Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam Escherichia coli DH-5α
KLONING GEN CYP71AV ASAL Artemisia annua DI DALAM
Escherichia coli DH-5α
OLIVIA SCARINTA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Kloning gen
CYP71AV asal Artemisia annua di dalam Escherichia coli DH-5α” adalah karya
bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Olivia Scarinta
NIM G34100094
ABSTRAK
OLIVIA SCARINTA. Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Kasus infeksi malaria menyebabkan 1.7 – 2.5 juta orang/tahun mengalami
kematian. Artemisia annua mengandung senyawa artemisinin yang efektif untuk
membasmi jenis-jenis malaria yang resisten terhadap kuinin dan klorokuin.
CYP71AV merupakan gen yang memiliki peranan penting dalam biosintesis
artemisinin dengan cara mengkatalis oksidasi dari produk intermediate yang banyak
dihasilkan dalam biosintesis artemisinin yaitu amorpha-4,11-diene. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkloning gen CYP71AV melalui teknologi DNA rekombinan.
Gen CYP71AV diamplifikasi dari cDNA total dengan menggunakan primer
spesifik. cDNA CYP71AV disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Plasmid
rekombinan yang mngandung gen CYP71AV diintroduksikan ke dalam
Escherichia coli galur DH5-α. Pengurutan cDNA CYP71AV menghasilkan sekitar
1571 pasang basa yang menyandikan 523 asam amino. Analisis kesejajaran lokal
nukleotida dengan CYP71AV dari beberapa spesies yang terdaftar di GeneBank
menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki kemiripan sebesar 98% dengan
complete cds A.annua (JQ254992.1). Hasil analisis domain menunjukkan bahwa
cDNA CYP71AV memiliki tiga daerah domain terkonservasi.
Kata kunci : cDNA CYP71AV, kloning, Artemisia annua.
ABSTRACT
OLIVIA SCARINTA. Cloning of CYP71AV gene from Artemisia annua into
Escherichia coli DH-5α. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Infection of malaria caused 1.7-2.5 million people die each year. Artemisia
annua contains artemisinin compounds effective to eradicate malaria types that are
resistant to quinine and chloroquine. CYP71AV is a gene that has critical role in
the biosynthesis of artemisinin by catalyzing the oxidation of intermediate
products Amorpha-4,11-diene, which are highly produced in the biosynthesis of
artemisinin. This study aimed to clone the CYP71AV gene through recombinant
DNA technology. CYP71AV gene from total cDNA was amplified using specific
primers. CYP71AV gene was inserted into pGEM-T Easy plasmid. The
recombinant plasmid containing CYP71AV gene introduced into Escherichia coli
strain DH5-α. CYP71AV gene sequencing produce approximately 1571 base pairs
encoding 523 amino acids. Local alignment analysis of nucleotides with CYP71AV
of several species listed in GeneBank showed that the cDNA CYP71AV have 98%
similarity with complete cds A.annua (JQ254992.1). Domain analysis showed that
the CYP71AV gene has three conserved domain.
Key words: cDNA CYP71AV, clone, Artemisia annua.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KLONING GEN CYP71AV ASAL Artemisia annua DI DALAM
Escherichia coli DH-5α
OLIVIA SCARINTA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi
Nama
NIM
Program Studi
: Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α
: Olivia Scarinta
: G34100094
: Biologi
Disetujui oleh
Dr Utut Widyastuti MSi
Pembimbing I
Dr Ir Aris Tjahjoleksono DEA
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena
skripsi yang berjudul “Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana di Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua
pihak yang telah memberikan bantuan dan dorongan hingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini, yaitu:
1
Dr Utut Widyastuti MSi dan Dr Ir Aris Tjahloleksono selaku dosen
pembimbing yang telah memberikan dana penelitian serta pengarahan dalam
penyusunan skripsi ini,
2
Dr Achmad Farajallah selaku dosen penguji yang telah memberikan saran
dan kritik untuk perbaikan skripsi ini,
3
Dr Ir Iman Rusmana MSi selaku ketua Departemen Biologi,
4
Mbak Pepi Elvavina yang telah membantu penulis selama penelitian di
Laboratorium,
5
Bernadi Tenggarahardja, Veronica Meiji, Nicholas Kevin serta seluruh
keluarga yang telah memberikan motivasi kepada penulis,
6
Tommy Gantohe, Silvana Godelifa Marsiana Fofid, Theresia Farneubun, dan
seluruh teman-teman Tim Pendamping.
7
Seluruh teman-teman Biologi 47 dan BIORIN.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna.
Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun dari semua pihak sangat
diharapkan. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak yang
memerlukannya.
Bogor, November 2014
Olivia Scarinta
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Ruang Lingkup Penelitian
1
BAHAN DAN METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Penelitian
2
Perbanyakan cDNA
2
Penyisipan fragmen DNA pada vektor pengklonan
2
Transformasi
3
Identifikasi hasil transformasi dan sekuensing
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Perbanyakan cDNA
4
Ligasi dan Transformasi
4
Identifikasi koloni rekombinan
5
Analisis urutan nukleotida gen CYP71AV
7
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
10
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL
1 Rasio molaritas sisipan dan vektor pada proses ligasiError! Bookmark not defined.
2 Rasio molaritas ligasi dan hasil transformasi
5
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi cDNA
2 Koloni yang tumbuh pada media LA+Amp+X-gal+IPTG dari hasil
transformasi
3 Peta plasmid pGEM-T Easy
4 Hasil PCR koloni dengan primer T7-SP6
5 Hasil PCR dengan primer kombinasi A (CYPF-SP6) dan B (T7-CYPR)
6 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim NotI
7 Perbandingan daerah domain terkonservasi cDNA CYP71AV dengan
complete cds Artemisia annua (JQ254992.1)
4
5
6
6
6
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
Perbedaan sekuen nukleotida CYP71AV dengan complete cds
Artemisia annua (JQ254992.1)
Pohon filogenetik gen CYP71AV dengan complete cds
A.annua
(JQ2549922.1)
10
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Adanya kemampuan Multidrug Resistance pada Plasmodium falciparum
menyebabkan malaria menjadi salah satu dari penyakit paling mematikan di
dunia. Lebih dari 600 juta kasus infeksi malaria menyebabkan 1.7 – 2.5 juta
orang/tahun mengalami kematian. Empat puluh persen dari jumlah tersebut
terdapat di negara berkembang, antara lain India, Indonesia, negara-negara di
Amerika Latin dan negara-negara di Afrika (Graz et al. 2011). Artemisia annua L.
(Asteraceae) merupakan tanaman obat yang sudah lama digunakan di Cina sebagai obat
antimalaria, mengandung senyawa terpenoid komplek artemisinin yang merupakan
senyawa seskuiterpen lakton endoperoksidase (Ferreira & Janick 1996). Artemisinin
adalah senyawa yang efektif untuk membasmi jenis-jenis malaria yang resisten
terhadap kuinin dan klorokuin serta malaria serebral yang disebabkan oleh
Plasmodium falciparum (Paniego & Giuletti 1994). Introduksi A. annua dari daerah
asalnya yang beriklim subtropik ke daerah tropik menyebabkan tanaman cepat
berbunga sehingga produktivitas artemisinin turun. Artemisia vulgaris adalah
jenis Artemisia lokal Indonesia yang dikenal dengan nama daerahnya sudamala
mengandung artemisinin 2.55 ppm lebih rendah dibandingkan kandungan
artemisinin A. annua (4.99 ppm) (Aryanti et al 2006) . Herba ini tersebar hampir
di semua dataran tinggi di Indonesia terutama di Papua. Pembuatan senyawa
artemisinin sintetik membutuhkan biaya yang besar sehingga A.annua ini masih
menjadi satu-satunya sumber obat tersebut. Tanaman A.annua memiliki gen
CYP71AV yang berperan penting dalam biosintesis artemisinin dengan cara
mengkatalis oksidasi dari produk intermediate amorpha-4,11-diene yaitu intermediate
yang banyak dihasilkan dalam biosintesis artemisinin (Teoh et al. 2006). Ekspresi gen
CYP71AV diketahui meningkat pada perkembangan daun setengah membuka yang
ditandai dengan meningkatnya kandungan artemisinin pada kelenjar trikoma
(Widyastuti et al. 2012). Oleh karena itu, kloning gen CYP71AV diharapkan dapat
digunakan untuk perbaikan genetik pada tanaman Artemisia annua maupun Artemisia
lokal Indonesia melalui penggunaan teknologi DNA rekombinan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gen CYP71AV melalui teknologi
DNA rekombinan dan identifikasi cDNA.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini antara lain perbanyakan cDNA, ligasi,
transformasi, PCR koloni, pemotongan DNA dengan enzim restriksi dan
sekuensing DNA.
2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2014 sampai Juni 2014 di
Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands (BIORIN),
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah cDNA yang berasal dari hasil penelitian
Widyastuti et al (2012), plasmid p-GEMT Easy digunakan sebagai vektor
pengklonan dan E.coli strain DH-5α sebagai inang vektor rekombinan, antibiotik
ampisilin 50 mg/mL, media inkubasi dan bahan-bahan proses ligasi dan
transformasi.
Alat
Alat yang digunakan adalah mesin PCR, microtube Eppendorf, pipet mikro,
laminar air flow cabinet, sentrifuse, mesin elektroforesis dan UV transilluminator.
Prosedur Penelitian
Perbanyakan cDNA
cDNA penyandi protein CYP71AV diperbanyak dengan PCR menggunakan
primer spesifik CYP71AV1-F (5’ CACCATGGCACTCTCACTGACCAC3’) dan
CYP71AV1-R (5’ CTAGAAACTTGGAACGAGTAACAAC3’). Untuk PCR, 100
ng cDNA dicampur dengan 0.2 µL Taq polimerase (5 ng/µL), 1 µL dNTP 2 mM,
0.25 µL primer forward 10 mM, 0.25 µL primer reverse 10 mM, 1 µL Taq buffer
10 x dan ditambah dengan ddH2O sehingga volume akhir mencapai 10 µL. PCR
dijalankan dengan program predenaturasi 950 C selama 5 menit, denaturasi 940 C
selama 30 detik, annealing 520 C selama 30 detik, dan elongasi 720 C selama 90
detik. Proses denaturasi, annealing, dan elongasi dilakukan sebanyak 30 siklus.
Penyisipan fragmen DNA pada vektor pengklonan
Sebanyak 2-15 ng cDNA yang dihasilkan dari PCR selanjutnya dicampur
dengan 1 µL pGEM-T easy 10 ng/µL, 0.2 µL DNA ligase T4 5 ng/µL , 5 µL 2x
buffer ligasi dan ditambah dengan ddH2O steril hingga volume akhir mencapai 10
µL, kemudian diinkubasikan pada suhu 40 C selama semalam (16 jam). Untuk
memperoleh hasil pengklonan yang optimal, jumlah DNA sisipan (cDNA
CYP71AV) yang dibutuhkan dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Vektor (ng) x Ukuran sisipan (kb)
Jumlah sisipan (ng) =
x Rasio molaritas
Ukuran vektor (kb)
3
Bila rasio molaritas sisipan dengan vektor adalah 3:1, jumlah vektor 10 ng,
ukuran vektor 3000 bp dan ukuran sisipan sebesar 1500 bp maka berdasarkan
rumus tersebut, jumlah sisipan yang dibutuhkan adalah 15 ng.
Ligasi dilakukan pada tiga taraf perbandingan seperti ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1 Rasio molaritas sisipan dan vektor pada proses ligasi
Rasio molaritas sisipan
Kode
Sisipan (ng) Vektor (ng)
dan vektor
A
3:1
15
10
B
1:1
5
10
C
1:3
2
10
Transformasi
Transformasi dilakukan dengan mengikuti metode yang digunakan oleh
Suharsono (2002). Untuk itu, satu koloni bakteri E. coli galur DH5-α dikulturkan
dalam 2 mL media LB (Bacto Trypton, Bacto Yeast dan NaCl) cair di dalam
shaking incubator (kecepatan 250 rpm), pada suhu 37oC, selama semalam,
kemudian disubkulturkan di dalam 5 mL media LB cair hingga OD600=0.4-0.5.
Bakteri diinkubasi selama 10 menit di dalam es dan diendapkan dengan cara
disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit. Endapan
bakteri disuspensikan dalam 495 µL buffer transformasi dan diinkubasi di dalam
es selama 10 menit. Setelah sentrifugasi, endapan bakteri disuspensikan dalam
125 µL TB (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM
MnCl2.4H2O, pH6.7), kemudian ditambah dengan 8.8 µL DMSO dan diinkubasi
di dalam es selama 10 menit sehingga diperoleh bakteri kompeten.
Sebanyak 50 µL dari bakteri kompeten dicampur dengan 10 µL produk
ligasi dan diinkubasi di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian
diinkubasi pada suhu 42oC, selama 60 detik, kemudian dimasukkan kembali ke
dalam es dan dibiarkan di dalamnya selama 5 menit. Campuran ini ditambah
dengan 100 µL media 2xYT (16 g/L Bacto-tryptone, 10 g/L Bacto yeast extract, 5
g/L NaCl, pH 7.0) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Bakteri
disebar secara merata dengan menggunakan batang kaca di atas media LA yang
mengandung 100 mg/L ampisilin dan 10 L 100 mM IPTG (Isopropiltio-βgalaktosida) serta 50 L 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3-indoly-β-Dgalactoside, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC semalam. Sebagai kontrol
pertumbuhan E.coli, sel bakteri E.coli kompeten disebar di atas media LA tanpa
ampisilin sedangkan untuk kontrol media, sel bakteri kompeten disebar di atas
media LA dengan ampisilin.
Identifikasi hasil transformasi dan sekuensing
Koloni yang membawa DNA rekombinan berwarna putih sedangkan yang
tidak membawa DNA rekombinan berwarna biru. Koloni yang membawa DNA
rekombinan selanjutnya diverifikasi dengan menggunakan PCR dengan primer
spesifik CypF-SP6 dan T7-CypR dan enzim restriksi Not1 yang akan memisahkan
vektor dan DNA asing yang disisipkan. Koloni yang telah membawa DNA
rekombinan selanjutnya disekuensing. Pengurutan DNA (DNA sequencing)
dilakukan oleh PT Genetika Science. Urutan nukleotida dari gen CYP71AV
4
dianalisis kemiripan dan homologinya dengan menggunakan program BLAST2
(Basic_Local_Alignment_Search_Tools) (http://www.ebiac.uk/blast2). Analisis
daerah terkonservasi dan domain dilakukan dengan menggunakan program
conserved domain NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Perbanyakan cDNA
Perbanyakan cDNA menggunakan PCR menghasilkan pita DNA yang
berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 1). Selain untuk memastikan keberadaan gen
target yang akan diklon dan dianalisis, hasil amplifikasi ini juga menunjukkan
konsentrasi cDNA CYP71AV yang tersimpan dalam stok. Konsentrasi cDNA
CYP71AV diperoleh dengan cara membandingkan visualisasi kecerahan pita
terhadap marker lamda ( ) pada gel elektroforesis. Hasil elektroforesis
menunjukkan konsentrasi CYP71AV pada stok cDNA adalah 50 ng/µL.
M
1
2000 bp
1500 bp
CYP71AV
1000 bp
Gambar 1 Hasil amplifikasi cDNA. M : marker 1 kb, lajur 1 merupakan hasil
amplifikasi cDNA.
Ligasi dan Transformasi
Gen CYP71AV yang berhasil diamplifikasi dari cDNA selanjutnya
diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy kemudian diintroduksikan ke dalam
E.coli galur DH5-α. Ligasi dilakukan pada tiga taraf perlakuan (Tabel 1). Seleksi
terhadap E.coli yang mengandung plasmid rekombinan pembawa sisipan fragmen
cDNA CYP71AV dilakukan pada media seleksi yang mengandung antibiotik
ampisilin, X-gal dan IPTG. Plasmid pGEM-T easy selain sebagai vektor pembawa
juga digunakan sebagai marker penyeleksi karena mengandung gen lacZ yang
menyandikan β-galaktosidase (β-gal), suatu enzim yang dapat mendegradasi
disakarida laktosa menjadi monosakarida glukosa dan galaktosa yang disertai
dengan perubahan warna media. X-gal adalah senyawa yang memiliki struktur
mirip dengan laktosa. Media akan menjadi biru ketika β-gal memotong struktur
X-gal tersebut. Koloni berwarna putih jika X-gal tidak terpotong karena koloni
tidak menghasilkan β-gal. Adanya sisipan pada gen lacZ menyebabkan gen lacZ
tidak diekspresikan sehingga koloni tidak menghasilkan β-gal (Sambrook 1989).
5
Dari 3 taraf perlakuan, hanya 2 yang menunjukkan hasil positif, hal ini
ditunjukkan dengan adanya koloni biru dan putih pada cawan A dan C, sedangkan
pada cawan B sama sekali tidak ada koloni yang tumbuh (Tabel 2). Keberhasilan
dari ligasi sangat ditentukan oleh perbandingan antara sisipan dan vektor yang
digunakan serta ukuran sisipan. Ukuran sisipan yang kecil menghasilkan peluang
terjadinya ligasi dengan lebih baik. Selain itu ketidak berhasilan ligasi juga
ditentukam oleh kualitas enzim ligasi.
Tabel 2 Rasio molaritas ligasi dan hasil transformasi
Rasio molaritas
Sisipan
Kode
sisipan dan vektor
(ng)
A
3:1
15
B
1:1
5
C
1:3
2
Kontrol media tanpa
antibiotik
Kontrol media
dengan antibiotik
Kontrol media tanpa
antibiotik
Cawan A
Vektor
(ng)
10
10
10
-
Jumlah
koloni/cawan
2
5
> 50
-
-
Kontrol media dengan
antibiotik
Cawan B
Cawan C
Gambar 2 Koloni yang tumbuh pada media LA+Amp+X-gal+IPTG dari hasil
transformasi
Identifikasi Koloni Rekombinan
Koloni dari cawan A dan C (Gambar 2) selanjutnya diidentifikasi
menggunakan PCR koloni dengan primer spesifik. PCR koloni dilakukan untuk
memastikan bahwa cDNA hasil kloning telah tersisip ke dalam plasmid pGEM-T
Easy. Sebanyak 7 koloni telah diidentifikasi yaitu 2 koloni berasal dari cawan A
6
dan 5 koloni berasal dari cawan C. Identifikasi dengan PCR dilakukan sebanyak 2
kali, pertama dengan primer T7-SP6 untuk memastikan bahwa koloni tesebut telah
mengandung gen target yang dibawa oleh plasmid pGEMT-Easy (Gambar 3) dan
yang ke dua dengan kombinasi primer CYPF-SP6 dan T7-CYPR untuk
memastikan bahwa gen target telah tersisip ke dalam vektor. PCR koloni dari
cawan A dan cawan C menggunakan primer T7-SP6 menghasilkan pita yang
berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 4). Kedua koloni tersebut kemudian
digunakan untuk PCR koloni menggunakan kombinasi primer CYPF-SP6 dan T7CYPR dan hasilnya adalah pita berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 5).
Gambar 3 Peta plasmid pGEM-T Easy
1
2
3
4
5
6
7
1 kb
2000 bp
1500 bp
1000 bp
Gambar 4 Hasil PCR koloni dengan primer T7-SP6. 1-2: koloni cawan A, 3-7:
koloni cawan B, marker: 1 kb.
2A
2B
4A
4B
1 kb
1500 bp
1000 bp
Gambar 5 Hasil PCR dengan primer kombinasi A (CYPF-SP6) dan B (T7-CYPR).
2A & 2B: koloni 2, 4A & 4B: koloni 4.
Untuk memastikan bahwa fragmen cDNA telah tersisip ke dalam vektor
maka DNA plasmid rekombinan diisolasi dari masing-masing koloni (koloni 2 &
4). Plasmid hasil isolasi ini kemudian dipotong dengan enzim restriksi NotI untuk
memastikan keberadaan gen sisipan.
Pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim NotI menghasilkan 2 pita
seperti terlihat pada Gambar 6. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid rekombinan
7
berhasil dipotong menjadi 2 bagian yaitu plasmid vektor dan fragmen sisipan
(cDNA atau gen CYP71AV). Pita yang berada di bagian atas adalah vektor yang
berukuran sekitar 3000 bp sedangkan pita yang berada di bawah adalah gen
CYP71AV yang berukuran sekitar 1500 bp. Posisi pita plasmid rekombinan baik
yang dipotong maupun yang tidak dipotong sejajar meskipun ukurannya berbeda,
hal ini disebabkan oleh plasmid rekombinan yang tidak dipotong bentuknya
sirkuler sehingga tidak bisa dipastikan ukurannya. Selain posisi, pita yang
dihasilkan juga sangat tipis, hal ini disebabkan oleh sedikitnya plasmid yang
berhasil diisolasi.
2-NotI
2
1 kb
4
4-NotI
3000 bp
plasmid
pGEM T1500 bp
CYP71AV
Gambar 6 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim NotI. 2- NotI: plasmid
rekombinan dipotong, 2: plasmid rekombinan klon 2 tidak dipotong,
1 kb: marker 1 kb, 4: plasmid rekombinan klon 4 tidak dipotong, 4NotI: plasmid rekombinan dipotong.
Analisis Urutan Nukleotida Gen CYP71AV
Pengurutan cDNA CYP71AV menghasilkan 1571 pb yang menyandikan 523
asam amino. Analisis kesejajaran lokal (local alignment) dilakukan untuk melihat
kesamaan dan kekerabatan dengan berbagai spesies yang tersedia di GeneBank.
Hasil analisis menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool) menunjukkan bahwa fragmen cDNA CYP71AV memiliki nilai kemiripan
yang tinggi dengan complete cds Artemisia annua (JQ254992.1), yaitu sebesar
98% dan nilai E-value sebesar nol. Nilai E-value merupakan nilai yang
menunjukkan signifikasi kemiripan sekuen. Jika suatu sekuen memiliki nilai Evalue semakin mendekati nilai 0 (nol) maka semakin dapat disimpulkan bahwa
sekuen tersebut mirip terhadap pasangan pengurutannya. Sebaliknya, jika suatu
sekuen memiliki nilai E-value lebih besar dari 0.001 maka sekuen tersebut sulit
untuk disimpulkan kemiripannya dengan data yang diambil dari GeneBank
(Claverie & Notredame 2003). Perbedaan nukleotida antara sekuen cDNA
CYP71AV dengan complete cds Artemisia annua dapat dilihat pada Lampiran 1.
Hasil filogenetik menunjukkan bahwa fragmen cDNA CYP71AV memiliki
kekerabatan paling dekat dengan Artemisia annua (Lampiran 2).
Selain terdapat perbedaan sebanyak 19 basa nukleotida, kedua sekuen ini
juga memiliki perbedaan pada domain yang terkonservasi. cDNA CYP71AV
memiliki tiga daerah domain terkonservasi yang berada pada interval 10-453, 497-
8
1078 dan 376-1478, sementara daerah domain terkonservasi pada complete cds
Artemisia annua (JQ254992.1) berada pada keseluruhan sekuen. Perbandingan
daerah domain terkonservasi kedua sekuen tersebut disajikan pada Gambar 7.
Hasil analisis domain menunjukkan bahwa urutan asam amino CYP71AV diduga
termasuk ke dalam tipe cytochrome P450 (Gambar 7). Cytochrome P450 adalah
kelompok protein heme-tiolase yang terlibat dalam degradasi oksidatif berbagai
senyawa, terutama racun lingkungan dan mutagen. Protein ini dibagi menjadi
empat kelas berdasarkan cara elektron dari NAD(P)H dikirim ke situs katalitik.
Konservasi sekuen cenderung rendah dalam famili ini dan hanya ada tiga residu
yang terkonservasi. Cytochrome P450 pada eukariot memiliki fungsi enzimatis
untuk mengkatalis hidrokarbon non aktif pada suhu fisiologis (NCBI 2010).
Gambar 7 Perbandingan daerah domain terkonservasi cDNA CYP71AV dengan
complete cds Artemisia annua (JQ254992.1)
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Kloning gen CYP71AV telah berhasil dilakukan. Analisis kesejajaran lokal
urutan nukleotida menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki nilai kemiripan
yang tinggi terhadap complete cds Artemisia annua (JQ2549922.1).
Saran
Perlu dilakukan optimasi pada metode isolasi plasmid agar hasil yang
diperoleh lebih optimal.
9
DAFTAR PUSTAKA
Aryanti, Ermayanti TM, Prinadi KI, Dewi RM. 2006. Uji daya antimalaria
Artemisia spp.
Terhadap Plasmodium falcifarum. Majalah Farmasi
Indonesia 17 (2): 81-84
Claverie JM, Notredame C. 2003. Bioinformatics for Dummies. Willey Publishing
Inc. New York.
Ferreira JFS, J Janick. 1995. Floral morphology of Artemisia annua with special
reference to trichomes. Int J Plant Sci 156 : 807-815.
Graz B, Kitua A, Malebo HM. 2011. To what extent can traditional medicine
contribute a complementary or alternative solution to malaria control
programmes? Malaria Journal 10: 1-6.
[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2010. Cytochrome P450
[internet].
[diacu
17
Oktober
2014]
Tersedia
dari:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Paniego NB, AM Giuletti. 1994. Artemisia annua L. : dedifferentiated and
differentiated cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36 : 163-168.
Sambrook J, Fritsch EJ, Maniatis T. 1989. Molecular cloning : A Laboratory
Manual. Second edition. Cold Spring Harbour : Laboratory Press.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati 3:6770
Teoh. KH, Polichuk DR, Reed DW, Nowak G, Covello PS. 2006. Artemisia
annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a
cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial
sesquiterpene lactone artemisinin. FEBS Letters 580: 1411-1416
Widyastuti U, Juliarni, Widiyastuti Y. 2012. Identifikasi Trikoma Kelenjar untuk
Produksi Artemisinin pada Artemisia annua L. menggunakan pendekatan
molekular. Prosiding Seminar Hasil Penelitian IPB. LPPM. Bogor
10
LAMPIRAN
Lampiran 1. Perbedaan sekuen nukleotida CYP71AV dengan complete cds Artemisia annua
(JQ254992.1)
CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ATGGCACTCTCACTGACCACCTCCATTGCTCTTGCCACGATCCTTTTCTT 50
ATGGCACTCTCACTGACCACTTCCATTGCTCTTGCAACGATCCTTTTGTT 50
******************** ************** *********** **
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CGTAATCTACAAGTTCGCTACTCGTTCCAAATCCACAAAAAACAGCCTTC 100
CGT---TTACAAGTTCGCTACTCGTTCCAAATCCACCAAAAAAAGCCTTC 97
***
***************************** ***** *******
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CTGAGCCATGGCGACTTCCCATTATTGGTCACATGCATCACTTGATTGGT 150
CTGAGCCATGGCGACTTCCCATTATTGGTCACATGCATCACTTGATTGGT 147
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ACAATACCACATCGTGGGCTTATGGATTTAGCCAGAAAGTATGGATCTTT 200
ACAACGCCACATCGTGGGGTTAGGGATTTAGCCAGAAAGTATGGATCTTT 197
**** ************ *** ***************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATGCATTTACAGCTTGGTGAAGTTTCAACAATCGTGGTGTCATCTCCGA 250
GATGCATTTACAGCTTGGTGAGGTTCCAACAATCGTGGTGTCATCTCCGA 247
******************** *** ************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATGGGCTAAAGAGATTTTGACAACGTACGACATTTCCTTTGCTAACAGG 300
AATGGGCTAAAGAGATTTTGACAACGTACGACATTACCTTTGCTAACAGG 297
*********************************** **************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CCCGAGACTTTAACTGGTGAGATTGTTTTATATCACAATACGGATGTTGT 350
CCCGAGACTTTAACTGGTGAGATTGTTTTATATCACAATACGGATGTTGT 347
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TCTTGCACCTTATGGTGAATACTGGAGGCAATTACGTAAAATTTGCACAT 400
TCTTGCACCTTATGGTGAATACTGGAGGCAATTACGTAAAATTTGCACAT 397
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TGGAGCTTTTGAGTGTTAAGAAAGTAAAGTCATTTCAGTCGCTTCGTGAA 450
TGGAGCTTTTGAGTGTTAAGAAAGTAAAGTCATTTCAGTCGCTTCGTGAA 447
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
GAGGAGTGTTGGAATTTGGTTCAAGAGATTAAAGCTTCAGGTTCAGGGAG 500
GAGGAGTGTTGGAATTTGGTTCAAGAGATTAAAGCTTCAGGTTCAGGGAG 497
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ACCCGGTTAACCTTTCAGAGAATGTTTTCAAGTTGATTGCAACGATACTT 550
ACC-GGTTAACCTTTCAGAGAATGTTTTCAAGTTGATTGCAACGATACTT 546
*** **********************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AGTAGAGCCGCATTTGGGAAAGGGATCAAGGACCAGAAAGAGTTAACGGA 600
AGTAGAGCCGCATTTGGGAAAGGGATCAAGGACCAGAAAGAGTTAACGGA 596
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
GATTGTGAAAGAGATACTGAGGCAAACTGGTGGTTTTGATGTGGCAGATA 650
GATTGTGAAAGAGATACTGAGGCAAACTGGTGGTTTTGATGTGGCAGATA 646
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TCTTTCCTTCAAAGAAATTTCTTCATCATCTTTCGGGCAAGAGAGCTCGG 700
TCTTTCCTTCAAAGAAATTTCTTCATCATCTTTCGGGCAAGAGAGCTCGG 696
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TTAACTAGCCTTCGCAAAAAGATCGATAGTTTAATCGATAACCTTGTAGC 750
TTAACTAGCCTTCGCAAAAAGATCGATAATTTAATCGATAACCTTGTAGC 746
**************************** *********************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TGAGCATACTGTTAACACCTCCAGTAAAACTAACGAGACACTCCTCGATG 800
TGAGCATACTGTTAACACCTCCAGTAAAACTAACGAGACACTCCTCGATG 796
**************************************************
11
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TTCTTTTAAGGCTCAAAGACAGTGCTGAATTCCCATTAACATCTGATAAC 850
TTCTTTTAAGGCTCAAAGACAGTGCTGAATTCCCATTAACATCTGATAAC 846
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ATTAAAGCCATCATTTTGGATATGTTTTGGAGCAGGCACAGACACTTCCT 900
ATTAAAGCCATCATTTTGGATATGTTT-GGAGCAGGCACAGACACTTCCT 895
*************************** **********************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CATCCACAATCGAATGGGGCGATTTCGGAACTCATAAAGTGTCCGAAAGC 950
CATCCACAATCGAATGGG-CGATTTCGGAACTCATAAAGTGTCCGAAAGC 944
****************** *******************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATGGGAGAAAGTACAAGCGGGAATTGAGGAAAGCATTGAACGGGAAAAG 1000
AATGG-AGAAAGTACAAGCGG-AATTGAGGAAAGCATTGAACGG-AAAAG 991
***** *************** ********************** *****
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AAAAGATCCCATGAGGAAGACATTCAAGAACTAAGCTACTTGAACATGGT 1050
AAAAGATCC-ATGAGGAAGACATTCAAGAACTAAGCTACTTGAACATGGT 1040
********* ****************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATCAAAGAAACATTGGAGGTTGCACCCTCCACTACCCCTTGGTTCTTGC 1100
AATCAAAGAAACATTG-AGGTTGCACCCTCCACTACCC-TTGGTTCT-GC 1087
**************** ********************* ******** **
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CAAGAGAAGTGCCGCCCAACCAAGTCAATTTTGGCTGGGATACAAACATA 1150
CAAGAGA-GTGCCGCC-AACCA-GTCAATTT-GGCTGG-ATACAA-CATA 1131
******* ******** ***** ******** ****** ****** ****
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CCCCAATAAGACCAAACTTATTGTCAACGTCTTTGCGATAAATAGGGACC 1200
CCC-AATAAGACCAAACTTATTGTCAACGTCTTTGCGATAAATAGGGACC 1180
*** **********************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CTGAATATTGGAAAGACGCTGAAGCTTTCATCCCTGAACGATTTGAAAAT 1250
CTGAATATTGGAAAGACGCTGAAGCTTTCATCCCTGAACGATTTGAAAAT 1230
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AGTTCTGCAACTGTCATGGGTGCAGAATACGAGTATCTTCCGTTTGGAGC 1300
AGTTCTGCAACTGTCATGGGTGCAGAATACGAGTATCTTCCGTTTGGAGC 1280
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TGGGAGAAGGATGTGTCCTGGAGCCGCACTTGGTTTAGCTAACGTGCAGC 1350
TGGGAGAAGGATGTGTCCTGGAGCCGCACTTGGTTTAGCTAACGTGCAGC 1330
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TCCCGCTCGCTAATATACTATATCATTTCAACTGGAAACTCCCCAATGGT 1400
TCCCGCTCGCTAATATACTATATCATTTCAACTGGAAACTCCCCAATGGT 1380
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
GTGAGCTATGACCAGATCGACATGACCGAGAGCTCTGGAGCCACGATGCA 1450
GTGAGCTATGACCAGATCGACATGACCGAGAGCTCTGGAGCCACGATGCA 1430
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AAGAAAGGCTGAGTTGTTACTCGT-CCAAGTTTCTAG 1486
AAGAAAGGCTGAGTTGTTACTCGTTCCAAGTTTCTAG 1467
************************ ************
12
Lampiran 2. Pohon filogenetik gen CYP71AV dengan complete cds A.annua (JQ2549922.1)
Escherichia coli DH-5α
OLIVIA SCARINTA
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Kloning gen
CYP71AV asal Artemisia annua di dalam Escherichia coli DH-5α” adalah karya
bersama saya dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, November 2014
Olivia Scarinta
NIM G34100094
ABSTRAK
OLIVIA SCARINTA. Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Kasus infeksi malaria menyebabkan 1.7 – 2.5 juta orang/tahun mengalami
kematian. Artemisia annua mengandung senyawa artemisinin yang efektif untuk
membasmi jenis-jenis malaria yang resisten terhadap kuinin dan klorokuin.
CYP71AV merupakan gen yang memiliki peranan penting dalam biosintesis
artemisinin dengan cara mengkatalis oksidasi dari produk intermediate yang banyak
dihasilkan dalam biosintesis artemisinin yaitu amorpha-4,11-diene. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkloning gen CYP71AV melalui teknologi DNA rekombinan.
Gen CYP71AV diamplifikasi dari cDNA total dengan menggunakan primer
spesifik. cDNA CYP71AV disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Plasmid
rekombinan yang mngandung gen CYP71AV diintroduksikan ke dalam
Escherichia coli galur DH5-α. Pengurutan cDNA CYP71AV menghasilkan sekitar
1571 pasang basa yang menyandikan 523 asam amino. Analisis kesejajaran lokal
nukleotida dengan CYP71AV dari beberapa spesies yang terdaftar di GeneBank
menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki kemiripan sebesar 98% dengan
complete cds A.annua (JQ254992.1). Hasil analisis domain menunjukkan bahwa
cDNA CYP71AV memiliki tiga daerah domain terkonservasi.
Kata kunci : cDNA CYP71AV, kloning, Artemisia annua.
ABSTRACT
OLIVIA SCARINTA. Cloning of CYP71AV gene from Artemisia annua into
Escherichia coli DH-5α. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and ARIS
TJAHJOLEKSONO.
Infection of malaria caused 1.7-2.5 million people die each year. Artemisia
annua contains artemisinin compounds effective to eradicate malaria types that are
resistant to quinine and chloroquine. CYP71AV is a gene that has critical role in
the biosynthesis of artemisinin by catalyzing the oxidation of intermediate
products Amorpha-4,11-diene, which are highly produced in the biosynthesis of
artemisinin. This study aimed to clone the CYP71AV gene through recombinant
DNA technology. CYP71AV gene from total cDNA was amplified using specific
primers. CYP71AV gene was inserted into pGEM-T Easy plasmid. The
recombinant plasmid containing CYP71AV gene introduced into Escherichia coli
strain DH5-α. CYP71AV gene sequencing produce approximately 1571 base pairs
encoding 523 amino acids. Local alignment analysis of nucleotides with CYP71AV
of several species listed in GeneBank showed that the cDNA CYP71AV have 98%
similarity with complete cds A.annua (JQ254992.1). Domain analysis showed that
the CYP71AV gene has three conserved domain.
Key words: cDNA CYP71AV, clone, Artemisia annua.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KLONING GEN CYP71AV ASAL Artemisia annua DI DALAM
Escherichia coli DH-5α
OLIVIA SCARINTA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi
Nama
NIM
Program Studi
: Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α
: Olivia Scarinta
: G34100094
: Biologi
Disetujui oleh
Dr Utut Widyastuti MSi
Pembimbing I
Dr Ir Aris Tjahjoleksono DEA
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena
skripsi yang berjudul “Kloning gen CYP71AV asal Artemisia annua di dalam
Escherichia coli DH-5α” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini merupakan
salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana di Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua
pihak yang telah memberikan bantuan dan dorongan hingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini, yaitu:
1
Dr Utut Widyastuti MSi dan Dr Ir Aris Tjahloleksono selaku dosen
pembimbing yang telah memberikan dana penelitian serta pengarahan dalam
penyusunan skripsi ini,
2
Dr Achmad Farajallah selaku dosen penguji yang telah memberikan saran
dan kritik untuk perbaikan skripsi ini,
3
Dr Ir Iman Rusmana MSi selaku ketua Departemen Biologi,
4
Mbak Pepi Elvavina yang telah membantu penulis selama penelitian di
Laboratorium,
5
Bernadi Tenggarahardja, Veronica Meiji, Nicholas Kevin serta seluruh
keluarga yang telah memberikan motivasi kepada penulis,
6
Tommy Gantohe, Silvana Godelifa Marsiana Fofid, Theresia Farneubun, dan
seluruh teman-teman Tim Pendamping.
7
Seluruh teman-teman Biologi 47 dan BIORIN.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna.
Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun dari semua pihak sangat
diharapkan. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak yang
memerlukannya.
Bogor, November 2014
Olivia Scarinta
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
1
Ruang Lingkup Penelitian
1
BAHAN DAN METODE
2
Waktu dan Tempat Penelitian
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Penelitian
2
Perbanyakan cDNA
2
Penyisipan fragmen DNA pada vektor pengklonan
2
Transformasi
3
Identifikasi hasil transformasi dan sekuensing
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Perbanyakan cDNA
4
Ligasi dan Transformasi
4
Identifikasi koloni rekombinan
5
Analisis urutan nukleotida gen CYP71AV
7
SIMPULAN DAN SARAN
8
Simpulan
8
Saran
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
10
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL
1 Rasio molaritas sisipan dan vektor pada proses ligasiError! Bookmark not defined.
2 Rasio molaritas ligasi dan hasil transformasi
5
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi cDNA
2 Koloni yang tumbuh pada media LA+Amp+X-gal+IPTG dari hasil
transformasi
3 Peta plasmid pGEM-T Easy
4 Hasil PCR koloni dengan primer T7-SP6
5 Hasil PCR dengan primer kombinasi A (CYPF-SP6) dan B (T7-CYPR)
6 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim NotI
7 Perbandingan daerah domain terkonservasi cDNA CYP71AV dengan
complete cds Artemisia annua (JQ254992.1)
4
5
6
6
6
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
Perbedaan sekuen nukleotida CYP71AV dengan complete cds
Artemisia annua (JQ254992.1)
Pohon filogenetik gen CYP71AV dengan complete cds
A.annua
(JQ2549922.1)
10
12
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Adanya kemampuan Multidrug Resistance pada Plasmodium falciparum
menyebabkan malaria menjadi salah satu dari penyakit paling mematikan di
dunia. Lebih dari 600 juta kasus infeksi malaria menyebabkan 1.7 – 2.5 juta
orang/tahun mengalami kematian. Empat puluh persen dari jumlah tersebut
terdapat di negara berkembang, antara lain India, Indonesia, negara-negara di
Amerika Latin dan negara-negara di Afrika (Graz et al. 2011). Artemisia annua L.
(Asteraceae) merupakan tanaman obat yang sudah lama digunakan di Cina sebagai obat
antimalaria, mengandung senyawa terpenoid komplek artemisinin yang merupakan
senyawa seskuiterpen lakton endoperoksidase (Ferreira & Janick 1996). Artemisinin
adalah senyawa yang efektif untuk membasmi jenis-jenis malaria yang resisten
terhadap kuinin dan klorokuin serta malaria serebral yang disebabkan oleh
Plasmodium falciparum (Paniego & Giuletti 1994). Introduksi A. annua dari daerah
asalnya yang beriklim subtropik ke daerah tropik menyebabkan tanaman cepat
berbunga sehingga produktivitas artemisinin turun. Artemisia vulgaris adalah
jenis Artemisia lokal Indonesia yang dikenal dengan nama daerahnya sudamala
mengandung artemisinin 2.55 ppm lebih rendah dibandingkan kandungan
artemisinin A. annua (4.99 ppm) (Aryanti et al 2006) . Herba ini tersebar hampir
di semua dataran tinggi di Indonesia terutama di Papua. Pembuatan senyawa
artemisinin sintetik membutuhkan biaya yang besar sehingga A.annua ini masih
menjadi satu-satunya sumber obat tersebut. Tanaman A.annua memiliki gen
CYP71AV yang berperan penting dalam biosintesis artemisinin dengan cara
mengkatalis oksidasi dari produk intermediate amorpha-4,11-diene yaitu intermediate
yang banyak dihasilkan dalam biosintesis artemisinin (Teoh et al. 2006). Ekspresi gen
CYP71AV diketahui meningkat pada perkembangan daun setengah membuka yang
ditandai dengan meningkatnya kandungan artemisinin pada kelenjar trikoma
(Widyastuti et al. 2012). Oleh karena itu, kloning gen CYP71AV diharapkan dapat
digunakan untuk perbaikan genetik pada tanaman Artemisia annua maupun Artemisia
lokal Indonesia melalui penggunaan teknologi DNA rekombinan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning gen CYP71AV melalui teknologi
DNA rekombinan dan identifikasi cDNA.
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini antara lain perbanyakan cDNA, ligasi,
transformasi, PCR koloni, pemotongan DNA dengan enzim restriksi dan
sekuensing DNA.
2
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2014 sampai Juni 2014 di
Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands (BIORIN),
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Dramaga.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah cDNA yang berasal dari hasil penelitian
Widyastuti et al (2012), plasmid p-GEMT Easy digunakan sebagai vektor
pengklonan dan E.coli strain DH-5α sebagai inang vektor rekombinan, antibiotik
ampisilin 50 mg/mL, media inkubasi dan bahan-bahan proses ligasi dan
transformasi.
Alat
Alat yang digunakan adalah mesin PCR, microtube Eppendorf, pipet mikro,
laminar air flow cabinet, sentrifuse, mesin elektroforesis dan UV transilluminator.
Prosedur Penelitian
Perbanyakan cDNA
cDNA penyandi protein CYP71AV diperbanyak dengan PCR menggunakan
primer spesifik CYP71AV1-F (5’ CACCATGGCACTCTCACTGACCAC3’) dan
CYP71AV1-R (5’ CTAGAAACTTGGAACGAGTAACAAC3’). Untuk PCR, 100
ng cDNA dicampur dengan 0.2 µL Taq polimerase (5 ng/µL), 1 µL dNTP 2 mM,
0.25 µL primer forward 10 mM, 0.25 µL primer reverse 10 mM, 1 µL Taq buffer
10 x dan ditambah dengan ddH2O sehingga volume akhir mencapai 10 µL. PCR
dijalankan dengan program predenaturasi 950 C selama 5 menit, denaturasi 940 C
selama 30 detik, annealing 520 C selama 30 detik, dan elongasi 720 C selama 90
detik. Proses denaturasi, annealing, dan elongasi dilakukan sebanyak 30 siklus.
Penyisipan fragmen DNA pada vektor pengklonan
Sebanyak 2-15 ng cDNA yang dihasilkan dari PCR selanjutnya dicampur
dengan 1 µL pGEM-T easy 10 ng/µL, 0.2 µL DNA ligase T4 5 ng/µL , 5 µL 2x
buffer ligasi dan ditambah dengan ddH2O steril hingga volume akhir mencapai 10
µL, kemudian diinkubasikan pada suhu 40 C selama semalam (16 jam). Untuk
memperoleh hasil pengklonan yang optimal, jumlah DNA sisipan (cDNA
CYP71AV) yang dibutuhkan dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
Vektor (ng) x Ukuran sisipan (kb)
Jumlah sisipan (ng) =
x Rasio molaritas
Ukuran vektor (kb)
3
Bila rasio molaritas sisipan dengan vektor adalah 3:1, jumlah vektor 10 ng,
ukuran vektor 3000 bp dan ukuran sisipan sebesar 1500 bp maka berdasarkan
rumus tersebut, jumlah sisipan yang dibutuhkan adalah 15 ng.
Ligasi dilakukan pada tiga taraf perbandingan seperti ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1 Rasio molaritas sisipan dan vektor pada proses ligasi
Rasio molaritas sisipan
Kode
Sisipan (ng) Vektor (ng)
dan vektor
A
3:1
15
10
B
1:1
5
10
C
1:3
2
10
Transformasi
Transformasi dilakukan dengan mengikuti metode yang digunakan oleh
Suharsono (2002). Untuk itu, satu koloni bakteri E. coli galur DH5-α dikulturkan
dalam 2 mL media LB (Bacto Trypton, Bacto Yeast dan NaCl) cair di dalam
shaking incubator (kecepatan 250 rpm), pada suhu 37oC, selama semalam,
kemudian disubkulturkan di dalam 5 mL media LB cair hingga OD600=0.4-0.5.
Bakteri diinkubasi selama 10 menit di dalam es dan diendapkan dengan cara
disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit. Endapan
bakteri disuspensikan dalam 495 µL buffer transformasi dan diinkubasi di dalam
es selama 10 menit. Setelah sentrifugasi, endapan bakteri disuspensikan dalam
125 µL TB (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM
MnCl2.4H2O, pH6.7), kemudian ditambah dengan 8.8 µL DMSO dan diinkubasi
di dalam es selama 10 menit sehingga diperoleh bakteri kompeten.
Sebanyak 50 µL dari bakteri kompeten dicampur dengan 10 µL produk
ligasi dan diinkubasi di dalam es selama 25 menit. Campuran ini kemudian
diinkubasi pada suhu 42oC, selama 60 detik, kemudian dimasukkan kembali ke
dalam es dan dibiarkan di dalamnya selama 5 menit. Campuran ini ditambah
dengan 100 µL media 2xYT (16 g/L Bacto-tryptone, 10 g/L Bacto yeast extract, 5
g/L NaCl, pH 7.0) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Bakteri
disebar secara merata dengan menggunakan batang kaca di atas media LA yang
mengandung 100 mg/L ampisilin dan 10 L 100 mM IPTG (Isopropiltio-βgalaktosida) serta 50 L 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3-indoly-β-Dgalactoside, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC semalam. Sebagai kontrol
pertumbuhan E.coli, sel bakteri E.coli kompeten disebar di atas media LA tanpa
ampisilin sedangkan untuk kontrol media, sel bakteri kompeten disebar di atas
media LA dengan ampisilin.
Identifikasi hasil transformasi dan sekuensing
Koloni yang membawa DNA rekombinan berwarna putih sedangkan yang
tidak membawa DNA rekombinan berwarna biru. Koloni yang membawa DNA
rekombinan selanjutnya diverifikasi dengan menggunakan PCR dengan primer
spesifik CypF-SP6 dan T7-CypR dan enzim restriksi Not1 yang akan memisahkan
vektor dan DNA asing yang disisipkan. Koloni yang telah membawa DNA
rekombinan selanjutnya disekuensing. Pengurutan DNA (DNA sequencing)
dilakukan oleh PT Genetika Science. Urutan nukleotida dari gen CYP71AV
4
dianalisis kemiripan dan homologinya dengan menggunakan program BLAST2
(Basic_Local_Alignment_Search_Tools) (http://www.ebiac.uk/blast2). Analisis
daerah terkonservasi dan domain dilakukan dengan menggunakan program
conserved domain NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Perbanyakan cDNA
Perbanyakan cDNA menggunakan PCR menghasilkan pita DNA yang
berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 1). Selain untuk memastikan keberadaan gen
target yang akan diklon dan dianalisis, hasil amplifikasi ini juga menunjukkan
konsentrasi cDNA CYP71AV yang tersimpan dalam stok. Konsentrasi cDNA
CYP71AV diperoleh dengan cara membandingkan visualisasi kecerahan pita
terhadap marker lamda ( ) pada gel elektroforesis. Hasil elektroforesis
menunjukkan konsentrasi CYP71AV pada stok cDNA adalah 50 ng/µL.
M
1
2000 bp
1500 bp
CYP71AV
1000 bp
Gambar 1 Hasil amplifikasi cDNA. M : marker 1 kb, lajur 1 merupakan hasil
amplifikasi cDNA.
Ligasi dan Transformasi
Gen CYP71AV yang berhasil diamplifikasi dari cDNA selanjutnya
diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy kemudian diintroduksikan ke dalam
E.coli galur DH5-α. Ligasi dilakukan pada tiga taraf perlakuan (Tabel 1). Seleksi
terhadap E.coli yang mengandung plasmid rekombinan pembawa sisipan fragmen
cDNA CYP71AV dilakukan pada media seleksi yang mengandung antibiotik
ampisilin, X-gal dan IPTG. Plasmid pGEM-T easy selain sebagai vektor pembawa
juga digunakan sebagai marker penyeleksi karena mengandung gen lacZ yang
menyandikan β-galaktosidase (β-gal), suatu enzim yang dapat mendegradasi
disakarida laktosa menjadi monosakarida glukosa dan galaktosa yang disertai
dengan perubahan warna media. X-gal adalah senyawa yang memiliki struktur
mirip dengan laktosa. Media akan menjadi biru ketika β-gal memotong struktur
X-gal tersebut. Koloni berwarna putih jika X-gal tidak terpotong karena koloni
tidak menghasilkan β-gal. Adanya sisipan pada gen lacZ menyebabkan gen lacZ
tidak diekspresikan sehingga koloni tidak menghasilkan β-gal (Sambrook 1989).
5
Dari 3 taraf perlakuan, hanya 2 yang menunjukkan hasil positif, hal ini
ditunjukkan dengan adanya koloni biru dan putih pada cawan A dan C, sedangkan
pada cawan B sama sekali tidak ada koloni yang tumbuh (Tabel 2). Keberhasilan
dari ligasi sangat ditentukan oleh perbandingan antara sisipan dan vektor yang
digunakan serta ukuran sisipan. Ukuran sisipan yang kecil menghasilkan peluang
terjadinya ligasi dengan lebih baik. Selain itu ketidak berhasilan ligasi juga
ditentukam oleh kualitas enzim ligasi.
Tabel 2 Rasio molaritas ligasi dan hasil transformasi
Rasio molaritas
Sisipan
Kode
sisipan dan vektor
(ng)
A
3:1
15
B
1:1
5
C
1:3
2
Kontrol media tanpa
antibiotik
Kontrol media
dengan antibiotik
Kontrol media tanpa
antibiotik
Cawan A
Vektor
(ng)
10
10
10
-
Jumlah
koloni/cawan
2
5
> 50
-
-
Kontrol media dengan
antibiotik
Cawan B
Cawan C
Gambar 2 Koloni yang tumbuh pada media LA+Amp+X-gal+IPTG dari hasil
transformasi
Identifikasi Koloni Rekombinan
Koloni dari cawan A dan C (Gambar 2) selanjutnya diidentifikasi
menggunakan PCR koloni dengan primer spesifik. PCR koloni dilakukan untuk
memastikan bahwa cDNA hasil kloning telah tersisip ke dalam plasmid pGEM-T
Easy. Sebanyak 7 koloni telah diidentifikasi yaitu 2 koloni berasal dari cawan A
6
dan 5 koloni berasal dari cawan C. Identifikasi dengan PCR dilakukan sebanyak 2
kali, pertama dengan primer T7-SP6 untuk memastikan bahwa koloni tesebut telah
mengandung gen target yang dibawa oleh plasmid pGEMT-Easy (Gambar 3) dan
yang ke dua dengan kombinasi primer CYPF-SP6 dan T7-CYPR untuk
memastikan bahwa gen target telah tersisip ke dalam vektor. PCR koloni dari
cawan A dan cawan C menggunakan primer T7-SP6 menghasilkan pita yang
berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 4). Kedua koloni tersebut kemudian
digunakan untuk PCR koloni menggunakan kombinasi primer CYPF-SP6 dan T7CYPR dan hasilnya adalah pita berukuran sekitar 1500 bp (Gambar 5).
Gambar 3 Peta plasmid pGEM-T Easy
1
2
3
4
5
6
7
1 kb
2000 bp
1500 bp
1000 bp
Gambar 4 Hasil PCR koloni dengan primer T7-SP6. 1-2: koloni cawan A, 3-7:
koloni cawan B, marker: 1 kb.
2A
2B
4A
4B
1 kb
1500 bp
1000 bp
Gambar 5 Hasil PCR dengan primer kombinasi A (CYPF-SP6) dan B (T7-CYPR).
2A & 2B: koloni 2, 4A & 4B: koloni 4.
Untuk memastikan bahwa fragmen cDNA telah tersisip ke dalam vektor
maka DNA plasmid rekombinan diisolasi dari masing-masing koloni (koloni 2 &
4). Plasmid hasil isolasi ini kemudian dipotong dengan enzim restriksi NotI untuk
memastikan keberadaan gen sisipan.
Pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim NotI menghasilkan 2 pita
seperti terlihat pada Gambar 6. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid rekombinan
7
berhasil dipotong menjadi 2 bagian yaitu plasmid vektor dan fragmen sisipan
(cDNA atau gen CYP71AV). Pita yang berada di bagian atas adalah vektor yang
berukuran sekitar 3000 bp sedangkan pita yang berada di bawah adalah gen
CYP71AV yang berukuran sekitar 1500 bp. Posisi pita plasmid rekombinan baik
yang dipotong maupun yang tidak dipotong sejajar meskipun ukurannya berbeda,
hal ini disebabkan oleh plasmid rekombinan yang tidak dipotong bentuknya
sirkuler sehingga tidak bisa dipastikan ukurannya. Selain posisi, pita yang
dihasilkan juga sangat tipis, hal ini disebabkan oleh sedikitnya plasmid yang
berhasil diisolasi.
2-NotI
2
1 kb
4
4-NotI
3000 bp
plasmid
pGEM T1500 bp
CYP71AV
Gambar 6 Hasil pemotongan plasmid dengan enzim NotI. 2- NotI: plasmid
rekombinan dipotong, 2: plasmid rekombinan klon 2 tidak dipotong,
1 kb: marker 1 kb, 4: plasmid rekombinan klon 4 tidak dipotong, 4NotI: plasmid rekombinan dipotong.
Analisis Urutan Nukleotida Gen CYP71AV
Pengurutan cDNA CYP71AV menghasilkan 1571 pb yang menyandikan 523
asam amino. Analisis kesejajaran lokal (local alignment) dilakukan untuk melihat
kesamaan dan kekerabatan dengan berbagai spesies yang tersedia di GeneBank.
Hasil analisis menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool) menunjukkan bahwa fragmen cDNA CYP71AV memiliki nilai kemiripan
yang tinggi dengan complete cds Artemisia annua (JQ254992.1), yaitu sebesar
98% dan nilai E-value sebesar nol. Nilai E-value merupakan nilai yang
menunjukkan signifikasi kemiripan sekuen. Jika suatu sekuen memiliki nilai Evalue semakin mendekati nilai 0 (nol) maka semakin dapat disimpulkan bahwa
sekuen tersebut mirip terhadap pasangan pengurutannya. Sebaliknya, jika suatu
sekuen memiliki nilai E-value lebih besar dari 0.001 maka sekuen tersebut sulit
untuk disimpulkan kemiripannya dengan data yang diambil dari GeneBank
(Claverie & Notredame 2003). Perbedaan nukleotida antara sekuen cDNA
CYP71AV dengan complete cds Artemisia annua dapat dilihat pada Lampiran 1.
Hasil filogenetik menunjukkan bahwa fragmen cDNA CYP71AV memiliki
kekerabatan paling dekat dengan Artemisia annua (Lampiran 2).
Selain terdapat perbedaan sebanyak 19 basa nukleotida, kedua sekuen ini
juga memiliki perbedaan pada domain yang terkonservasi. cDNA CYP71AV
memiliki tiga daerah domain terkonservasi yang berada pada interval 10-453, 497-
8
1078 dan 376-1478, sementara daerah domain terkonservasi pada complete cds
Artemisia annua (JQ254992.1) berada pada keseluruhan sekuen. Perbandingan
daerah domain terkonservasi kedua sekuen tersebut disajikan pada Gambar 7.
Hasil analisis domain menunjukkan bahwa urutan asam amino CYP71AV diduga
termasuk ke dalam tipe cytochrome P450 (Gambar 7). Cytochrome P450 adalah
kelompok protein heme-tiolase yang terlibat dalam degradasi oksidatif berbagai
senyawa, terutama racun lingkungan dan mutagen. Protein ini dibagi menjadi
empat kelas berdasarkan cara elektron dari NAD(P)H dikirim ke situs katalitik.
Konservasi sekuen cenderung rendah dalam famili ini dan hanya ada tiga residu
yang terkonservasi. Cytochrome P450 pada eukariot memiliki fungsi enzimatis
untuk mengkatalis hidrokarbon non aktif pada suhu fisiologis (NCBI 2010).
Gambar 7 Perbandingan daerah domain terkonservasi cDNA CYP71AV dengan
complete cds Artemisia annua (JQ254992.1)
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Kloning gen CYP71AV telah berhasil dilakukan. Analisis kesejajaran lokal
urutan nukleotida menunjukkan bahwa cDNA CYP71AV memiliki nilai kemiripan
yang tinggi terhadap complete cds Artemisia annua (JQ2549922.1).
Saran
Perlu dilakukan optimasi pada metode isolasi plasmid agar hasil yang
diperoleh lebih optimal.
9
DAFTAR PUSTAKA
Aryanti, Ermayanti TM, Prinadi KI, Dewi RM. 2006. Uji daya antimalaria
Artemisia spp.
Terhadap Plasmodium falcifarum. Majalah Farmasi
Indonesia 17 (2): 81-84
Claverie JM, Notredame C. 2003. Bioinformatics for Dummies. Willey Publishing
Inc. New York.
Ferreira JFS, J Janick. 1995. Floral morphology of Artemisia annua with special
reference to trichomes. Int J Plant Sci 156 : 807-815.
Graz B, Kitua A, Malebo HM. 2011. To what extent can traditional medicine
contribute a complementary or alternative solution to malaria control
programmes? Malaria Journal 10: 1-6.
[NCBI] National Center for Biotechnology Information. 2010. Cytochrome P450
[internet].
[diacu
17
Oktober
2014]
Tersedia
dari:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Paniego NB, AM Giuletti. 1994. Artemisia annua L. : dedifferentiated and
differentiated cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36 : 163-168.
Sambrook J, Fritsch EJ, Maniatis T. 1989. Molecular cloning : A Laboratory
Manual. Second edition. Cold Spring Harbour : Laboratory Press.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati 3:6770
Teoh. KH, Polichuk DR, Reed DW, Nowak G, Covello PS. 2006. Artemisia
annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a
cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial
sesquiterpene lactone artemisinin. FEBS Letters 580: 1411-1416
Widyastuti U, Juliarni, Widiyastuti Y. 2012. Identifikasi Trikoma Kelenjar untuk
Produksi Artemisinin pada Artemisia annua L. menggunakan pendekatan
molekular. Prosiding Seminar Hasil Penelitian IPB. LPPM. Bogor
10
LAMPIRAN
Lampiran 1. Perbedaan sekuen nukleotida CYP71AV dengan complete cds Artemisia annua
(JQ254992.1)
CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ATGGCACTCTCACTGACCACCTCCATTGCTCTTGCCACGATCCTTTTCTT 50
ATGGCACTCTCACTGACCACTTCCATTGCTCTTGCAACGATCCTTTTGTT 50
******************** ************** *********** **
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CGTAATCTACAAGTTCGCTACTCGTTCCAAATCCACAAAAAACAGCCTTC 100
CGT---TTACAAGTTCGCTACTCGTTCCAAATCCACCAAAAAAAGCCTTC 97
***
***************************** ***** *******
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CTGAGCCATGGCGACTTCCCATTATTGGTCACATGCATCACTTGATTGGT 150
CTGAGCCATGGCGACTTCCCATTATTGGTCACATGCATCACTTGATTGGT 147
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ACAATACCACATCGTGGGCTTATGGATTTAGCCAGAAAGTATGGATCTTT 200
ACAACGCCACATCGTGGGGTTAGGGATTTAGCCAGAAAGTATGGATCTTT 197
**** ************ *** ***************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATGCATTTACAGCTTGGTGAAGTTTCAACAATCGTGGTGTCATCTCCGA 250
GATGCATTTACAGCTTGGTGAGGTTCCAACAATCGTGGTGTCATCTCCGA 247
******************** *** ************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATGGGCTAAAGAGATTTTGACAACGTACGACATTTCCTTTGCTAACAGG 300
AATGGGCTAAAGAGATTTTGACAACGTACGACATTACCTTTGCTAACAGG 297
*********************************** **************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CCCGAGACTTTAACTGGTGAGATTGTTTTATATCACAATACGGATGTTGT 350
CCCGAGACTTTAACTGGTGAGATTGTTTTATATCACAATACGGATGTTGT 347
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TCTTGCACCTTATGGTGAATACTGGAGGCAATTACGTAAAATTTGCACAT 400
TCTTGCACCTTATGGTGAATACTGGAGGCAATTACGTAAAATTTGCACAT 397
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TGGAGCTTTTGAGTGTTAAGAAAGTAAAGTCATTTCAGTCGCTTCGTGAA 450
TGGAGCTTTTGAGTGTTAAGAAAGTAAAGTCATTTCAGTCGCTTCGTGAA 447
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
GAGGAGTGTTGGAATTTGGTTCAAGAGATTAAAGCTTCAGGTTCAGGGAG 500
GAGGAGTGTTGGAATTTGGTTCAAGAGATTAAAGCTTCAGGTTCAGGGAG 497
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ACCCGGTTAACCTTTCAGAGAATGTTTTCAAGTTGATTGCAACGATACTT 550
ACC-GGTTAACCTTTCAGAGAATGTTTTCAAGTTGATTGCAACGATACTT 546
*** **********************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AGTAGAGCCGCATTTGGGAAAGGGATCAAGGACCAGAAAGAGTTAACGGA 600
AGTAGAGCCGCATTTGGGAAAGGGATCAAGGACCAGAAAGAGTTAACGGA 596
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
GATTGTGAAAGAGATACTGAGGCAAACTGGTGGTTTTGATGTGGCAGATA 650
GATTGTGAAAGAGATACTGAGGCAAACTGGTGGTTTTGATGTGGCAGATA 646
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TCTTTCCTTCAAAGAAATTTCTTCATCATCTTTCGGGCAAGAGAGCTCGG 700
TCTTTCCTTCAAAGAAATTTCTTCATCATCTTTCGGGCAAGAGAGCTCGG 696
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TTAACTAGCCTTCGCAAAAAGATCGATAGTTTAATCGATAACCTTGTAGC 750
TTAACTAGCCTTCGCAAAAAGATCGATAATTTAATCGATAACCTTGTAGC 746
**************************** *********************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TGAGCATACTGTTAACACCTCCAGTAAAACTAACGAGACACTCCTCGATG 800
TGAGCATACTGTTAACACCTCCAGTAAAACTAACGAGACACTCCTCGATG 796
**************************************************
11
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TTCTTTTAAGGCTCAAAGACAGTGCTGAATTCCCATTAACATCTGATAAC 850
TTCTTTTAAGGCTCAAAGACAGTGCTGAATTCCCATTAACATCTGATAAC 846
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
ATTAAAGCCATCATTTTGGATATGTTTTGGAGCAGGCACAGACACTTCCT 900
ATTAAAGCCATCATTTTGGATATGTTT-GGAGCAGGCACAGACACTTCCT 895
*************************** **********************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CATCCACAATCGAATGGGGCGATTTCGGAACTCATAAAGTGTCCGAAAGC 950
CATCCACAATCGAATGGG-CGATTTCGGAACTCATAAAGTGTCCGAAAGC 944
****************** *******************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATGGGAGAAAGTACAAGCGGGAATTGAGGAAAGCATTGAACGGGAAAAG 1000
AATGG-AGAAAGTACAAGCGG-AATTGAGGAAAGCATTGAACGG-AAAAG 991
***** *************** ********************** *****
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AAAAGATCCCATGAGGAAGACATTCAAGAACTAAGCTACTTGAACATGGT 1050
AAAAGATCC-ATGAGGAAGACATTCAAGAACTAAGCTACTTGAACATGGT 1040
********* ****************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AATCAAAGAAACATTGGAGGTTGCACCCTCCACTACCCCTTGGTTCTTGC 1100
AATCAAAGAAACATTG-AGGTTGCACCCTCCACTACCC-TTGGTTCT-GC 1087
**************** ********************* ******** **
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CAAGAGAAGTGCCGCCCAACCAAGTCAATTTTGGCTGGGATACAAACATA 1150
CAAGAGA-GTGCCGCC-AACCA-GTCAATTT-GGCTGG-ATACAA-CATA 1131
******* ******** ***** ******** ****** ****** ****
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CCCCAATAAGACCAAACTTATTGTCAACGTCTTTGCGATAAATAGGGACC 1200
CCC-AATAAGACCAAACTTATTGTCAACGTCTTTGCGATAAATAGGGACC 1180
*** **********************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
CTGAATATTGGAAAGACGCTGAAGCTTTCATCCCTGAACGATTTGAAAAT 1250
CTGAATATTGGAAAGACGCTGAAGCTTTCATCCCTGAACGATTTGAAAAT 1230
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AGTTCTGCAACTGTCATGGGTGCAGAATACGAGTATCTTCCGTTTGGAGC 1300
AGTTCTGCAACTGTCATGGGTGCAGAATACGAGTATCTTCCGTTTGGAGC 1280
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TGGGAGAAGGATGTGTCCTGGAGCCGCACTTGGTTTAGCTAACGTGCAGC 1350
TGGGAGAAGGATGTGTCCTGGAGCCGCACTTGGTTTAGCTAACGTGCAGC 1330
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
TCCCGCTCGCTAATATACTATATCATTTCAACTGGAAACTCCCCAATGGT 1400
TCCCGCTCGCTAATATACTATATCATTTCAACTGGAAACTCCCCAATGGT 1380
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
GTGAGCTATGACCAGATCGACATGACCGAGAGCTCTGGAGCCACGATGCA 1450
GTGAGCTATGACCAGATCGACATGACCGAGAGCTCTGGAGCCACGATGCA 1430
**************************************************
Artemisia_SP6_T7_reverse_compl
gi|398708925|gb|JQ254992.1|
AAGAAAGGCTGAGTTGTTACTCGT-CCAAGTTTCTAG 1486
AAGAAAGGCTGAGTTGTTACTCGTTCCAAGTTTCTAG 1467
************************ ************
12
Lampiran 2. Pohon filogenetik gen CYP71AV dengan complete cds A.annua (JQ2549922.1)