Kolagenase Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dan aplikasinya pada pembuatan peptida kolagen bioaktif

KOLAGENASE Bacillus licheniformis F11 ASAL PALEMBANG
DAN APLIKASINYA PADA PEMBUATAN
PEPTIDA KOLAGEN BIOAKTIF

ACE BAEHAKI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI
DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini, saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul Kolagenase
Bacillus licheniformis F11 Asal Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan
Peptida Kolagen Bioaktif adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan atau tidak diterbitkan dari penulis lain disebutkan dalam teks dan
dicatumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir disertasi ini

Bogor, Juni 2012

Ace Baehaki
NRP F261080091

ii

ABSTRACT
ACE BAEHAKI. Collagenase of Bacillus licheniformis F11 from Palembang and
Application to Produce Bioactive Collagen Peptide. Under guidance of MAGGY
THENAWIDJAJA SUHARTONO, SUKARNO, DAHRUL SYAH and SISWA
SETYAHADI.
Collagenase is endopeptidase which can cleave helical collagen into small
peptide fragments. The objective of the study was to select Bacillus licheniformis F11
which produced the best collagenase, purify collagenase dan characterize the crude
and purified collagenase and apply collagenase from Indonesian Bacillus
licheniformis in the production of bioactive collagen peptides which act as
antioxidant, inhibitor of ACE (angiotensin I-converting enzyme) and anti cancer. The
Bacillus licheniformis F11.1 and F11.4 were deleted gen from B. licheniformis F11,

respectively. Collagenase from B. licheniformis was selected for application to
hydrolyze fish skin collagen to produce collagen peptides. B. licheniformis 11.1
produced higher protease activity as compared to B. licheniformis F11.4 when grown
in LB media. The optimum production time was 15 h for B. licheniiformis F11.1
with protease activity of 0.028 U/ml or 0.909 U/mg protein. For B. licheniformis F11.4
it was between 20-35 hours of fermentation, with enzyme activity of 0.005 U/ml or 0.157
U/mg protein. When collagen was added to the Modified LB media different responses
were obtained. The activity of protease from B. licheniformis F11.1 decreased from 0.028
U/ml or 0.909 U/mg protein to 0.005 U/ml or 0.172 U/mg protein while that of B.
licheniformis F11.4 increased from 0.005 U/ml or 0.157 U/mg protein to 0.017 U/ml or
0.546 U/mg protein. Based on result from extracellular collagenase production and
spesificities towards substrate and finger print substrate, B. licheniformis F11.4 was
selected for further study. Enzyme purification was done with ammonium sulphate 50%
(w/v) precipitation, followed by DEAE Sephadex A-50 column chromatography.
Precipitation with ammonium sulphate resulted in 5-fold purification with a yield of
10.1%. After purification with DEAE Sephadex A-50 column, the enzyme was purified
26.3-fold with a yield of 2.6%. The relative molecular weight was estimated to be 124
and 26 kDa. The optimum activity of both crude and purified collagenase (without and
with Ca2+) were observed at 500C. The crude enzyme had pH optimum at 9.0, while the
purified enzyme at 7.0. The crude collagenase activity was inhibited by FeCl2 (1mM) and

CoCl2 (1 mM) while CuCl2 increased its activity. The purified collagenase activity was
inhibited by CuCl2 (1 mM), FeCl2 (1 mM), MgCl2 (1 mM) and CoCl2 (1 mM). However,
CaCl2 (10 mM), ZnCl2 (5 and 10 mM) and CuCl2 (5 and 10 mM) increased its activity.
The radical scavenging activity (as measured by DPPH) of the collagen peptide
hydrolysed with purified collagenase was higher (30.28%) than that of these hydrolysed
with crude collagenase (23.50%). However, ferric ion reduction activity of the collagen
peptide hydrolysed with crude collagenase (2.12) was higher than that of the collagen
peptide hydrolysed with purified collagenase (0.78) and these were also higher than the
2.0 mM BHT antioxidant used as control. The ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme)
inhibitor activity of the collagen peptide hydrolysed with crude was higher (83%) as
compared to that hydrolysed with purified collagenase (74%). The antiproliferation
activity towards HeLa cervix cancer cells of the collagen peptide hydrolysed with
purified collagenase (39.2%) was higher than that of the collagen peptide hydrolysed with
crude (23.5%). The antiproliferation activity towards HCT-116 colon cancer cells of
the collagen peptide hydrolysed with crude and purified collagenase were similar,
with antiproliferation activity at 88.1% at concentration of 1,000 ppm.
Keywords: collagen, collagenase, Bacillus licheniformis F11.4, antioxidant, ACE
inhibitor, cancer antiproliferation

iii

RINGKASAN
ACE BAEHAKI. Kolagenase Bacillus licheniformis F11 Asal Palembang dan
Aplikasinya pada Pembuatan Peptida Kolagen Bioaktif. Di bawah bimbingan
MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, SUKARNO, DAHRUL SYAH dan
SISWA SETYAHADI.
Kolagenase adalah endopeptidase yang dapat memecah kolagen. Kolagen
dapat diperoleh dari berbagai sumber yaitu kulit dan tulang sapi, babi, ayam dan
ikan. Bacillus licheniformis F11.1 dan F11.4 merupakan hasil mutasi dari Bacillus
licheniformis F11 asal Palembang. Tujuan penelitian ini adalah pemilahan
Bacillus licheniformis F11 yang menghasilkan kolagenase tertinggi, memurnikan
dan mengkarakterisasi kolagenase ekstraselular dari B. licheniformis F11 terpilih
dan mengaplikasikan enzimnya dalam pembuatan peptida bioaktif. Kedua
Bacillus ditumbuhkan pada media berkolagen untuk produksi kolagenase.
Kolagenase dari Bacillus licheniformis yang terpilih selanjutnya digunakan untuk
menghidrolisis kolagen sehingga dihasilkan peptida kolagen. Peptida kolagen
diuji aktivitasnya sebagai antioksidan (DPPH dan pereduksi ion ferric), inhibitor
ACE (angiotensin I-converting enzyme) dan anti proliferasi sel kanker serviks
(HeLa) dan sel kanker kolon (HCT-116) dengan metode MTT.
Tahap pertama penelitian bertujuan untuk memilah mutan yang

menghasilkan kolagenase yang tertinggi. Hasil penelitian menunjukkan pada
media Luria Bertani (LB), B. licheniformis F11.1 menghasilkan aktivitas protease
yang lebih tinggi dibandingkan dengan B. licheniformis F11.4. Aktivitas tertinggi
B.licheniformis F11.1 adalah 0,028 U/ml atau 0,909 U/mg protein pada jam ke 15
dan B.licheniformis F11.4 adalah 0,005 U/ml atau 0,157 U/mg protein pada jam
ke 5-40. Produksi pada media LB + kolagen 5% menghasilkan respon yang
berbeda, aktivitas protease B. licheniformis F11.1 mengalami penurunan dari
0,028 U/ml atau 0,909 U/mg protein menjadi 0,005 U/ml atau 0,172 U/mg protein
pada jam ke 20-35 sedangkan aktivitas protease B. licheniformis F11.4 meningkat
dari 0,005 U/ml atau 0,157 U/mg protein menjadi 0,017 U/ml atau 0,456 U/mg
protein pada jam ke 10-15. Hasil uji spesifitas substrat menunjukkan ketika
diproduksi pada media LB, kedua protease lebih aktif pada substrat kasein
dibandingkan dengan tiga protein lain (kolagen, gelatin dan fibrin). Penambahan
kolagen pada media (LB + kolagen 5%) dapat menginduksi aktivitas fraksi
pemecah kolagen menjadi lebih tinggi pada Bacillus licheniformis F11.4,
sedangkan Bacillus licheniformis F11.1 aktivitas terhadap substrat kolagen
berkurang. Hasil analisis spesifitas substrat didukung dengan hasil finger print
substrate menggunakan zimogram menunjukkan pada substrat kolagen
menghasilkan pita yang lebih banyak dan intensitas pita yang lebih nyata
dibandingkan dengan media LB. Berdasarkan hasil dari produksi protease

ekstraselularnya, spesifitas terhadap substrat dan analisis finger print berbagai
substrat, B.licheniformis F11.4 dipilih sebagai isolat untuk menghasilkan
kolagenase untuk penelitian tahap selanjutnya.
Tahap kedua penelitian bertujuan untuk memurnikan dan karakterisasi
enzim kolagenase. Tahap pemurnian diawali dengan penambahan 50% amonium
sulfat dilanjutkan dengan kromatografi DEAE Sephadex A-50. Pengendapan
dengan amonium sulfat menghasilkan tingkat kemurnian sebesar 5 kali dengan

iv

yield kolagenase sebesar 10,1%. Pemurnian dengan kolom DEAE Sephadex A-50
memberikan tingkat kemurnian sampai 26,3 kali dengan yield sebesar 2,6%.
Kolagenase murni diperkirakan berukuran 124 dan 26 kD. Enzim crude dan
enzim murni (tanpa dan dengan ion Ca2+) memiliki suhu optimum yang sama
yaitu 500C. Pengaruh pH terhadap aktivitas kolagenase dianalisis pada kisaran pH
2,0 sampai pH 12,0 dengan menggunakan bufer universal. Enzim crude memiliki
pH optimum pada pH 9,0 dan enzim murni (tanpa dan dengan Ca2+) memiliki pH
optimum pada pH 7,0. Pada pengujian pengaruh ion logam, ditemukan aktivitas
kolagenase crude yang dihambat FeCl2 (1mM) and CoCl2 (1 mM) dengan
persentase penurunan masing-masing sebesar 28% dan 39%, sedangkan CuCl2

meningkatkan aktivitas kolagenase crude sebesar 60%. Aktivitas kolagenase
murni dihambat oleh CuCl2 (1 mM), FeCl2 (1 mM), CoCl2 (1 mM) dan MgCl2 (1
mM) dengan persentase penurunan masing-masing sebesar 44%, 60%, 94% dan
86% sedangkan CaCl2 (10 mM) meningkatkan aktivitas sebesar 109%, ZnCl2 (5
mM) meningkatkan aktivitas sebesar 66% dan ZnCl2 (10 mM) meningkatkan
aktivitas sebesar 72%. Ion logam CuCl2 (5 mM) dapat meningkatkan aktivitas
sebesar 30% dan CuCl2 (10 mM) meningkatkan aktivitas kolagenase murni
sebesar 55%.
Tahap ketiga penelitian bertujuan untuk membuat peptida kolagen dengan
menggunakan kolagenase. Hidrolisis kolagen dengan menggunakan kolagenase
crude menunjukkan derajat hidrolisis tertinggi 79,41%. Hidrolisis kolagen dengan
menggunakan kolagenase murni memiliki derajat hidrolisis tertinggi sebesar
52,94%. Hasil aktivitas scavenging radikal DPPH peptida kolagen yang
dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (30,28%) lebih tinggi dibandingkan
dengan peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase crude (23,5%).
Aktivitas pereduksi ion ferric oleh peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis
kolagenase crude (2,12) memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan
peptida yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (0,78). Aktivitas
penghambatan ACE peptida kolagen yang dibuat menggunakan kolagenase crude
(83%) lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dibuat menggunakan

kolagenase murni (74%). Hasil pengujian dengan metode MTT terhadap
kemampuan proliferasi sel VERO menunjukkan peptida kolagen pada konsentrasi
100, 500 dan 1000 ppm tidak bersifat toksik terhadap sel VERO. Aktivitas
penghambatan terhadap sel kanker serviks HeLa oleh peptida kolagen yang
dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (39,2%) sedikit lebih tinggi
dibandingkan dengan peptida yang dihasikan dari hidrolisis kolagenase crude
(33,3%). Penghambatan proliferasi sel kanker kolon HCT-116 oleh peptida yang
dihasilkan dari hidrolisis kolagenase crude dan murni pada konsentrasi 1000 ppm
memiliki penghambatan proliferasi tertinggi dengan aktivitas penghambatan yang
sama yaitu sebesar 88,1%.
Kata kunci:

kolagen, kolagenase, Bacillus licheniformis F11.4, antioksidan,
inhibitor ACE, antiproliferasi sel kanker

v

© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2012
Hak cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencatumkan
atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya
ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepetingan yang wajar
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

vi

KOLAGENASE Bacillus licheniformis F11 ASAL PALEMBANG
DAN APLIKASINYA PADA PEMBUATAN
PEPTIDA KOLAGEN BIOAKTIF

Oleh:
ACE BAEHAKI

Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor
pada

Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

vii

Penguji pada ujian tertutup: Dr. Ir. Ferri Kusnandar, M.Sc
Dr. drh. Diah Iskandriati

Penguji pada ujian terbuka: Dr. Ir. I Made Artika, M.Sc
Dr. Ir. Ekowati Chasanah, M.Sc

viii

Judul Disertasi

:

Kolagenase Bacillus licheniformis F11 asal
Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan
Peptida Kolagen Bioaktif

Nama Mahasiswa

:

Ace Baehaki

Nomor Pokok

:

F261080091

Program Mayor

:

Ilmu Pangan

Menyetujui,
Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono
Ketua

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Anggota

Dr. Ir. Sukarno, M.Sc
Anggota

Dr. Ir. Siswa Setyahadi, M.Sc
Anggota

Mengetahui,
Ketua Program Mayor
Ilmu Pangan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Ratih Dewanti Hariyadi, M.Sc.

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal ujian: 13 Juni 2012

Tanggal lulus:

ix

PRAKATA

Puji Syukur dipanjatkan ke hadirat Allah SWT, atas rahmat dan karuniaNya, karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian yang berjudul ”Kolagenase
Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dan Aplikasinya pada Pembuatan
Peptida Kolagen Bioaktif” dilaksanakan dari bulan Pebruari 2010 sampai bulan
Oktober 2011. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan
Biokimia, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut
Pertanian Bogor dan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi
Satwa Primata Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang tinggi kepada
Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono sebagai ketua komisi pembimbing yang telah
mencurahkan waktu dan perhatian selama proses pembuatan proposal, bimbingan
dalam penelitian, penulisan disertasi dan artikel ilmiah. Terima kasih atas fasilitas
yang diberikan kepada penulis untuk melakukan penelitian di Laboratorium
Mikrobiologi

dan

Biokimia,

Pusat

Penelitian

Sumberdaya

Hayati

dan

Bioteknologi (PPSHB) Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr.
Ir. Sukarno, M.Sc atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan disertasi. Bapak
telah memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr.
Ir. Dahrul Syah, M.Sc Agr atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan
disertasi. Bapak telah memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr.
Ir. Siswa Setyahadi, M.Sc atas bimbingan dalam penelitian dan penulisan
disertasi. Bapak telah berkenan memberikan bakteri Bacillus licehniformis F11.1
dan F11.4 yang merupakan isolat koleksi Laboratorium Teknologi Bioindustri
Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT).
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada
Prof. Dr. Friedhelm Meinhardt dan kolageanya di University of Mű ster, Jerman
yang telah mengkontruksi mutan Bacillus licheniformis F11.1 dan F11.4. Isolat
hasil kontruksi beliau yang digunakan dalam penelitian ini.

x

Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi disampaikan kepada Dr. Ir.
Endang Prangdimurti, MS sebagai penguji luar komisi dalam ujian kualifikasi Doktor
dan Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc dan Dr. drh. Diah Iskandriati dalam ujian tertutup,
Dr. Ir. I Made Artika, M.AppSc dan Dr. Ir. Ekowati Chasanah, M.Sc dalam ujian
terbuka atas segala masukannya dalam menyempurnakan rancangan penelitian dan
penulisan disertasi.
Terima kasih kepeda Rektor Universitas Sriwijaya, Dekan Fakultas Pertanian
dan ketua Program Studi Teknologi Hasil Perikanan Universitas Sriwijaya yang telah
mengijinkan dan mendukung penulis dalam melanjutkan pendidikan S3 di Program
Studi Ilmu Pangan. Terima kasih kepada Ketua Program Studi Ilmu Pangan, Kepala
Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi dan Kepala Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi
Satwa Primata IPB.
Terima kasih kepada DIKTI Depdikbud yang telah memberikan beasiswa
BPPS dan dana penelitian Hibah kerjasama luar negeri dan publikasi internasional
tahun 2010 dan hibah bersaing tahun 2011-2012. Rekan-rekan dan sahabat
seperjuangan di PPSHB-IPB, Program Studi Ilmu Pangan (Mursalin, Rindy Panca T,
Nur Wulandari, Mega Safithri, Tuti Suryanti, Nelis Imaningsih, Lula Nadia,
Rahmawati, Rijanti Rahayu M, Andi Early Febrinda, Sitti Nurmiah, Emma Rochima
dan lain-lain) dan Program Studi lain di lingkungan IPB, terima kasih atas
persahabatan, dorongan semangat dan bantuan selama penelitian. Terima kasih
kepada Ibu Ika Malikha, S.TP, Ibu Eni Sumartini, mba Mar, mba Pepi, mba Dewi,
mba Silmi dan lain-lain yang selalu siap mengulurkan tangan dalam membantu
penelitian ini.
Terima kasih kepada isteri None Afriyanti, S.Si dan ketiga anakku Rifqoh
Muflihah, M. Syafwan Fikri dan M. Mufid Abdulaziz yang senantiasa memberikan
semangat, menyejukan, menguatkan dan sabar mendampingi penulis menjalani studi
ini. Terima kasih kepada orang tua (Bapak Solihin dan Ibu Titin) dan Bapak mertua
Achtab Said yang senantiasa memberikan dukungan, doa dan dorongan semangat.
Semoga Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah diberikan dengan
balasan yang lebih sempurna.
Bogor, Juni 2012
Ace Baehaki

xi

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 9 Juni 1976 sebagai anak
pertama dari lima bersaudara dari Bapak Solihin dan Ibu Titin. Tahun 2002
penulis menikah dengan None Afriyanti, S.Si dan dikaruniai tiga orang anak,
Rifqoh Mufilhah Baehaki (2003), Muhamad Syafwan Fikri Baehaki (2007) dan
Muhamad Mufid Abdul Aziz Baehaki (2010),
Sekolah dasar hingga menengah penulis selesaikan di Bogor. Pada tahun
1998 penulis menyelesaikan pendidikan strata satu di Jurusan Teknologi Hasil
Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Tahun
2001 penulis melanjutkan pendidikan S2 pada program studi Ilmu Pangan IPB
dan menulis tesis dengan judul karakterisasi protease dari beberapa bakteri
patogen di bawah bimbingan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono dan Dr. Ir. Nurheni
Sri Palupi, M.Si dan lulus pada tahun 2004. Tahun 2008 penulis diterima sebagai
mahasiswa S3 pada Program Studi Ilmu Pangan Sekolah Pascasarjana IPB.
Sejak tahun 2001 penulis bekerja sebagai staf pengajar pada Program
Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
Palembang.
Daftar Publikasi
1. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Azis B. Sitanggang,
Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt. 2012.“Purification and characterization of
collagenase from Bacillus licheniformis F11.4” sudah terbit pada African Journal
of Microbiology Research, Vol 6(10): 2373-2379 tanggal 16 Maret 2012. DOI:
10.5897/AJMR11.1379 (ISI Indexed Journal, Impact Factor 0.533)
2. Ace Baehaki, Sukarno, Dahrul Syah, Azis B. Sitanggang, Siswa Setyahadi,
Friedhelm Meinhardt, Maggy T. Suhartono. ”Different expression of protease
from

Bacillus licheniformis

F11.1

and F11.4 isolated from Palembang

Indonesia” submitted pada Biocatalysis and Agricultural Biotechnology (Elsevier)
3. Ace Baehaki, Sukarno, Dahrul Syah, Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt,
Maggy T. Suhartono. “Collagen peptide with antioxidant, ACE inhibitor and anti
cancer activity” submitted pada Jurnal Food Chemistry (Elsevier).

xii

Daftar Seminar Internasional
1. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Azis B. Sitanggang,
Siswa Setyahadi, Friedhelm Meinhardt. “Purification and characterization of
collagenase from Bacillus licheniformis F11.4” telah diseminarkan pada seminar
internasional The Council of Rector of Indonesia State University (CRISU) and
The Council of University President of Thailand (CUPT) di Universitas Sriwijaya
Palembang tanggal 20-22 Oktober 2011 (Oral presenter)
2. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Siswa Setyahadi,
Friedhelm Meinhardt. “Study on the collagenase from Bacillus licheniformis
F11.4 and the use for production of collagen peptides with antioxidant activity”
telah diseminarkan pada International symposium on Marine Ecosystem, Natural
Product and Their Bioactive Metabolites di IPB International Convention Center
Bogor, tanggal 25-27 Oktober 2011. (Poster presenter)
3. Ace Baehaki, Maggy T. Suhartono, Sukarno, Dahrul Syah, Siswa Setyahadi,
Friedhelm Meinhardt. “The collagen peptide with antioxidant, ACE inhibitor and
anti cancer activity” telah diseminarkan pada International Conference on
Biomedical Science di ITB Bandung (Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati),
tanggal 27 – 28 Pebruari 2012. (Oral poster presenter).

xiii

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................

xix

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................

xxi

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xxv

PENDAHULUAN
Latar Belakang .................................................................................
Perumusan Masalah ........................................................................
Tujuan Penelitian .............................................................................
Hipotesis Penelitian .........................................................................

1
2
4
4

TINJAUAN PUSTAKA
Kolagenase .......................................................................................
Kolagen ............................................................................................
Bakteri Bacillus licheniformis F11 Penghasil Protease.....................
Peptida sebagai Antioksidan .............................................................
Peptida sebagai Inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme)..
Peptida sebagi Anti Kanker ..............................................................
Bioavailibilitas Peptida ......................................................................

5
9
11
13
17
21
23

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian ..........................................................
27
Bahan dan Alat .................................................................................
27
Metode Penelitian .............................................................................
28
Pemilahan Isolat dan Produksi Kolagenase ……………………….
30
Media Pertumbuhan dan Produksi Kolagenase ……………
30
Pengukuran Aktivitas Kolagenase………………………….. 30
Analisis Protein Enzim …………………………………….
31
Spesifitas dan Finger Print Substrate ……………………...
32
Pemurnian Enzim …………………………………………………..
32
Pengendapan dengan Amonium Sulfat …………………….
32
Dialisis ……………………………………………………..
33
Pemurnian dengan Kromatografi Pertukaran Ion ………….
33
Penentuan Berat Molekul dengan SDS-PAGE dan
Zimogram …………………………………………………..
34
Karakterisasi Kolagenase …………………………………………..
35
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim ………………….
35
Stabilitas terhadap Panas …………………………………… 35
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim…………………….. 36
Stabilitas pada pH Optimum………………………………… 36
Pengaruh Ion Logam ……………………………………….. 36
Spesifitas Substrat Kolagenase Murni ……………………… 36
Penentuan Vmax dan Km Kolagenase Murni ………………… 37

xiv

Pembuatan Peptida Kolagen dengan Kolagenase ………..................
Pengaruh Waktu Hidrolisis pada Derajat Hidrolisis…………
Pola Peptida Hasil Hidrolisis ………………………………..
Pengukuran Peptida Kolagen sebagai Antioksidan …………………
Aktivitas Scavenging Radikal DPPH ……………………….
Kekuatan Antioksidan Mereduksi Ferric (Reducing
Power) ………………………………………………………
Pengukuran Peptida Kolagen sebagai Inhibitor ACE ………………
Pengukuran Peptida Kolagen sebagai Antiproliferasi Sel
Kanker secara In Vitro……………………………………………….
Pemeliharaan Kultur Sel …………………………………….
Pengujian Aktivitas Antiproliferasi Sel Kanker …………….
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemilahan Isolat Penghasil Kolagenase Tertinggi…………………..
Fermentasi …………………………………………………..
Spesifitas Substrat …………………………………………..
Finger Print Substrate Protease B.licheniformis
F11.1 dan F11.4 ……………………………………………...
Pemurnian enzim Kolagenase………………………………………..
Pengendapan Amonium Sulfat ………………………………
Pemurnian dengan Kromatografi Pertukaran Ion ……………
Karakterisasi Kolagenase …………………………………………....
Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim …………………..
Stabilitas terhadap Suhu ……………………………………..
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim ……………………..
Stabilitas pada pH Optimum ………………………………..
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Enzim …………….
Spesifitas Substrat Kolagenase Murni ……………………….
Penentuan Vmax dan Km Kolagenase Murni …………………..
Pembuatan Peptida Kolagen …………………………………………
Derajat Hidrolisis ………………………………………….…
Pola Peptida Hasil Hidrolisis …………………………………
Aktivitas Antioksidan Peptida Kolagen ……………………………...
Aktivitas Penghambatan ACE ……………………………………….
Aktivitas Antiproliferasi Sel Kanker …………………………………
Pengaruh Peptida Kolagen terhadap Proliferasi Sel VERO…..
Pengaruh Peptida Kolagen terhadap Proliferasi Sel HeLa……
Pengaruh Peptida Kolagen terhadap Proliferasi Sel HCT-116..

37
37
38
38
38
39
39
41
41
41

43
43
47
50
53
53
54
57
57
60
64
66
67
70
71
72
72
74
76
80
84
84
86
87

KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan …………………………………………………………… 93
Saran ………………………………………………………………….. 94
DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………... 95
LAMPIRAN ..................................................................................................... 111

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Karakteristik kolagenase dari beberapa bakteri.................................

7

2. Beberapa peptida antioksidan ..........................................................

16

3. Peptida inhibitor ACE ......................................................................

20

4. Rute pada absorbsi peptida ………………………………………..

24

5. Prosedur pengukuran aktivitas inhibitor ACE ..................................

40

6. Ringkasan produksi protease pada media LB dan LB + kolagen ....

45

7. Ringkasan fraksi protease yang diproduksi oleh Bacillus
licheniformis F11.1 dan Bacillus licheniformis F11.4 yang
terdeteksi pada zimogram……………………………………………

52

8. Tahapan pemurnian kolagenase dari B. licheniformis F11.4………..

56

9. Karakteristik kolagenase B. lichneniformis F11.4 dibandingkan
dengan kolagenase dari bakteri lain…………………….....................

58

10. Nilai k dan waktu paruh kolagenase crude dan murni (tanpa
dan dengan Ca2+). …………………………………………………..

64

xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1. Langkah - langkah pemecahan kolagen oleh kolagenase
Kolagenanase mengikat pada kolagen sebelum memecah
triple-helix kolagen Chung et al. 2004) ...............................................

8

2. Struktur
kolagen dan interaksinya dengan kolagenase
(MMP-1). (A) Peptida triple-helix yang dijelaskan oleh
Kramer et al. (2001) dan sisi aktif dari domain katalitik
yang dijelaskan oleh Li et al. (2005). (B) Model peptida
triple-helix dan MMP-1 yang diputar 90 0 ke arah kiri. Lokasi
katalitik Zn ditunjukkan dengan panah ..............................................

10

3. Prediksi sekuen kitinase A strain F5 dan F11 dengan prediksi
susunan kitinase B. licheniformis DSM13 dan MD1. (A) N-terminal yang diduga signal peptida dengan huruf tebal italics.
Kitinase dari B. licheniformis DSM13 dan MD1 memiliki 692
asam amino sedangkan kitinase F5 dan F11 hanya memiliki 160
asam amino (B) mutasi frameshift dengan penghilangan A
(Waldeck et al. 2006)……………………………………………….

12

4. Mekanisme scavenging radikal DPPH oleh antioksidan (Ebada
et al. 2008) ........................................................................................

15

5. Mekanisme ACE dalam meningkatkan hipertensi (Beevers dan
Greegor 1987) ....................................................................................

18

6. Perkiraan model sisi pengikatan Captropil dan peptida pada sisi aktif
Enzim ACE. (A) sisi pengikatan Captropil (Illingworth 2002),
(B) sisi pengikatan peptida (Byun & Kim 2002) ………………………

21

7. Diagram Alir Penelitian ....................................................................

29

8. Aktivitas protease (U/ml) Bacillus licheniformis F11.1 (A dan C)
dan Bacillus licheniformis F11.4 (B dan D) pada media LB
(A dan B) dan LB + kolagen (C dan D)..............................................

43

9. Aktivitas spesifik
protease selama fermentasi Bacillus
licheniformis F11.1 (A dan C) dan Bacillus licheniformis F11.4
(B dan D) pada media LB (A dan B) dan LB + kolagen (C dan D)......

44

xvii

10. Aktivitas protease Bacillus licheniformis F11.1 (A dan C) dan
Bacillus licheniformis F11.4 (B dan D) yang diproduksi dari dua
tipe media: LB (A dan B) dan LB + kolagen (C dan D) pada
berbagai substrat....................................................................................

47

11. Rasio hidrolisis kolagen dengan substrat lain (kasein, gelatin dan
fibrin). oleh protease Bacillus licheniformis F11.1 (A dan C) dan
Bacillus licheniformis F11.4 (B dan D) yang diproduksi dari dua
tipe media: LB (A dan B) dan LB + kolagen (C dan D).......................

49

12. (A) Zimogram protease Bacillus licheniformis F11.1 dan F11.4
dengan media LB dan media LB + kolagen. Analisis zimogram
dilakukan pada substrat kolagen (lajur 2), kasein (lajur 3), gelatin
(lajur 4) dan fibrin (lajur 5). Lajur 1 adalah marker. Jumlah sampel
yang ditambahkan 15 μ l. (B) Ilustrasi Gambar ....................................

51

13. Aktivitas kolagenase B. licheniformis F11.4 hasil pengendapan
dengan berbagai macam konsentrasi garam amonium sulfat…………

53

14. Profil elusi kolagenase B. licheniformis F11.4 dengan kolom
DEAE Sephadex A-50. Volume tiap fraksi 5 ml/tabung dan elusi
buffer fosfat 0,02 M pH 8…………………………………………….

55

15. Berat molekul kolagenase B. licheniformis F11.4. (A) SDS-PAGE
dan (B) zimogram Lajur 1, marker: phosphorylase b (97 kDa),
bovine serum albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic
anhydrase (30 kDa), and lysozyme (14 kDa); lajur 2, ekstrak kasar;
dan lajur 3, enzim murni DEAE Sephadex A-50 fraksi 44……………

56

16. Pengaruh suhu terhadap aktivitas kolagenase Bacillus licheniformis
F11.4. (A) kolagenase crude dan (B) kolagenase murni dengan
10 mM Ca2+ (□ ) dan tanpa 10 mM Ca2+ (Δ ). Aktivitas kolagenase
dilakukan pada buffer fosfat 0,05 M pH 7.0………………………….

57

17. Pengaruh suhu terhadap stabilitas kolagenase B. licheniformis
F11.4. (A) kolagenase crude dan (B) kolagenase murni. Enzim
dalam buffer fosfat 0,05 M (pH 7,0) pada 500C dan 700C.
Aktivitas residu enzim diukur pada kondisi standar…………………..

61

18. Hubungan ln [aktivasi] kolagenase crude B. licheniformis F11.4
waktu pemanasan……………………………………...........................

62

19. Hubungan ln [aktivasi] kolagenase murni B. licheniformis F11.4
tanpa Ca2+ waktu pemanasan……………………………………....

62

20. Hubungan ln [aktivasi] kolagenase murni B. licheniformis F11.4
dengan Ca2+ waktu pemanasan……………………………………....

63

xviii

21. Pengaruh pH terhadap stabilitas kolagenase B. licheniformis F11.4.
(A) kolagenase crude dan (B) kolagenase murni. Enzim dengan
10 mM Ca2+ (□ ) dan tanpa 10 mM Ca2+ (Δ ) dalam buffer fosfat
0,05 M (pH 7,0). Aktivitas residu kolagenase diukur suhu 500C……….

65

22. Stabilitas pada pH optimum kolagenase B. licheniformis F11.4.
(A) kolagenase crude dan (B) kolagenase murni dengan 10 mM Ca2+
(□ ) dan tanpa 10 mM Ca2+ (Δ ) dalam bufer fosfat 0,05 M (pH 9.0
untuk kolagenase crude dan pH 7,0 untuk kolagenase murni).
Kolagenase Aktivitas diukur suhu 500C ……………………………......

67

23. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas kolagenase Bacillus
licheniformis F11.4. (A) kolagenase crude dan (B) kolagenase
murni. Enzim dalam buffer fosfat 0,05 M (pH 7,0) pada 500C.
Aktivitas residu enzim diukur pada kondisi standar……………………..

68

24. Spesifitas substrat kolagenase B. licheniformis F11.4 murni (Insert:
Spesifitas substrat kolagenase B. licheniformis F11.4 ekstrak kasar)…….

70

25. Rasio hidrolisis kolagen dengan substrat lain (kasein, gelatin dan
fibrin) oleh kolagenase Bacillus licheniformis F11.4 murni (Insert:
rasio substrat kolagenase B. licheniformis F11.4 ekstrak kasar) ...............

71

26. Penentuan parameter kinetika enzim koalgenase murni dari
Bacillus licheniformis F11.4 dengan Lineweaver-Burk plot…………….

72

27. Derajat hidrolisis kolagenase B.licheniformis F11.4 pada substrat
kolagen. (A) kolagenase crude (0,56 U/mg) dan (B) kolagenase murni
(0,28 U/mg) ………………………………………………………………

73

28. Pola hidrolisis kolagen oleh enzim kolagenase B. licheniformis
F11.4. kolagenase crude (A dan B) dan kolagenase murni (C dan D)
dengan aktivitas kolagenase A=0,056 U/mg; B=0,028 U/mg; C=0,028
dan D=0,014 U/mg (M=marker, K=kolagen tanpa hidrolisis) …………..

75

29. Aktivitas scavenging radikal peptida kolagen hasil hidrolisis
kolagenase B. licheniformis F11.4. (A) kolagenase crude dan
(B) kolagenase murni. Konsentrasi peptide kolagen adalah 0,54 mg/ml
dan konsentrasi BHT 2,0 mM………………………………………….... 77
30. Kekuatan pereduksi peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase
B. licheniformis F11.4. (A) kolagenase crude dan (B) kolagenase
murni. Konsentrasi peptide kolagen adalah 0,54 mg/ml dan konsentrasi
BHT 2,0 mM mM……………………………………….......................... 79

xix

31. Aktivitas inhibitor ACE pada peptida kolagen hasil hidrolisis
kolagenase B. licheniformis F11.4. (A) kolagenase crude dan
(B) kolagenase murni. Kolagen dihidrolisis dengan perbedaan
Unit enzim dengan konsentrasi protein kolagen 0,54 mg/ml.
Konsentrasi Captropil yang digunakan adalah 1 mg/ml………………….. 81
32. Aktivitas inhibitor ACE pada peptida kolagen dengan perbedaan
konsentrasi kolagen yang dihidrolisis. (A) Peptida hasil hidrolisis
kolagenase crude dan (B) kolagenase murni. Unit enzim kolagenase
adalah 0,056 U/ml untuk kolagenase dan 0,028 U/ml pada kolagenase
murni. Konsentrasi Captropil 1 mg/ml…………………………………...

83

33. Aktivitas antiproliferasi peptida kolagen terhadap sel VERO,
(A) peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase crude dan (B) peptida
kolagen hasil hidrolisis kolagenase murni………………………………

85

34. Aktivitas antiproliferasi peptida kolagen terhadap sel kanker serviks
HeLa, (A) peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase crude dan
(B) peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase murni…………………...

86

35. Aktivitas antiproliferasi peptide kolagen terhadap sel kanker kolon
HCT-16, (A) peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase crude dan
(B) peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase murni……..................... 88
36. SDS-PAGE dan zimogram kolagenase, kolagen dan peptida kolagen
hasil hidrolisisnya yang memilki aktivitas antioksidan, inhibitor ACE
dan anti kanker yang tertinggi…………………………………………..

91

xx

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1.

Pereaksi untuk analisa protease dan kolagenase …………………

111

2.

Komposisi larutan standar metode Bradford …………………….

112

3.

Kurva Standar Protein …………………………………………….

113

4.

Pereaksi untuk SDS-PAGE dan zimogram ……………………….

114

5.

Komposisi gel penahan dan pemisah SDS-PAGE dan zimogram ...

116

6.

Kurva Penentuan berat molekul …………………………………...

117

7.

Pembuatan Bufer Universal………………………………………..

118

8.

Pendugaan waktu paruh (t1/2) enzim (Toledo 2006)……………….

119

9.

Pereaksi untuk uji pengukuran derajat hidrolisis………………….

120

10. Pereaksi untuk uji pengukuran aktivitas antioksidan……………..

121

11. Pereaksi untuk pengukuran aktivitas inhibitor ACE…………….

122

xxi

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Protein berperan signifikan pada peningkatan kesehatan manusia selain
nilai gizinya. Hidrolisis enzimatik secara luas digunakan untuk meningkatkan
nilai gizi dan sifat fungsional dari protein pangan. Hidrolisat protein ikan telah
dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan, antihipertensi, antiproliferasi sel
kanker, antimikroba dan imunomodulator. Hidrolisat protein dengan bahan baku
ikan yang menunjukkan aktivitas antioksidan yang telah dilaporkan adalah dari
daging ikan Yellowfin, Alaska Pollack, Round Scad dan Pasifik Hake. Hidrolisat
protein yang memiliki aktivitas sebagai inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting
Enzyme), diantaranya adalah hidrolisat dari ikan Sardin. Aktivitas antiproliferasi
dari hidrolisat protein juga telah diteliti yaitu hidrolisat protein ikan terhadap sel
kanker payudara.
Kolagen merupakan protein struktural yang berlimpah dan seluruhnya
berada pada tubuh mahluk hidup. Bentuk utama dari kolagen yang dikenal sebagai
kolagen tipe 1 terdapat secara luas pada kulit, otot, tulang dan organ dalam
vertebrata tingkat tinggi. Vertebrata tingkat rendah seperti ikan juga memiliki
kolagen tipe 1.
Peptida kolagen diperoleh melalui proses enzimatis menggunakan
kolagenase dan enzim proteolitik lainnya.

Penggunaan kolagenase pada

pembuatan peptida kolagen lebih efektif karena kolagenase merupakan
endopeptidase yang dapat memecah domain triple helix dari kolagen. Kolagenase
lebih efektif bekerja pada kolagen yang belum terdenaturasi.
Proses hidrolisis kolagen membutuhkan sumber enzim kolagenase.
Pencarian sumber kolagenase sudah banyak dilakukan peneliti.

Sumber

kolagenase yang telah dilaporkan adalah Bacillus subtillis FS-2 (Nagano & To
1999), Bacillus subtilis CN2 (Tran & Nagano 2002), Bacillus sp. MO-1 (Okamoto
et al. 2001), Bacillus subtilis AS1.398 (Riu et al. 2009), Bacillus pumilus CoI-J
(Wu et al. 2010), Streptomyces sp. strain 3B

(Petrova et al. 2006a)

dan

2

Streptomyces parvulus (Sakurai et al. 2009). Beberapa peneliti menggunakan
organ dalam ikan sebagai sumber kolagenase yaitu organ dalam ikan makarel
(Park et al. 2002), organ dalam ikan filefish (Kim et al. 2002), hepatopancreas
udang (Aoki et al. 2003) dan hepatopancreas kepiting raja (Rudenskaya et al.
2004).
Berbagai pertimbangan penggunaan mikroba sebagai sumber enzim antara
lain mikroba dapat tumbuh relatif cepat, ramah lingkungan, mudah diisolasi dan
terbuka peluang untuk meningkatkan mutu enzim melalui rekayasa genetika.
Bakteri yang berpotensi sebagai sumber kolagenase adalah Bacillus licheniformis
F11.1 dan Bacillus licheniformis F11.4. Kedua bakteri ini merupakan derivat dari
B. licheniformis F11 yang diisolasi dari limbah udang di daerah Palembang
Sumatera Selatan. Isolasi B.licheniformis F11 dilakukan atas kerjasama antara
Laboratorium Bioindustri, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT)
dengan Universitas Hamburg, Jerman dalam skema Indonesia-Germany
Biotechnology (IG-Biotech) phase 3.
Sumber kolagen yang digunakan adalah kulit ikan bandeng yang
merupakan salah satu limbah pengolahan hasil perikanan. Produksi ikan nasional
tahun 2009 sekitar 10.065.120 ton (BPS 2010) tentunya menghasilkan limbah
yang cukup besar. Salah satu bentuk pemanfaatan limbah kulit ikan adalah dengan
dibuat menjadi peptida kolagen menggunakan kolagenase Bacillus licheniformis
F11. Peptida kolagen dari kulit ikan selanjutnya diuji bioaktivitasnya yang
meliputi aktivitas antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme)
dan antiproliferasi sel kanker.

Perumusan Masalah

Kolagenase merupakan endopeptidase yang dapat memecah domain triple
helix dari kolagen. Kolagenase mempunyai banyak manfaat dan diaplikasikan
pada industri pangan, farmasi dan riset, salah satunya digunakan dalam hidrolisis
protein menjadi peptida bioaktif. Protein akan menghasilkan asam-asam amino

3

bila dihidrolisis sempurna, tetapi hidrolisis secara parsial menghasilkan molekulmolekul peptida dengan sekuen asam amino spesifik yang memiliki bioaktivitas.
Hidrolisis protein menghasilkan peptida dapat dilakukan secara parsial
menggunakan asam atau basa. Mengingat proses penambahan asam maupun basa
pada proses hidrolisis dapat merusak beberapa gugus asam amino dan
menghasilkan senyawa karsinogenik, maka fungsi asam atau basa dapat
digantikan oleh enzim yang bekerja secara spesifik. Aplikasi kolagenase perlu
dilakukan dalam rangka mencari proses yang lebih efektif dan lebih ramah
lingkungan.
Bakteri Bacillus merupakan bakteri utama penghasil enzim secara industri.
Bacillus penghasil kolagenase adalah Bacillus subtillis

FS-2 (Nagano & To

1999), Bacillus subtilis CN2 (Tran & Nagano 2002), Bacillus sp. MO-1 (Okamoto
et al. 2001), Bacillus subtilis AS1.398 (Riu et al. 2009), Bacillus pumilus CoI-J
(Wu et al. 2010), Streptomyces sp. strain 3B

(Petrova et al. 2006a)

dan

Streptomyces parvulus (Sakurai et al. 2009). Bakteri B. licheniformis F11.1 dan B.
licheniformis F11.4 diketahui menghasilkan protease yang tinggi, kedua bakteri
ini merupakan hasil mutasi dari B. licheniformis F11 yang secara alamiah tidak
memiliki chiA (chiA) dengan menghilangkan operon pembentukan poliglutamat
(pga) menghasilkan B. licheniformis F11.1 (chiA, pga) dan mutasi dengan
menghilangkan operon pembentukan poliglutamat (pga) dan chiBA (double
mutant) menghasilkan B. licheniformis F11.4 (pga, chiBA) yang ditemukan
kehilangan kitinase tetapi menghasilkan aktivitas protease yang tinggi.
Diperkirakan bakeri proteolitik ini mampu memecah kolagen sebagai substrat.
Pada aplikasi kolagenase dibutuhkan informasi karakteristik enzim dan kondisi
kerja yang optimum. Pada beberapa aplikasi, ekstrak kasar dapat bekerja secara
efisien, tetapi pada aplikasi yang lain, kolagenase yang lebih murni dibutuhkan.
Untuk itu pemurnian dan karakterisasi kolagenase perlu dilakukan sebelum
diaplikasikan dalam substrat kolagen. Peptida kolagen yang memiliki aktivitas
bioaktif sudah banyak diteliti diantaranya peptida kolagen dari babi yang memiliki
aktivitas antioksidan (Li et al. 2007), peptida kolagen dari kulit ayam yang
memiliki aktivitas inhibitor ACE (Saiga et al. 2008), peptida kolagen dari kulit
tuna bluefin yang memilki aktivitas anti kanker (Han et al. 2011) dan peptida

4

kolagen dari kulit salmon yang dapat menurunkan trigliserida

pada tikus

percobaan (Saito et al. 2009). Peptida kolagen yang dihasilkan oleh aktivitas
kolagenase B.licheniformis F11.1 dan B.licheniformis F11.4 diharapkan memiliki
aktivitas bioaktif sebagai antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting
Enzyme) dan antiproliferasi sel kanker.

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah 1) memilah isolat yang menghasilkan
kolagenase yang efektif dalam menghidrolisis kolagen, 2) memurnikan dan
mengkarakterisasi kolagenase ekstraseluler dari B. licheniformis F11 terpilih dan
3) mengaplikasikan enzimnya dalam pembuatan peptida kolagen dari kulit ikan
bandeng serta melakukan pengujian sifat bioaktif peptida kolagen yang dihasilkan
yaitu aktivitas antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) dan
antiproliferasi sel kanker (sel kanker serviks HeLa dan sel kanker kolon HCT116).

Hipotesis

Hipotesis dalam penelitian ini adalah kolagenase dari bakteri Bacillus
licheniformis F11 asal Palembang dapat digunakan untuk memproduksi peptida
kolagen. Peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase Bacillus licheniformis F11
bersifat antioksidan, inhibitor
antiproliferasi sel kanker.

ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) dan

TINJAUAN PUSTAKA

Kolagenase
Kolagenase merupakan endopeptidase yang dapat memecah domain triple
helix dari kolagen. Berdasarkan fungsi fisiologisnya, kolagenase digolongkan
menjadi dua tipe, yaitu serin kolagenase dan metallokolagenase. Serin kolagenase
seperti semua serin proteinase, memiliki residu serin pada sisi katalitiknya
(Daboor et al. 2010). Serin kolagenase memiliki berat molekul pada kisaran
24 - 36 kDa (Roy et al. 1996 dalam Daboor et al. 2010), enzim ini berhubungan
dengan organ pencernaan (Zefirova et al. 1996) dan dapat memecah struktur triple
helix kolagen tipe I, II dan III serta terlibat pada produksi hormon dan degradasi
protein, pembekuan darah dan fibrinolisis (Neurath 1984). Metallokolagenase
merupakan enzim yang mengandung Zn yang membutuhkan kalsium untuk
kestabilan (Stricklin et al. 1977). Metallokolagenase merupakan anggota Matrix
Metalloproteinase (MMP) dengan berat molekul yang bervariasi dari 30 hingga
150 kDa (Harris & Vatar 1982). Selain itu, metallokolagenase termasuk dalam
enzim ekstraseluler yang terlibat dalam pembentukan kembali matriks
ekstraseluler, jenis enzim ini telah banyak dipelajari dari berbagai jaringan
mamalia, bakteri dan bisa ular (Park et al. 2002).
Kolagenase mempunyai banyak manfaat dan diaplikasikan pada industri
pangan, obat-obatan dan riset, salah satunya digunakan dalam hidrolisis protein.
Semua protein akan menghasilkan asam-asam amino bila dihidrolisis, tetapi ada
beberapa protein yang disamping menghasilkan asam amino juga menghasilkan
peptida (Bjarnason 2001). Gesualdo & Li-Chan (1999) menyatakan bahwa
hidrolisis protein untuk menghasilkan peptida dan asam amino dapat dilakukan
secara parsial menggunakan asam atau basa.

Hidrolisis menggunakan asam

maupun basa dapat merusak beberapa gugus asam amino dan menghasilkan
senyawa karsinogenik, maka fungsi asam atau basa dapat digantikan oleh enzim
yang spesifik.

Pencarian enzim penghidrolisis kolagen (kolagenase) perlu

dilakukan dalam rangka mengganti penggunaan asam dan basa.

6

Salah satu sumber enzim kolagenase yang telah diketahui adalah dari
bakteri. Penelitian ekstraksi kolagenase dari bakteri sudah banyak dipublikasikan.
Beberapa bakteri yang menghasilkan kolagenase adalah Bacillus subtillis FS-2
(Nagano & To 1999), Bacillus subtilis CN2 (Tran & Nagano 2002), Bacillus sp.
MO-1 (Okamoto et al. 2001), Bacillus subtilis AS1.398 (Riu et al. 2009), Bacillus
pumilus CoI-J (Wu et al. 2010), Streptomyces sp. strain 3B (Petrova et al. 2006a)
dan Streptomyces parvulus (Sakurai et al. 2009). Beberapa karakterisasi
kolagenase dari bakteri hasil penelitian sebelumnya terdapat pada Tabel 1.
Konformasi triple-helix membuat kolagen resisten terhadap sebagian besar
proteinase. Pada vertebrata, enzim yang dapat memecah triple-helix kolagen
adalah kolagenase (Visse & Nagase 2003) dan kathepsin K (Garnero et al. 1998).
Kathepsin K memecah

kolagen pada lingkungan asam, sedangkan enzim

kolagenolitik bekerja pada lingkungan pH netral dan termasuk anggota dari
matriks metalloproteinase (MMP) (Sternlicht & Werb 2001). Grup yang termasuk
kolagenase adalah MMP-1, MMP-8, MMP-13 dan MMP-18 dan yang termasuk
gelatinase A adalah MMP-2 (Aimes & Quigley 1995; Patterson et al. 2001).
Chung et al. (2004) menyelidiki mekanisme kolagenase dalam
mendegradasi jaringan kolagen. Pada penelitiannya secara in vitro, digunakan
dua substrat, yaitu kolagen utuh tipe I (kolagen fibril dari kulit dan tulang hewan)
dan gelatin. Kolagenase yang digunakan adalah prototipe MMP-1 (E200A). Pada
perbedaan substrat ini kolagenase mempunyai aktifitas yang tinggi pada kolagen
dibandingkan dengan gelatin, sehingga ini membuktikan bahwa kolagenase lebih
efektif bekerja pada kolagen yang belum terdenaturasi. Kolagenase dapat
memecah tripolipeptida walaupun pada suhu tubuh 37 oC bahkan 100C dan 40C
walaupun lebih sedikit kolagen yang terpecah.
Kolagenase disintesis sebagai pre-proenzim dan disekresikan sebagai
proenzim yang inaktif yang mengandung propeptida, domain katalitik, bagian
yang kaya akan prolin dan domain C-terminal hemopexin (Hpx).

Clark &

Cawston (1989) pertama kali melaporkan pemecahan triple-helix kolagen oleh
MMP-1 (kolagenase 1) yang membutuhkan domain C-terminal Hpx (hemopexin).
Domain katalitik dalam keadaan sendiri masih memiliki aktivitas proteolitik pada

7

peptida dan protein non kolagen tetapi tidak dapat memecah kolagen (Clark &
Cawston, 1989).

Tabel 1. Karakteristik kolagenase dari beberapa bakteri
Sumber

Berat
Molekul
(kDa)

pH
optimum

Suhu
Optimum

(0C)

Bacillus
licheniformis
N22
Bacillus subtilis
CN2

120 dan
29

Bacillus cereus
MBL13

38

7 – 8,5

50

Bacillus subtilis
FS-2

125

9

50

Bacillus sp.
MO-1

210 dan 9
105

70-75

Bacillus
pumilus COI-J
Alicyclobacillus
sendaiensis
Strain NTAP-1
Pseudomonas
sp
Streptomyces
parvulus
Streptomyces
sp. strain 3B
Streptomyces
exfoliaus CFS
1068
Thermoactinom
yces sp. 21E

58,64

7,5

45

37

3,9

60

45

7,4

45

52

9

37

Streptomyces
sp. A8

75

Ion
logam
sebagai
aktivator

Ion
logam
sebagai
inhibitor

Literatur

Asdornnithee et al.

14-30

116 dan 7,5
97
14,5
7

37

50

70-75

9-9,5

Ca2+,
Zn2+ dan
Mg2+

Ca2+ dan
Mg2+

70

Ca2+ dan
Mg 2+

Cu2+

(1994)
Tran &
Nagano
(2004)
Liu et al.
(2010)

Hiroko &
Kim
(1999)
Okamoto
et al.
(2001)
2+
Mn dan Wu et al.
Pb2+
(2010)
Tsuruoka
et al.
(2003)
Hisano et
al (1989)
Sakurai et
al. (2009)
Petrova et
al . (2006a)
Jain &
Jain
(2010)
Petrova et
al .
(2006b)
2+
Pb ,
ChakraborAg2+,
ty &
Cu2+ dan Chandra
Zn2+
(1986)

8

Menurut Chung et al. (2004) domain k