Kadar Fenol Total Dan Bioaktivitas Flavon Dari Kulit Kacang Tanah Sebagai Antioksidan Dan Antiproliferasi Terhadap Sel Kanker Hela

KADAR FENOL TOTAL DAN BIOAKTIVITAS FLAVON DARI
KULIT KACANG TANAH SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN
ANTIPROLIFERASI TERHADAP SEL KANKER HELA

AIKA LATIFAH ALAWIYAH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Kadar Fenol Total dan
Bioaktivitas Flavon dari Kulit Kacang Tanah sebagai Antioksidan dan
Antiproliferasi terhadap Sel Kanker HeLa adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya limpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Oktober 2016

Aika Latifah Alawiyah
NIM G451140091

RINGKASAN
AIKA LATIFAH ALAWIYAH. Kadar Fenol Total dan Bioaktivitas Flavon dari
Kulit Kacang Tanah sebagai Antioksidan dan Antiproliferasi terhadap Sel Kanker
HeLa. Dibimbing oleh SUMINAR SETIATI ACHMADI dan GUSTINI
SYAHBIRIN.
Kulit kacang tanah umumnya menjadi limbah atau dimanfaatkan sebagai
pakan ternak saja. Kadar fenol total suatu bahan memiliki korelasi dengan
aktivitas antioksidan, sehingga kadar fenol total dapat memengaruhi bioaktivitas
tersebut. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menentukan kadar senyawa
fenol dan bioaktivitasnya sebagai antioksidan serta mengevaluasi isolat flavon
dari kulit kacang tanah sebagai antiproliferasi pada sel kanker HeLa.
Sampel diekstraksi dengan teknik refluks menggunakan pelarut etanol
kemudian difraksionasi. Fraksi etil asetat diperoleh melalui teknik ekstraksi caircair dari ekstrak etanol dan pemisahan selanjutnya menggunakan kromatografi

kolom gravitasi untuk mendapatkan isolat flavon. Kadar fenol total dari ekstrak
etanol dan fraksi etil asetat ditentukan menggunakan metode Folin-Ciocalteau.
Hasil uji menunjukkan kadar fenol total ekstrak etanol dan fraksi etil asetat
masing-masing 262 dan 532 mg/g ekstrak. Aktivitas antioksidan dari ekstrak
etanol dan fraksi etil asetat dievaluasi menggunakan metode penangkapan radikal
2,2-difenilpikrilhidrazil (DPPH) yang masing-masing menghasilkan IC50 32 dan
19 µg/mL.
Isolat flavon diidentifikasi menggunakan spektrofotometer ultraviolettampak dan menghasilkan pita serapan di daerah 342, 297.5, dan 220 nm.
Spektrum massa dari isolat dengan menggunakan teknik kromatografi cairspektrometri massa memperlihatkan fragmen dengan m/z 271. Namun, spektrum
menunjukkan bahwa fraksi yang mengandung apigenin ini belum sepenuhnya
murni. Penghambatan proliferasi sel kanker HeLa menggunakan metode reaksi 3(4,5–dimetil tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) mengungkap
bahwa isolat flavon kulit kacang tanah memiliki potensi moderat dengan nilai IC50
34 µg/mL.
Kata kunci: apigenin, fenol total, flavon, kapasitas antioksidan, kulit kacang
tanah, sel kanker HeLa

SUMMARY
AIKA LATIFAH ALAWIYAH. Total Phenol Content and Flavone Bioactivity of
Peanut Hulls as Antioxidant and Antiproliferation toward HeLa Cancer Cells.
Supervised by SUMINAR SETIATI ACHMADI and GUSTINI SYAHBIRIN.

Peanut hulls are mostly wasted or used as animal feed. Total phenol content
of a substance correlates with antioxidant capacity, so that the total phenol content
can affect the bioactivity. Therefore, this study aimed to determine the total
phenolic content and antioxidant activity as well as evaluating the flavones
isolated from the peanut shell as an anti-proliferation of HeLa cancer cells.
The extraction was done by refluxing the ground sample in ethanol and
further fractionated. Ethyl acetate fraction obtained through the technique of
liquid-liquid extraction of the ethanol extract was further separated by gravity
column chromatography to obtain flavones. The total phenol content of the
ethanol extract and the ethyl acetate fraction was determined using FolinCiocalteau method, giving 262 and 532 mg/g extract, respectively. The
antioxidant activity of both extracts was evaluated using 2,2diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging method, giving IC50 of 32 and
19 µg/mL, respectively.
The flavone isolate was further identified by ultraviolet-visible
spectrophotometer, resulting absorption bands at 342, 297.5, and 220 nm. The
mass spectrum of the isolate based on liquid chromatography-mass spectrometry
techniques revealing fragment of the m/z 271 peak. However, the spectra indicate
that the fraction containing apigenin is not completely pure. Inhibition toward
proliferation of HeLa cancer cells was evaluated for the flavones using 3-(4,5–
dimethyl tyazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reaction method.
The results showed that the flavone has moderate potency in inhibiting the

proliferation of HeLa cancer cells with IC50 value of 34 µg/mL.
Keywords: antioxidant capacity, apigenin, flavone, HeLa cancer cells, peanut
hulls, total phenol

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KADAR FENOL TOTAL DAN BIOAKTIVITAS FLAVON DARI
KULIT KACANG TANAH SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN
ANTIPROLIFERASI TERHADAP SEL KANKER HELA

AIKA LATIFAH ALAWIYAH

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Kimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUTE PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr dr Irma H Suparto, MS

PRAKATA
Puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah swt yang telah memberikan
rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat terselesaikan. Tema
penelitian ini adalah Kadar Fenol Total dan Bioaktivitas Flavon dari Kulit Kacang
Tanah sebagai Antioksidan dan Antiproliferasi terhadap Sel Kanker HeLa yang
diselesaikan sejak bulan November 2015 sampai Juli 2016.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof Ir Suminar Setiati

Achmadi, PhD selaku Ketua Komisi Pembimbing dan Ibu Dr Dra Gustini
Syahbirin, MS selaku Anggota Komisi Pembimbing, atas segala waktu, arahan,
bimbingan, serta motivasi yang diberikan kepada penulis, Dr dr Irma H Suparto
selaku Penguji Luar Komisi yang telah memberikan banyak saran untuk perbaikan
karya ilmiah ini, terima kasih kepada bapak Sabur, semua rekan peneliti di
Laboratorium Kimia Organik, serta rekan-rekan mahasiswa Program Studi S-2
Kimia yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan penelitian ini.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, suami, saudarasaudariku dan teman-teman atas doa, dukungan dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat

Bogor, Oktober 2016

Aika Latifah Alawiyah

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Kacang tanah adalah tumbuhan palawija terbesar setelah kacang kedelai.
Produksinya tersebar luas di setiap daerah Indonesia. Daerah Jawa Timur, Jawa
Tengah, dan Jawa Barat menjadi pusat produksi utama kacang tanah. Berdasarkan

data statistik Tanaman Pangan dan Holtikultura tahun 2010-2014, Sukabumi
sebagai penghasil terbesar ketiga di Provinsi Jawa Barat setelah Garut dan Cianjur
(Dinas Pertanian Tanaman Pangan 2014). Mayoritas masyarakat memanfaatkan
tanaman kacang tanah bagian bijinya saja, sedangkan kulit luarnya hanya sebagai
bahan pakan ternak atau limbah. Faktanya, berbagai manfaat dapat dihasilkan dari
limbah kulit luar kacang tanah karena keberadaan senyawa golongan fenol seperti
eriodiktiol (Qiu et al. 2012), polifenol (Zhang et al. 2013), 5.7-dihidroksikromon,
dan luteolin (Sheng et al. 2014). Dari kajian peneliti terdahulu diketahui bahwa
senyawa fenolik ini bersifat farmakologi, yaitu sebagai antibakteri (Zhang et al.
2013), antiinflamasi (Haryoto et al. 2010), dan aktivitas larvasidal (Velu et al.
2015). Bioaktivitas antioksidan telah diketahui dari senyawa 5.7dihidroksikromon, eriodiktiol, dan luteolin dengan kadar masing-masing 0.59,
0.92, dan 2.36 mg/g dalam ekstrak metanol. Selain itu, pada konsentrasi 500
µg/mL ekstrak metanol kulit luar kacang tanah mampu menginhibisi peroksidase
pada sistem asam linoleat hingga 80 % (Win et al. 2011). Kapasitas antioksidan
sejalan dengan kadar senyawa pada suatu bahan. Hasil penelitian Husni et al.
(2014) pada rumput laut membuktikan bahwa kadar total senyawa fenol
berkorelasi positif dengan kapasitas antioksidannya. Kadar fenol total yang tinggi
menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi dan dapat secara efektif
menghambat pertumbuhan sel kanker (Vuong et al. 2014).
Kanker serviks menjadi permasalahan serius bagi wanita. Kanker ini

merupakan penyakit mematikan kedua setelah kanker payudara yang terjadi pada
wanita. Pada tahun 2012, wanita yang mengidap kanker serviks mencapai 84%
dari kasus baru yang terjadi di seluruh dunia (WHO 2016). Telah banyak
ditemukan beberapa pengobatan secara medis untuk mengatasi permasalahan
kanker ini. Salah satu senyawa fenolik, yaitu flavon, diidentifikasi berpotensi
sebagai antioksidan maupun antikanker. Apigenin termasuk ke dalam golongan
flavon yang diketahui potensinya sebagai antioksidan. Gao et al. (2012) telah
mengidentifikasi apigenin dalam fraksi etil asetat dari Cajanus cajan dan
aktivitasnya sebagai antioksidan yang kuat dengan nilai IC50
μ
.
Apigenin juga mampu menghambat proses oksidasi asam linoleat (Liu et al.
2012). Potensi sebagai antioksidan dari flavon menyebabkan senyawa ini juga
berperan dalam menghambat tumbuhnya sel kanker seperti sel kanker paru-paru
(MRC-5), payudara (MCF7), usus besar (HT-29), dan serviks (HeLa) masingmasing dengan nilai IC50 sebesar
dan
μ
Penghambatan proliferasi dari golongan flavon ini lebih aktif terhadap sel MCF7
dan HeLa diantara sel kanker lainnya (Beara et al. 2012). Kadar senyawa dalam
suatu sampel perlu ditentukan dalam mengevaluasi aktivitasnya sebagai

antioksidan dan penghambatannya terhadap sel kanker. Oleh karena itu, penelitian
ini bertujuan menentukan kadar fenol total, aktivitas antioksidan, dan

2

antiproliferasi isolat golongan flavon dari kulit luar kacang tanah secara in vitro
pada sel HeLa.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini diharapkan memperoleh kadar fenol total tinggi, sehingga
dapat berpengaruh besar pada aktivitas antioksidan dan antiproliferasi isolat
golongan flavon dari kulit luar kacang tanah secara in vitro pada sel kanker HeLa.

Manfaat Penelitian
Hasil kajian ini diharapkan dapat berkontribusi dalam mengembangkan
kulit kacang tanah sebagai antioksidan dan antikanker pada pengobatan secara
herbal.

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan
Sampel yang digunakan adalah kulit luar kacang tanah yang diperoleh dari
Kabupaten Sukabumi. Sampel dibersihkan dan dikeringkan dengan cara dianginanginkan untuk menghindari rusaknya senyawa yang terdapat pada sampel
tersebut (Haryoto et al. 2010). Bahan uji dijadikan serbuk berukuran 0.18 mm
(Hamadou et al. 2014). Bahan-bahan lainnya yang diperlukan ialah reagen FolinCiocalteau, standar asam galat, reagen 2,2-difenilpikrilhidrazil (DPPH), sel Vero
(ATCC CCL 81), sel HeLa (ATCC CCL 2), medium Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (DMEM), 3-(4,5–dimetil tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida
(MTT) (Sigma), fetal bovin serum (FBS), dimetil sulfoksida (DMSO), dan
Doksorubisin.
Alat analitis yang digunakan ialah 3 perangkat ekstraksi (soklet,
ultrasonikator, dan refluks) sebagai tahap awal untuk proses pemisahan senyawa
target (Lampiran 1), seperangkat alat kromatografi, microplate 96-well,
microplate mixer, ELISA microplate reader (BIO RAD i-Mark 11421), inkubator
CO2 (Thermo Forma), spektrofotometer ultraviolet-tampak (UV-Vis) HITACHI
UV/Vis Spectrophotometer U2800, dan kromatografi cair-spektrometer massa
(LC-MS) merek Waters Acquity.

Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada November 2015 sampai Juni 2016 di
Laboratorium Kimia Organik, Laboratorium Bersama Departemen Kimia,

Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Laboratorium Kesehatan Daerah Provinsi
DKI Jakarta, dan Pusat Studi Satwa Primata, Institut Pertanian Bogor.

3

Penentuan Kadar Air
Cawan porselen dikeringkan terlebih dahulu selama 30 menit di dalam oven
pada suhu 105 °C, kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang hingga
mendapatkan bobot konstan dari cawan. Sebanyak 1 g serbuk sampel diletakkan
ke dalam cawan dan dipanaskan pada suhu 105 °C selama 3 jam di dalam oven.
Cawan yang berisi sampel didinginkan kembali dalam eksikator selama 30 menit,
kemudian ditimbang, dilakukan beberapa kali pengulangan hingga diperoleh
bobot konstan. Nilai kadar air sampel dihitung berdasarkan rumus:
Keterangan:
A = Bobot cawan kosong
B = Bobot cawan + sampel sebelum pengeringan dalam oven
C = Bobot cawan + sampel setelah pengeringan dalam oven

Uji Kualitatif Golongan Fenol dan Flavonoid (Harborne 1987)
Uji fitokimia untuk fenol dan flavonoid secara kualitatif dilakukan pada
serbuk kulit kacang tanah dan ekstrak kasar. Sebanyak 1 g sampel uji dilarutkan
dalam 10 mL air sambil dikocok selama 1 menit, kemudian ditambahkan 2 tetes
HCl 1 N. Lapisan air pada proses tersebut diambil 2 mL dan ditambahkan FeCl3.
Keberadaan senyawa golongan fenol ditandai dengan timbulnya warna ungu, biru
tua, atau hitam kehijauan. Uji spesifik dari senyawa flavonoid dilakukan juga
untuk sampel uji. Sebanyak 1 g sampel ditambah 10 mL air panas dan dididihkan
selama 5 menit, disaring, dan diuji filtratnya. Ke dalam filtrat ditambahkan 0.5 g
serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol, kemudian dikocok secara
kuat. Keberadaan flavonoid ditunjukkan dengan warna merah/kuning/jingga pada
lapisan amil alkohol.

Ekstraksi Flavon (Qiu et al. 2012), (Fidrianny et al. 2014), (Velu et al. 2015)
Serbuk kulit kacang tanah (20 g) diekstraksi terlebih dahulu dengan
menggunakan 3 cara ekstraksi (soksletasi, ultrasonikasi, dan refluks) untuk
memperoleh metode ekstraksi terbaik dengan pelarut etanol 96% masing-masing
250 mL. Metode ekstraksi refluks digunakan sebagai metode ekstraksi terbaik
berdasarkan kandungan kadar fenol yang terdapat dalam ekstrak kasar kulit
kacang tanah. Serbuk kulit kacang tanah (900 g) diekstraksi menggunakan metode
ekstraksi terpilih (refluks) selama 210 menit, kemudian disaring dan filtratnya
dievaporasi menggunakan evaporator putar di bawah vakum pada suhu 35 ºC,
sehingga diperoleh ekstrak etanol kental. Rendemen ekstrak dihitung berdasarkan
rumus:
Rendemen ekstrak =
Ekstrak etanol selanjutnya diekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah.
Metode ekstraksi bertingkat diawali dengan pelarut n-heksana. Ekstrak etanol (40
g) difraksionasi menggunakan n-heksana 2700 mL, sehingga dihasilkan fraksi n-

4

heksana dan etanol. Fraksi etanol selanjutnya dihidrolisis menggunakan HCl 2N
selama 3 jam pada suhu 100 C, kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat hasil
hidrolisis. Fraksi yang telah terhidrolisis kemudian difraksionasi menggunakan
etil asetat 4500 mL, selanjutnya diuji kadar fenol total dan aktivitas
antioksidannya.

Penentuan Kadar Fenol Total Menggunakan Metode Folin-Ciocalteau
(Farmakope Herbal Indonesia 2011)
Ekstrak kental dari hasil ekstraksi menggunakan soksletasi, ultrasonikasi,
dan refluks ditentukan kadar senyawa fenol totalnya. Dari setiap ekstrak diambil
10 mg untuk dilarutkan ke dalam 50 mL metanol p.a. Setiap sampel uji (1 mL)
ditambahkan 5 mL reagen Folin-Ciocalteau. Setelah diinkubasi selama 8 menit
pada suhu ruang, ke dalam larutan ditambahkan NaOH 1% sebanyak 4 mL,
kemudian diinkubasi kembali selama 1 jam. Absorbansnya diukur pada panjang
gelombang 730 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Larutan asam galat
dengan beragam konsentrasi digunakan sebagai standar. Ekstrak etanol dari
metode ekstraksi terbaik dan fraksi etil asetat juga ditentukan kadar fenol total
dengan metode yang sama.

Uji Aktivitas Antioksidan (Hussain et al. 2012)
Ekstrak kasar dan fraksi etil asetat dibuat dalam berbagai ragam konsentrasi
(10-150 µg/mL) dan asam askorbat dijadikan sebagai kontrol positif. Larutan uji
(2 ml) ditambahkan 10 mL reagen DPPH. Larutan blanko disiapkan dengan
melarutkan DPPH dalam etanol tanpa tambahan larutan uji. Campuran dikocok
kuat, setelah itu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang dan diukur
absorbansnya pada panjang gelombang 517 nm.
Nilai serapan larutan DPPH sebelum dan sesudah penambahan sampel
dihitung sebagai persen inhibisi (% inhibisi) dengan rumus sebagai berikut:
% inhibisi =
Keterangan:
Akontrol = Absorbans tidak mengandung sampel
Asampel = Absorbans sampel
Selain itu, kapasitas antioksidan dari sampel ditentukan berdasarkan
perhitungan nilai IC50.
Isolasi Flavon (Kang et al. 2010)
Eluen terbaik dipilih terlebih dahulu untuk mengisolasi senyawa flavon
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Pelat KLT yang digunakan adalah
jenis silika G60F254. Fraksi etil asetat ditotolkan pada pelat KLT, setelah
dikeringkan, kemudian dielusi oleh eluen terbaik yang telah dijenuhkan
sebelumnya dalam ruang elusi. Eluen yang digunakan adalah diklorometana

5

(DCM):metanol. Hasil elusi dari KLT diamati di bawah lampu UV pada panjang
gelombang 254 dan 366 nm untuk memvisualkan pola noda yang dihasilkan.
Fraksi etil asetat (4.13 g) diimpregnasi ke dalam 12.39 g silika gel hingga
semua sampel terserap dalam silika. Fraksionasi dilakukan menggunakan
kromatografi kolom gravitasi yang dielusi secara gradien mulai dari n-heksana, nheksana:DCM, DCM, DCM:metanol, dan metanol. Fraksi dari kolom
kromatografi yang diperoleh kemudian diidentifikasi kandungan senyawa
flavonnya menggunakan KLT, spektrofotometer UV-Vis, dan LC-MS,
selanjutnya diujikan bioaktivitasnya sebagai antioksidan dan antiproliferasi pada
sel kanker HeLa.

Uji Aktivitas Antiproliferasi Flavon pada Sel HeLa (Radji et al. 2010)
Isolat flavon diujikan terlebih dahulu pada sel Vero untuk menentukan
ragam konsentrasi yang diperlukan dalam uji sel kanker. Ragam konsentrasi yang
aman pada pengujian terhadap sel Vero kemudian dipilih untuk diujikan pada sel
kanker HeLa. Larutan uji diencerkan menjadi sederet konsentrasi yang telah
ditentukan dengan menggunakan pelarut DMSO.
Pada penelitian ini, konsentrasi tertinggi yang digunakan sebesar 200 µg/mL
dan konsentrasi terendah sebesar 12.5 µg/mL dengan angka kelipatan seri
konsentrasi 2. Ragam konsentrasi diambil yang tidak merusak sel Vero. Sel Vero
dan sel HeLa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam medium pertumbuhan sel.
Media tumbuh untuk sel Vero dan sel HeLa adalah DMEM dengan tambahan
masing-masing 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin.
Sebanyak
μ suspensi sel dala
ediu di asukkan ke dala pelat
yang terdiri atas 96 sumur, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator
CO2 dengan konsentrasi 5% pada suhu 37 C. Ekstrak etanol, fraksi etil asetat,
dan isolat flavon dilarutkan dengan pelarut DMSO dalam berbagai ragam
konsentrasi yang telah ditentukan sebelumnya, kemudian dimasukkan
μ ke
dalam sel yang telah disiapkan. Selanjutnya pelat diinkubasi dalam inkubator CO2
5% selama 48 jam pada suhu 37 oC. Selain itu dibuat suatu larutan kontrol
pembanding, yaitu media DMEM tanpa larutan uji dan Doksorubisin sebagai
kontrol positif. Setelah diinkubasi 48 jam, media di setiap sumur dalam pelat
dikeluarkan. Reagen MTT ditambahkan sebanyak 10 µL/sumur, kemudian
diinkubasi kembali selama 4 jam hingga terbentuk formazan berwarna ungu pada
sel hidup. Larutan SDS 1% ditambahkan pada setiap sumur dan didiamkan selama
24 jam pada suhu kamar. Absorbans diukur dengan menggunakan
spektrofotometer ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
Penghambatan pertumbuhan sel kanker dihitung menurut rumus berikut:
Persentase inhibisi =
Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan persamaan regresi linear yang
menyatakan hubungan antara konsentrasi sampel uji dan persentase
penghambatan.

6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identitas Botani dan Simplisia
Bagian kulit luar kacang tanah yang dijadikan sebagai objek utama dalam
penelitian ini diidentifikasi di Herbarium Bogoriens, Bidang Botani Pusat
Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Spesimen dinyatakan termasuk ke dalam keluarga
Leguminosae, spesies Arachis hypogaea L.

Kandungan Fenol dan Flavonoid
Kandungan senyawa pada kulit kacang tanah didominasi oleh golongan
fenol, yaitu flavonoid yang ditandai dengan warna kuning hingga hijau kehitaman
(Gambar 1). Hal ini terjadi karena penambahan FeCl3 yang mengakibatkan
terbentuknya kompleks Fe3+ polifenol. Kompleks senyawa tersebut hasil dari
pasangan elektron yang didonorkan oleh atom oksigen pada polifenol terhadap
Fe3+ yang memiliki orbital d kosong dengan membentuk ikatan kovalen koordinat.

A
B
Gambar 1 Hasil uji fitokimia fenol pada serbuk (A) dan ekstrak etanol (B)
Uji fitokimia untuk flavonoid juga dilakukan terhadap serbuk dan ekstrak.
Hasil uji menunjukkan bahwa serbuk dan ekstrak etanol mengandung flavonoid
yang ditandai dengan warna kuning pada lapisan amil alkohol (Gambar 2).
Identifikasi keberadaan flavonoid adalah setelah pemutusan ikatan glikosida oleh
serbuk Mg dan HCl pekat. Flavonoid yang terbebas ikatan dengan gula kemudian
ditarik oleh amil alkohol, sehingga amil alkohol menjadi berwarna kuning yang
mengindikasikan terbentuknya garam flavilium (Marlinda et al. 2012).

A
B
Gambar 2 Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk (A) dan esktrak etanol (B)

7

Berdasarkan uji fitokimia fenol dan flavonoid pada serbuk dan ekstrak
sampel, intensitas warna hijau kehitaman dan kuning mengindikasikan bahwa
kulit kacang tanah mengandung senyawa golongan fenol, khususnya flavonoid.
Selain itu alkaloid, triterpenoid, steroid juga ditemukan dalam kulit kacang tanah,
tetapi dengan kadar yang sedikit dibandingkan dengan senyawa fenol (Velu et al.
2015).

Ekstrak Flavon
Senyawa golongan flavon dapat diekstraksi dengan berbagai metode
ekstraksi seperti maserasi, soksletasi, refluks, dan ultrasonikasi. Pada penelitian
ini dilakukan ekstraksi pendahuluan menggunakan 3 jenis ekstraksi, yaitu
soksletasi, refluks, dan ultrasonikasi dengan pelarut etanol untuk menentukan
metode ekstraksi terbaik pada tahap selanjutnya. Metode ekstraksi nonkonvensional lebih efisien dalam mengekstraksi senyawa flavonoid dan rendemen
yang dihasilkan lebih banyak (Zeidan et al. 2014).
Berdasarkan ekstraksi pendahuluan menggunakan 3 metode, rendemen
ekstrak etanol melalui refluks lebih tinggi di antara 2 metode lainnya (Tabel 1).
Pengaruh suhu dan waktu ekstraksi pada refluks menentukan keefektifan ekstraksi
flavon dari serbuk sampel. Sama halnya seperti metode refluks, soksletasi
menggunakan indikator suhu tetapi hanya menghasilkan rendemen kasar setengah
dari cara refluks meskipun waktu ekstraksi 2 kali lipat lebih lama karena kontak
langsung yang minimum antara pelarut dengan sampel. Cara ultrasonikasi
ternyata kurang efisien dalam mengekstraksi flavon dari matriks simplisia.
Walaupun metode ini menggunakan bantuan gelombang ultrasonik dalam
memecahkan dinding sel dari suatu matriks simplisia, tetapi diperlukan waktu
ekstraksi dan suhu yang optimum agar diperoleh rendemen ekstrak yang lebih
tinggi. Rendemen ini digunakan sebagai salah satu faktor dalam pemilihan metode
ekstraksi terbaik. Ekstraksi simplisia dari 900 g yang menggunakan metode
terpilih (refluks) menghasilkan rendemen 5.56 % dengan bobot ekstrak 44.7 gram
(Lampiran 2).
Tabel 1

Rendemen ekstrak dari 3 metode ekstraksi (refluks, soksletasi, dan
ultrasonikasi)

Metode
ekstraksi

Bobot
simplisia
(g)

Waktu
ekstraksi
(menit)

Bobot
ekstrak
(g)

Kadar
air
(%)

Rendemen
terkoreksi
(%)

Refluks

20

210

3.35

10.71

18.76

Soksletasi

20

540

1.65

10.71

9.24

Ultrasonikasi

20

120

1.33

10.71

7.45

Rendemen terbaik ini juga sejalan dengan laporan (Abidin et al. 2014), yang
mengevaluasi berbagai metode ekstraksi senyawa flavon, yaitu luteolin,
menggunakan pelarut etanol dari daun Vitex negundo. Hasil evaluasi ini

8

menunjukkan bahwa metode refluks menghasilkan rendemen ekstrak lebih tinggi,
yakni 9.6%. Dari penelitian sebelumnya dilaporkan bahwa maserasi kulit kacang
tanah hanya menghasilkan rendemen 0.01% ekstrak kasar (Haryoto et al. 2010).
Berbagai parameter harus dikendalikan dalam metode refluks ini seperti faktor
suhu, waktu ekstraksi, pelarut, dan nisbah pelarut:sampel. Pada penelitian ini
serbuk direfluks pada suhu 70 C selama 210 menit. Proses ekstraksi dengan suhu
di bawah 80 C bertujuan meminimumkan degradasi senyawa flavonoid
(Ghasemzadeh 2014).
Ekstrak yang dihasilkan dari metode refluks kemudian difraksionasi secara
bertingkat menggunakan corong pisah yang bertujuan memisahkan senyawa
berdasarkan kelarutannya dengan tingkat kepolaran yang berbeda. Ekstrak
difraksionasi terlebih dahulu menggunakan n-heksana 2700 mL untuk
memperoleh senyawa yang bersifat nonpolar seperti lipid/lemak. Sari hasil
fraksionasi ini diperoleh rendemen fraksi n-heksana dan etanol masing-masing
sebesar 2.40 dan 37.60 g. Fraksi bebas lemak (33.60 g) selanjutnya difraksionasi
menggunakan etil asetat yang sebelumnya dihidrolisis dahulu menggunakan HCl
2 N. Hidrolisis ini dimaksudkan untuk memutuskan ikatan glikosida dari senyawa
agar mendapatkan aglikon. Pada umumnya senyawa flavonoid pada tanaman
tersedia dalam bentuk flavonoid glikosida, sehingga diperlukan hidrolisis asam
untuk memperoleh flavonoid aglikon (Irianti et al. 2015). Rendemen fraksi etil
asetat lebih tinggi dibandingkan fraksi etanol (Tabel 2). Hal ini mengindikasikan
bahwa senyawa flavon aglikon banyak terekstraksi pada pelarut etil asetat.
Tabel 2 Rendemen ekstrak hasil fraksionasi
Fraksi

Massa
ekstrak (g)

Rendemen
(%)

Fraksi n-heksana

2.40

6.00

Fraksi etanol

16.28

40.70

Fraksi etil asetat

17.97

44.90

Kadar Fenol Total
Kadar fenol dari suatu ekstrak ditentukan menggunakan spektrofotometer
UV-Vis dengan pereaksi khusus Folin-Ciocalteau. Pereaksi ini bereaksi dengan
senyawa fenol yang ada dalam ekstrak membentuk larutan berwarna yang dapat
diukur absorbansnya. Senyawa fenol ini dapat bereaksi jika dalam suasana basa,
yaitu terjadinya disosiasi proton pada senyawa fenol menjadi ion fenolat. Reaksi
yang terjadi ditandai dengan terbentuknya warna biru setelah penambahan basa
yang dapat diukur absorbansnya pada panjang gelombang 730 nm. Gugus
hidroksil dari fenol akan mereduksi asam heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat)
yang terdapat dalam pereaksi Folin-Ciocalteau menjadi suatu kompleks
molibdenum-tungsten yang berwarna biru. Semakin pekat warna biru pada
larutan, berarti semakin besar konsentrasi senyawa fenol, artinya semakin banyak

9

ion fenolat yang mereduksi asam heteropoli menjadi kompleks molibdenumtungsten.
Kadar fenol total dari kulit kacang tanah ditetapkan pada 3 ekstrak dari cara
refluks, soksletasi, dan ultrasonikasi sebagai langkah pendahuluan untuk
penentuan metode ekstraksi terbaik. Kadar fenol ini juga ditetapkan pada ekstrak
etanol hasil dari metode terbaik (refluks) dan fraksi etil asetat. Asam galat
digunakan sebagai standar yang tergolong ke dalam asam fenol sederhana turunan
dari asam hidroksibenzoat. Berdasarkan absorbans yang dihasilkan, kurva standar
dibuat untuk digunakan dalam penentuan kadar fenol total dari sampel uji
(Lampiran 3).
Pada kurva standar asam galat diperoleh persamaan y=0.0056x-0.0249
dengan tingkat keakuratan dan ketelitian yang baik berdasarkan nilai R yang
dihasilkan mendekati 1. Persamaan tersebut digunakan dalam menentukan
konsentrasi dari sampel uji dengan menggunakan data absorbans.
Kadar fenol total tertinggi diperoleh dari metode ekstraksi menggunakan
refluks (Tabel 3). Metode refluks ini beberapa kali lipat lebih efektif dalam
mengekstraksi senyawa seperti fenol dan flavonoid karena perlakuan panas dapat
membebaskan dan mengaktifkan bobot molekul rendah dari subunit molekul
polimer dengan bobot molekul tinggi (Hatam et al. 2013). Kadar fenol total dari
900 g simplisia adalah 262.30 mg GAE/g ekstrak. Kadar fenol dari peneliti
sebelumnya dengan sampel yang sama dan dengan cara refluks adalah 69.10 mg
GAE/g ekstrak (Fidrianny et al. 2014), sedangkan menggunakan metode
ultrasonikasi dan maserasi oven mikrogelombang biasa masing-masing adalah
5.94 mg GAE /g (Hussain et al. 2011) dan 7.79 mg GAE/g ekstrak (Mulyadi et al.
2014). Kadar fenol dari ekstrak etanol kasar yang dihasilkan pada penelitian ini
sangat nyata berbeda dengan penelitian-penelitian sebelumnya. Hal ini dapat
disebabkan oleh faktor tempat tumbuh, yakni pengaruh perbedaan suhu, kondisi
tanah, curah hujan, kelembapan, dan intensitas cahaya (Susanti et al. 2012).
Berbagai faktor tersebut menyebabkan konstituen kimia pada tumbuhan menjadi
beragam (Rohaeti et al. 2011).
Tabel 3 Kadar fenol total dari ekstrak hasil peragaman metode ekstraksi
Fenol total
Kadar fenol total Kadar fenol total dari
Metode ekstraksi
(mg GAE/g kulit kacang tanah penelitian terdahulu
ekstrak)
(%)
(%)
Refluks
496.84
49.68
6.90a
Soksletasi
65.30
6.53
Ultrasonikasi
37.32
3.73
1.60b
a
(Fidrianny et al. 2014)
b
(Zhang et al. 2013)
Dari fraksi etil asetat juga tetapkan kadar fenol totalnya. Kadar fenol total
yang terdapat pada fraksi ini 2 kali lebih tinggi dibandingkan dengan kadar fenol
pada ekstrak etanol, yaitu 531.90 mg GAE/g (Tabel 4). Hal ini disebabkan oleh
peran senyawa aglikon yang dihasilkan dari proses hidrolisis. Keberhasilan
hidrolisis asam pada senyawa glikosida dibuktikan dengan meningkatnya kadar

10

fenol total (Auliawan 2014). Gambar 3 berikut memperlihatkan reaksi hidrolisis
asam dalam memutuskan fenol glikosida:

Gambar 3 Reaksi pemutusan ikatan fenol glikosida menggunakan hidrolisis asam
Tabel 4 Kadar fenol total ekstrak etanol dan fraksi etil asetat
Kadar fenol total
Fenol total
Sampel uji
kulit kacang tanah
(mg GAE/g ekstrak)
(%)
Ekstrak etanol
262.30
26.2
Fraksi etil asetat
531.90
53.2

Aktivitas Antioksidan
Kadar fenol total dalam sampel dapat berkaitan dengan bioaktivitasnya
sebagai antioksidan. Ekstrak etanol dan fraksi etil asetat memiliki potensi tinggi
dalam menangkap radikal DPPH. Metode DPPH dipilih sebagai metode untuk
mengevaluasi aktivitas antioksidan karena lebih cepat, mudah, terpercaya, dan
tidak memerlukan pereaksi atau alat khusus dalam pengukurannya. DPPH
merupakan radikal yang stabil dan tidak mudah hancur dalam air, metanol, atau
etanol. Delokalisasi dari radikal ini menimbulkan warna ungu tua ditandai dengan
pita serapan di daerah 520 nm dalam larutan etanol. Ketika DPPH bereaksi
dengan senyawa antioksidan, maka radikal DPPH menghasilkan bentuk yang
tereduksi ditandai dengan warna ungu tua yang berubah menjadi kuning
berdasarkan reaksi pada Gambar 4.

Gambar 4 Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan (Molyneux 2004)
Aktivitas antioksidan ini ditetapkan menggunakan spektrofotometer UVVis. Persentase penangkapan radikal dihitung berdasarkan pengukuran absorbans
sampel uji. Fraksi etil asetat dan isolat flavon memiliki persentase penangkapan
radikal DPPH paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol pada konsentrasi
20 µg/mL (Lampiran 4). Ekstrak hasil pemurnian lebih disukai dibandingkan

11

dengan ekstrak kasar yang masih banyak bercampur komponen pengganggu
bioaktivitas senyawa seperti lemak dan lilin (Hernani et al. 2007). Flavon,
flavanol, dan flavonol lebih banyak tertarik oleh pelarut etil asetat karena sifat
kepolarannya yang kurang polar. Senyawa ini memiliki sejumlah gugus hidroksil
yang mampu menyediakan hidrogen yang bertanggung jawab dalam menangkap
radikal DPPH (Zhou et al. 2011, Wen et al. 2014). Persamaan regresi diperoleh
dari hubungan antara persentase penangkapan radikal dan konsentrasi bahan uji
(Lampiran 4), selanjutnya digunakan untuk menentukan konsentrasi 50%
penangkapan radikal (IC50) dari bahan uji dengan tingkat keakuratan dan
ketelitian yang baik berdasarkan nilai R mendekati 1.
Pada penelitian ini, ekstrak etanol memiliki kapasitas antioksidan yang kuat
dengan nilai IC50 36.36 µg/mL. Hussain et al. (2011) telah melaporkan bahwa
kapasitas antioksidan dari esktrak etanol kulit kacang tanah sebesar 38.90 µg/mL.
Dapat dikatakan bahwa kapasitas antioksidan pada penelitian ini sedikit lebih
besar dibandingkan dengan sebelumnya. Setelah pemurnian menggunakan etil
asetat aktivitas antioksidan menjadi lebih tinggi dengan nilai IC50 18.68 µg/mL.
Berbagai faktor mempengaruhi kapasitas antioksidan dari suatu bahan uji seperti
kandungan senyawa fenol dan kadar total senyawa. Senyawa fenol dan polifenol
sebagian besar tersebar pada berbagai jenis tanaman. Telah ditemukan bahwa
senyawa fenol memiliki aktivitas antioksidan berdasarkan sifat gugus hidroksil
yang terdapat pada fenol mampu menangkap radikal. Senyawa fenol ini
melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksil untuk diikat oleh radikal dan
menghasilkan radikal fenoksil yang sifatnya stabil (Aksoy et al. 2013).
Faktor lainnya ialah efek dari hidrolisis asam pada ekstrak yang
menghasilkan senyawa aglikon pada fraksi etil asetat. Kapasitas antioksidan
senyawa aglikon lebih tinggi dibandingkan dengan bentuk glikosidanya karena
gula yang terikat pada gugus hidroksil dapat mengganggu penangkapan radikal,
sehingga menurunkan efisiensi aktivitasnya (Irianti et al. 2015). Aktivitas
antioksidan dari kulit ari dan biji kacang tanah telah dilaporkan dalam penelitian
Gaafar et al. (2015) dengan menggunakan berbagai metode uji, di antaranya
penangkapan radikal DPPH, pengkelat ion Fe, reaksi reduksi, dan uji ABTS• .
Berdasarkan uji DPPH, ekstrak aseton mempunyai aktivitas antioksidan dengan
kategori kuat pada nilai IC50
≤ I 50 ≤
(
dan
)
Sementara itu, kapasitas antioksidan untuk isolat flavon tidak jauh berbeda
dengan fraksi etil asetat yang memiliki nilai IC 50 19.66 µg/mL. Ekstrak etanol
kasar, fraksi etil asetat, dan isolat dari kulit kacang tanah memiliki aktivitas
antioksidan yang sangat kuat karena pada konsentrasi < 50 µg/mL telah efektif
dalam menangkap 50% radikal bebas. Terdapat korelasi antara kadar fenol total
dan aktivitas antioksidan (Tabel 5). Semakin tinggi kadar fenol total maka
semakin tinggi juga aktivitas antioksidannya. Asumsi tersebut berdasarkan
analisis menggunakan korelasi Pearson (Lampiran 5). Hasil uji korelasi ini
menunjukkan hubungan positif antara kadar fenol total dan kapasitas antioksidan
(p 100 µg/mL, maka
bahan uji dikatakan aman bagi tubuh karena efek sitotoksik pada sel Vero dimulai
dari konsentrasi tersebut (Budi et al. 2000). Oleh karena itu, uji toksisitas dari
bahan uji (ekstrak kasar, fraksi etil asetat, dan isolat flavon) dilakukan terlebih
dahulu pada sel Vero guna menentukan batas konsentrasi yang aman terhadap sel
Vero. Ragam konsentrasi yang digunakan adalah 200, 150, 100, 50, 25, dan 12.5
µg/mL. Hasil uji toksisitas pada sel Vero dari ketiga bahan uji memperlihatkan
kemampuan penghambatan berbeda (Lampiran 7). Ketiga sampel bersifat toksik
terhadap sel Vero pada konsentrasi lebih dari 150 µg/mL masing-masing dengan
kematian untuk ketiga sampel adalah 50.6, 49.9, dan 64.2% dengan nilai IC50
masing-masing 253.8, 161.02, dan 152.83 µg/mL. Konsentrasi bahan uji di atas
150 µg/mL telah mampu mematikan sel normal yang mengakibatkan kerusakan
membran, sehingga biru tripan akan berikatan dengan protein dalam sel yang
mengindikasikan sel mati ditandai adanya tampak biru berdasarkan pengamatan
secara mikroskopik (Nurani 2012). Oleh karena itu konsentrasi ≤ 150 µg/mL
aman digunakan pada sel Vero meskipun memiliki sitotoksik terhadap sel kanker
HeLa. Gambar 10 berikut ini merupakan pengamatan sitotoksik bahan uji pada sel
Vero secara mikroskopik.

A.
B.
C.
Gambar 10 Sel Vero sebelum penambahan isolat flavon (A), penambahan isolat
pada konsentrasi < 200 µg/mL ( ) dan konsentrasi ≥
µg/mL (C)
Ekstrak etanol, fraksi etil asetat, dan isolat diujikan pada sel kanker HeLa
dengan ragam konsentrasi yan sa a ≤ 150 µg/mL. Hasil uji menghasilkan nilai
persentase penghambatan dan nilai IC50 yang berbeda, masing-masing 79.5,
73.74, 34.11 µg/mL (Lampiran 8). Berdasarkan National Cancer Institute (NCI)
Amerika, nilai 30 < IC50