungkinan akan meningkat dengan makin
banyaknya isu-isu “ bact to nature”. Selain itu, pemanfaatan tumbuhan sebagai
bahan baku obat juga terkait dengan adanya senyawa aktif pada tumbuhan yang
bersifat bioaktif. Salah satu sifat bioaktif dari senyawa pada tumbuhan adalah
sebagai antibakteri.
Penelusuran dan pemanfaatan senyawa aktif alami yang bersifat
antibakteri didasarkan karena banyaknya bakteri bakteri patogen yang dapat
menimbulkan masalah serius pada manusia, sedangkan disisi lain banyak isolat
bakteri yang resisten terhadap antibakteri. Penggunaan bahan-bahan kimia dan
antibiotik yang tidak rasional selain menyebabkan resistensi bakteri juga
berdampak terhadap lingkungan dan efek residunya bagi manusia, sedangkan
karakteristik dari bahan aktif alami lebih mudah terurai di perairan (Marpaung
2004).
Penggunaan obat tradisional secara umum dinilai lebih aman dari pada
penggunaan obat modern, hal ini disebabkan karena obat tradisional memiliki
efek samping yang relatif lebih kecil dari pada obat modern. Efek samping obat
tradisional ٛ relatif kecil jika digunakan secara tepat, yang meliputi: kebenaran
bahan, ketepatan dosis, ketepatan waktu pengunaan, ketepatan cara pengunaan,

1

ketepatan telaah informasi, tanpa penyalahgunaan, ketepatan memilih obat untuk
indikasi tertentu (Kumalasari 2006).
Menurut Wijakusuma et al (1996), bahwa penggunaan daun miana secara
empiris umumnya di masyarakat dalam bentuk segar dan godokan atau infusan
dapat memiliki banyak khasiat diantaranya untuk obat bisul, obses, borok, luka
bernanah, radang telinga dan mata, sedangkan akar digunakan untuk obat diare
dan mulas.
Batang dan daun miana mengandung minyak atsiri (karvakrol, eugenol
dan etil salisilat), fenol, tanin, lemak, dan fitosterol (Winarto 2007). Berdasarkan
penelitian pendahuluan yang sebelumnya dilakukan oleh Suwarjiheryana (1987)
dengan soklet bertingkat dilaporkan bahwa selain mengandung minyak atsiri
(0.047%), daun miana juga mengandung senyawa alkaloid, flavonoid dan saponin.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dan
konsentrasi

hambat

minimum

(MIC)

serta

untuk

mengisolasi,

dan

mengkarakterisasi senyawa aktif dari ekstrak daun miana yang memiliki aktivitas
antibakteri. Sehingga penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
ilmiah yang tepat penggunaan daun miana sebagai senyawa antibakteri kepada
masyarakat.

2

TINJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Miana (Coleus scutellarioides [L] Benth.)
Miana diklasifikasikan ke dalam divisi spermatophyta, subdivisi
Angiospermae, ordo Solanales, family Lamiaceae, genus Solenostemon, dan
spesies Coleus scutellarioides, Linn,Benth. (Depkes 2000). Miana mempunyai
nama lain yang sangat banyak seperti: Si gresing (Batak) adang-adang
(Palembang) jawer kotok (Sunda) her atau kentangan (Jawa) dhin-kamandhinan
(Madura) mayam (Menado) ati-ati, panci-panci (Bugis).
Miana merupakan tanaman yang berasal dari Asia Tenggara, yang
sebenarnya adalah tumbuhan terna (herba) yang bisa tumbuh setinggi 30 cm
sampai 150 cm sangat mudah didapat dan dibudidayakan. Miana dapat tumbuh
subur di daerah dataran rendah sampai ketinggian 1500 meter di atas permukaan
laut. Miana juga bisa didapat disekitar sungai atau pematang sawah dan tepi-tepi
jalan pedesaan sebagai tumbuhan liar. Miana juga merupakan tumbuhan setahun,
tumbuh tegak atau berbaring pada pangkalnya, bagian yang menyentuh tanah
keluar akar, jika seluruh bagian diremas akan mengeluarkan bau yang harum.
Batang bersegi empat dengan alur yang agak dalam pada masing-masing sisinya,
berambut, percabangan banyak, berwarna ungu kemerahan. Daun tunggal,
panjang tangkai 3-4 cm. Helaian daun berbentuk bulat telur, pangkal membulat
atau melekuk menyerupai bentuk jantung, ujung meruncing, tepi beringgit, tulang
daun menyirip jelas (berupa alur) berbentuk gambaran seperti jala, permukaan
daun agak mengkilap, berambut halus, panjang 7 - 11 cm, lebar 3,5 - 6 cm
berwarna ungu kecoklatan sampai ungu kehitaman.
Tanaman ini termasuk familia Lamiaceae alias bayam-bayaman, yang
warna daunnya beragam, cantik dan memikat mata. Warna daun yang beraneka
ragam mulai dari keemasan, kehitaman (Curly lava) pink (Alabama sunset),
merah (Plum parfait), kekuningan (Yellow parfait) ungu hingga kombinasi dari
beragam warna. Bentuk daun juga bervariasi, oval, tepi bergerigi, hingga keriting.
Namun tidak semua jenis miana berkhasiat obat, hanya miana yang daunnya
berwarna merah kecoklatan/ kehitaman dengan tepi berbentuk gerigi yang dapat
digunakan sebagai obat.

3

Gambar 1 Tanaman Miana (Coleus scutellarioides, Linn,Benth)
Zat bioaktif adalah zat yang termasuk metabolik sekunder yang bersifat
aktif secara biologis, aktivitasnya antara lain sebagai antimikroba yaitu suatu zat
yang dapat membunuh mikroba seperti bakteri, khamir, dan kapang yang dapat
digunakan untuk industri pangan dan farmasi yang dapat berasal dari golongan
terpenoid, fenolik dan alkaloid (Haswira 2006).
Menurut Winarto (2007) penggunaan daun miana sendiri dapat digunakan
dalam bentuk segar seperti tumbukan, perasan, seduhan dan rebusan yang oleh
masyarakat daun miana dimanfaatkan sebagai obat bisul, abses, borok luka
bernanah, radang telinga, terlambat bulan, keputihan, cacingan dan gangguan
pencernaan (dispepsi) sedangkan akarnya digunakan sebagai obat mulas dan sakit
perut.
Kemampuannya sebagai obat karena daun tanaman yang berasal dari
wilayah Asia Tenggara ini mengandung senyawa thymol, karvakrol, eugenol,
metileugenol, dan etil salisilat. Thymol memiliki sifat antelmintik (mematikan
cacing) dan antiseptik. Karvakrol merupakan senyawa bersifat disinfektan,
antifungal, dan antelmintik. Eugenol dapat menghilangkan rasa nyeri atau bersifat
analgesik. Sedangkan etil salisilat mampu meniadakan iritasi (Pratiwi 1999).
Dilaporkan juga bahwa daun miana juaga memiliki saponin dan alkaloid,
beberapa jenis saponin sendiri memiliki sifat antibiotik seperti pengaruh anti fungi,
anti mikroba (Seigler DS 1998). Walaupun mekanisme penghambatan alkaloid
terhadap bakteri belum diketahui secara jelas. Menurut Robinson (1995) bahwa

4

alkaloid mampu mengganggu proses pembentukan jembatan silang yang
menyusun peptidoglikan sel bakteri, menyebabkan tidak terbentuknya secara utuh
dinding sel sehingga sel bakteri menjadi mati.
Dilaporkan juga bahwa daun miana juga memiliki efek sebagai
antiinflamasi terhadap radang yang diderita oleh tikus, berdasarkan analisis
kualitatif dengan spektrofotometer ultraviolet menunjukkan bahwa senyawa
tersebut mempunyai gugus kromofor dengan panjang gelombang 321,2 nm dan
213,4 nm, sedangkan analisis kualitatif dengan spektrofotometer inframerah
menunjukkan bahwa senyawa tersebut mempunyai gugus amina (NH2), alkil dan
cincin aromatik (Tjitraresmi 1995).
Pada beberapa penelitian dilaporkan bahwa miana termasuk ke dalam 64
dari 117 tanaman yang secara empiris digunakan oleh masyarakat dari berbagai
daerah untuk obat diare karena mengandung zat kimia yang bersifat antidiare, dan
atau mengandung zat yang bersifat antibakteri (bakteri penyebab diare), jika
ditinjau dari kandungan kimianya maka sebagai obat diare bahan ini kedudukanya
lebih diperkuat karena adanya bahan seperti minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan
turunan fenolik (polifenol) yang bersifat antibakteri ( Sundari & Winarno 1996).

Bakteri Uji
Bakteri adalah sel prokariot yang khas yang bersifat uniseluler dan tidak
mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya, sel bakteri
berbentuk khas seperti bola, batang, atau spiral yang umumnya bakteri
berdiameter 0.5-1.0 μm dan panjang antara 1.5-2.5 μm dengan struktur luarnya
berupa flagella, pili dan kapsul (Pelczar & Chan 1986).
Bardasarkan komposisi dinding sel, bakteri dibedakan menjadi dua yaitu
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif memiliki
struktur dinding sel yang lebih tipis dari bakteri Gram positif tetapi memiliki
dinding sel yang berlapis tiga. Komposisi dinding sel Gram negatif terdiri atas
lipid (11-22%) dan peptidoglikan (10% dari berat kering) yang terdapat pada
lapisan kaku sebelah dalam dinding sel. Bila dibandingkan dengan Gram negatif,
bakteri Gram positif memiliki struktur dinding sel yang lebih tebal tetapi berlapis
tunggal, dengan komposisi dinding sel terdiri atas peptidoglikan (50% berat

5

kering), lipid (1-4%) dan asam teikoat. Berbeda dengan bakteri Gram negatif,
bakteri Gram positif lebih rentan terhadap penisilin (Pelczar & Chan 1986;
Cummins 1990; Williams et al 1996).
Bakteri uji yang digunakan dalam menentukan aktivitas antibakteri suatu
tanaman herba adalah bakteri standar dan dapat juga tergantung pada khasiat
tanaman tersebut terhadap organ tubuh yang diserang oleh bakteri. Mengingat
akan kemampuan daun miana yang dapat mengobati beberapa penyakit seperti
bisul/ borok, sakit mata merah dan gangguan pencernaa maka untuk itu digunakan
bakteri yang hidup dipermukaan kulit (Staphylococcu aureus dan Staphylococcu
epidermidis) dan di dalam saluran pencernaan. (Escherichia coli dan Salmonella
entereditidis).
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk bulat
(coccus), berdiameter 1 μm, sering berkelompok, mengandung pigmen karoten
orange dan kuning, non volatil dan bersifat fakultatif anaerobik (Singleton 1999).
S. aureus memiliki struktur dinding sel yang relatif tebal dan berlapis tunggal,
dinding selnya memiliki kandungan lipid rendah dengan kandungan peptidoglikan
tinggi dan mengandung asam teikoat sehingga bakteri ini lebih rentan terhadap
penisilin. Bakteri ini memiliki suhu optimum pertumbuhan 30-370 C dan nilai pH
optimum pertumbuhan 7.0-7.5. Bakteri ini menyebabkan berbagai penyakit
seperti infeksi terhadap borok atau bisul yang bernanah, radang selapot otak,
peracunan terhadap darah dan racun pada makanan (Buchanan & Gibbons 1974).
Escherichia coli merupakan Gram negatif dengan struktur dinding sel
relatif tipis dan berlapis tiga, dinding selnya memiliki kandungan lipid tinggi
dengan kandungan peptidoglikan relatif rendah dan tidak memiliki asam teikoat.
Bakteri ini memiliki bentuk batang (basil) dengan ukuran lebar 0.5 nm dan
panjang 1.0-3.0 nm, tidak berkapsul. Bakteri yang kurang rentan terhadap
penisilin ini merupakan bakteri fakultatif anaerobik dengan suhu dan pH optimum
pertumbuhan yang sama seperti S. aureus. Bakteri ini penyebab diare akut dan
penyakit infeksi saluran air seni (Buchanan & Gibbons 1974).
Staphylococcus epidermidis memiliki sifat yang hampir sama dengan S.
aureus, karena selain tergolong bakteri Gram positif bakteri ini juga tidak
bergerak dan membentuk spora. Mudah tumbuh pada pada suhu 370 C pada

6

berbagai media pembenihan bakteriologik dalam keadaan aerobik atau mikroaerobik. Koloninya berbentuk bulat, menonjol membentuk pigmen berwarna putih.
Relatif resisten terhadap pengeringan, suhu panas (tahan 500 C selama 30 menit),
dan larutan klorida 8%. Bakteri ini merupakan flora normal pada kulit dari saluran
pernafasan bagian atas manusia bakteri ini dapat menimbulkan penyakit bila
habitat normalnya terganggu, misalnya bila terdapat luka maka bakteri ini dapat
masuk ke dalam aliran darah dan akan menyebabkan infeksi pada daerah yang
bukan habitatnya.
Salmonella spp. merupakan bakteri

penyebab patogen utama yang

penyebab kasus-kasus keracunan (Meat et al 1999 dalam Alzoreky & Nakahara
2003). Salmonella merupakan salah satu bakteri Gram negatif yang berbentuk
basil (batang) yang dapat menyebabkan gastroenteritis pada manusia. Secara
ekologi telah dikenal 3 tipe utama spesies salmonella yaitu (1) Salmonella typhi
agen penyebab penyakit typhus pada manusia, (2) Salmonella choleraesuis yang
ditemukan hidup di unggas, sapi, babi, (3) Salmonella enteriditis yang ditemukan
dapat hidup di manusia dan hewan, pada manusia akan meyebabkan penyakit
gastroenteritis akut. Telah dilaporkan bahwa salah satu jenis salmonella
merupakan bakteri agen gastroenteridis di USA. Makanan-makanan yang berasal
dari hewan memiliki resiko tinggi terhadap kontaminasi salmonella, perlakuan
khusus dan penyimpanan dingin dapat mengurangi potensi hidup dan tumbuhnya
salmonella (McKane & Kandel 1996).
Senyawa Antibakteri
Antibakteri adalah zat yang menghambat pertumbuhan bakteri dan
digunakan secara khusus untuk mengobati infeksi (Pelczar & Chan 1986),
antibakteri termasuk ke dalam antimikroba (Schunack et al 1990). Senyawasenyawa kemoterapeutik, baik yang sintetik maupun alami yang bersifat toksik
terhadap mikroorganisme disebut senyawa antimikroba.
Aktivitas antibakteri ditentukan oleh spektrum kerja (spektrum kerja luas
dan spektrum kerja sempit), cara kerja (bakterisida atau bakteriostatik) dan
ditentukan pula oleh konsentrasi minimum untuk inhibisi (KMI) serta potensi
pada KMI. Suatu antibakteri dikatakan mempunyai aktivitas yang tinggi bila KMI
terjadi pada kadar antibiotik yang rendah tetapi mempunyai daya bunuh atau daya

7

hambat yang besar (Wattimena JR et al 1991). Bakteriostatik yang bersifat
menghambat pertumbuhan bakteri dapat bertindak sebagai bakterisida dalam
konsentrasi yang tingggi (Schunack et al 1990), dan sebaliknya bakterisida pada
konsentrasi rendah dapat bersifat bakteriostatik atau tidak bekerja sama sekali.
Umumnya antibiotik yang digunakan untuk mengobati infeksi bakteri
adalah molekul kecil yang menghambat sintesis makromolekul bakteri dengan
target enzim yang terlibat di dalam sintesis protein dan dinding sel bakteri
(Alberts et al 2002). Obat yang bekerja terhadap dinding sel dan membran
sitoplasma mempunyai cara kerja bakterisida, karena tanpa dinding sel mikroba
tidak dapat bertahan terhadap pengaruh luar demikian pula kerusakan membran
dapat mengganggu pertukaran zat aktif yang penting untuk kehidupan mikroba
seperti penisilin dan turunannya. Obat yang bekerja menghambat sintesis protein
bekerja secara bakteriostatik, karena kekurangan protein mengakibatkan hambatan
pertumbuhan mikroba seperti tetrasiklin, klorofenol, eritromisin, linkomisin,
rifampisin (Wattimena et al 1991).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibedakan dalam 5
kelompok yaitu: (1) Antibakteri yang bekerja menganggu metabolisme sel
mikroba contoh sulfonamid, asam p-aminosalisilat (PAS) dan sulfon; (2)
antimikroba yang menghambat sintesis membran sel mikroba contoh penisilin,
sefalosporin, basitrasin, vankomisin dan sikloserin; (3) antimikroba yang
mengganggu permeabelitas membran sel mikroba contoh polimiksin; (4)
antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba contoh tetrasiklin dan
kloramfenikol; dan (5) antimikroba yang menghambat sintesis atau merusak asam
nukleat sel mikroba contoh rifampisin (Setiabudy 2007).
Aktivitas zat antimikroba dipengaruhi oleh faktor lingkungannya yaitu
konsentrasi atau intesitas zat antimikrobial, jumlah mikroorganisme, suhu, spesies
mikrooganisme, adanya bahan organik, dan pH. Bakteri Gram positif cenderung
lebih sensitif terhadap senyawa antimikroba bila dibandingkan dengan bakteri
Gram negatif yang lebih resisten terhadap senyawa antimikroba, hal ini
disebabkan karena struktur dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana dari
Bakteri Gram negatif sehingga senyawa antimikroba lebih mudah menemukan
sasarannya untuk bekerja (Pelczar & Chan 1986).

8

Penentuan aktivitas antibakteri
Penetapan aktivitas antibiotik secara in vitro menurut Wattimena et al
(1991) dapat dikelompokkan dalam dua cara yaitu (1) Cara difusi agar
menggunakan cakram, silinder atau cekungan sebagai tempat antibiotik. (2) Cara
turbidimetri pada media cair (cara tabung). Jawekz et al. (1972) menambahkan
metode bioautografi dapat juga digunakan dalam menguji aktivitas antimikroba.
Dari ketiga metode diatas yang sering digunakan untuk uji antimikroba adalah
metode difusi. Metode ini dilakukan dengan dasar proses difusi di dalam agar,
substansi antimikroba diletakkan pada media agar yang telah diinokulasi dengan
bakteri uji sehingga antibakteri dalam media agar akan berdifusi dan akan
membentuk zona bening disekitar substansi yaitu zona pertumbuhan yang
dihambat. Berdasarkan pada tujuan penggunaanya metode pengujian kepekaan
senyawa antimikroba dapat dibagi menjadi 3 jenis yaitu difusi, dilusi, dan
kombinasi antara difusi dan dilusi (Lalitha 2004).
Penentuan daya antibakteri dapat dilakukan dengan menentukan adanya
daya hambat pertumbuhan bakteri atau dilanjutkan dengan menentukan potensi
daya hambat dengan membandingkan dengan antibiotik atau dengan menentukan
koefisien fenol. Fenol sendiri merupakan zat pembaku (standar) daya antiseptik
obat lain sehingga daya antiseptik dinyatakan dengan koefisien fenol, walaupun
fenol bukan antiseptik yang kuat ( Estuningtyas & Arif 2007). Penentuan
antibakteri juga dapat dilakukan dengan menggunakan plate agar dengan cara
sumur atau menggunakan cakram yang mengandung sejumlah antibiotik, atau
dengan menentukan penghambatan pertumbuhan dengan menentukan kekeruhan
atau dengan turbidimetri, atau dengan menentukan konsentrasi terendah yang
menghambat pertumbuhan (MIC = minimal inhibition concentration) atau
konsentrasi terendah yang mematikan kuman (MLC = minimal lethal
concentration) (Dzulkarnain, Dian & Au 1996).

9

Ekstraksi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri
Bentuk bahan yang diuji dapat berupa bentuk sediaan yang digunakan
secara empirik, seperti tumbukan, perasan, seduhan, rebusan dan sebagainya.
Percobaan pendahuluan ini dilanjutkan dengan bentuk sediaan yang diperoleh
dengan penyarian menggunakan berbagai penyari (palarut) seperti etanol, metanol,
etil-asetat, eter minyak tanah, kloroform, diklorometana atau campuran bahan ini
dengan berbagai perbandingan. Langkah lebih maju adalah dengan mencoba zatzat murni dari tanaman (Dzulkarnain, Dian & Au 1996).
Isolasi senyawa antibakteri dimulai dengan mengekstrak senyawa aktif
yang ada di dalam daun miana. Ekstraksi merupakan suatu metode dalam
memisahkan campuran beberapa zat menjadi komponen-komponen yang terpisah
(Winarno, Fardiaz & Fardiaz 1973). Ektraksi dapat digunakan untuk memisahkan
senyawa organik yang terdapat pada tumbuhan yang berdasarkan atas perbedaan
kepolaran dari senyawa yang dikandung, komponen-komponen pembentuk suatu
bahan akan berpindah dari bahan ke dalam cairan pelarut. Metode yang paling
sederhana untuk mengekstraksi padatan adalah dengan mencampurkan seluruh
bahan dengan pelarut, suatu bahan akan menunjukkan kelarutan yang berbeda
dalam pelarut yang berbeda tergantung pada polaritas senyawa yang akan
diekstrak (Yusnira 2005) sehingga diperoleh senyawa murni dari tanaman tersebut
yang berkhasiat sebagai obat. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan
pelarut adalah selektifitas, kemampuan mengekstrak, toksisitas, kemudahan untuk
diuapkan dan harga pelarut.
Ekstraksi dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu ekstraksi sederhana dan
ekstraksi khusus. Ekstraksi sederhana terdiri dari maserasi, perkolasi, reperkolasi,
evakolasi dan dialokasi, sedangkan ektraksi khusus terdiri dari soklet, arus balik,
dan ultrasonik (Harborne 1996). Maserasi merupakan metode ekstraksi yang
paling sering digunakan dibanding metode ekstraksi yang lain. Kelebihan metode
maserasi dibandingkan dengan metode ekstraksi lainnya antara lain adalah:
metodenya sederhana, tidak memerlukan alat-alat yang rumit, relatif murah, dan
bisa menghindari kerusakan komponen senyawa yang tidak tahan panas yang
terkandung dalam sampel.

10

Dalam mengekstrak komponen aktif dari suatu jaringan tumbuhan
umumnya terlebih dahulu dilakukan penghalusan jaringan tumbuhan tersebut
sebelum dilakukan ekstraksi. Hal ini dimaksudkan untuk memperluas permukaan
yang akan diekstraksi. Metabolisme sekunder dari tumbuhan dapat larut dalam
pelarut organik. Pelarut organik yang biasa digunakan untuk memproduksi
konsentrat, ekstrak minyak atsiri dari bunga, daun, biji, akar dan bagian lain dari
tanaman adalah etil asetat, heksan, eter, benzen, toluen, etanol, isopropanol,
aseton, dan air (Mukhopadhyay 2002).
Hasil ekstraksi kemudian dipekatkan dengan rotavaporator pada suhu 30400C (Suradikusuma 1989) kemudian dilanjutkan dengan partisi menggunakan
beberapa jenis pelarut, dimulai dari yang non polar sampai ke pelarut yang
bersifat polar (Harborne 1987). Bila kita menelaah profil fitokimia lengkap, dari
suatu jenis tumbuhan, maka sebelum dikromatografi, ekstrak kasar perlu
difraksinasi untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari
golongan utama yang lainnya (Harbone 1987).
Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang banyak digunakan untuk
tujuan kualitatif, kuantitatif dan preparatif. Teknik kromatografi untuk pemisahan
suatu campuran komponen dipengaruhi oleh sifat kelarutan dari komponen yang
bersangkutan didalam eluennya, sifat interaksi komponen dengan bahan yang
terdapat didalam fase diam dan interaksi pelarut dengan fase gerak (Harborne
1987; Gritter et al 1991 & Hostetman et al 1997). Disamping pengoperasiaanya
yang mudah, sederhana dan membutuhkan cuplikan yang sedikit, kromatografi
memiliki banyak keuntungan yang lain diantaranya waktu pengerjaanya singkat,
cukup efektif dan dapat melakukan pemisahan yang tidak mungkin dilakukan
dengan metode lain (Nur et al 1987).
KLT dapat digunakan untuk pemisahan analitik dan preparatif, KLT
analitik digunakan untuk pemisahan awal cuplikan dan KLT preparatif hanya
dilakukan jika diperlukan fraksi tertentu dari campuran (Gritter et al. 1991). Pada
teknik kromatografi, ektraks yang diperoleh dipisahkan menjadi komponennya
berdasarkan pendistribusian zat di antara dua fase, yaitu fase diam (stasioner) dan
fase gerak (mobil), senyawa yang berbeda akan mempunyai koefisien distribusi
yang berbeda diantara 2 fase. Sebagai fase diam (penyerap) biasanya digunakan

11

silika gel atau alumina karena permukaan bahannya memiliki kemampuan dalam
menyerap senyawa organik. Menurut Sastroamidjojo (1991) KLT silika gel dapat
digunakan untuk pemisahan asam-asam amino, alkohol, gula, asam-asam lemak,
lipid, minyak esensial, anion dan kation organik, sterol dan terpenoid.
Proses pemurnian fraksi aktif yang bersifat antibakteri dapat dilakukan
dengan cara kromatografi yaitu kromatografi lapis tipis (KLT) analitik dan
preparatif serta mengkarakterisasinya dengan menggunakan kkomatografi gas
(GC-MS), jika diduga senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri dalam
bentuk gas.
Kromatografi gas-spektroskopi massa GC-MS merupakan salah satu
teknik pemisahan dan identifikasi suatu senyawa yang telah berhasil
dikembangkan dengan menggabungkan dua instrumen dengan dasar analisis yang
berbeda tetapi saling menunjang sehingga dalam menentukan komponen dan
komposisi suatu zat (minyak atsiri) menjadi lebih mudah dan sederhana ( Agusta
2000). Pada GC-MS, kedua alat dihubungkan dengan suatu interfase.
Kromatografi gas berfungsi sebagai alat pemisah komponen campuran dalam
sempel, sedangkan spektrometer massa berfungsi untuk mendeteksi masingmasing melekul komponen yang telah dipisahkan pada sistem kromatografi.
Analisis dengan kromatografi merupakan metode yang cepat dan akurat untuk
memisahkan campuran yang rumit, mampu menganalisis cuplikan dalam jumlah
sangat kecil dan menghasilkan senyawa yang berguna akan struktur serta
identifikasi senyawa organik. Sehingga bila ditinjau dari kecepatan dan
kesederhanaan, GC lebih baik dari

HPLC walaupun kedua teknik analisis

kualitatif ini sama-sama efisien, selektif dan komplemen satu sama lain (Khopkar
1990).
Kromatografi gas dan spektroskopi massa mempunyai persamaan dalam
volatilitas dan jumlah sampel yang digunakan sekitar 1 μmol pada pemasukkan
kromatografi gas dan sampel untuk spektroskopis massa berasal dari efluen
(keluaran dari kolom kromatografi gas) (Haswira 2006). Menurut Nur &
adijuwana (1989) umumnya spektroskopis massa digunakan untuk menentukan
struktur molekul atau massa dari suatu senyawa.

12

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 6 bulan, dimulai dari bulan Januari
sampai Juli 2008 di Laboratorium Bakteriologi Balai Besar Veteriner CimangguBogor. Uji fitokimia dilakukan di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia
IPB. Karakterisasi dengan GC-MS dilakukan di Laboratorium Forensik MABES
POLRI, Blok M-Jakarta.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun miana yang tua (3-5 helai dari
pucuk)

yang

diperoleh

dari

BALITRO-Bogor,

Staphylococcus epidermidis (Gram positif),

Staphylococcus

aureus,

Escherichia coli dan Salmonella

entereditidis (Gram negatif) yang diperoleh dari koleksi bakteri Laboratorium
BALITVET Cimanggu-Bogor, media Nutrient Agar (NA), Peptone Yeast Glukose
(PYG) Agar, aquades, aseton, heksan, kloroform, amoniak, H2SO4, pereaksi
Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, metanol 30%, pereaksi Lieberman
Burchard, FeCl3 1% (b/v), etanol, antibiotik standar, silika gel. Sedangkan alatalat yang digunakan antara lain adalah alat-alat gelas, cawan petri, lampu bunsen,
lup inokulasi, shaker mixer, kertas saring, penangas, tanur, autoklaf, laminar,
eksikator, penangas, neraca analitik, rotavavor, inkubator, GC-MS dan oven.
Metode Penelitian
Preparasi sampel
Daun miana yang digunakan adalah daun miana tua yang diperoleh dari 35 helai dari pucuk dengan bentuk daun yang sempurna dan berwarna merah. Daun
miana yang masih segar dicuci dengan air bersih dan ditiriskan dalam wadah yang
berlubang agar sisa air yang tertinggal dapat dipisahkan. Setelah itu dikeringkan
di udara terbuka yang tidak langsung terkena matahari selama 4-5 hari sampai
diperoleh berat akhirnya yang konstan. Daun miana kering kemudian dihaluskan
dengan menggunakan blender menjadi bubukhalus, disaring hingga menjadi
bubuk.

13

Ekstraksi daun miana
Bubuk daun miana yang diperoleh diekstraksi dengan metode maserasi
yaitu 75 gram serbuk daun miana direndam dalam 300 ml aseton dingin selama
3x24 jam. Kemudian ekstrak disaring dan dipekatkan dengan rotavapor pada suhu
450C. Residu yang diperoleh ditimbang dan ditentukan rendemennya.
Berat ekstrak

X 100%

Rendemen (%) =
Berat sampel
Ekstraks aseton yang diperoleh dipartisi dengan pelarut air dan heksan
dengan perbandingan yang sama, sehingga akan diperoleh 3 fraksi yaitu fraksi air,
fraksi heksan dan fraksi aseton yaitu fraksi yang ada diantara fraksi air dan fraksi
heksan (Lampiran 2). Ketiga fraksi dan crude diuji aktivitas antibakterinya. Fraksi
atau crude yang memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar selanjutnya
dipisahkan komponennya menggunakan KLT analitik dan preparatif untuk
seterusnya dikarakterisasi dengan menggunakan GC-MS.
Analisis Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan 5 ml kloroform dan
3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 2 tetes
H2SO4 2 M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung, kemudian masing-masing
tabung ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid
ditandai dengan terbentuknya endapan putih dengan pereaksi Meyer, endapan
merah dengan pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat dengan pereksi Wagner.
Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 ml
metanol 30% kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat yang diperoleh
kemudian ditambahkan dengan H2SO4. Adanya flavonoid ditandai dengan
terbentuknya warna merah.
Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 ml
aquades kemudian dipanaskan selama 5 menit, kemudian dikocok selama 5 menit.
Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa setinggi kurang lebih 1
cm secara stabil setelah didiamkan selama 15 menit.

14

Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan
dengan 5 ml etanol 30% lalu dipanas selama 5 menit dan kemudian disaring.
Filtrat yang diperoleh diuapkan kemudian ditambahkan dengan eter. Lapisan eter
ditambahkan dengan pereaksi Lieberman Burchard (3 tetes asetat anhidrida dan 1
tetes H2SO4 pekat). Triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah
atau ungu dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.
Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak ditambahkan dengan 5 ml aquades
lalu dididihkan selam 5 menit. Larutan kemudian disaring dan filtratnya
ditambahkan dengan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Adanya warna biru tua atau hitam
yang terbentuk menunjukkan adanya tanin.
Penetapan kadar air (AOAC 1970)
Pinggan porselen dimasukkan ke dalam oven bersuhu 1050 C selama 1 jam,
kemudian pinggan didinginkan dalam eksikator. Setelah dingin, pinggan
ditimbang. Sebanyak ± 2 g sampel dimasukkan ke dalam pinggan porselen,
kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 3 jam suhu 1050 C. Setelah 3 jam
pinggan didinginkan di eksikator, kemudian pinggan dan isinya ditimbang.
Perlakuan dilakukan sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar air dihitung
dengan persamaan:
Berat air

X 100%

% Kadar air =
Berat sampel
Penetapan kadar abu (AOAC 1984)
Penetapan kadar abu diawali dengan memasukkan cawan pengabuan ke
dalam tanur bersuhu 5500C selama 1 jam kemudian didinginkan dalam eksikator
dan setelah dingin bobotnya ditimbang. Sebanyak ± 2 g sampel dimasukkan ke
dalam cawan pengabuan, lalu cawan dipanaskan pada suhu 1200C sampai tidak
ada asap yang keluar dari wadah. Tahap berikutnya sampel dalam cawan
dimasukkan ke dalam tanur dengan suhu 4500C untuk kemudian suhu tanur
dinaikkan sampai 6000C dan dibiarkan selama 5 jam. Pemanasan dilakukan
sampai diperoleh abu berwarna putih keabu-abuan. Penimbangan dilakukan
sampai diperoleh bobot yang konstan.

15

Berat abu

X 100%

% Kadar abu =
Berat sampel
Uji Antibakteri
Pelaksanaan

uji

aktivitas

antimikroba

dilakukan

secara

aseptik

menggunakan metode difusi agar. Uji aktivitas antibakteri, bakteri-bakteri uji
yang telah diregenerasi pada media agar gores nutrien agar (NA) kemudian
diinkubasi pada suhu 370 selama 24 jam. Biakan bakteri yang diperoleh kemudian
diencerkan menggunakan metode McFarland 0.5 dengan konsentrasi bakteri 1 x
108 sel per ml. Bakteri yang telah diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam
media agar Pepton Yeast Agar (PYG) (400C) sebanyak 100 μl kemudian diratakan
dan dibiarkan agar memadat. Setelah padat media agar dilubangi dengan diameter
5.5 mm kemudian dimasukkan sampel yang akan diuji aktivitas antibakterinya
(Bintang M 1993). Selanjutnya cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu
35-370C. Daerah bening di sekitar kertas cakram menunjukkan uji positif,
diameter daerah bening yang diperoleh diukur, dibandingkan dengan senyawa
standar antibiotik komersil sebagai kontrol positif dan pelarut yang digunakan
dalam proses ektraksi sebagai kontrol negatif. Sampel yang digunakan dalam
bentuk ekstrak aseton, bentuk segar, infusan daun miana serta hasil fraksinasi
ekstrak aseton daun miana.
Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (MIC)
Metode analisis yang digunakan dalam penentuan KHM/MIC adalah
metode agar dilusi menurut European society of Clinical Microbiology ang
Infection (2000) yang dimodifikasi. Ekstrak yang telah dirotavapor dengan
konsentrasi ½ dari konsentrasi awal yaitu 100-0.5 mg/L dimasukkan ke dalam
agar PYG

(400 C) lalu dituangkan ke petri steril, setelah agar padat lalu

ditambahkan 10 μL (koloni 107 cpu) kultur bakteri yang telah disiapkan lalu
disebarkan ke permukaan media agar tersebut. Kemudian diinkubasi pada suhu
360C selama 24 jam. MIC diperoleh dari konsterasi terendah (mg/ml) ekstrak
yang disebarkan pada media agar yang tidak memperlihatkan adanya

16

pertumbuhan bakteri. Penentuan MIC juga dilakukan dengan metode difusi untuk
mengetahui diameter zona hambat yang dihasilkan.
Kromatografi Lapis Tipis dan Analisis GC-MS
Kromatografi Lapis Tipis, ekstrak aseton yang memiliki aktivitas
antibakteri

yang

paling

besar

dimurnikan

melalui

pemisahan

dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik dan preparatif. Fase diam
yang digunakan adalah aluminium silika gel G, dengan eluen aseton : n-heksan
(25 : 95). Setelah dielusi di dalam wadah yang tertutup rapat kemudian plat
dikeringkan. Pola pemisahan yang terbentuk dideteksi dengan lampu UV panjang
gelombang 256 nm dan 366 nm. Noda-noda yang memiliki nilai Rf yang sama
kemudian disatukan dan dilarutkan dalam aseton untuk duji aktivitas
antibakterinya.
Identifikasi jenis senyawa yang berperan sebagai antibakteri dilakukan
dengan menggunakan GC-MS. Senyawa yang diidentifikasi dengan GC-MS
adalah fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar dibandingkan
dengan fraksi yang lain. Fraksi aseton yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar
kemudian dilarutkan ke dalam 1 ml aseton. Larutan kemudian disaring dan 2 μl
larutan diinjeksikan ke GC-MS. Kondisi GC-MS untuk analisis ini adalah:
Jenis kolom
Panjang kolom
Diameter kolom
Film
Temperature limit
Isi kolom
Merek GC-MS
Gas pembawa
Laju alir
Suhu ruang injeksi
Suhu oven
Suhu interfac
Suhu quadrupole
Volume injeksi
Injektor

: HP-5MS
: 30 m
: 0.5 mm
: 0.25 μm
: -60 – 3250C
: 5 % dipenil & 95% metilpolisiklosan
: GC Agilent seri 6890N
MS Agilent seri 5973 inert
: Helium
: 1.0 ml/menit
: 2500 C
: suhu awal 700 C dan 2900 C
: 2900 C
: 1500 C
: 2 μl
: HP-5MS

17

HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Kadar Air dan Abu Daun Miana
Sampel pelitian yang akan dianalisis sering mengandung air yang
jumlahnya tidak menentu sehingga penentapan kadar air terhadap sampel yang
akan dianalisis perlu dilakukan untuk mengetahui jumlah bahan (berat kering)
yang terdapat di dalam ekstrak (Zuhud et al 2001). Analisis kadar air yang
dilakukan terhadap daun miana diperoleh kadar air daun segar miana 88.41%
dan 21.09% untuk daun kering miana, sedangkan penelitian pendahuluan
kandungan kimia daun iler yang dilakukan oleh Suwarjiheryana (1987) diperoleh
kadar air daun iler/ miana 83.05%. Perbedaan yang dihasilkan dari penelitian
yang dilakukan dapat disebabkan karena jumlah air yang terkandung dalam
bahan sering tergantung dari perlakuaan yang telah dialami bahan dan
kelembaban tempat disimpannya bahan sehingga penentuan kadar air bahan
dapat dinyatakan sebagai % bahan kering dan akan konstan nilainnya (Haryadi
1993). Nilai yang diperoleh tergolong tinggi karena untuk tujuan penyimpanan
dalam jangka waktu lama dan menghindari kerusakan oleh jamur dan bakteri,
maka kadar air yan diperkenankan adalah dibawah 10%.
Kadar air yang tinggi menyebabkan mikroba lebih mudah mengalami
pertumbuhan. Selain rentan terhadap kerusakan terhadap mikroba dan jamur
kadar air yang tinggi juga berpengaruh terhadap rendemen (yield) yang
dihasilkan dari daun miana, mikroba khususnya bakteri memerlukan air untuk
mempertahankan hidupnya. Penelitian ini menggunakan daun miana kering
dalam proses ekstraksi karena selain untuk mendapatkan rendemen yang lebih
besar juga untuk menghindari kontaminasi oleh mikroba.
Penentuan kadar abu merupakan salah cara untuk menentukan adanya
mineral/ senyawa anorganik dalam suatu bahan. Pembakaran yang dilakukan
akan menghancurkan senyawa-senyawa organik ke dalam bentuk gas yang
mudah terbang. Mineral sebagai senyawa anorganik akan tertinggal dalam
bentuk abu yang dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitaf. Kadar
abu pada daun miana segar ialah 1.29% dan pada daun kering ialah 8.52 %.

18

Ekstraksi Daun Miana
Daun miana diek