Kloning Dua Kandidat Gen yang Terlibat Dalam Biosintesis Magnetosom pada Magnetospirillum magneticum AMB-1 di Escherichia coli

KLONING DUA KANDIDAT GEN YANG TERLIBAT
DALAM BIOSINTESIS MAGNETOSOM PADA
Magnetospirillum magneticum AMB-1 DI Escherichia coli

YONATAN BANOET

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

ABSTRAK
YONATAN BANOET. Kloning Dua Kandidat Gen yang Terlibat dalam Biosintesis
Magnetosom pada Magnetospirillum magneticum AMB-1 di Esherichia coli. Dibimbing
oleh ARIS TRI WAHYUDI dan UTUT WIDYASTUTI.
Magnetospirillum magneticum AMB-1 adalah salah satu strain bakteri magnet
yang mampu mensintesis magnetosom. Magnetosom pada M. magneticum AMB-1
merupakan partikel magnetit berukuran nano yang diselimuti membran, dan mampu
memberikan kemampuan magneto-aerotaksis pada bakteri magnet. Pembentukan
magnetosom pada sel bakteri magnet dikontrol secara genetik. Sampai saat ini telah

diketahui setidaknya ada 36 gen yang terlibat dalam biosintesis magnetosom, dua open
reading frame (ORF) diantaranya adalah ORF 14 dan ORF 38.0. Kedua ORF tersebut
dalam penelitian ini dianalisis secara bioinformatika dan diintroduksikan kedalam sel E.
coli DH5α menggunakan vektor kloning pGEMT-Easy.
Hasil analisis bioinformatika untuk ORF 14 menunjukkan bahwa gen tersebut
mengkode protein yang memiliki homologi sebesar 90% dengan domain GGDEF pada
Magnetospirillum magnetotacticum MS-1. Sedangkan hasil analisis bioinformatika untuk
ORF 38 menunjukkan bahwa gen tersebut memiliki homologi sebesar 70% dengan 6hydroxynicotinate reductase pada Bradyrhizobium sp. BTAi1. Verifikasi hasil kloning
kedua ORF dilakukan melalui pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim
restriksi EcoRI, NdeI, dan BamHI; serta PCR koloni. Verifikasi hasil kloning membuktikan
bahwa kedua ORF telah berhasil diintroduksi ke dalam sel E. coli DH5α.

ABSTRACT
YONATAN BANOET. The Cloning of Two Candidate Genes that Involved in
Magnetosomes Biosynthesizes of Magnetospirillum magneticum AMB-1 to Escherichia
coli. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and UTUT WIDYASTUTI.
Magnetospirillum magneticum AMB-1 is a magnetotactic bacterium that
synthesizes nanoscale magnetites particles enveloped by membrane, called as
magnetosomes. Magnetosomes are membranous bacterial organelles that allow magnetoaerotaxis in magnetotactic bacteria. The formation of magnetosomes in magnetotactic
bacteria was genetically controlled. There are 36 genes from the genome of M. magneticum

AMB-1 that involved in magnetosomes formation, two open reading frames from those
genes referred to ORF 14 and ORF 38.0. Here in, bioinformatics analysis was done to
analyze ORF 14 and ORF 38.0. These genes were amplified by polymerase chain reaction
and cloned in Escherichia coli DH5α using pGEMT-Easy as a Cloning Vector System.
Bioinformatics analysis of ORF 14 showed that this gene codes the protein which
has 90% homology with the GGDEF domain in Magnetospirillum magnetotacticum MS-1.
Meanwhile, bioinformatics analysis of ORF 38.0 showed that this gene codes the protein
which has 70% homology with 6-hydroxynicotinate reductase in Bradyrhizobium sp.
BTAi1. Verification for the cloned genes was done by colony PCR and digestion of
recombinant plasmid with EcoRI, NdeI, and BamHI. These steps showed that ORF 14 and
ORF 38.0 have already been cloned to E. coli DH5α.

KLONING DUA KANDIDAT GEN YANG TERLIBAT
DALAM BIOSINTESIS MAGNETOSOM PADA
Magnetospirillum magneticum AMB-1 DI Escherichia coli

YONATAN BANOET

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains
Pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Judul

Nama
NIM

: Kloning Dua Kandidat Gen yang Terlibat Dalam Biosintesis
Magnetosom pada Magnetospirillum magneticum AMB-1 di
Escherichia coli.
: Yonatan Banoet
: G34104069

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si.
M.Si
NIP 131957319

Dr. Utut Widyastuti,
NIP 131851279

Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806

Tanggal lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas kasih
dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian yang
dilaporkan dalam karya ilmiah ini dilakukan mulai Februari 2008 sampai dengan Juli 2008,
di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M. Si dan Dr. Utut
Widyastuti atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan. Demikian pula kepada Dr.
Dedy Duryadi S., DEA sebagai wakil komisi pendidikan atas saran dan masukan yang
diberikan. Terima kasih kepada Rika Indri Astuti, M. Si dan Ari Sulistiowati, M. Si di
Laboratorium Mikrobiologi, juga kepada Muzuni, M. Si di Laboratorium BIORIN PAU
atas bantuan, saran, dan budi baiknya selama penulis menjalankan penelitian ini. Terima
kasih kepada keluarga untuk dukungan dan semangat yang telah diberikan sampai saat ini.
Terima kasih juga kepada teman-teman di Asrama Mahasiswa IPB Ekasari atas tawa dan
hiburan yang selalu ada, dan kepada teman-teman Biologi 41 tercinta atas bantuan, senyum,
dan perhatiannya. Semoga skripsi ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2009

Yonatan Banoet

RIWAYAT HIDUP
Penulis diahirkan di Denpasar, Bali tanggal 23 Juli 1986, dari ayah Nahor Banoet
dan Ibu Wiwi Kartiwi. Penulis adalah anak kedua dari dua bersaudara. Penulis lulus SD
tahun 1998 dan lulus dari SLTP tahun 2001. Tahun 2004 penulis lulus dari SMAN 1 Bekasi
dan pada tahun yang sama diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, melalui jalur SPMB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
Mikrobiologi Dasar, Genetika Dasar, Pengantar Genetika Molekuler, Fisiologi Tumbuhan,
dan Fisiologi Hewan selama tahun ajaran 2007/2008. Penulis melaksanakan kegiatan
Praktik Lapang di Rumah Sakit Immanuel, Bandung pada tahun 2007.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .......................................................................................................................
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................................................
PENDAHULUAN

Latar Belakang .................................................................................................................
Tujuan ..............................................................................................................................

vi
vi
vi
1
1

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat ...........................................................................................................
1
Bahan ...............................................................................................................................
1
Metode
Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan 38.0 ...............................................
2
Amplifikasi ORF 14 dan 38.0 ...............................................................................
2
Kloning ORF 14 dan 38.0 ke dalam Sel E. coli DH5α .........................................

2
Verifikasi Hasil Kloning ORF 14 dan 38.0 ..........................................................
3
HASIL
Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan 38.0 ..........................................................
5
Amplifikasi ORF 14 dan 38.0 ..........................................................................................
5
Kloning ORF 14 dan 38.0 ke dalam Sel E. coli DH5α ....................................................
5
Verifikasi Hasil Kloning ORF 14 dan 38.0 ......................................................................
6
PEMBAHASAN .........................................................................................................................
7
SIMPULAN ................................................................................................................................
9
SARAN .......................................................................................................................................
9
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................
9

LAMPIRAN................................................................................................................................... 10

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil analisis bioinformatika sekuen ORF 14 dan ORF 38.0 ..................................................

5

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Skema proses konstruksi plasmid rekombinan pGEMT-14 dan pGEMT-38.0,
dan kloning kedua ORF ke dalam sel E. coli DH5α...............................................................
2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan program ScanProsite .........................................
3 Elektroforesis gel agarosa DNA hasil amplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0 .............................
4 Koloni putih E. coli DH5α yang membawa plasmid rekombinan ...........................................
5 Elektroforesis gel agarosa DNA hasil verifikasi kloning ORF 14 dan 38.0
ke dalam E. coli DH5α ............................................................................................................

4
6

6
6
7

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Peta keseluruhan genom M. magneticum AMB-1 ................................................................... 11
2 Peta plasmid pGEMT-Easy (Promega) ................................................................................... 12
3 Penempelan primer spesifik ORF 14 dan 38.0............................................................................ 13

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelompok bakteri magnet merupakan
bakteri gram negatif dan termasuk ke
dalam grup α-proteobakteria (Burgess et
al. 2007).
Bakteri magnet memiliki
habitat di perairan tawar dan laut.
Kelompok bakteri magnet memilih
lingkungan mikroaerofilik atau anaerob

seperti
sedimen
dan
memiliki
ketergantungan terhadap unsur-unsur
mineral dalam perairan, terutama terhadap
besi (Schuler & Baeurlein 1998).
Bakteri magnet memiliki kemampuan
untuk merespon medan magnet dan
cenderung bermigrasi sepanjang garis
bidang magnet bumi (Blakemore 1975).
Hal ini dikarenakan kemampuan kelompok
bakteri tersebut mensintesis magnetosom.
Magnetosom merupakan partikel magnetit
(Fe3O4) atau greigit (Fe3S4), dan dilapisi
membran fesikel yang berasal dari
invaginasi membran sitoplasma (Gorby et
al. 1998, Komeili et al. 2006). Umumnya
magnetosom tersusun berantai dalam sel,
terdiri dari 15 sampai 20 partikel magnet
berukuran antara 20 hingga 50 nm.
Magnetosom berperan seperti jarum
kompas yang mengorientasikan bakteri
magnet pada medan magnet bumi,
sehingga bakteri magnet dapat memilih
lingkungan mikroaerofilik yang menjadi
habitatnya (Bazylinski & Frankel 2004,
Smith et al. 2006).
Salah satu strain bakteri magnet yang
sering dijadikan model dalam biosintesis
magnetosom adalah Magnetospirillum
magneticum AMB-1. Strain tersebut
bersifat anaerob fakultatif, mampu tumbuh
dalam kondisi aerob, namun tidak dapat
mensintesis magnetosom. Strain tersebut
juga mudah dikulturkan di laboratorium
(Matsunaga et al. 1991). Partikel
magnetosom dalam sel M. magneticum
AMB-1 berupa magnet magnetit (Fe3O4)
dan tersusun berbentuk rantai memanjang
searah panjang sel (Wahyudi et al. 2003).
Matsunaga et al. (2005) telah
mensekuen keseluruhan DNA genom M.
magneticum AMB-1. Ukuran genom total
M. Magneticum AMB-1 adalah 4. 9 Mb.
Berdasarkan studi genetik terhadap
pembentukan magnetosom pada M.
magneticum AMB-1 melalui mutagenesis
menggunakan transposon, setidaknya ada
36 gen yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom dan tersebar pada genom

bakteri tersebut (Lampiran 1). Dua open
reading frame (ORF) diantaranya telah
diketahui terlibat dalam biosintesis
magnetosom
melalui
mutagenesis
menggunakan transposon adalah ORF 14
dan ORF 38.0 (Wahyudi 2004a).
Penelitian ini menggunakan sekuen
ORF 14 dan 38.0 yang terdapat pada Gen
Bank
untuk
dianalisis
secara
bioinformatika.
Kedua
ORF
akan
diintroduksikan ke dalam sel Esherichia
coli DH5α menggunakan vektor kloning
pGEMT-Easy. Kloning molekuler yang
dilakukan dalam penelitian ini akan
berguna dalam telaah lanjutan mengenai
peranan kedua ORF dalam biosintesis
magnetosom pada M. magneticum AMB1.
Biosintesis magnetosom pada bakteri
merupakan proses kompleks yang
diregulasi secara genetik. Sampai saat ini
mekanisme
dalam
pembentukan
magnetosom belum dapat dipahami
sepenuhnya (Grünberg 2001, Wahyudi
2004b). Sehingga diperlukan telaah
molekuler
seperti
isolasi,
kloning
molekuler, dan karakterisasi tiap gen yang
terlibat biosintesis magnetosom.
Tujuan
Melakukan analisis bioinformatika dan
melakukan kloning molekuler terhadap
dua ORF yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Febuari hingga Juli 2008 di Laboratorium
Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan
yang
digunakan
dalam
penelitian ini adalah genom M.
magneticum AMB-1, sekuen ORF 14
(gene id: amb0759) dan ORF 38.0 (gene
id: amb1482), galur Escherichia coli
DH5α, media Luria Agar (LA) (NaCl 10
g/L, Bacto Trypton 10 g/L, Yeast extract 5
g/L dan Bacto Agar 15 g/L) dan Luria
Broth (LB), ampisilin (5 mg/ml), pGEMTEasy (Promega) (Lampiran 2), gel agarosa,
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Dgalactopyranoside
(X-gal),
KIT-

2

Polymerase Chain Reaction (PCR)
(TAKARA La Taq), primer spesifik
(forward dan reverse) yang didesain
berdasarkan sekuen ORF 14 dan 38.0,
Geneaid Gel/PCR Fragments Extraction
Kit, bufer transformasi (0.1 M CaCl2, 5
mM MgCl2, 5mM Tris-Cl pada pH 7),
enzim restriksi EcoRI, NdeI dan BamHI
(Promega). Alat-alat yang digunakan
dalam penelitian ini adalah mesin
sentrifuse (Jouan A14), mesin PCR 2400
(Perkin-Elmer), piranti elektroforesis
(BioRad), dan peralatan yang umum
digunakan di laboratorium mikrobiologi.
Metode
Analisis Bioinformatika Sekuen
ORF 14 dan ORF 38.0. Analisis
bioinformatika sekuen ORF 14 (gene id:
amb0759) dan ORF 38.0 (gene id:
amb1482) menggunakan program Bioedit,
ScanProsite yang tersedia di situs
www.expasy.org, dan BLASTX yang
tersedia di situs www.ncbi.nlm.nih.gov.
Amplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0
dengan Polymerase chain reaction.
Amplifikasi ORF 14 (1059 bp) dan ORF
38.0 (1482 bp) dilakukan dengan
mencampurkan berturut-turut 1.25 µl
ddH2O, 12.5 µl bufer PCR GC II, 4 µl (2.5
mM) dNTPs, 0.25 µl (5 unit/µl) enzim LA
Taq DNA Polymerase, 1 µl (10 pmol)
primer spesifik (forward dan reverse)
masing-masing ORF, dan 5 µl (0.5 µg)
DNA template. Sekuen primer spesifik
ORF 14 yaitu forward: GGG GGA CAT
ATG AAG AGT CCG GAT ACC;
reverse: GGG GGA TCC AAA CTA TTT
CGC CGC TTC GCC. Sedangkan sekuen
primer spesifik ORF 38.0 yaitu forward:
GGG GGA CAT ATG AGC GAC GTC
GTC GAA; reverse: GGG GGA TCC
AAA TCA CGT GTC GTC CCC CCA.
Sekuen kedua primer yang digunakan
dalam penelitian ini memiliki situs
restriksi enzim NdeI (forward, terlihat
pada basa yang digarisbawahi) dan BamHI
(reverse, terlihat pada basa yang digaris
bawahi) (Lampiran 3).
Tahap awal dalam reaksi PCR adalah
pradenaturasi pada suhu 95 0C selama 2
menit. Selanjutnya reaksi PCR dilakukan
sebanyak 30 siklus, tiap siklus terdiri dari
tahap denaturasi, annealing, dan elongasi.
Denaturasi kedua DNA dilakukan pada
suhu 950C selama 2 menit, annealing pada

suhu 580C selama 1 menit, dan elongasi
pada suhu 720C selama 1 menit. Tahap
terakhir dilakukan pada suhu 720C selama
10 menit.
Produk PCR dielektroforesis pada gel
agarosa 1% (b/v). Proses selanjutnya
adalah purifikasi produk PCR dari gel
agarosa menggunakan PCR Fragments
Extraction
Kit
(Geneaid).
Setelah
dielektroforesis, gel berisi pita DNA hasil
PCR dipotong dan dimasukkan ke dalam
tabung mikro 1.5 ml. Kemudian, ke dalam
tabung tersebut ditambahkan 500 µl DF
Buffer, lalu diinkubasi pada suhu 600C
selama 10 menit. Setelah gel larut, tabung
mikro diinkubasikan hingga suhunya sama
dengan suhu ruang. Pengikatan DNA
dilakukan dengan memasukkan campuran
gel ke dalam tabung penampung yang
dilengkapi DFkolom. Selanjutnya tabung
penampung disentrifugasi pada kecepatan
13000 rpm selama 30 detik. Cairan yang
tertampung dibuang, kemudian DFkolom
dimasukkan kembali ke dalam tabung
penampung. Proses pencucian dilakukan
dengan menambahkan 600 µl Wash Buffer
pada DFkolom dan disentrifugasi pada
kecepatan 13000 rpm selama 30 detik.
Cairan
yang
tertampung
dibuang,
kemudian Dfkolom dikembalikan ke
tabung penampung dan disentrifugasi
selama 3 menit untuk mengeringkan
membran pada DFkolom. DFkolom
dipindahkan ke tabung mikro steril, lalu 30
µl Elution Buffer ditambahkan di tengahtengah membran Dfkolom, untuk proses
elusi. Kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 2 menit dan disentrifugasi
selama 1 menit pada kecepatan 13000
rpm. DFkolom dibuang dan DNA yang
tertampung disimpan pada suhu -200C.
Kloning ORF 14 dan ORF 38.0 ke
dalam sel E. coli DH5α. Amplikon hasil
purifikasi diligasi ke dalam vektor kloning
pGEMT-Easy. Ligasi ORF 14 ke plasmid
pGEMT-Easy
dilakukan
dengan
mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x
Rapid Ligation Buffer (Promega), 0.53 µl
(53 ng) DNA sisipan, 1 µl (3 Weiss
Unit/µl) enzim T4 DNA ligase (Promega),
1 µl (50 ng) vektor kloning pGEMT-Easy
(Promega).
Campuran
kemudian
dilarutkan dengan ddH2O hingga volume
reaksi 10 µl. Ligasi ORF 38.0 ke plasmid
pGEMTEasy
dilakukan
dengan
mencampurkan berturut-turut 5 µl 2x
Rapid Ligation Buffer, 0.71 µl (80 ng)

3

DNA sisipan, 1 µl (3 Weiss Unit/µl) enzim
T4 DNA ligase, dan 1 µl (50 ng) vektor
kloning
pGEMT-Easy.
Campuran
kemudian dilarutkan dengan ddH2O
hingga volume reaksi 10 µl. Inkubasi
dilakukan pada suhu 15 0C selama 12 jam.
Ligasi ORF 14 dan ORF 38.0 ke dalam
pGEMT-Easy akan menghasilkan plasmid
rekombinan
pGEMT-Easy-14
dan
pGEMT-Easy-38.0 (Gambar1). Plasmid
rekombinan kemudian diintroduksikan
kedalam sel E. coli DH5α (Gambar 1)
menggunakan metode kejutan panas
(Sambrook & Russel 1989).
Tahap awal dalam introduksi kedua
plasmid rekombinan ke dalam sel E. coli
DH5α adalah pembuatan sel kompeten
(Sambrook & Russel 1989). Satu koloni E.
coli DH5α dikulturkan kedalam 2 ml
media LB, lalu diinkubasi pada suhu 37 0C
dan kecepatan 100 rpm selama 16 jam.
Setelah 16 jam, 0.5 ml kultur dipindahkan
ke dalam 50 ml media LB, dan diinkubasi
selama 3 jam pada suhu 37 0C dan
kecepatan 100 rpm. Sebanyak 1.5 ml
kultur dipindahkan kedalam tabung mikro
steril dan disentrifugasi pada kecepatan
3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang
didapat kemudian diresuspensi dengan 1
ml bufer transformasi (0.1 M CaCl2, 5 mM
MgCl2, 5mM Tris-Cl pada pH 7) dingin
lalu diinkubasi dalam es selama 20 menit,
dan disentrifugasi kembali pada kecepatan
3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang
didapatkan kemudian diresuspensi dengan
250 µl bufer transformasi dingin selama
10 menit. Setelah diinkubasi dalam es, sel
E. coli DH5α telah kompeten dan siap
diintroduksi dengan plasmid rekombinan.
Sebanyak 250 µl sel E. coli yang telah
dibuat kompeten dicampurkan dengan 10
µl plasmid rekombinan dan diinkubasi
pada suhu 420C selama 45 detik, kemudian
diinkubasikan kembali dalam es selama 2
menit. 100 µl media LB ditambahkan
kedalam suspensi dan diinkubasi pada
inkubator bergoyang selama 24 jam pada
Suspensi
selanjutnya
suhu
370C.
disentrifugasi pada 8000 rpm selama 2
menit, pelet diresuspensi dengan 100 µl
media LB, kemudian sebanyak 100 µl
suspensi disebarkan pada media LA +
Amp 50 µg/ml + X-gal 40 µg/ml.
Verifikasi Hasil Kloning ORF 14 dan
ORF 38.0. Verifikasi dilakukan untuk
memastikan bahwa koloni putih E. coli
DH5α yang tumbuh pada media LA

diduga membawa plasmid rekombinan
pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0.
Verifikasi dilakukan dengan pemotongan
plasmid rekombinan menggunakan enzim
restriksi EcoRI (5‘ G–A–A–T–T–C 3‘),
BamHI (5; G–G–A–T–C–C 3‘), dan NdeI
(5‘ C–A–T–A–T–G 3‘) (Promega), dan
PCR koloni menggunakan primer spesifik
untuk mengamplifikasi kedua ORF.
Isolasi
plasmid
rekombinan
menggunakan metode Sambrook & Russel
(1989) dilakukan dengan mengkulturkan
koloni putih yang tumbuh ke dalam 10 ml
media LB, lalu diinkubasi pada suhu 37 0C
dan kecepatan 100 rpm selama 16 jam. 1,5
ml kultur sel E. coli DH5α disentrifugasi
pada kecepatan 5000 rpm selama 2 menit,
pelet diresuspensi dengan 100 µl larutan A
(glukosa 50 mM, Tris-Cl 25 mM pH 8 dan
ethylenediamintetra-acetic acid [EDTA]
10 mM pH 8), lalu ditambahkan 150 µl
larutan B (sodium dodecyl sulfat [SDS]
1% dan NaOH 0.2 N) untuk melisis sel,
dan 200 µl larutan C (kalium asetat 5M
dan asam asetat glasial pada pH 6),
kemudian disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit. Presipitasi
plasmid dilakukan menggunakan etanol
absolut (2 kali volume) dan sodium asetat
3 M (10% volume total), dan diinkubasi
selama 12 jam pada suhu -20 0C,
kemudian disentrifugasi pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit. Pelet dibilas
dengan 1 ml etanol 70 %, kemudian
dikeringudarakan selama 3 jam. Plasmid
rekombinan diresuspensi dalam 20 µl
ddH2O, lalu ditambahkan 0.2 µl RNase 1%
(b/v). Verifikasi pertama kali dilakukan
dengan pemotongan plasmid rekombinan
menggunakan enzim restriksi EcoRI.
Sebanyak 3 µl (± 120 ng) plasmid
rekombinan hasil isolasi ditambahkan 2 µl
bufer H (Promega), 0.2 µl Bouvine serum
albumin (BSA) (Promega), 0.5 µl (6 unit)
EcoRI (Promega) dan ddH2O hingga
volume reaksi 20 µl. Campuran reaksi
kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C
selama 12 jam. ORF 14 memiliki situs
restriksi untuk EcoRI pada basa ke 776,
sehingga pemotongan plasmid rekombinan
pGEMT-Easy-14 akan menghasilkan 3
pita DNA berukuran 3 kb (pGEMT-Easy),
pita sekitar 0.8 kb, dan 0.3 kb (ORF 14).
Sedangkan
pemotongan
plasmid
rekombinan pGEMT-Easy-38.0 hanya
akan menghasilkan 2 pita DNA berukuran
3 kb (pGEMT-Easy) dan pita sekitar 1.5
kb (ORF 38.0).

4

Amplikon ORF 14 (1059 pb)

Amplikon ORF 38.0 (1482 pb)

NdeI

NdeI

BamHI

XmnI2009
Nae 2707

ScaI 1890

Amp  

BamHI

XmnI2009
ScaI 1890

Nae 2707

r

lacZ 

Amp

ORI

lacZ 

ORI 

XmnI2009
ScaI 1890

r

Nae 2707

pGEMT-Easy-14
r
Amp   (4.1 kb)
lacZ 

TRANSFORMASI

E. coli DH5α yang membawa
plasmid rekombinan pGEMTEasy-14

XmnI2009
ScaI 1890

Nae 2707

pGEMT-Easy-38.0
(4.5 kb)
lacZr
Amp
lacZ 

TRANSFORMASI

E. coli DH5α yang membawa
plasmid rekombinan pGEMTEasy-38.0

Gambar 1. Skema konstruksi plasmid rekombinan pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0,
dan kloning kedua ORF ke dalam sel E. coli DH5α.

5

Plasmid rekombinan (pGEMT-Easy-14
dan pGEMT-Easy-38.0) yang telah
diverifikasi menggunakan enzim restriksi
EcoRI,
kemudian
dipilh
untuk
pemotongan menggunakan enzim restriksi
BamHI dan NdeI (Promega) yang situs
restriksinya terdapat pada primer spesifik
kedua ORF. Sebanyak 3 µl (± 160 ng)
plasmid rekombinan ditambahkan 2 µl
bufer D (Promega), 0.2 µl BSA
(Promega), 0.5 (5 unit) µl BamHI, 0.5 µl
(5 unit) NdeI dan ddH2O hingga volume
reaksi 20 µl. Campuran reaksi kemudian
diinkubasi pada suhu 37 0C selama 12 jam.
PCR koloni menggunakan primer
spesifik ORF 14 dan ORF 38.0 dilakukan
untuk memastikan bahwa DNA sisipan
adalah benar-benar ORF 14 dan ORF 38.0.
Koloni putih E. coli DH5α yang telah
diverifikasi menggunakan enzim restriksi
EcoRI, BamHI, dan NdeI kemudian
disuspensikan kedalam 25 µl ddH2O dan
dipanaskan pada suhu 95 0C selama 2
menit, 2.5 µl suspensi ditambahkan
kedalam 22.5 µl reaksi PCR. Komposisi
reaksi dan kondisi PCR dalam verifikasi
sama dengan kondisi PCR yang digunakan
untuk mengamplifikasi kedua ORF
tersebut diatas. Visualisasi hasil restriksi
dan PCR koloni dengan elektroforesis
menggunakan gel agarosa 0.7% (b/v).
HASIL
Hasil Analisis Bioinformatika Sekuen
ORF 14 dan ORF 38.0. Hasil analisis
bioinformatika menggunakan program
BLASTX NCBI untuk ORF 14
menunjukkan
sekuen
tersebut
mengkodekan protein yang memiliki
homologi sebesar 90% dengan protein

berdomain
GGDEF
pada
M.
magnetotacticum MS-1, sedangkan ORF
38.0 mengkodekan protein yang memiliki
homologi sebesar 70% dengan 6hydroxynicotinate
reductase
pada
Bradyrhizobium sp. BTAi1 (Tabel 1).
Sekuen asam amino yang dikode ORF 14
berdasarkan analisis program ScanProsite
memiliki ukuran 352 asam amino dan
memiliki satu domain GGDEF (Gambar 2
a). Sekuen asam amino yang dikode ORF
38.0 memiliki ukuran 493 asam amino.
Berdasarkan
analisis
menggunakan
program ScanProsite, protein yang dikode
ORF tersebut adalah protein feredoksin
(2Fe2S) (Gambar 2b).
Amplifikasi ORF 14 dan ORF 38.0.
Visualisasi hasil amplifikasi ORF 14 dan
ORF 38.0 pada gel agarosa 1% (b/v)
menunjukkan pita berukuran sekitar 1.1 kb
untuk ORF 14 dan sekitar 1.5 kb untuk
ORF 38.0 (Gambar 3). Hal ini sesuai
dengan ukuran sebenarnya kedua sekuen
tersebut pada GenBank.
Kloning ORF 14 dan ORF 38.0 ke
dalam sel E. coli DH5α. DNA hasil
amplifikasi telah diligasikan kedalam
vektor kloning pGEMT-Easy (3 kb),
proses ligasi menghasilkan plasmid
rekombinan
pGEMT-Easy-14
dan
pGEMT-Easy-38.0. Plasmid rekombinan
yang
dikonstruksi
telah
berhasil
diintroduksikan ke dalam sel E. coli DH5α
melalui metode kejutan panas (heat
shock). Koloni E. coli DH5α yang
membawa plasmid rekombinan terlihat
berwarna putih pada media LA yang
mengandung ampisilin (50 µg/ml) dan Xgal (40 µg/ml) (Gambar 4).

Tabel 1. Hasil Analisis Bioinformatika Sekuen ORF 14 dan ORF 38.0, diambil tiga hasil
yang terbaik dari analisis menggunakan program BLASTX-NCBI.
ORF
14

38.0

Homologi
GGDEF domain

Identitas
(%)
90

Similiaritas
(%)
95

GGDEF domain

61

76

Diguanylate cyclase

42

61

6-hydroxynicotinate reductase

70

82

Evalue
3e170
2e104
2e66
0.0

5methyltetrahydropteroyltriglut
amate-homocysteine
methyltransferase
6-hydroxynicotinate reductase

66

80

0.0

65

77

9e177

Organisme

No Akses

M. magnetotacticum
MS-1
M. gryphiswaldense
MSR-1
Bradyrhizobium sp.
BTAi1
Bradyrhizobium sp.
BTAi1
Roseobacter sp.
AzwK-3b

ZP_00054
171.2
CAM7560
7.1
YP_00123
9949.1
YP_00123
8498.1
ZP_01901
924.1

Burkholderia
xenovorans LB400

YP_55464
9.1

6

a)

(352 aa)

100 aa

GGDEF: (207-342) APLSLLMIDIDHFKQFNDTYGHQLGDQVLKLVARSLSEVAQAKDTAARYGGEEFAVILPA
TPLEKSMEVAETIRNQVSTKRLTNrrtgqvLGQVTLSIGAALLREAEAPDSLVHRADEAM
YLAKRDGRNRVKSEID
1

b)

2

100 aa

3 4

5

(493aa)
Keterangan:
1. HDG
2. RGG
3. LGG
4. QVI
5. RNY

(103-105) 2Fe2S
(358-361) 2Fe2S
(450-452) 2Fe2S
(462-464) 2Fe2S
(485-487) 2Fe2S

Gambar 2. Hasil analisis bioinformatika menggunakan program ScanProsite. a. Domain GGDEF
yang dikode ORF 14, b. Feredoksin (2Fe2S) yang dikode ORF 38.0.
b
10000

1

2

3

4000
2000
1500
1000
500

ORF 38.0
(sekitar1.5 kb)
ORF 14
(sekitar1.1 kb)

1.5 mm

Gambar 3. Elektroforesis gel agarosa 1 % (b/v)
DNA hasil amplifikasi ORF 14
(lane 2) dan ORF 38.0 (lane 3).
Lane 1: Marker 1 kb DNA Ladder
(Promega).
Verifikasi Hasil Kloning ORF 14 dan ORF
38.0. Pemotongan plasmid rekombinan hasil
isolasi dari beberapa koloni putih E. coli
DH5α yang diduga adalah pGEMT-Easy-14
menggunakan enzim restriksi EcoRI telah
menghasilkan pita berukuran 3 kb yang
menunjukkan ukuran pGEMT-Easy, pita
berukuran sekitar 0.8 kb dan 0.3 kb yang
menunjukkan bahwa ORF 14 (sekitar 1.1 kb)
telah terpotong EcoRI (Gambar 5a).
Visualisasi hasil restriksi plasmid rekombinan
pada lane 2 gel agarosa (Gambar 5a) hanya
memperlihatkan dua pita yaitu pGEMT-Easy
dan fragmen DNA yang tidak sesuai dengan
ukuran ORF 14 jika terpotong EcoRI,
sehingga plasmid rekombinan pada lane 2
bukan pGEMT-Easy-14. Pemotongan plasmid
rekombinan yang diduga adalah pGEMTEasy-38.0 menggunakan enzim restriksi
EcoRI telah menghasilkan pita berukuran 3 kb
yang menunjukkan pGEMT-Easy dan pita

Gambar 4. Koloni putih E. coli DH5α yang
diduga membawa plasmid
rekombinan (ditunjukan oleh
panah merah).

berukuran sekitar 1.5 kb yang menunjukkan
ukuran ORF 38.0 (Gambar 5b). Verifikasi
kedua plasmid rekombinan menggunakan
enzim restriksi NdeI dan BamHI masingmasing menghasilkan dua pita pada gel
agarosa (Gambar 5c). Pita 3 kb (lane 2 &3)
menunjukkan ukuran plasmid pGEMT-Easy,
sedangkan pita berukuran sekitar 1.5 kb (lane
2) menunjukkan ukuran ORF 38.0 dan pita
berukuran sekitar 1.1 kb (lane 3)
menunjukkan ukuran ORF 14. PCR koloni
menggunakan primer spesifik ORF 14 dan
ORF 38.0 menghasilkan pita berukuran
sekitar 1.1 kb untuk ORF 14 dan sekitar 1.5
kb untuk ORF 38.0 (Gambar 5d). Pemotongan
plasmid rekombinan dan PCR koloni yang
dilakukan dalam penelitian ini telah
membuktikan bahwa ORF 14 dan ORF 38.0
dari M. magneticum AMB-1 telah berhasil
diintroduksi ke dalam sel E. coli DH5α.

7

1

2

3

4

5

1

3

4

b

b
pGEMT-Easy
(3 kb)

3000
2000

a)

2

pGEMT-Easy
(3 kb)

3000

1000

Pita 0.8 kb ORF
14

500

Pita 0.3 kb ORF
14

2000

ORF 38.0
(sekitar1.5 kb)

1000

500
Restriksi pGEMT-Easy-14 menggunakan EcoRI. b) Restriksi pGEMT-Easy-38 menggunakan EcoRI.
Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech
Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech
Lane 3, 4, 5: Hasil Restriksi pGEMT-14
Lane 2, 3, 4: Hasil Restriksi pGEMT-38
1

2

3

1

2

3

b
b
pGEMT-Easy
(3 kb)

3000

3000
2000

2000
ORF 38.0
(sekitar 1.5 kb)
ORF 14
(sekitar1.1 kb)

1000

1000

ORF 38.0
(sekitar1.5 kb)
ORF 14
(sekitar 1.1 kb)

500

500
c)

Restriksi pGEMT-Easy-14 dan pGEMT-Easy-38.0 d) PCR koloni dari koloni putih E. coli DH5α
menggunakan NdeI dan BamHI.
Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech
Lane 1: 1 kb DNA Ladder RealBiotech
Lane 2: Amplikon ORF 14
Lane 2: Restriksi pGEMT-38.0
Lane 3: Amplikon ORF 38.0
Lane 3: Restriksi pGEMT-14
Gambar 5. Elektroforesis gel agarosa 0.7 % (b/v) DNA hasil verifikasi kloning ORF 14 dan 38.0
ke dalam E. coli DH5α.
PEMBAHASAN
Berdasarkan sekuen yang terdapat pada
GenBank, ORF 14 memiliki ukuran sebesar
1059 pasang basa (pb), sedangkan ORF 38.0
berukuran 1482 pb. Kedua ORF telah berhasil
diamplifikasi
dalam
penelitian
ini,
elektroforesis gel agarosa menunjukkan pita
DNA berukuran sekitar 1.1 kb untuk amplikon
ORF 14 dan pita DNA berukuran sekitar 1.5
kb untuk amplikon ORF 38.0. Penentuan
ukuran amplikon kedua ORF didasarkan pada
pengamatan visual letak pita DNA terhadap
marker (1 kb DNA Ladder Promega), terdapat
kemungkinan perbedaan ukuran amplikon
kedua ORF dengan ukuran kedua ORF pada

GenBank karena ada penambahan dari primer
yang digunakan.
Analisis menggunakan program BLASTX
NCBI dalam penelitian ini memperlihatkan
sekuen tersebut mengkode protein yang
memiliki homologi dengan protein berdomain
GGDEF pada M. magnetotacticum MS-1. Hal
ini ditunjukkan oleh nilai identitas (90 %)
yang menunjukkan kesamaan sekuen asam
amino dan nilai similiaritas (95 %) yang
menunjukkan kesamaan struktur dan fungsi
protein yang dikode ORF 14 dengan domain
GGDEF. Nilai expectation value (e-value)
menunjukkan jumlah pemasangan yang
kemungkinan terjadi dengan sekuen yang ada
di GenBank. Nilai e-value 0.0 menunjukkan
kesamaan panjang kedua sekuen yang

8

dibandingkan pada analisis BLAST, dan
merupakan nilai terbaik dalam menentukan
homologi suatu sekuen DNA. Analisis
menggunakan program ScanProsite juga
memperlihatkan bahwa sekuen asam amino
yang dikode ORF 14 mengkonservasi domain
GGDEF pada asam amino ke-207 hingga
asam amino ke-342, dan memiliki motif
GGD/EF pada sekuen asam aminonya.
Domain GGDEF berperan dalam sistem
transduksi sinyal bakteri. Secara fungsional,
domain GGDEF dalam sistem transduksi
sinyal sama seperti situs katalisis pada
adenilat siklase dan DNA polimerase, yaitu
mengkatalisis pembentukan ikatan 3’-5’
fosfodiester. Domain GGDEF pada sel
prokariot mengkatalisis pembentukan molekul
c-diGMP dari dua molekul GTP (Chan et al
2004). c-diGMP merupakan molekul yang
berfungsi sebagai second messenger pada sel
prokariot (D’Argenio & Miller 2004).
Biosintesis
magnetosom
memerlukan
kespesifikan lingkungan seperti kondisi
mikroaerofilik
dan
ketersediaan
besi
(Fe3+/Fe2+) (Wahyudi 2004b). Domain
GGDEF pada bakteri magnet kemungkinan
terlibat dalam merespon kondisi lingkungan
seperti konsentrasi oksigen. Domain-domain
yang terlibat dalam regulasi dan transduksi
sinyal seperti GGDEF, EAL, HD-GYP, dan
CheY pada M. magneticum AMB-1 berada
dalam jumlah berlebihan dibandingkan
dengan kelompok bakteri yang hidup bebas
lainnya. Domain-domain tersebut terlibat
dalam regulasi biosintesis magnetosom dan
kemotaksis seperti merespon konsentrasi
oksigen dan besi di lingkungan, juga berperan
dalam magnetotaksis (Matsunaga et al. 2005).
ORF 14 sebelumnya telah diidentifikasi
Wahyudi (2004a) melalui mutagenesis
menggunakan
transposon.
Penyisipan
transposon pada ORF 14 menyebabkan
ekspresi gen tersebut menghasilkan domain
GGDEF
tidak
berlangsung,
sehingga
pembentukan c-diGMP yang merupakan
second messenger pada sistem transduksi
sinyal tidak terjadi. Hal tersebut menyebabkan
sel M. magneticum AMB-1 tidak dapat
mensintesis magnetosom.
Analisis menggunakan program BLASTX
NCBI memperlihatkan sekuen ORF 38.0
mengkode protein yang memiliki homologi
dengan 6-hidroxynicotinate reductase pada
Bradyrhizobium sp BTAi1 dengan nilai evalue mencapai 0.0. 6-hydroxynicotinate
reductase merupakan protein yang memiliki
feredoksin dan berperan pada sistem transfer
elektron (Alhapel 2006). Berdasarkan analisis

menggunakan program ScanProsite, sekuen
asam amino yang dikode ORF 38.0 memiliki
2Fe2S feredoksin.
Enzim ini berperan dalam proses
katabolisme nicotinate adenin dinucleotide
(NAD+) pada kondisi mikroaerofilik dengan
mereduksi
6-hydroxynicotinate
menjadi
1,4,5,6-tetrahydroxy-6-oxonicotinate.
dilakukan
untuk
Metabolisme
NAD+
mensuplai kebutuhan sel akan nitrogen,
karbon, dan energi (Alhapel 2006).
Kemampuan magneto-aerotaksis pada
bakteri magnet membutuhkan regulasi yang
kompleks dan kebutuhan energi yang besar.
Sel bakteri magnet harus mensintesis
magnetosom, mampu merespon medan
magnet bumi menggunakan magnetosom,
mendeteksi perubahan konsentrasi oksigen,
mengirimkan seluruh informasi tesebut ke
flagela dan menggerakkan flagela sehingga
bakteri magnet dapat memilih lingkungan
mikroaerofilik untuk pertumbuhan yang
optimal (Matsunaga et al 2005).
ORF 14 dan ORF 38.0 dalam penelitian ini
berhasil diamplifikasi dan diintroduksi ke
dalam sel E. coli DH5α menggunakan vektor
kloning pGEMT-Easy. Kloning molekuler
kedalam sel E. coli DH5α dilakukan dengan
tujuan membentuk klon, sehingga DNA
rekombinan (pGEMT-Easy-14 & pGEMTEasy-38.0) yang membawa kedua ORF dapat
diperbanyak dan disimpan dalam keadaan
stabil untuk jangka waktu yang panjang
(Dawson et al. 1996).
Seleksi sel E. coli DH5α yang membawa
plasmid rekombinan dapat dilakukan karena
vektor pGEMT-Easy memiliki gen resisten
ampisilin, sehingga koloni yang tumbuh pada
media LA mengandung ampisilin adalah
koloni yang membawa vektor pGEMT-Easy.
Multicloning site (MCS) pada pGEMT-Easy
berada pada gen lacZ. Penyisipan ORF 14
atau ORF 38.0 pada gen lacZ menyebabkan
tidak adanya α-komplementasi antara plasmid
rekombinan dan sel inang dalam pembentukan
enzim β-galactosidase. Hal ini menyebabkan
senyawa X-gal yang terdapat pada media LA
tidak dapat dipecah. Pemecahan senyawa Xgal akan mengubah koloni E. coli DH5α yang
membawa plasmid nonrekombinan menjadi
biru (Turner et al. 1997), sedangkan koloni
putih adalah E. coli DH5α yang diduga
membawa plasmid rekombinan (pGEMTEasy-14 atau pGEMT-Easy-38.0).
Kloning molekuler ORF 14 dan 38.0 yang
telah dilakukan dalam penelitian ini
merupakan suatu tahap awal untuk melakukan
telaah molekuler dan fisiologis yang lebih

9

mendalam terhadap peranan kedua ORF
terebut dalam biosintesis magnetosom pada
M. magneticum AMB-1.
SIMPULAN
Analisis bioinformatika menunjukkan
ORF 14 mengkode protein yang memiliki
homologi sebesar 90% dengan domain
GGDEF pada M. magnetotacticum MS-1.
Sedangkan ORF 38.0 mengkode protein yang
memiliki homologi sebesar 70% dengan 6hidroxynicotinate
reductase
pada
Bradyrhizobium sp. BTAi1. Kedua ORF telah
berhasil diamplifikasi menggunakan primer
spesifik berdasarkan sekuen dua ORF yang
digunakan dalam penelitian ini, dan berhasil
diintroduksi ke dalam sel E. coli DH5α
menggunakan vektor kloning pGEMT-Easy.
SARAN
Ekspresi ORF 14 dan ORF 38.0 perlu
dilakukan untuk mengkarakterisasi protein
yang dikodekan kedua ORF tersebut. Hal ini
akan berguna dalam mempelajari peranan
ORF 14 dan ORF 38.0 dalam biosintesis
magnetosom pada M. magneticum AMB-1.
DAFTAR PUSTAKA
Alhapel A et al. 2006. Molecular and
functional
analysis
of
nicotinate
catabolism in Eubacterium barkeri. Proc
Natl Acad Sci 103: 12341-12346.
Bazylinski DA, Frankel RB. 2004.
Magnetosom formation in prokaryotes.
Nat Rev Microbiol 2: 217-230.
Blakemore RP. 1975. Magnetotactic bacteria.
Science 190:377-379.
Burgess JG, Kawaguchi R, Sakaguchi T,
Thornhill RH, Matsunaga T. 2007.
Evolutionary
Relationships
among
Magnetospirillum Strains Inferred from
Phylogenetic
Analysis
of
16S
rDNASequences. J Bacteriol 175: 66896694.
Chan et al. 2004. Structural basis of activity
and allosteric control of diguanylate
cyclase. Proc Natl Acad Sci 101:1708417089.
D’Argenio DA, Miller SI. 2004. Cyclic diGMP as a bacterial second messenger.
Microbiology 150: 2497-2502.
Dawson MT, Powell R, Gannon F. 1996.
Gene Technology. Graham JM, Bilington
D, Gilmartin PM, editor. Oxford: BIOS
Scientific Publ. Ltd. hlm 91-95.

Gorby YA, Beveridge TJ, Blakemore RP.
1998. Characterization of bacterial
magnetosome membrane. J Bacteriol
170:834-841.
Grünberg K, Wawer C, Tebo M B, Schuler D.
2001. A large gene cluster encoding
several
magnetosome
proteins
is
conserved in different species of
magnetotactic bacteria. Appl Environ
Microbiol 67: 4573-4582.
Komeili A, Li Z, Newman DK, Jensen GJ.
2006. Magnetosome are cell membrane
invaginations organized by the actin-like
protein Mam. Nature 311:342-343.
Matsunaga T, Sakaguchi T, Todokoro F.
1991. Magnetite formation by a magnetic
bacterium capable of growing aerobically.
Appl Microbiol Biotechnol 35:651-655.
Matsunaga et al. 2005. Complete genome
sequence of the falcutative anaerobic
magnetotactic bacterium Magnetispirillum
sp. strain AMB-1. DNA Res 12:157-166.
Sambrook W, Russel DW. 1989. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Vol 1. Ed
e-3. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory.
Schuler D, Baeurlein E. 1998. Iron-limited
growth and kinetics of iron uptake in
Magnetospirillum gryphiswaldense. Arhc
Microbiol 166:301-307.
Smith et al. 2006. Quantifying the Magnetic
Advantage in Magnetotaxis. Biophys J 91:
1098–1107.
Turner PC, Mc Lennan, Bates AD. White
MRH. 1997. Instant Notes in Molecular
Biology. Washington: BIOS Scientific.
Wahyudi AT, Takeyama H, Okamura Y,
Fukuda Y, Matsunaga T. 2003.
Characterization of aldehyde ferredoxin
oxidoreductase gene defective mutant in
Magnetospirillum magneticum AMB-1.
Biochem Biophys Res Commun 303:223229.
Wahyudi AT. 2004a. Genome-wide screening
of genes involved in magnetite synthesis in
Magnetispirillum magneticum AMB-1
[disertasi].
Tokyo
University
of
Agriculture and Technology. Japan.
Wahyudi
AT.
2004b.
Pembentukan
magnetosom pada bakteri. Hayati 9:39-42.

LAMPIRAN

11

Lampiran 1. Peta keseluruhan genom M. magneticum AMB-1 (Matsunaga et al 2005).

 

4967148

Keterangan:
1. Ukuran genom: 4967148 pb; tidak memiliki plasmid.
2. % GC DNA genom: 65.09 %
% GC ORFs: 65.55 %
3. Jumlah ORF: 4472 (lingkaran 1 dan 2).
4. Sebanyak 36 ORF terlibat dalam biosintesis magnetosom, dan tersebar pada genom M.
magneticum AMB-1 (lingkaran 6 dan 7).

12

Lampiran 2. Peta Plasmid pGEMT-Easy (Promega).

13

Lampiran 3. Penempelan primer spesifik ORF 14 dan 38.0.
ORF 14 (1059 pb)
5’-GGG-GGA-CATATGAAG AGT CCGGAT ACC
ATGAAGAGTCCGGATACCCTTGATGTCGCCGCCCATTGCGCCCGGGCGGCGCTGG
CCATGATGGAGCGGCACAAGGTGCCGCCCCATCCCGAGAATTACGCCATCTGGTACGCCTATGTGGCCG
GGCGCAATCCGGACCTGACCGCCGCCATCGACGCCATCTTGCAATCGGGCAAGAAGTTCACAGCCAAG
GTCAATGACGAACTCTACGAGCGCTTTGCCGTCTTCCCCCAGGACACTGCCGAACTGCGCGAAGTGGGC
CAGCGGGTCGAGGAGGCGGTGGGGCGCGTGCTGGAATACCTGAGCAACGCCAACCAGGGCACCAGCAA
TTACGGCGCAGCCCTGGAGGATTTCAGCGGCAAGCTGGCCGACGGGCCGTCCGCCGCCGGGTTGTCCGA
ACTGATCTCGGGCATCCTGGCCGAGACCAAGGTGATGGCCGATCTGAACCGGCAACTGGAACAGCGCC
TGGAAAACTCGTCCAACGAGGTGGCGCGGCTGCGCAACCACCTGGACGACCTGAAGCGCGAGGCCTCC
ACCGACGCCCTGACCCAGTTGGCCAACCGCAAGCTGTTCGATCACTCGCTCAATCTGGCGGTGCTCGAC
GCCAGGGCGGCGGATGCGCCGCTGTCGCTGCTGATGATCGACATCGATCACTTCAAGCAGTTCAACGAC
ACCTACGGCCACCAGCTGGGCGATCAGGTGCTGAAGCTGGTGGCGCGCTCGCTCTCCGAGGTGGCCCAG
GCCAAGGATACCGCCGCCCGCTATGGTGGCGAGGAATTCGCGGTGATCCTGCCCGCCACGCCCCTGGAG
AAGTCCATGGAGGTGGCGGAAACCATCCGCAATCAGGTCTCCACCAAGCGGCTGACCAACCGTCGCAC
TGGTCAGGTCCTGGGCCAGGTGACCCTGTCCATCGGCGCCGCCCTGCTTCGGGAGGCCGAGGCCCCCGA
TTCCCTGGTCCACCGCGCCGACGAGGCCATGTATCTCGCCAAGCGCGACGGCCGCAACCGGGTGAAGA
GCGAGATCGACCTGGAAAAGCCAACGGGCGAAGCGGCGAAATAG
CCG CTT CG C CGCTTT ATCAAACCTAGG-GGG-5’

ORF 38.0 (1482 pb)
5’-GGG-GGA-CATATG AGC GACGTC GTCGAA
ATGAGCGACGTCGTCGAAGCCGGCATCATCAATTGCGACGCCTGCCCGGTGCTGTGCCGCAT
CCGCGAGGGGCGTTCGGGGGCCTGCGACCGCTATGCCAATACCGGCGGCACGCTCACCCGCGT
CGACCCGCTGGTGGTGGTCCAGGCCATCAAGGAGAAGGACGGCAAGCTGATCCCCTTCCTGTCCACCGA
CCGGGAATGGGACGGCGCCGTGGTCTCCAACTCGCCCACCTTCATCACCGGCATCGGCGCGTCGACCACT
TATCCCGATTACAAGCCCGCCCCCTTCATCGTCGCGGCCGAGCATGACGGCGTCGACATGGTCACCGTGG
TGACCGAAGGCATCTTCAGCTATTGCGCCGTCAAGGTGAAGATCGACACCGACCGCTTCTTAGGCCCGGA
ACAGTCCACGGTGAGGGCGGGCGGCGAGGCGGTGGGCCATGTGACCACCAGCGAGTACGGCTCGCAAAT
GCTGTCCATCGGCGGCGTCCACCATCTGACCGGCGGCTCCAAGAAGGAGGGCAAGCTCACCTGCGACAC
CATGCTGGCGCTGTGCAACAAGCAGGCGGTGGAGCTGACCATCGATAACGGCGCCACCGTGGTGGTCCA
GGCGGGTCAGGCCCCCATCGTCAACGGCACCGTCGAGGAACGCATGCGGGTGGGCTGCGGCTCGGCCAC
CATCGGCATGTTCGCCAAGCAATGGTTCGGGCTGGTGGAAGAGGTGGTGGTGGTCGACGACCACATCAC
CGGCCTGCTGTCCGAGCACAAGGCCGGACGCTATCTCGGCATCGAGGACAGCGGCGCGGTGATCCGCGG
CCGCCGCTCGACGCTGGGGCGCTATTTCCAGGTGGCAGAGCCGGGGACCGGCTGGGGCGGCACCAACAT
CACCGACCCGCTGTCCATCCTCGACCCATTCAATCCCAAGGTGGCCAAGCCCGGCCATCGCCTGCTGATG
GTCAGCACCACCGGCGAACATGCCGGCTATTACGTCCTGGATCAGGACCTGAAGCCGGTGGAGGCCGAG
ATGCCCGCCGCCGTGGCCGCCACGGTGGAGCGCATGCGCGAGAATTGCGAGGCGGCGCTCTGCTCGGTG
GTGTTCATCGCCGGAGCGGGCGGCTCGCTGCGGGCCGGGGTCACCGAGAACCCGGTCAAGCTGACCCGC
TCGGTCAAGGACTCACTGACCCTGGTCACCAGCGGCGGCGCCCCGGTCTATGTCTGGCCGGGCGGCGGCA
TCACCTACATGGTCGACGTGCTGCGCATGCCCGACCACTCGTTCGGCGCCGTGCCCACCCCCGCTTTGGT
GGCGCCCATCGAGTTCACCATGCGCCTCGACGACTATCGCGCCCTGGGCGGCCACATGGATGCCGTGGTG
CGGCTGGAGCAGGTCATCAATCAGGATCGGCGCAAATCGGTGCAATGGGACCCGGACAATCCCTGGCCC
ATGCTGAAGCGGAACTACAAGTGGGGGGACGACACGTGA
ACC CCCCTG CTG TGC ACT AAACCTAGG-GGG-5’

KLONING DUA KANDIDAT GEN YANG TERLIBAT
DALAM BIOSINTESIS MAGNETOSOM PADA
Magnetospirillum magneticum AMB-1 DI Escherichia coli

YONATAN BANOET

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

ABSTRAK
YONATAN BANOET. Kloning Dua Kandidat Gen yang Terlibat dalam Biosintesis
Magnetosom pada Magnetospirillum magneticum AMB-1 di Esherichia coli. Dibimbing
oleh ARIS TRI WAHYUDI dan UTUT WIDYASTUTI.
Magnetospirillum magneticum AMB-1 adalah salah satu strain bakteri magnet
yang mampu mensintesis magnetosom. Magnetosom pada M. magneticum AMB-1
merupakan partikel magnetit berukuran nano yang diselimuti membran, dan mampu
memberikan kemampuan magneto-aerotaksis pada bakteri magnet. Pembentukan
magnetosom pada sel bakteri magnet dikontrol secara genetik. Sampai saat ini telah
diketahui setidaknya ada 36 gen yang terlibat dalam biosintesis magnetosom, dua open
reading frame (ORF) diantaranya adalah ORF 14 dan ORF 38.0. Kedua ORF tersebut
dalam penelitian ini dianalisis secara bioinformatika dan diintroduksikan kedalam sel E.
coli DH5Į menggunakan vektor kloning pGEMT-Easy.
Hasil analisis bioinformatika untuk ORF 14 menunjukkan bahwa gen tersebut
mengkode protein yang memiliki homologi sebesar 90% dengan domain GGDEF pada
Magnetospirillum magnetotacticum MS-1. Sedangkan hasil analisis bioinformatika untuk
ORF 38 menunjukkan bahwa gen tersebut memiliki homologi sebesar 70% dengan 6hydroxynicotinate reductase pada Bradyrhizobium sp. BTAi1. Verifikasi hasil kloning
kedua ORF dilakukan melalui pemotongan plasmid rekombinan menggunakan enzim
restriksi EcoRI, NdeI, dan BamHI; serta PCR koloni. Verifikasi hasil kloning membuktikan
bahwa kedua ORF telah berhasil diintroduksi ke dalam sel E. coli DH5Į.

ABSTRACT
YONATAN BANOET. The Cloning of Two Candidate Genes that Involved in
Magnetosomes Biosynthesizes of Magnetospirillum magneticum AMB-1 to Escherichia
coli. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and UTUT WIDYASTUTI.
Magnetospirillum magneticum AMB-1 is a magnetotactic bacterium that
synthesizes nanoscale magnetites particles enveloped by membrane, called as
magnetosomes. Magnetosomes are membranous bacterial organelles that allow magnetoaerotaxis in magnetotactic bacteria. The formation of magnetosomes in magnetotactic
bacteria was genetically controlled. There are 36 genes from the genome of M. magneticum
AMB-1 that involved in magnetosomes formation, two open reading frames from those
genes referred to ORF 14 and ORF 38.0. Here in, bioinformatics analysis was done to
analyze ORF 14 and ORF 38.0. These genes were amplified by polymerase chain reaction
and cloned in Escherichia coli DH5Į using pGEMT-Easy as a Cloning Vector System.
Bioinformatics analysis of ORF 14 showed that this gene codes the protein which
has 90% homology with the GGDEF domain in Magnetospirillum magnetotacticum MS-1.
Meanwhile, bioinformatics analysis of ORF 38.0 showed that this gene codes the protein
which has 70% homology with 6-hydroxynicotinate reductase in Bradyrhizobium sp.
BTAi1. Verification for the cloned genes was done by colony PCR and digestion of
recombinant plasmid with EcoRI, NdeI, and BamHI. These steps showed that ORF 14 and
ORF 38.0 have already been cloned to E. coli DH5Į.

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelompok bakteri magnet merupakan
bakteri gram negatif dan termasuk ke
dalam grup α-proteobakteria (Burgess et
al. 2007).
Bakteri magnet memiliki
habitat di perairan tawar dan laut.
Kelompok bakteri magnet memilih
lingkungan mikroaerofilik atau anaerob
seperti
sedimen
dan
memiliki
ketergantungan terhadap unsur-unsur
mineral dalam perairan, terutama terhadap
besi (Schuler & Baeurlein 1998).
Bakteri magnet memiliki kemampuan
untuk merespon medan magnet dan
cenderung bermigrasi sepanjang garis
bidang magnet bumi (Blakemore 1975).
Hal ini dikarenakan kemampuan kelompok
bakteri tersebut mensintesis magnetosom.
Magnetosom merupakan partikel magnetit
(Fe3O4) atau greigit (Fe3S4), dan dilapisi
membran fesikel yang berasal dari
invaginasi membran sitoplasma (Gorby et
al. 1998, Komeili et al. 2006). Umumnya
magnetosom tersusun berantai dalam sel,
terdiri dari 15 sampai 20 partikel magnet
berukuran antara 20 hingga 50 nm.
Magnetosom berperan seperti jarum
kompas yang mengorientasikan bakteri
magnet pada medan magnet bumi,
sehingga bakteri magnet dapat memilih
lingkungan mikroaerofilik yang menjadi
habitatnya (Bazylinski & Frankel 2004,
Smith et al. 2006).
Salah satu strain bakteri magnet yang
sering dijadikan model dalam biosintesis
magnetosom adalah Magnetospirillum
magneticum AMB-1. Strain tersebut
bersifat anaerob fakultatif, mampu tumbuh
dalam kondisi aerob, namun tidak dapat
mensintesis magnetosom. Strain tersebut
juga mudah dikulturkan di laboratorium
(Matsunaga et al. 1991). Partikel
magnetosom dalam sel M. magneticum
AMB-1 berupa magnet magnetit (Fe3O4)
dan tersusun berbentuk rantai memanjang
searah panjang sel (Wahyudi et al. 2003).
Matsunaga et al. (2005) telah
mensekuen keseluruhan DNA genom M.
magneticum AMB-1. Ukuran genom total
M. Magneticum AMB-1 adalah 4. 9 Mb.
Berdasarkan studi genetik terhadap
pembentukan magnetosom pada M.
magneticum AMB-1 melalui mutagenesis
menggunakan transposon, setidaknya ada
36 gen yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom dan tersebar pada genom

bakteri tersebut (Lampiran 1). Dua open
reading frame (ORF) diantaranya telah
diketahui terlibat dalam biosintesis
magnetosom
melalui
mutagenesis
menggunakan transposon adalah ORF 14
dan ORF 38.0 (Wahyudi 2004a).
Penelitian ini menggunakan sekuen
ORF 14 dan 38.0 yang terdapat pada Gen
Bank
untuk
dianalisis
secara
bioinformatika.
Kedua
ORF
akan
diintroduksikan ke dalam sel Esherichia
coli DH5α menggunakan vektor kloning
pGEMT-Easy. Kloning molekuler yang
dilakukan dalam penelitian ini akan
berguna dalam telaah lanjutan mengenai
peranan kedua ORF dalam biosintesis
magnetosom pada M. magneticum AMB1.
Biosintesis magnetosom pada bakteri
merupakan proses kompleks yang
diregulasi secara genetik. Sampai saat ini
mekanisme
dalam
pembentukan
magnetosom belum dapat dipahami
sepenuhnya (Grünberg 2001, Wahyudi
2004b). Sehingga diperlukan telaah
molekuler
seperti
isolasi,
kloning
molekuler, dan karakterisasi tiap gen yang
terlibat biosintesis magnetosom.
Tujuan
Melakukan analisis bioinformatika dan
melakukan kloning molekuler terhadap
dua ORF yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan
Febuari hingga Juli 2008 di Laboratorium
Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi,
FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan
yang
digunakan
dalam
penelitian ini adalah genom M.
magneticum AMB-1, sekuen ORF 14
(gene id: amb0759) dan ORF 38.0 (gene
id: amb1482), galur Escherichia coli
DH5α, media Luria Agar (LA) (NaCl 10
g/L, Bacto Trypton 10 g/L, Yeast extract 5
g/L dan Bacto Agar 15 g/L) dan Luria
Broth (LB), ampisilin (5 mg/ml), pGEMTEasy (Promega) (Lampiran 2), gel agarosa,
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-Dgalactopyranoside
(X-gal),
KIT-

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelompok bakteri magnet merupakan
bakteri gram negatif dan termasuk ke
dalam grup α-proteobakteria (Burgess et
al. 2007).
Bakteri magnet memiliki
habitat di perairan tawar dan laut.
Kelompok bakteri magnet memilih
lingkungan mikroaerofilik atau anaerob
seperti
sedimen
dan
memiliki
ketergantungan terhadap unsur-unsur
mineral dalam perairan, terutama terhadap
besi (Schuler & Baeurlein 1998).
Bakteri magnet memiliki kemampuan
untuk merespon medan magnet dan
cenderung bermigrasi sepanjang garis
bidang magnet bumi (Blakemore 1975).
Hal ini dikarenakan kemampuan kelompok
bakteri tersebut mensintesis magnetosom.
Magnetosom merupakan partikel magnetit
(Fe3O4) atau greigit (Fe3S4), dan dilapisi
membran fesikel yang berasal dari
invaginasi membran sitoplasma (Gorby et
al. 1998, Komeili et al. 2006). Umumnya