Isolasi dan Kloning pada Escherichia coli Gen AaWRKY1 Artemisia annua L

i

ISOLASI DAN KLONING PADA Escherichia coli GEN AaWRKY1
Artemisia annua L

ELMITA HAPSARI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

ii

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Kloning
Gen AaWRKY1 Artemisia annua L adalah benar karya saya dengan arahan dari

komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.

Bogor, September 2014

ELMITA HAPSARI
NIM G84100088

iv

ABSTRAK
ELMITA HAPSARI. Isolasi dan Kloning pada Escherichia coli Gen AaWRKY1
Artemisia annua L Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan SRI KOERNIATI.
Gen AaWRKY1 menyandi protein WRKY1 yang merupakan aktivator
transkripsi Amorpha-4,11-diene synthase (ADS) yang berfungsi sebagai
katalisator biosintesis artemisinin sehingga peningkatan ekspresi gen AaWRKY1

secara berlebih dapat meningkatkan kadar artemisinin. Studi ini bertujuan
mengisolasi gen AaWRKY1 dari Artemisa annua L. Amplifikasi gen AaWRKY1
dilakukan dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan
pasangan primer spesifik dan cetakan cDNA. Fragmen gen AaWRKY1 produk
PCR selanjutnya diklon pada vektor kloning pJET 1.2 dengan bantuan enzim T4ligase dan ditransformasikan ke sel kompeten bakteri Escherichia coli DH5α
melalui metode kejut panas, serta ditumbuhkan pada media LB agar yang
mengandung antibiotik ampisilin, kemudian koloni diseleksi dengan PCR Koloni.
Hasil studi menunjukkan bahwa amplifikasi gen AaWRKY1 dengan primer
spesifik menghasikan amplikon berukuran ± 1500 pb. Fragmen gen tersebut
berhasil diklon ke vektor pJET 1.2 dan digunakan untuk mentransformasi sel E.
coli DH5α. Konfirmasi klon rekombinan dilakukan dengan PCR Koloni untuk
mendapatkan koloni rekombinan pembawa gen AaWRKY.
Kata kunci : Artemisia annua L, gen AaWRKY1, kloning, PCR Koloni, pJET 1.2.

ABSTRACT
ELMITA HAPSARI. Isolation and Cloning in Escherichia coli gene AaWRKY1 of
Artemisia annua L WRKY gene (AaWRKY1) from Artemisia annua L Supervised
by I Made Artika and Sri Koerniati.
Artemisia annua WRKY1 (AaWRKY1) gene encodes a protein WRKY a
transcriptional activator of Amorpha-4,11-diene synthase (ADS). The

overexpression farnesil diphosphate AaWRKY1 genes can increase levels of
artemisinin. This study was aimed to isolate an AaWRKY1 gene from Artemisia
annua L. Amplification of AaWRKY1 gene was done by PCR (Polymerase Chain
Reaction) technique using specific primer pairs and cDNA as a template.
Subsequently, AaWRKY1 gene fragment was cloned into a cloning vector pJET
1.2 using T4-ligase and transformed into competent cell Escherichia coli DH5α
through heat shock method, and grown on LB agar medium containing ampicillin.
Result showed that amplification with specific primers of AaWRKY1 gene
generated an amplicon fragment of ± 1500 bp. The gene fragment was succesfully
cloned into pJET 1.2 and transformed into cells of E. coli DH5α. Confirmation of
recombinant clone was carried out using colony PCR to obtain recombinant
colonies.
Keywords : Artemisia annua L , AaWRKY1 gene, cloning, colony PCR, pJET 1.2
Vector

v

ISOLASI DAN KLONING PADA Escherichia coli GEN AaWRKY1
Artemisia annua L

ELMITA HAPSARI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

vi

vii

Judul Skripsi : Isolasi dan Kloning pada Escherichia coli Gen AaWRKY1
Artemisia annua L

Nama
: Elmita Hapsari
NIM
: G84100088

Disetujui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Pembimbing I

Dr Ir Sri Koerniati, MSc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

viii

PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan
rahmat, taufik, serta hidayah-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Shalawat dan salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW
dan keluarga dan sahabatnya. Tema yang dipilih dalam penelitian yang
dilaksanakan Februari sampai Juni 2014 ini ialah Isolasi dan Kloning pada
Eschericia coli Gen AaWRKY1 Artemisia annua L.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
memberikan bantuan dalam pembuatan laporan ini. Ucapan terima kasih terutama
ditujukan kepada Bapak I Made Artika selaku dosen pembimbing utama dan Ibu
Sri Koerniati selaku pembimbing lapangan yang telah membimbing serta memberi
saran dan kritik yang membangun. Ucapan terima kasih penulis juga sampaikan
kepada para peneliti, teknisi, staf, serta sesama mahasiswa yang juga melakukan
penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jl. Tentara
Pelajar No.3A, Cimanggu, Bogor. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Bapak, Ibu, Mba Hesti, Mba Edna, Ario, serta teman-teman Sekar Arum

(Maya,Karan,Ezik,Jihan,Vivi,Ita,Ka Risma), Lia, Safirah, Ukdiah, Zahra, Afiah,
teman-teman ‘S’, teman-teman sepembimbingan dan teman-teman Biokimia 47
atas segala doa, dan dukungan yang selalu diberikan.
Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi berbagai pihak
dan Ilmu pengetahuan, khususnya ilmu Biokimia.

Bogor, September 2014
Elmita Hapsari

ix

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. x
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... x
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
METODE ................................................................................................................ 2
Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................................. 2
Bahan ................................................................................................................... 2
Alat ...................................................................................................................... 2

Prosedur ............................................................................................................... 3
HASIL ..................................................................................................................... 6
PEMBAHASAN ................................................................................................... 10
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 15
Simpulan ............................................................................................................ 15
Saran .................................................................................................................. 15
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 15
LAMPIRAN .......................................................................................................... 18
RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... 24

x

DAFTAR TABEL
1 Komposisi larutan mix ligasi vektor pJET 1.2
2 Komposisi larutan mix PCR Koloni
3 Hasil Kuantitas RNA total Artemisia Annua L

5
6
7

DAFTAR GAMBAR
Elektroforegram hasil kualitas RNA Artemisia Annua L
Elektroforegram amplikon gen AaWRKY1
Elektroforegram purifikasi amplikon gen AaWRKY1
Hasil transformasi gen AaWRKY1 pada palsmid pJET 1.2 melalui bakteri
E.coli DH5α
5 Elektroforegram PCR Koloni
6 Elektroforegram PCR Koloni 2

1
2
3
4

6
7
8
8
9

9

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6

Diagram alir penelitian
Peta plasmid pJET 1.2
Komposisi larutan sediaan
Ekstrasi dan Purifikasi DNA dengan QIAQuick Qiagen
Diagram Alir Pembuatan Sel Kompeten E.coli DH5α
Diagram Alir Pembuatan Media LB

18
19
20

21
22
23

1

PENDAHULUAN
Penyakit Malaria merupakan penyakit yang dapat menyebabkan kematian
terutama pada bayi, anak balita, dan ibu hamil. Penyakit Malaria juga masih
endemis di sebagian besar wilayah Indonesia.Wilayah Indonesia bagian Timur
merupakan wilayah stratifikasi malaria tinggi berdasarkan indikator Annual
Parasite Incidence (API) (Depkes RI 2009).
Pengobatan malaria umumnya mengacu pada rekomendasi WHO.
Indonesia memiliki obat antimalaria standar (klorokuin, kina, primakuin dan
sulfadoksin-primetamin). WHO (2010) menyatakan bahwa Plasmodium
falciparum yang merupakan parasit protozoa penyebab malaria telah resisten
terhadap pil kina yang digunakan sebagai obat antimalaria standar. Adanya
resistensi Plasmodium falciparum terhadap pil Kina membuat WHO membuat
rujukan baru untuk pengobatan penyakit malaria yaitu dengan Artemnisin
Combination Therapy (ACT) yang sudah mulai diterapkan di Indonesia sejak
tahun 2004. ACT menggunakan dua pigmen yaitu artesunate amodiaquine (AAQ)
dan dihydroartemisinin pip eraquine phosphate (DHP) selain itu AAQ memiliki
efek efikasi yang lebih kecil dan efek samping yang lebih berat dari DHP
(Hasugian et al 2007).
Tanaman Artemisia annua L mengandung bahan aktif artemisinin dengan
kadar rata-rata 0.1-0.8% dalam berat kering tanaman (Dongming et al 2009).
Namun budidaya di Indonesia hanya bisa menghasilkan tanaman Artemisia
dengan kadar artemisinin antara 0.39% (Gusmaini & Hera 2007). Atas dasar hal
tersebut, upaya peningkatan kadar artemisinin pada tanaman Artemisia annua L
diperlukan. Peningkatan kadar artemisinin dapat dilakukan dengan rekaya
genetika. Peningkatan produksi artemisinin diperlukan mengingat kasus malaria
yang masih tinggi di Indonesia khususnya bagian timur.
Salah satu pendekatan rekayasa genetik yang dapat dilakukan untuk
meningkatkan kadar artemisinin pada tanaman Artemisia annua L adalah dengan
mengkontrol ekspresi gen yang berkaitan dengan sintesis artemisinin. Langkah
utama dalam biosintesis artemisinin adalah siklus farnesil difosfat yang dikatalisis
oleh amorpha-4,11-diene synthase (ADS) yang diregulasi oleh gen faktor
transkripsi (Dongming et al 2009). Overekspresi gen faktor transkripsi merupakan
pendekatan yang menjanjikan untuk mendorong jalur metabolik sekunder
(Verpoorte dan Memelink 2002, Pertesen 2007). Teknologi DNA rekombinan
yang dilakukan adalah kloning gen AaWRKY1 yang diperoleh dari daun Artemisia
annua L.
Protein WRKY merupakan faktor transkripsi dapat menaikkan atau
menurunkan ekspresi gen (Oh et al. 2008). Gen AaWRKY1 menyandi protein
WRKY1 yang merupakan aktivator transkripsi Amorpha-4,11-diene synthase
(ADS). Protein WRKY merupakan suatu grup utama dalam faktor transkripsi pada
suatu tanaman spesifik. W-box memiliki elemen yang terdapat pada promoter
ADS. Gen AaWRKY1 mengkode leusin zipper yang terdapat protein WRKY dan
dapat berinteraksi dengan tiga kali elemen W-box (Dongming et al 2009).
Overexpresion pada gen AaWRKY1 akan mengaktifkan promoter ADS yang
secara stabil (Dongming et al 2009). Oleh sebab itu gen AaWRKY1 sangat
berpartisipasi dalam regulasi biosintesis artemisinin (Dongming et al 2009).

2

Pada Penelitian ini dilakukan isolasi gen AaWRKY1 dari tanaman
Artemisia annua L, apabila gen AaWRKY1 tersebut berhasil diisolasi dan
dikarakterisasi, maka pemulia tanaman dapat memanfaatkan gen tersebut sebagai
sumber gen baru dalam memperbaiki produktivitas artemisinin, seperti melalui
penyisipan gen tersebut ke dalam tanaman melalui teknologi rekayasa genetik.
Molekul DNA yang mengandung gen AaWRKY1 diperbanyak melalui
amplifikasi dan digunakan untuk mentransformasi sel Escherichia coli (Tsen et al.
2002). Penyisipan molekul DNA rekombinan ke dalam sel Escherichia coli
menggunakan vektor berupa plasmid pJET 1.2 sehingga akan menghasilkan sel
transforman yang mengandung AaWRKY1 untuk diaplikasikan pada tanaman
Artemisia annua L sehingga diharapkan tanaman yang sudah disisipin gen
AaWRKY1 dapat menghasilkan kadar artemisinin yang tinggi dan stabil.
Penelitian ini bertujuan melakukan isolasi gen AaWRKY1, dan mengklon gen ke
dalam vektor kloning pJET 1.2 agar dapat menambah koleksi penyediaan gen
yang memperbaiki produksi artemisinin. Penelitian ini diharapkan menjadi
langkah awal dalam menghasilkan lini tanaman transgenik Artemisia annua L
sehingga memiliki kadar artemisinin yang tinggi dan stabil.

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai Juni 2014 bertempat
di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar No.3A,
Cimanggu,Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun muda 0.1 gram
atau kurang lebih 2 helai daun muda tanaman Artemisia annua L, akuades,
nitrogen cair, mini kit RNeasy Qiagen (buffer RLT (Qiagen), buffer RPE (Qiagen),
buffer RW1(Qiagen), diethylpyrocarbonate (DEPC) 0.1 %, supermix 5x enzim
transcriptase i script, cDNA sintetase Roche, RNAs Free water,buffer PCR (5x
HiFi Fidelity), primer gen WR1 (forward 5’- GTC GAC ATG GAA AGT GTT
TGT GTT TAT GGA -3’, dan Reverse 5’- GAA TTC TTA AAA TTT GAA ATC
AAG GTC TAA ATC -3’), enzim Taq DNA Polimerase Hot Start, agarosa, buffer
TAE 1x (asam borat 0.83 M, Tris HCl 1 M pH 8.3, etilendiamina tetra-asetat 10
mM), akuades, marker DNA 1 kb (Invtritrogen), marker DNA 100bp (Vivantis),
loading dye, gel red (BIOTIUM, Biorad),Plasmid pJET 1.2, T4 ligase (Thermo
Scientific), bufer ligasi, 10x Taq buffer (Thermo Scientific), dNTP mix 2 mM, 25
mM MgCl2, pJET 1.2 Forward Sequencing Primer 10 µM, pJET 1.2 Reverse
Sequencing Primer 10 µM, Taq DNA Polymerase 5 U/µL (Thermo Scientific),
kultur bakteri Escherichia coli, media LB (Luria bertani),dan antibiotik ampisilin.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan Petri, autoklaf,
mortar, tabung mikrosentrifugasi 1.5 mL dan 2 mL, vortex, Microwave [Sanyo],

3

neraca analitik, labu Erlenmeyer, pipet volumetrik, QIAshredder spin column,
tabung RNeasy mini column, sentrifus, Nanodrop 2000/200c Spectrophotometer
V1.0 User Manual with package Laptop [Thermo Scientific], mesin PCR DNA
Peltier Thermal Cycler [Bio-Rad], stopwatch, perangkat alat elektroforesis,
komputer, UV Illuminator ChemiDocTM Gel System EQ [Bio-Rad] (Sistem XRS,
Image Lab™ Software, dan kamera CCD), laminar, dan alat-alat gelas.
Prosedur
Isolasi Total RNA Artemisia Annua L
Bagian tanaman yang digunakan untuk isolasi RNA Artemisia Annua L
adalah daun muda berdasarkan metode Qiagen 2010. Semua peralatan yang
digunakan terlebih dahulu direndam dengan diethylpyrocarbonate (DEPC) 0.1 %
dan disterilasasi dengan autoklaf. Sebanyak 0.1 gram daun dimasukkan ke dalam
mortar, dan ditambahkan nitrogen cair sampai semua daun terendam. Daun
digerus hingga halus dan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL kemudian
ditambahkan dengan 450 µL buffer RLT yang mengandung merkaptoetanol 5 µL
dan divorteks selama 1 menit hingga homogen lalu diinkubasi pada suhu 56 ºC
selama 3 menit. Kemudian suspensi dipindahkan ke dalam tabung QIAshredder
spin column. Sampel disentrifus selama 2 menit dengan kecepatan 12000 rpm.
Supernatan yang dihasilkan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL yang
baru dan ditambahkan etanol absolut (96%) sebanyak setengah dari volume total.
Selanjutnya sebanyak 650 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung RNeasy
mini column, tabung kemudian disentrifus kembali selama 15 detik pada
kecepatan 1200 g.
Supernatan yang dihasilkan pada tahap ini dibuang kemudian pelet yang
terdapat pada membran ditambahkan dengan larutan RW1 yang mengandung
etanol sebanyak 700 µL ke dalam kolom RNeasy. Suspensi kemudian disentrifus
kembali dengan kecepatan 1200 g selama 15 detik. Supernatan yang dihasilkan
dibuang, ditambahkan buffer RPE sebanyak 500 µL kedalam kolom Rneasy dan
disentrifus selama 2 menit dengan kecepatan 1200 g. Kolom RNeasy dipindahkan
ke dalam tabung mikro 1.5 mL yang baru kemudian ditambahkan 50 µL air bebas
RNase pada bagian tengah, didiamkan selama 15 menit, kemudian disentrifus
pada kecepatan 1200 g selama 1 menit sehingga diperoleh RNA total. Kemudian
kolom RNeasy kembali dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL yang baru
lainnya dan ditambahkan 30 µL air bebas RNase, didiamkan selama 15 menit,
kemudian disentrifus pada kecepatan 1200 g selama 1 menit sehingga diperoleh
RNA total tabung kedua.
Uji Kuantitatif, Kualitatif dan Kemurnian RNA Artemisia annua L dengan
Spektrofotometer
RNA yang telah diisolasi kemudian dianalisis secara kuantitatif, kualitatif
dan kemurnian RNA yang dilakukan dengan metode Thermo Fisher Scientific
2009. Uji Kualitatif RNA dilakukan melalui metode elektroforesis. RNA
dielektroresis dalam gel agarosa 1 % pada tegangan listik 75 volt selama 45 menit.
Analisis kuantitatif RNA dilakukan menggunakan spektrofotometri Nanodrop.
Sebanyak 2µL sampel RNA hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan
menggunakan spektrofotometer nanodrop (Biorad). Blanko yang digunakan

4

adalah larutan akuades. Larutan akuades dimasukkan ke dalam lubang optik
sebanyak 2 µL dan kemudian dibersihkan dengan tisu. Selanjutnya sampel RNA
sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam lubang optik. Hasil pengukuran berupa
konsentrasi ng/µL dan kemurnian RNA dapat dilihat langsung berdasarkan nilai
rasio absorbansi pada panjang gelombang 230, 260, dan 280 nm.
Sintesis cDNA dengan Kit Transcriptor synthesis (RT-PCR)
Sintesis cDNA dengan iScript Reverse Transcription Supermix.
Campuran reaksi terdiri dari iScript RT supermix 4 µL, RNA total 9 µL, Nuclease
free water 7 µL sehingga total campuran reaksi 20 µL. Campuran reaksi tersebut
diinkubasi 25°C selama 5 menit kemudian tahap reverse transcription dengan
inkubasi pada suhu 42°C selama 30 menit dan dilanjutkan dengan tahap inaktivasi
pada suhu 85°C selama 5 menit.
Sintesis cDNA dengan Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
Roche. Tahap pertama yang dilakukan adalah denaturasi cetakan RNA dan primer.
Campuran reaksi terdiri dari RNA total 9 µL , primer WR1 (Forward 5’- GTC
GAC ATG GAA AGT GTT TGT GTT TAT GGA -3’, dan Reverse 5’- GAA
TTC TTA AAA TTT GAA ATC AAG GTC TAA ATC -3’ masing-masing
sebanyak 0.3µL dan PCR grade Water 3.4 µL sehingga total volume 13 µL.
Campuran diinkubasikan pada suhu 65°C selama 5 menit selain itu campuran
berisi RT-Mix disiapkan, campuran tersebut terdiri dari Transcriptor reverse
transcriptase reaction buffer 5x konsentrasi sebanyak 4 µL, protector RNase
inhibitor 0.5 µL, deoxynucleotide mix 2 µL, dan transcriptor reverse transcriptase
0.5 µL sehingga total volume pada campuran RT-mix 7 µL. campuran RT-Mix
dimasukkan kedalam tube berisi kan campuran RNA-primer yang telah diinkubasi
sebelumnya sehingga volume akhir menjadi 20 µL. Tahap kedua yaitu tahap
reverse transcription dengan inkubasi campuran reaksi pada suhu 50°C selama 30
menit dan dilanjutkan dengan tahap inaktivasi pada suhu 85°C selama 5 menit.
Isolasi Gen AaWRKY1
cDNA yang didapatkan dari sintesis menggunakan iScript maupun Roche
dijadikan sebagai cetakan untuk reaksi PCR. Tabung mikro diisi dengan campuran
reaksi PCR (total volum reaksi 25 µL ) yang terdiri atas 5 µL buffer PCR 5x
Kappa HiFi Fidelity, 10 mM dNTPs mix 0.75 µL, 3 µL campuran primer WR1
(Forward 5’- GTC GAC ATG GAA AGT GTT TGT GTT TAT GGA -3’,
sedangkan Reverse 5’- GAA TTC TTA AAA TTT GAA ATC AAG GTC TAA
ATC -3’), 0.5 U/µL enzim Taq polymerase, 2.5 µL cDNA , dan 14.25 µL ddH2O.
Reaksi amplifikasi dilakukan dengan tahap reaksi denaturasi pada suhu 96ºC
selama 3 menit dilakukan satu kali, kemudian denaturasi kembali pada suhu 94°C
selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 53ºC selama 1 menit, dan
pemanjangan pada suhu 72ºC selama 45 detik dan urutan reaksi ini diulang
sebanyak 25 siklus dan diikuti proses pemanjangan akhir pada suhu 72ºC selama
5 menit. Selanjutnya produk PCR kemudian dicek keberadaan pita produk hasil
PCR dengan elektroforesis gel agarosa 1% yang telah ditambahkan gel red dan
divisualisasi menggunakan UV Illuminator ChemiDoc EQ (Bio-rad). Fragmen gen
AaWRKY1 berukuran 1500pb yang nampak pada gel agarosa selanjutnya dipotong
dari gel, dielusi dan diekstrak untuk mendapatkan pita DNA ukuran yang
diingnkan dan memisahkan DNA fragmen dari matriks gel dengan metode

5

ekstraksi gel menggunakan kit extraction and purification Kit Qiaquick
(QIAGEN).
Ligasi Gen AaWRKY1 pada Vektor pJET1.2
Gen AaWRKY1 (1500 pb) yang didapatkan selanjutnya diligasikan pada
vektor pJET1.2. Campuran mix ligasi diinkubasi pada suhu 22°C selama 10 menit.
Campuran reaksi ligasi memiliki komposisi seperti pada Tabel 1. (Thermo Fisher
Scientific 2012)
Tabel 1 Komposisi larutan mix ligasi vektor pJET 1.2
Larutan
2x Buffer reaksi
Plasmid pJET 1.2
Produk PCR purifikasi
T4 ligase
Water (nuclease free)
Volume total

Volume
10.0 µL
1.0 µL
1.0 µL
1.0µL
13.0µL
20 µL

Transformasi Plasmid Rekombinan AaWRKY1 ke dalam Sel Escherichia coli
(Sambrook & Rusell 2001).
Reaksi ligasi antara vektor pJET 1.2 dan gen AaWRKY1 sebanyak 10 L
dimasukkan ke dalam tube yang telah diisi dengan sel kompeten E. coli, kemudian
diinkubasi di dalam es selama 30 menit. Selanjutnya campuran diinkubasi pada
suhu 42ºC selama 90 detik, dan segera disimpan dalam es selama 2 menit. Media
LB cair ditambahkan sebanyak 950 µL dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1
jam. Setelah itu dilakukan sentrifugasi pada 5000 rpm 1 menit, Kemudian kultur
dibuang dan disisakan sedikit. Kemudian sisa kultur hasil transformasi disebar
pada media LB padat yang mengandung ampisilin (100 mg/L), dan diinkubasi
pada suhu 37 °C selama 16 jam. Koloni yang tumbuh kemudian diperbanyak
dalam 5 mL LB cair yang mengandung 5 µL ampisilin (100 mg/L) dan diinkubasi
pada shaker incubator 37ºC selama 16 jam.
Analisis Koloni Rekombinan dengan PCR Koloni
Kultur koloni E.coli hasil transformasi kemudian diseleksi yang
mengandung gen AaWRKY1 dengan menggunakan PCR koloni. Langkah pertama
koloni tunggal dikulturkan kembali ke dalam 5 mL media LB cair yang telah
mengandung ampicilin kemudian keesokan harinya sebanyak 100 µl dari setiap
kultur koloni dipanaskan pada suhu 100oC kemudian disentrifugasi pada
10.000rpm selama 5 menit, hasil sentrifugasi dibuang sedikit. Selanjutnya 5 µl
dimasukkan kedalam 20 µL campuran mix PCR. Larutan mix PCR koloni
memiliki komponen seperti yang disajikan Tabel 2. Larutan mix PCR
dicampurkan dengan baik pada bak es. PCR dilakukan dengan program denaturasi
pada suhu 95°C selama 3 menit, kemudian denaturasi kembali pada suhu 94°C
selama 30 detik, penempelan pada suhu 60°C selama 30 detik kemudian
pemanjangan pada suhu 72° selama 1 menit sebanyak 25 siklus diikuti dengan
diikuti proses pemanjangan akhir pada suhu 72ºC selama 5 menit. Hasil koloni
transforman yang membawa gen AaWRKY 1 dapat dilihat dengan visualisasi
elektroforesis.

6

Tabel 2 Komposisi larutan mix PCR Koloni
Larutan
Kultur koloni
10x Taq buffer
dNTP mix 2 mM each
25 mM MgCl2
pJET 1.2 Forward Sequencing Primer 10 µM
pJET 1.2 Reverse Sequencing Primer10 µM
Water, Nuclease-free
Taq DNA Polymerase 5U/ µL
Total Volume

Volume
5.0 µL
2.0 µL
2.0 µL
1.2 µL
0.4 µL
0.4 µL
13.9 µL
0.1 µL
25 µL

HASIL
Hasil kualitas, kuantitas, dan kemurnian RNA total Artemisia annua L
Hasil kualitas RNA yang divisualisasikan dengan Chemidoc (Biorad)
menunjukkan bahwa RNA total memiliki ukuran kurang lebih 11000pb
(Gambar1). Hasil tersebut ditunjukkan oleh kelima sampel. Hasil tersebut
menunjukkan ukuran yang sama untuk kelima sampel (Gambar 1). RNA juga
diuji secara kuantitatif melalui pengukuran absorbansi pada panjang gelombang
230, 260 dan 280 nm. Konsentrasi RNA yang diisolasi berbeda-beda namun
berkisar 50-180 ng/µL hasil tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. Nilai kemurnian
RNA hasil isolasi diukur pada rasio 260/280 dan 260/230.

Gambar 1 Elektroforegram hasil kualitas RNA Artemisia annua L.(1) Marker 1kb
Invitrogen, (2) sampel 1, (3) sampel 2, (4) sampel 3, (5) sampel 4, (6)
sampel

7

Tabel 3 Hasil Kuantitas RNA total Artemisia annua L
Sampel
1
2
3
4
5

A260
4.68
1.44
2.50
1.74
1.29

[RNA] (ng/µL)
187.3
100.3
57.6
69.8
51.8

A260/A280
2.01
1.87
2.02
1.92
1.94

A260/A230
2.04
1.58
1.88
1.02
1.21

Amplifikon Gen faktor transkripsi AaWRKY1
Elektroforegram gen faktor transkripsi AaWRKY1didapatkan melalui PCR
cDNA yang disintesis dari RNA menggunakan dua jenis kit, Transcriptor First
Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) dan kit iScript (Biorad). Hasil
elektroforegram yang didapat dari kedua jenis kit tidak ada perbedaan. Keduanya
menghasilkan pita dengan pola yang sama. Primer yang digunakan kurang
spesifik sehingga menghasilkan beberapa pita namun hanya pita yang berukuran
1500 pb yang dimurnikan (Gambar 2). Elektroforegram gen AaWRKY1yang
dimurnikan berukuran 1500 pb dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 2 Elektroforegram amplikon gen AaWRKY1 (1) Marker 100 bp Vivantis,
(2) & (3) Amplikon gen AaWRKY1 yang berasal dari template
cDNA iScript, (4) Marker 100 bp Vivantis, (5) & (6) Amplikon gen
AaWRKY1 yang berasal dari template cDNA Rosche

8

Gambar 3 Elektroforegram purifikasi amplikon gen AaWRKY1.(1) Purifikasi gen
AaWRKY1, (2) Marker 100 bp Vivantis
Transforman E.coli yang membawa Gen AaWRKY1
Fragmen gen AaWRKY 1 hasil amplifikasi yang sudah dimurnikan melalui
gel purification diligasi dengan vektor cloning pJET 1.2 kemudian digunakan
untuk mentransformasi sel E.coli DH5α. Transforman E.coli DH5α yang
membawa gen AaWRKY1 akan tumbuh didalam media seleksi antibiotik
ampisilin yang ditunjukkan pada Gambar 4. Koloni tunggal bakteri yang tumbuh
pada media LB agar yang mengandung ampicilin 100 mg/L. Sebanyak 28 koloni.
Koloni-koloni yang tumbuh selanjutnya dikonfirmasi melalui PCR koloni.

Gambar 4 Hasil transformasi gen AaWRKY1 pada palsmid pJET 1.2 melalui
bakteri E.coli DH5α

9

Konfirmasi Plasmid Rekombinan AaWRKY 1
Bakteri E.coli DH5α yang telah bertransformasi membawa plasmid
rekombinan gen AaWRKY 1 dikonfirmasi melalui PCR koloni . Hasil PCR koloni
ditunjukkan Gambar 5 dan Gambar 6. Dari ke-28 Koloni hanya koloni ke-14 yang
membawa gen AaWRKY1 berukuran 1500 pb (Gambar 6).

Gambar 5 Elektroforegram PCR koloni. (M) Marker 1 kb, (-) Kontrol negative,
(+) amplikon gen AaWRKY1, (1) koloni 1, (2) koloni 2, (3) koloni 3,
(4) koloni 4, (5) koloni 5, (6) koloni 6, (7) koloni 7, (8) koloni 8, (9)
koloni 9, (10) koloni 10, (11) koloni 11, (12) koloni 12

Gambar 6 Elektroforegram PCR koloni. (M) Marker 1 kb, (13) koloni 13, (14)
koloni 14, (15) koloni 15, (16) koloni 16, (17) koloni 17, (18) koloni
18, (19) koloni 19, (20) koloni 20, (21) koloni 21, (22) koloni 22,
(23) koloni 23, (24) koloni 24, (25) Koloni 25,(26) Koloni 26, (27)
Koloni 27, (28) Koloni 28

10

PEMBAHASAN
Tanaman Artemisia annua L yang digunakan sebagai bahan penelitian
diperoleh dari Kebun Percobaan Balitro di Manoko, Lembang. Artemisia annua L
termasuk ke dalam divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida pada ordo
Arterales dan famili Asteraceae, terdiri dari hampir 200 spesies. Artemisia annua,
Artemisia capilaris dan Artemisia vulgaris adalah tiga spesies dominan.Artemisia
annua L merupakan tanaman subtropis yang berasal dari daerah di Cina yaitu
Mongolia (Mc Vaugh 1984) dan tersebar ke Vietnam dan Malaysia namun saat
ini tanaman Artemisia telah tersebar ke Argentina, Bulgaria, Francis, Hungaria,
Rumania, Italia, Spanyol, USA, dan Yugoslavia (Klayman 1993). Artemisia
annua L memiliki gen WRKY1. Protein WRKY merupakan suatu grup utama
dalam faktor transkripsi pada suatu tanaman spesifik. WRKY full-length cDNA
dalam Artemisia annua L disebut dengan AaWRKY1. Gen AaWRKY1 merupakan
aktivator transkripsi Amorpha-4,11-diene synthase (ADS) yang berfungsi sebagai
katalisator siklus farnesil difosfat sebagai langkah utama biosintesis artemisinin
(OH et al 2008).
Bahan aktif artemisinin diperlukan untuk pengobatan malaria. Peningkatan
kadar artemisnin dalam berat kering tanaman perlu dilakukan mengingat budidaya
di Indonesia hanya bisa menghasilkan tanaman artemisia dengan kadar
artemisinin antara 0.39% (Gusmaini & Hera 2007). Artemisinin diakumulasi
dalam organ bagian atas daun dan bunga yang diebut glandular trichomes
(Ferreira, Simon & Janick 1995). Oleh sebab itu jaringan yang digunakan untuk
mengisolasi RNA adalah daun. Isolasi RNA dilakukan sebagai tahap awal dari
isolasi gen AaWRKY 1.
Kualitas, Kuantitas dan Kemurnian RNA Artemisa annua L
RNA Artemisia annua L diisolasi untuk mendapatkan RNA total.
Penggunaan isolat RNA total sebagai materi awal mempunyai beberapa
keuntungan dibandingkan menggunakan mRNA. Pertama ialah RNA total
memiliki jumlah per-sel lebih banyak dibandingkan mRNA. Kedua ialah proporsi
rRNA yang besar dalam RNA total dapat berperan sebagai target RNase sehingga
memperlambat digesti nonspesifik dari mRNA (Qiagen 2010) selain itu RNA
digunakan sebagai cetakan cDNA karena primer yang didesain berasal dari
sekuens cDNA yang terdapat pada gen bank NCBI.
Kualitas RNA diperoleh dengan visualisasi menggunakan elektroforesis
agarosa 1%. Gel Agarosa dapat memisahkan fragmen DNA dari beberapa ratus
hingga 20.000 pb. Gel Agarosa 1% memiliki struktur serat yang baik, ukuran pori
besar dan tahan terhadap gesekan (Bintang 2010). Hasil yang didapatkan besar
RNA total adalah 11000 pb (Gambar 1). Pita RNA yang didapatkan sangat baik
terang dan tebal. Ukuran RNA yang didapatkan ini cukup besar karena isolasi
yang dilakukan merupakan isolasi total RNA.
Kuantitas konsentrasi RNA total diperoleh dengan spektrofotometri
nanodrop. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA ditentukan melalui
pengukuran absorbansi sampel RNA pada panjang gelombang 260 nm, 280 nm,
dan 230 nm. Konsentrasi RNA Artemisia annua L terbesar yang didapatkan
adalah 187.3 ng/µL sedangkan sampel lain menghasilkan konsentrasi RNA
sebesar 100.3 ng/µL, 57.6 ng/µL, 69.8 ng/µL, dan 51.8 ng/µL. Perbedaan nilai

11

konsentrasi tersebut dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu, perbedaan jenis
sampel, hasil gerusan sampel yang kurang halus, dan pengocokan yang kurang
kuat saat melakukan ekstraksi sehingga seluruh isi sel tidak dapat terlisis dengan
sempurna (Couch & Fritz 1990). Qiagen (2010) menyatakan bahwa kit komersial
RNeasy Plant Mini Kit dapat menghasilkan RNA total sampai dengan 35 µg
dalam 0.1 gram daun. Isolasi RNA total Artemisia annua L juga pernah
dilakukan Appalasamy et al (2012) dengan metode CTAB modifikasi dengan
Konsentrasi RNA total terbesar yang didapat adalah 43.38 ng/µL. Appalasamy et
al (2012) juga melakukan isolasi total RNA dengan kit komersial yaitu IQeasyTM
Plus Plant RNA Extraction Mini Kit (iNtRON Technologies) yang menghasilkan
konsentrasi RNA terbesar 16.42 ng/µL.
Kualitas kemurnian hasil isolasi RNA Artemisia annua L dapat diperoleh
juga dengan menggunakan spektrofotometri nanodrop. Rasio absorbansi 260 nm
dan 280 nm menunjukkan kemurnian RNA terhadap protein. Nanodrop
Technologies (2007) menyatakan bahwa nilai A260/280 ~2 dapat diterima sebagai
RNA yang murni. Hasil isolasi RNA didapatkan nilai A260/280 bervariasi yaitu
2.01, 1.87, 2.02, 1.92, dan 1.94. Nilai tersebut menunjukkan bahwa RNA yang
telah diisolasi murni dari protein. Rasio A260/230 digunakan sebagai indikator
tingkat kontaminasi oleh polisakarida dan polifenol (Loulakakis et al. 1996 dan
Schultz et al. 1994). Nilai A260/230 untuk RNA yang dikatakan murni berkisar
2.0-2.2. Hasil isolasi RNA menunjukkan bahwa nilai A260/230 yang didapat
adalah 2.04, 1.58,1.88, 1.02, dan 1.21. Nilai tersebut menunjukkan bahwa isolasi
RNA yang masih dibawah angka 2.0 menunjukan bahwa RNA tersebut masih
mengandung polisakarida/karbohidrat atau polifenol. RNA pada sampel 1 murni
terhadap protein dan polifenol sehingga RNA pada sampel tersebut digunakan
untuk membuat cDNA, dan isolasi gen AaWRKY1
Amplikon Gen AaWRKY 1 dari Artemisia annua L
Gen AaWRKY 1 diisolasi dengan cara amplifikasi cDNA menggunakan
teknik PCR dan primer spesifik yang didisain berdasarkan sekuen gen AaWRKY 1
yang ada di genebank (NCBI FJ390842). Sintesis cDNA dilakukan dengan teknik
RT-PCR dengan menggunakan RNA total sebagai cetakan (Watson et al 1987)
dan enzim reverse transcriptase. Enzim Reverse transcriptase digunakan untuk
membuat salinan cDNA dari mRNA dengan perluasan primer biasanya oligo dT
yang memanfaatkan poli A dari mRNA (Turner et al 1995). Oligo dT dapat terikat
dengan ekor poli (A) dan dapat digunakan untuk memperoleh kembali mRNA hal
ini sudah berlangsung secara alami saat preparasi isolasi RNA total yaitu saat lisis
sel dengan fenol-kloroform yang melewati kolom oligo (dT)-selulosa (Turner et al
1995). Gen yang diekpresikan pada jaringan tertentu dapat diisolasi dengan
menggunakan cDNA sebagai cetakan (template). cDNA merupakan DNA yang
komplemen dengan mRNA (Dale & Schantz 2002),mRNA adalah transkrip dari
gen-gen yang terekspresi yang membawa pesan berupa informasi genetik dari
DNA ke dalam bentuk protein (Darnell et al 1990). Isolasi gen dari cDNA
sebagai cetakan lebih baik karena cDNA yang berasal dari eukariotik mRNA tidak
memiliki sekuen intron sehingga yang hanya segmen penyandi protein (ekson)
yang akan diekpresikan kedalam E.coli.
Amplifikasi gen AaWRKY1 menggunakan sepasang primer WR1 Forward
dan WR1 Reverse dirancang berdasarkan Dongming et al (2009) yang spesifik

12

mengamplifikasi gen AaWRKY1 berukuran 1478 pb. Primer optimum menempel
pada cetakan pada suhu 53ºC selama 1 menit dan memulai melakukan
pemanjangan pada suhu 72ºC. Hasil amplifikasi gen divisualisasi dengan
elektroforesis gel agarosa 1%. Hasil verifikasi dengan menggunakan marka 1kb
(Invitrogen) memperlihatkan bahwa gen yang teramplifikasi kira-kira berukuran
1500 pb, mendekati 1478 pb. Sintesis cDNA menggunakan dua kit komersial
yang berbeda merek namun hasil amplifikasi dari kedua jenis cetakan tidak
berbeda menghasilkan pola yang sama dan pita berukuran kira-kira 1500 pb
(Gambar 2). Perbedaan kedua kit komersial tersebut hanya pada jenisnya saja. Kit
iScript Reverse Transcription Supermix menggunakan one step RT-PCR
sedangakan Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Rosche merupakan
teknik sintesis cDNA dengan two-step RT-PCR. one step RT-PCR mengkonversi
RNA menjadi cDNA dilakukan dalam satu rangkaian reaksi dan dalam satu
tabung reaksi yang sama sehingga tidak ada proses transfer sampel sehingga
mengurangi kontaminasi. iScript Reverse Transcription Supermix mengandung
oligo (dT) dan random primer sedangkan Transcriptor First Strand cDNA
Synthesis Kit Rosche merupakan metode two-step RT PCR dengan reaksi
transkripsi balik dan reaksi primer dengan RNA dilakukan terpisah melibatkan
beberapa tabung reaksi. two-step RT PCR menggunakan primer spesifik sehingga
diharapkan hasilnya lebih spesifik. Namun Gambar 2 menunjukkan hasil
amplifikasi kedua jenis merek tidak ada perbedaan keduanya menghasilkan pita
1500 pb namun tidak spesifik.
Meskipun pita yang berukuran 1500 pb merupakan pita yang paling terang
namun, terdapat fragmen lain yang terbentuk dari pita yang dihasilkan pada gel
agarosa. Hal tersebut dapat disebabkan karena penggunaan suhu annealing yang
belum optimal dan primer yang digunakan kurang spesifik. Suhu annealing
adalah suhu dimana primer akan menempel pada template DNA. Suhu annealing
yang terlalu tinggi dapat menyebabkan penempelan primer pada cetakan kurang
optimal sehingga kemampuan primer menempel pada target rendah dan
menghasilkan pita yang tipis (Sasmito 2010) sedangkan suhu annealing yang
terlalu rendah dapat menyebabkan primer berlekatan tidak spesifik. Waktu yang
digunakan pada tahap annealing antara 30-60 detik (Sambrook & Russel 2001).
Selain suhu annealing, primer yang kurang spesifik juga dapat menyebabkan
primer bukan saja menempel pada gen target tapi pada gen lain sehingga
membentuk dua pita atau lebih. Primer WR1 memiliki panjang 33 basa, sehingga
cukup panjang untuk mendapatkan gen yang spesifik karena menurut Grunenwald
(2003) primer yang lebih panjang lebih spesifik namun tidak efisien. Jumlah
siklus PCR juga menentukan spesifisitas produk PCR. Jumlah siklus yang optimal
adalah 25-25 siklus (Fairbanks dan Andersen 1999). Siklus yang digunakan pada
amplifikasi gen AaWRKY1 adalah 25 siklus sehingga berada pada siklus yang
optimal. Primer merupakan rantai tunggal pendek yang mengandung nukleotida
serta bersifat spesifik. Primer akan melekat pada sekuen yang komplemen dan
membatasi daerah fragmen DNA yang akan diperbanyak, kemudian DNA
polymerase akan menginisiasi sintesis salinannya (Weaver & Hedrick 2005). Hal
yang paling sulit dalam mendesain primer adalah menghindari primer yang saling
berkomplemen khususnya pada ujung 3’. Ketika bagian primer berkomplemen
dengan bagiannya sendiri maka akan menyebabkan primer melipat setengah
(hairpin) hal ini menyebabkan masalah dalam PCR karena primer berinteraksi

13

dengan primer itu sendiri dan tidak memungkinkan untuk melakukan reaksi. lebih
berbahaya jika molekul primer akan diperpanjang dengan DNA polimerase
sehingga sekuen yang didapatkan berubah sehingga tidak dapat berikatan dengan
situs target (Bing & Harry 2002). Hal lain yang juga harus dihindari adalah
sekuen primer forward dan reverse yang saling berkomplemen sehingga
menyebabkan primer-dimer. Penentuan urutan basa pasangan primer perlu
dianalisis
menggunakan
program
untuk
mengetahui
kemungkinan
terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi
silang (cross-homology) sehingga tidak terbentuk produk-produk non spesifik
yang muncul pada saat visualisasi produk PCR dengan elektroforesis gel agarosa.
Hasil amplifikasi gen AaWRKY1 menghasilkan beberapa pita namun, pita
yang berukuran 1500pb lah yang paling kuat dan terang. Pita tersebut diduga
sebagai gen AaWRKY1. Amplikon gen AaWRKY1 yang berukuran 1500pb
dimurnikan dengan kit komersial Extraction and Purification Kit (QIAquick
Qiagen). Permurnian bertujuan untuk mendapatkan hanya gen AaWRKY1 yang
berukuran 1500pb. Selain itu permurnian juga dilakukan agar amplikon gen
AaWRKY1 bebas dari pengotor-pengotor lain berupa nukleotida, sisa-sisa garam,
dan enzim yang dapat mengganggu proses selanjutnya (Dobhal et al. 2010).
Keberhasilan permurnian gen AaWRKY1 dapat dilihat pada Gambar 3 yaitu
didapatkan pita tunggal yang berukuran 1500pb.
Plasmid Rekombinan AaWRKY1
Vektor yang digunakan dalam penelitian ini adalah pJET 1.2. Setelah gen
AaWRKY1 dimurnikan kemudian gen tersebut diligasikan ke vektor pJET1.2 agar
dapat ditransformasikan ke dalam E.coli DH5α sebagai sel inang. Vektor
merupakan media pembawa DNA asing ke dalam sel inang (Pierce 2005). Vektor
dapat berupa plasmid, bakteriofaga, fagemid, kosmid. Vektor plasmid bakteri
merupakan vektor yang sering digunakan dalam konstruksi DNA rekombinan.
Vektor pJET 1.2 merupakan vektor berupa plasmid. Terdapat dua jenis vektor
yaitu vektor pengklonan dan vektor ekspresi. Vektor ekspresi adalah vektor yang
dapat mengekpresikan protein dan memiliki daerah promoter sedangkan vektor
pengklonan berfungsi untuk perbanyakan gen (Madigan et al 2009). Vektor pJET
1.2 merupakan vektor pengklonan dengan ukuran 2974 pb. pJET 1.2 merupakan
vektor kloning linear yang dapat menerima insert berukuran 6pb sampai 10kb.
Vektor kloning pJET 1.2 dipilih karena memiliki kelebihan yaitu pJET 1.2 telah
mengandung grup fosfat pada ujung 5’ sehingga fosforilasi pada primer PCR
tidak diperlukan. Selain itu pJET 1.2 hanya memerlukan waktu 5-10 menit dalam
penyambungan DNA insert ke vektor sehingga lebih efisien waktu. Keuntungan
lainnya adalah dapat langsung digunakan untuk mentrasnformasikan semua jenis
strain E.coli dengan hasil ligasi. Ligasi dilakukan dengan menggunakan enzim T4
Ligase. Enzim tersebut mempercepat pembentukan ikatan fosfodiester antara
ujung 5’P dengan 3’OH pada DNA (Pheiffer & Zimmerman 1λ83). Vektor pJET
1.2 juga lebih praktis digunakan karena hanya rekombinan plasmid yang
mengandung DNA sisipan yang akan tumbuh dicawan kultur sehingga seleksi
biru-putih tidak diperlukan (Thermo Fisher scientific 2012). Hasil Ligasi gen
AaWRKY1 ke vektor pJET 1.2 menghasilkan plasmid rekombinan gen AaWRKY1.
Ukuran pJET 1.2 adalah 2974 pb sedangkan ukuran gen AaWRKY1 1500pb

14

sehingga total plasmid berukuran 4474 pb. Peta plasmid gambaran hasil ligasi
dapat dilihat pada Lampiran 2.
Koloni hasil transformasi pembawa gen AaWRKY1
Hasil Ligasi gen AaWRKY1 ke vektor pJET 1.2 kemudian
ditransformasikan ke dalam sel bakteri Escherichia coli strain DH5α yang sudah
dibuat kompeten dengan menggunakan larutan Innoe bufer yang dapat dilihat
komposisinya pada Lampiran 3. Transformasi dilakukan dengan menggunakan
metode heat shock. Transformasi metode ini dilakukan dengan cara memberikan
kejut panas pada sel bakteri kompeten yaitu sel bakteri yang telah diberi CaCl2.
Sel bakteri yang telah kompeten akan mudah dimasukkan DNA rekombinan
setelah dibeti kejutan panas (Sambrook & Russell 2001). Kejut panas dilakukan
pada suhu 42°C selama 90 detik dilanjutnya dengan inkubasi pada suhu dingin
selama kurang lebih 15 menit untuk meningkatkan efisiensi dari transformasi
(Kaur & Singh 2010). Dengan sistem kejutan panas, Kemungkinan masuknya
DNA asing ke dalam sel akan menjadi lebih besar jika pada lingkungannya
terdapat ion divalent Ca2+ dan Mg2+ yang diberikan dalam bentuk CaCl2 dan
MgCl2.
Hasil transformasi E.coli dibiakan kedalam media Luria Bertani (LB)
padat yang sudah mengandung antibiotik ampicilin 100 mg/L sebagai media
seleksi sehingga koloni yang terbentuk pada cawan diduga merupakan E.coli yang
membawa plasmid rekombinan gen AaWRKY1 (Gambar 4). Marka seleksi
biasanya berupa gen yang membawa sifat resisten antibiotik tertentu dan vektor
pJET 1.2 memiliki marka seleksi berupa gen resisten ampisilin NPTII dapat
dilihat pada peta plasmid pJET 1.2 pada Lampiran 2. Terdapat kurang lebih 28
koloni tunggal, kemudian dilakukan konfirmasi plasmid pembawa gen tersebut
melalui amplifikasi PCR.
Hasil PCR Koloni
Analisis koloni rekombinan dilakukan untuk konfirmasi keberhasilan
konstruksi gen AaWRKY1. Analisis dilakukan untuk memastikan transforman
membawa gen AaWRKY1 bukan plasmid kosong atau DNA lain yang tersisipi.
Analisis dilakukan dengan PCR koloni, PCR koloni dipilih karena vektor kloning
yang digunakan adalah pJET 1.2 dengan fragmen DNA sisipan berukuran kurang
dari 3 (Thermo Fisher Scientific 2012). Selain itu, PCR koloni merupakan metode
yang cepat untuk Screening plasmid insert secara langsung tanpa proses preparasi
plasmid sebelumnya. Sebelum PCR koloni, koloni tunggal transforman dibiakkan
kembali pada media LB cair yang sudang diberi antibiotik ampicilin kemudian
setelah satu hari dibiakkan kultur diambil dan dipanaskan pada 100°C hal ini
bertujuan agar DNA plasmid lepas dari E.coli sehingga dapat langsung
diamplifikasi dengan PCR. PCR koloni menggunakan primer pJET 1.2 forward
dan pJET 1.2 primer reverse (Thermo Fisher scientific 2012). Primer pJET 1.2
forward dan pJET 1.2 primer reverse digunakan untuk PCR koloni karena gen
yang diduga gen AaWRKY 1 telah diiligasi dalam vektor pJET 1.2 sehingga
amplifikasi gen diharapkan merupakan gen yang disisipkan.
Hasil PCR koloni divisualisasi dengan elektroforesis. Dari 28 koloni
transforman yang DNA plasmid nya diamplifikasi hanya satu koloni transforman
yang membawa gen AaWRKY1 (Gambar 5 dan 6). Sedangkan koloni lainnya

15

menunjukkan fragmen DNA yang lebih rendah ukurannya yaitu pada koloni 1,
koloni 2, koloni 3, koloni 4, koloni 5, koloni 6 (Gambar 5), koloni 21 dan Koloni
25 (Gambar 6) hal ini dikarenakan hasil transformasi berhasil namun hasil ligasi
bukan fragmen gen yang diduga gen AaWRKY1 yang terligasi atau plasmid
kemasukan insert DNA lain, dan koloni sisanya menunjukan hasil dimer primer
hal tersebut dikarenakan tidak ada DNA yang tersisipi dalam plasmid atau dapat
dikatakan plasmid kosong. Koloni ke-14 yang positif sebelumnya telah dibiakkan
kedalam media LB cari yang telah diberi ampicilin. Fragmen gen target yaitu gen
AaWRKY1 yang berukuran 1500pb diindentifikasi telah terdapat pada vektor
kloning pJET 1.2. hal tersebut dibuktikan dengan terdapatnya satu pita DNA
spesifik yang berukuran 1500pb pada hasil PCR Koloni.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Gen yang diduga gen AaWRKY1 telah berhasil diisolasi dari daun tanaman
Artemisia annua L. Hasil amplifikasi gen yang diduga gen AaWRKY1 berukuran
sekitar 1500pb. Gen yang diduga gen AaWRKY1 sudah berhasil dikloning ke
dalam vektor kloning pJET 1.2. dan ditransfer ke E.coli Satu dari 28 koloni
transforman membawa gen AaWRKY1 berukuran 1500pb.
Saran
Perlu dilakukan sequencing vektor rekombinan untuk mengkomfirmasi
keberadaan dan kebenaran setiap komponen didalam vektor sebelum dilakukan
transformasi plasmid vektor rekombinan ke tanaman.

DAFTAR PUSTAKA
Appalasamy S, Ning S P, Arvind B, Ahmad S O, Nad-Ali B J, Chan L K. 2012.
Optimization of total RNA isolation method from the aromatic medical
plant Artemisia annua L. International Jurnal of Plant Biology 3 (e7) : 3437.
Bing Y C & Harry W. 2002. PCR cloning protocol. Second edition. USA :
Library of Congress Cataloging in Publication Data.
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta (ID) : Erlangga.
Couch JA, Fritz PJ. 1990. Isolation of DNA from plants high in polyphenolics.
Plant Mol Biol Rep 8: 8-12 Dale JW. 1994. Molecular Genetic of Bacteria
England: John Wiley and Sons.
Dale JW., MV, Schantz. 2002. From genes to genomes. Canada (CA): John Wiley
& Sons, Inc.

16

Darnell et al. 1990. Molecular CellBiology. New York (US):Scientific American
Books.
Departemen Kesehatan RI. 2009. Rencana Strategis Kementerian Kesehatan
Tahun 2010-2014. Jakarta.
Departemen Kesehatan. 2009. Profil Kesehatan Indonesia 2008. Jakarta.
http://www.depkes. go.id [11 Februari 2014].
Dobhal S, P Dinesh, K Anil, A Sanjeev. 2010. Studies on plant regeneration and
transformation efficiency of Agrobacterium mediated transformation using
neomycin phospotransferase II (nptII) dan glucuronidase (GUS) as a
reporter gene. Afr J Biotech 9(41):6853-6859.
Dongming Ma, Gaobin Pu, Caiyan Lei, Lanqing Ma, Huahong Wang, Yangwu
Guo, Jianlin Chen , Zhigao Du , Hong Wang , Guofeng Li. 2009. Isolation
and characterization of AaWRKY1, an Artemisia annua transcription
factor that regulates the Amorpha-4,11-diene synthase gene, a key gene of
Artemisinin biosynthesis. Plant Cell Physiol 50 (12): 2146-2161.
doi:10.1093/pcp/pcp149.
Duke SO and RL. Paul. 1993. Development an fine structure of glandular
trichomes of Artemisia annua L. J.Int.Plant Sci. 154 (1) : 107-118. doi:
10.1086/297096.
Faibanks D J & Andersen. 1999. Genetics : The continuity of life. Pasific Grove
(US): Brooks/Cole Publishing Company.
Ferreira JFS, Simon JE, & Janick J. 1995. Developmen-tal studies of Artemisia
annua: flowering and Artemisinin production under greenhouse and field
conditions. Planta Medica.l. 61(2): 167-170. doi:10.1055/s-2006-958040.
Grunewald H. 2003. Optimization of polymerase chain reactions. Dalam Bartlett
& Stirling (Eds), Method in Molecular Biology: PCR Protocols Second
Edition. New York (US) : Humana press.
Gusmaini dan Hera N. 2007. Potensi pengembangan budidaya Artemisia annua L
di Indonesia .Presp. 6(2): 57-67.
Hasugian AR, Purba HLE, Wuwung RM, Ebsworth EP, Maristela R, Penttinen
PMP, Laihad F, Anstey NM, Tjitra E, Price RN. 2007.
Dihydroartemisinin-piperaquine versus Artesunate-amodiaquine: superior
efficacy and posttreatment prophylaxis against multidrug-resistant
Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax malaria. Clin Infect Dis.
44 (8): 1075-7.
Kaur R, Singh K. 2000. Orchid Transformation: protocol, problems and pracatical
applications. Asian J Exp. Biol. Sci, 1 (4):711-718.
Klayman D L. 1993. Artemisia annua: from weed to respectable antimalarial plant.
In: Kinghorn AD and Balandri MF (eds) Human Medicinal Agents from
Plants.
Loulakakis KA. 1996. Isolation of functional RNA from grapevine tissues poor
innucleic acid content. J Enol Vitic 47:181-185.
Madigan M T, J M Martinko, P V Dunlap,& D P Clark. 2009. Brock Biology of
microorganism. 12th Edition. San Francisco (US) : Pearson Education.
McVaugh R. 1984. A descriptive account of the vascular plants of Western
Mexico. In: Andersohn WR (ed.) Flora Novo- Galiciana Vol. 12.
Compositae. Ann Arbor: University of Michigan Pres.

17

Nanodrop Techologies, Inc. 2007. 260/280 and 260/230 Ratios nanodrop ND1000 and ND-8000 8-sample spectrophotometers. Techinal Support Bul.
Wilmington USA.
Oh SK, Baek KH, Park JM,Yi SY, Yu SH, Kamoun S Choi D. 2008. Capsicum
annuum WRKY protein CaWRKY1 is a negative regulator of pathogen
defense . New Phytol.177 : 977 – 989.
Petersen M. 2007. Current status of metabolic phytochemistry .Phytochemistry
68 : 2847 – 2860.
Pheiffer BH, Zimmerman SB. 1983. Polymer-stimulated ligation: enchanced
blunt-or cohesive-end ligation of DNA or deoxyriboologonucleotides by
T4 DNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acid Res 11: 7853-7871.
Pierce BA. 2005. Genetics : A conceptual approach. New York (US): WH
Freeman Publisher.
Qiagen. 2010. High-performance RNA for gene expression analysis. Qiagen Inc.,
United State of America (US) : 39 hlm.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory manual. 3rd
Edition. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr, Cold Spring
Harbor.
Sasmito B. 2010. Ekspresi gen Aminocyclopropane carboxylic synthase pada klon
tanaman karet akibat pemberian etefon [skripsi]. Bogor (ID): Institut
Pertanian Bogor.
Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrophotometer V1.0
User Manual. Wilmington: Thermo Fisher Scientific.
Thermo Fisher Scientific. 2012. Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit
Product Information. Wilmington: Thermo Fisher Scientific.
Turner P C et al 1995. Bios Instant Notes in Molecular Biology. New York (US) :